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La cromatografa lquida de alta eficacia o high performance liquid chromatography (HPLC) es un

tipo de cromatografa en columna utilizada frecuentemente en bioqumica y qumica analtica.


Tambin se la denomina a veces cromatografa lquida de alta presin o cromatografa lquida de
alta resolucin (high pressure liquid chromatography) (HPLC), aunque esta terminologa se
considera antigua y est en desuso. El HPLC es una tcnica utilizada para separar los
componentes de una mezcla basndose en diferentes tipos de interacciones qumicas entre las
sustancias analizadas y la columna cromatogrfica.

Cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC)


En la HPLC isocrtica el compuesto pasa por la columna cromatogrfica a travs de la fase
estacionaria (normalmente, un cilindro con pequeas partculas redondeadas con ciertas
caractersticas qumicas en su superficie) mediante el bombeo de lquido (fase mvil) a alta
presin a travs de la columna. La muestra a analizar es introducida en pequeas cantidades y sus
componentes se retrasan diferencialmente dependiendo de las interacciones qumicas o fsicas con
la fase estacionaria a medida que adelantan por la columna. El grado de retencin de los
componentes de la muestra depende de la naturaleza del compuesto, de la composicin de la fase
estacionaria y de la fase mvil. El tiempo que tarda un compuesto a ser eluido de la columna se
denomina tiempo de retencin y se considera una propiedad identificativa caracterstica de un
compuesto en una determinada fase mvil y estacionaria. La utilizacin de presin en este tipo de
cromatografas incrementa la velocidad lineal de los compuestos dentro de la columna y reduce as
su difusin dentro de la columna mejorando la resolucin de la cromatografa. Los disolventes ms
utilizados son el agua, el metanol y el acetonitrilo. El agua puede contener tampones, sales, o
compuestos como el cido trifluoroactico, que ayudan a la separacin de los compuestos.
Una mejora introducida a la tcnica de HPLC descrita es la variacin en la composicin de la fase
mvil durante el anlisis, conocida como elucin en gradiente. Un gradiente normal en una
cromatografa de fase reversa puede empezar a un 5% de acetonitrilo y progresar de forma lineal
hasta un 50% en 25 minutos. El gradiente utilizado vara en funcin de la hidrofobicidad del
compuesto. El gradiente separa los componentes de la muestra como una funcin de la afinidad
del compuesto por la fase mvil utilizada respecto a la afinidad por la fase estacionaria. En el
ejemplo, utilizando un gradiente agua/acetonitrilo los compuestos ms hidroflicos eluirn a mayor
concentracin de agua, mientras que los compuestos ms hidrofbicos eluirn a concentraciones
elevadas de acetonitrilo. A menudo, hace falta realizar una serie de pruebas previas con tal de
optimizar el gradiente de forma que permita una buena separacin de los compuestos.

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