Cuantificacin en CG y HPLC

Los detectores dan una respuesta que es proporcional a la cantidad de sustancia (m):

El coeficiente de proporcionalidad a es caracterstico de cada sustancia pero no es

posible predecirlo en forma sencilla

Respuesta = a m

Como el componente atraviesa

el detector en un perodo de
tiempo, la respuesta debe ser
evaluada en todo ese perodo

rea de la seal

Si el coeficiente a es igual para varios

compuestos podemos determinar su
proporcin relativa en una mezcla

A1/A2 = m1/m
/ 2

Esto depender del tipo de detector y

la similitud entre los compuestos

En cromatografa gaseosa con detector de ionizacin de llama, las

diferencias de respuesta pueden ser muy grandes
mezcla de solventes conteniendo 1,5 mg/ml de cada uno

Chromatography Today, 2012, 52-56

Diferencias mucho mayores pueden darse en cromatografa lquida con

detector UV-visible donde algunos componentes pueden tener
respuesta nula y otros respuesta alta a una dada longitud de onda.

El factor de respuesta ( f ) es la inversa del coeficiente a y

corresponde a la cantidad de sustancia por unidad de rea

En el caso ms general cada

componente tendr un factor de
respuesta caracterstico

m1/m2 = f1A1/f2A2
1

Para conocer la relacin entre los componentes debo

conocer los factores de respuesta individuales fi

Los factores de respuesta los determino

experimentalmente midiendo el rea de la
seal producida por una cantidad conocida
((Mi) de cada componente
p

f1 = M1/A1 , etc.
1

Esto requiere tener patrones de referencia

de pureza conocida de cada componente

Solvente

f (CG-FID)

metanol

0,151

isopropanol

0,234

acetato de
etilo

0,196

cloroformo

0,039

tolueno

0,490

MTBE

0,303

acetonitrilo

0,212

Mtodos de cuantificacin
Mtodo del estndar externo:

M1 = C1 x (Vol de inyeccin)

1) inyecto una masa conocida M1 del

componente a cuantificar (solucin
de calibrado de concentracin C1)
1

2) mido el rea de la seal (A1) y

calculo el factor:

f1 = M1/A1

A1

3) inyecto la muestra problema y mido

p
a
el rea de la seal del componente
cuantificar

4) usando el factor calculo la masa

del componente en la muestra
inyectada y/o la concentracin

m1 = f1A1

Si el volumen de inyeccin es igual:

C1 = m1/(Vol de inyeccin)
C1 = C1A1/A1

Ventajas

Sencillo de implementar

Desventajas

Requiere volmenes de inyeccin precisos y reproducibles

Requiere una gran estabilidad en el tiempo del sistema

cromatogrfico (flujos, ancho de picos, etc.)

Si se pasan varias muestras, debe inyectarse la solucin de

calibracin periodicamente (por ejemplo cada 3 o 5 muestras) para
verificar que el sistema est estable

El mtodo es susceptible a errores introducidos al hacer diluciones,

etc.

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del

componente, debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de
calibracin) y/o inyectar cantidad de estndar externo acorde a cada muestra

Mtodo del estndar interno

1) Se agrega una cantidad igual del estndar (SI) a la
solucin de calibrado y a las muestras de modo
de tener la misma concentracin del estndar

ASI

A1

2) inyecto la solucin de calibrado (concentracin

conocida C1 del componente a cuantificar)
SI

3) mido el rea de las seales del componente a

cuantificar (A1) y del SI y calculo el factor de
respuesta relativo:

(F1CSI) = C1ASI/A1

F1 = C1ASI/CSIA1

A1

ASI
4) inyecto la muestra problema (que contiene una
cantidad conocida de SI) y mido el rea de la
seal del componente a cuantificar y del SI
SI

5) usando el factor F calculo la concentracin

del componente en la muestra inyectada C1

C1 = F1CSIA1/ASI

Ventajas

Es independiente del volumen de inyeccin

No requiere precisin en la preparacin de la solucin de SI ni conocer su

pureza, solo agregar la misma cantidad a muestras y solucin de calibrado

Es independiente de los errores por diluciones una vez agregado el SI

E independiente
Es
i d
di t de
d variaciones
i i
en ell flujo
fl j o en las
l condiciones
di i
de
d corrida
id

Desventajas

Requiere disponer de una sustancia (el SI) que no se superponga con

ninguno de los componentes de la muestra y que sea eluida en las
mismas condiciones

La preparacin de muestras y soluciones de calibrado es ms

laboriosa

Si las muestras a analizar contienen cantidades muy dispares del componente,

debe verificarse el rango de linealidad de respuesta (curva de calibracin) y/o
utilizar soluciones calibradoras diferentes (de concentraciones similares a las
muestras)

Los mtodos de estndar externo y estndar interno son de aplicacin

general
Sin embargo debe tenerse cuidado con ciertos tipos de detectores que pueden tener
mucha variabilidad de respuesta incluso dentro de una misma corrida, y respuesta no
lineal, como por ejemplo los detectores selectivos de masa

En el caso de CG o HPLC acoplados a espectrmetros de masa, los cromatogramas

de corriente inica total no son adecuados para cuantificar
La solucin ms conveniente es usar la misma sustancia como estndar interno

En la prctica se usa como estndar interno la misma sustancia deuterada

Se agrega a la muestra una cantidad conocida de la

sustancia a determinar (X) deuterada

TIC

El cromatograma de corriente inica total muestra

todos los componentes y un nico pico para XH y XD
X

El cromatograma de los iones de m/z = M solo

mostrar algunos componentes

AX

X-H
X
Hn

El cromatograma de los iones de m/z = M+n mostrar al

componente X con n 1H reemplazados por 2H al mismo
tiempo de retencin que puede usarse como SI

ASI

M+n

X-Dn

Como el componente a determinar y el SI son iguales y son detectados en el mismo momento

(al mismo tiempo de retencin) la determinacin no se afecta por la variabilidad del detector.

En RMN cada grupo de ncleos idnticos dar una seal de

complejidad variable pero inequivocamente asignable

el rea de cada seal es directamente proporcional a la magnetizacin de

l ncleos
los
l
que la
l producen
d

en un espectro RMN las reas relativas de las distintas seales dependen

solo del nmero de ncleos que les dan origen

existe una relacin sencilla y exacta entre las reas relativas de distintas
seales en un mismo espectro

las reas relativas son independientes de la concentracin y se

corresponden con la fraccin molar de cada grupo de ncleos

Experimentos posibles
Cuantificacin relativa de componentes
similar a un CG pero el factor de respuesta es conocido en forma exacta
nx: moles del componente x
Nx: N de ncleos de x que contribuyen a la seal Ix

La fraccin molar de un componente en una mezcla puede determinarse en forma

directa, si se requiere %P/P se deben conocer las masas molares.
RMN es el mtodo ms usado para la determinacin relativa de ismeros,
diastermeros y enantemeros (usando solventes o complejantes quirales), en ese
caso no hace falta conocer la masa molar
Cuantificacin absoluta de componentes
La forma ms simple es agregar un estndar (gravimetra) a una masa conocida de
cualquier mezcla: se obtienen resultados absolutos
RMN es un mtodo primario de medicin relativo
Un mtodo primario de medicin es un mtodo con la ms alta calidad metrolgica
cuya operacin puede ser descripta y entendida en forma completa, para el cual
puede escribirse un anlisis completo de incertidumbre en trminos de unidades SI
y cuyos resultados son aceptados sin referencia a un estndar de la cantidad que
se est midiendo

Determinacin de grado de etoxilacin de

lauril alcohol etoxilado

0,88 1,26 1,57

3,55-3,80

3,44

CH3((CH2)9CH2CH2O ((CH2CH2O))n -11-CH2CH2OH

AHC

AOX (4n+2)H

23H

4n 2
23

n 5,75

A OX
AHC

A OX
0,5
A HC

n 5,75

un patrn de referencia

A OX
0,5
A HC

AOX (4n+2)H

n = 8,1

AHC

0,88 1,26 1,57

23H

3,44

3,55-3,80

CH 3(CH 2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

n 5,75

una muestra desconocida

A OX
0,5
A HC

AOX (4n+2)H

n = 8,9

AHC

0,88 1,26 1,57

3,55-3,80

23H

3,44

CH 3(CH 2)9CH2CH2O (CH2CH2O)n -1-CH2CH2OH

6,624
H

CN
C C
CO2 CH2CH3

H
7,061

0.847

1.022

1.388
1.374
1.360

1.624

1.814

1,374 (t)

3.600

4.373
4.358
4.344
4.330

6.624

7.061

4,351 (c)

VP12185
Current Data Parameters
NAME
U06-110801
EXPNO
1
PROCNO
1
F2 - Acquisition Parameters
Date_
2006-08-17
Time
12.53
INSTRUM
Avance 500
PROBHD
5 mm PABBI 1H/
PULPROG
zg30
TD
65536
SOLVENT
CDCl3
NS
32
DS
2
SWH
7500.000 Hz
FIDRES
0.114441 Hz
AQ
4.3691168 sec
RG
4
DW
66.667 usec
DE
6.00 usec
TE
296.5 K
D1
1.00000000 sec
TD0
1
======== CHANNEL f1 ========
NUC1
1H
P1
7.00 usec
PL1
0.00 dB
SFO1
500.1327507 MHz

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

0.25

3.03

0.16

0.13

0.30

1.98

1.00

0.00
0.01

0.01

1.00

F2 - Processing parameters
SI
32768
SF
500.1300063 MHz
WDW
EM
SSB
0
LB
0.30 Hz
GB
0
PC
1.00

1.5

1.0

0.5

0.0

ppm

espectro RMN 1H 500 MHz de adhesivo de base cianoacrilato (la gotita)

6,624

6,72

OH

CN

C C
H

2x(AreaH1 + AreaH2)xMCN

1,374 (t)

OH

satlites de 13C
(0,56%)

6.721

7.062

7,061
4,351 (c)

5600 x AreaHQxMHQ

ppm Hidroquinona =

CO2 CH2CH3

6.624

4.5

7.10

7.05

7.00

6.95

6.85

4.0

6.80

6.75

3.5

3.0

2.5

2.0

0.992

0.004

0.006
6.90

6.70

6.65

1.5

6.60

ppm

6.55

1.0

0.848

7.15

1.022

7.20

1.389
1.375
1.361

7.25

1.620

7.30

1.815

7.35

3.601

7.40
4.374
4.359
4.345
4.331

7.45

0.005

1.000

determinacin de
contenido de
hidroquinona en
adhesivo de base
cianoacrilato ((la
la
gotita)

ppm

Muestra + SI diluida con D2O

En RMN tambin podemos usar el mtodo

de estndar interno (similar al usado en CG
o HPLC)

En este ejemplo usamos RMN 13C

No es necesario separar los
componentes, ya que la informacin
en un espectro RMN permite
diferenciarlos e identificarlos
Solucin de calibracin

No debemos preocuparnos por

condiciones especiales de medicin
porque, como en GC y HPLC, el factor
de respuesta se refiere al estndar
interno

Pero en RMN la cuantificacin se hace respecto a los ncleos sin

importar en que molcula estn, ya que su respuesta relativa (rea)
es independiente de sta

La sustancia usada como referencia y nuestra muestra no

tienen porqu ser la misma
patrones de referencia de cada analito a
No necesitamos p
cuantificar
No se requiere la separacin previa de los componentes
Que condiciones debe cumplir la sustancia de referencia?
contener al menos un ncleo igual al de la muestra (1H, 13C, 31P,
19F, 29Si, etc.)
ser soluble en el mismo solvente q
que la muestra
no dar seales prximas a las de la muestra
preferentemente dar una nica seal (no imprescindible)
obtenerse comercialmente con alto grado de pureza y ttulo
confiable
ser estable, no voltil y preferentemente slida

Algunos patrones de referencia comunmente usados en QNMR:

ncleos

solventes

dimetilsulfona

1H, 13C

agua, orgnicos

1,3,5-trioxano

1H, 13C

orgnicos

acetato de sodio
anhidro

1H, 13C

agua

fosfato de sodio
dodecahidrato

31P

agua

trifenilfosfato

31P

orgnicos

trifluoroacetato de etilo

19F

orgnicos

ortosilicato de etilo

29Si

orgnicos

2.8933
2.8687

3.4534

Espectro RMN 1H (500 MHz) de glifosato

solvente: D2O - piridina-d5 (7:1)

HOD
D
DO2C CH2 N CH2 PO3D2

piridina-d4
8.0

7.5

7.0

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

1.5

1.0

0.5

0.0

(ppm)

10

2.8687

2.8933

3.4534

el 1,12% de las molculas tienen13C

Impureza

DO2C

J 1H-31P

D
CH2 N CH2 PO3D2

13

J 1H-13C

D
DO2C CH2 N

satlite 13C

satlite 13C
(0,56%)

3.75

3.70

13CH
2

PO3D2

J 1H-13C

3.65

3.60

3.55

3.50

3.45

3.40

3.35

3.30

3.25

3.20
(ppm)

3.15

3.10

3.05

3.00

2.95

2.90

2.85

2.80

2.75

2.70

2.65

1.6315

2.9247
2.9006

3.4939

agregando acetato de sodio:

Muestra: Pur-2
Cdigo interno: U04-190803

CH3COOGroup Peak
1

N-CH2PO3H2

N CH2COON-CH

Start (ppm/Hz)

End (ppm/Hz)

3.89 1944.4

3.24 1621.0

Area

Area %

2.4174E+005

100.00

3.89 1944.4

3.24 1621.0

2.4156E+005

3.41 1706.4

3.37 1687.8

1.8026E+002

0.07

3.16 1579.1

2.65 1326.6

2.4170E+005

100.00

3.16 1579.1

2.65 1326.6

2.4170E+005

100.00

1.86

930.1

1.35

673.4

1.1128E+005

100.00

1.86

930.1

1.35

673.4

1.1128E+005

100.00

2
1
3
1

99.93

Area(glifosato)
moles(glifosato) = moles(estndar) x

Hestndar
x

Area(estndar)

Hglifosato

moles(glifosato) x M(glifosato)
%glifosato =
W(muestra)

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

(ppm)

La concentracin no interviene! Los errores volumtricos no influyen en el resultado

11

2.5659

2.8350
2.8104

2.9438
2.9197

3.0740
3.0499

3.3955

3.5003

Glifosato tcnico del

mercado local

HO2C CH2
NH
HO2C CH2
IDA

HO2C CH2
CH3

N CH2 PO3H2

H2O3P CH2

NMG
CH3

NH

H2O3P CH2
IMPA +
satlite 13C

NMG

CH2 PO3H2

CH3

MAMPA

satlite 13C

CH3
CH2 PO3H2

no ident.

H
MAMPA

H2NCH2 PO3H2

glicina
g

AMPA
NMG

satlite 13C

3.60

3.50

3.40

3.30

3.20

3.10
(ppm)

3.00

2.90

2.80

2.70

2.60

2.50

2.40

HO2C CH2

Otro glifosato local

N CH2 PO3H2
NMG

2.8483
2.8273
2.8232
2.8028

2.9293
2.9052

3.1156
3.0924
3.0669
3.0432

3.3064

3.3847

3.4990

3.7235

3.9015
3.8788

4.4015

CH3

2.5559

3.70

no ident.

HO2C CH 2
NH
HO2C CH 2

HO2C CH2
N

CH3
N

CH2 PO3H2

CH2 PO3H2

HO2C CH2

MAMPA

glicina

PMIDA
Satlite 13C +
IMPA

Satlite 13C

no ident.
PMIDA N-xido

4.5

4.4

4.3

4.2

4.1

H2NCH2 PO3H2
AMPA

PMIDA

4.0

3.9

3.8

3.7

3.6

3.5

3.4

3.3

3.2

3.1

3.0

2.9

2.8

2.7

2.6

2.5

(ppm)

12

En una muestra grado tcnico podemos adems cuantificar las impurezas (respecto
al acetato o al glifosato)
*** Current Data Parameters ***
Group Peak

Start (ppm/Hz)

End (ppm/Hz)

Area

Area %

3.83 1917.6

3.26 1630.4

2.1654E+005

100.00

1
2
3

3.76 1879.4

3.69 1845.0

2.0670E+003

0.95

3.83 1917.6

3.31 1655.3

2.1347E+005

98.58

qseq

3.39 1697.4

3.37 1684.0

5.3871E+002

0.25

INSTRUM :

AM-500

3.31 1655.3

3.26 1630.4

4.7055E+002

0.22

NS

1.80

900.3

1.45

724.7

1.1127E+005

100.00

O1

8177.00 Hz

1.80

900.3

1.45

724.7

1.1127E+005

100.00

O2

7700.00 Hz

SW

14.9213 ppm

TD

TE

NAME

: GLIFOSATO

LOTE 10-04

65536

1.6234

AQ_mod

2.9235
2.8993

3.7208

: U04-120703 A

*** Acquisition Parameters ***

3.3820

PROCNO

3.4968

303 K

CPULSE

:
10.500 usec
acetato
(3H)
SFREQ
: 500.1354210 MHz

glifosato (2H)

*** Processing Parameters ***

LB

SI

SR

6700.07 Hz

AQ_time

4.3908880 sec

NUCLEUS :

0.20 Hz
32768

SOLVENT : D2O (+piridina-d)

DDATE

2004/J l/26
2004/Jul/26

PMIDA (4H)

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

(ppm)

Si queremos integrales con error menor al 1,1% debemos adoptar un

criterio uniforme respecto a las seales satlite
Podemos incluir los satlites siempre o excluirlos siempre en la integracin de
las seales de un espectro
La superposicin con otras seales dificulta incluirlos
Lneas muy anchas en la base dificulta excluirlos

Una alternativa es eliminar el acoplamiento 1H-13C. Esto tiene varias ventajas

adicionales:
Desaparece el ensanchamiento de la base de las lneas al eliminar los
acoplamientos 1H-13C a 2 y 3 enlaces
Se elimina el error de integracin provocado por superposicin de seales
con satlites de seales vecinas
Se pueden identificar con mayor facilidad impurezas en concentraciones
menores al 1%

13

Sin desacople de 13C

Con desacople GARP-1

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

3.8

1.4

3.6

3.4

3.2

3.0

1.6411

2.9407
2.9164

3.5052

1.6315

2.9247
2.9006

3.4939

temperatura regulada a 303 K

2.8

2.6
(ppm)

(ppm)

2.4

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

2.9941

7.9684

8.9619

10.5103

12.4288

Tambin es posible usar RMN 31P

HO2C CH2 N CH2 PO3H2

H2
glifosato
HO2C CH2
N CH2 PO3H2
HO2C CH2
+ CH2 PO3H2
N
HO2C CH2
OHO2C CH2

H 2NCH 2 PO3H 2

fosfato

29

28

27

26

25

24

23

22

21

20

19

18

17

16

15

14
(ppm)

13

12

11

10

-1

14

Espectro RMN 31P (202 MHz) de metamidofos tcnico

solvente metanol, sin efecto Overhauser Nuclear, escala vertical x20,

P
NH2

H3CO

SCH3

- 18 . 00

- 10 . 78
- 10 . 90

1. 64
1.5 8
1 .44

1 2 .74
10 .96
1 0.8 5
10 .7 7
10 .72
10 .6 7
9 .7 7
9 .36
9.3 3

2 2.2 7
21 .9 3
2 0.2 7
20 .15
1 9 .46
1 9.4 2
1 9.3 5
1 9.2 5
19 .18

25 .7 3
2 5 .54

30 .9 3
3 0.4 5
30 .38
29 .1

3 2.3 5

3 7.3 4

39 .16

Podemos hacer una cuantificacin absoluta agregando un estndar interno:

O
O P O
3

P
NH2

H3CO

SCH3

AreaMTD

40

1.0 00

AreaTPPO

1.2 05

MolesMTD = MolesTPPO

35

30

25

20

15

10

-5

-10

-15

-20

ppm

15

1.9 30
1 .91 3

1 .25 1
1 .20 1

2.0 7 7

1 .02

ttulo 98,1%
(por CG 98,1%)

1 .0 2

2 .98 5

6.3 7 5

6 .70 7
6 .69 0

7 .41 1
7 .39 4
7.3 7 8
7.3 77
7 .36 1
7 .1 67
7 .14 2
7.0 4 0
7 .02 4

cuantificacin de deltametrina
estndar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

DMSO2

Br
O

Br

7.5

6.5

6.0

5.5

5.0

4.5

4.0

3.5

3.0

2.5

2.0

6.1 1

18 .53

1.0 2

7.0

CN

1 .0 0

3.0 9

1.0 3
2 .06

3. 07

1.5

1.0

0.5

ppm

cuantificacin de cipermetrina (mezcla de 4 diastermeros)

estndar de referencia: dimetilsulfona (CH3)2SO2

ttulo 93,1%

DMSO2

Group Peak

Start (ppm/Hz)

End (ppm/Hz)

6.46 3230.5

Area

Area %

6.09 3045.8 1.4219E+009

100.00
64.90

6.46 3230.5

6.20 3100.2 9.2275E+008

6.20 3100.2

6.09 3045.8 4.9830E

4.9830E+008
008

6.14 3070.7

6.09 3047.6 8.3154E+005

0.06

5.69 2844.5

5.57 2783.8 3.9989E+008

100.00

5.68 2842.2

5.66 2828.4 6.5241E+005

0.16

5.69 2844.5

5.57 2783.8 3.9819E+008

99.58

5.59 2793.4

5.57 2784.4 1.0422E+006

0.26

2.9817

U08-130301

5.6476
5.6313
5.6257
5.6094

6.1930
6.1787
6.1756
6.1613

Estndar de cipermetrina Lote 080125P1

35.05

3.22 1611.0

2.79 1393.0 1.3766E+010

100.00

3.22 1611.0

2.79 1393.0 1.3759E+010

99.95

2.92 1460.9

2.79 1396.6 6.8632E+006

0.05

Cl
O

Cl
H

O
CN

desacople GARP centrado a 100 ppm

regulacin de temperatura a 303 K
6.4

6.2

6.0

5.8

5.6

5.4

5.2

5.0

4.8

4.6
(ppm)

4.4

4.2

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

16

anlisis de excipientes en un producto farmacutico

Polietilenglicol (PEG 400) 1%
propilenglicol 0,4%
Alcohol polivinlico 2%
agua

H(O CH2CH2

)nOH

CH2OH

3,52-3,65
(

CH2OH
CH3

)n

CHCH2

1,030
1 030

1,30-2,10

OH

Verificacin
soluciones acuosas de cada excipiente conteniendo 1mg/ml de dimetilsulfona
Medicin
producto farmacutico conteniendo 1 mg/ml de dimetilsulfona

Llenado de ceros a 128K

ventana exponencial; LB: 0,30 Hz
Correccin de fase y de lnea de
base automtica con ajuste fino
manual
Referencia: 10% D2O
Integracin de seales manual,

Tabla de datos: 32K

Ancho espectral: 0 - 4,1 ppm
Tiempo de adquisicin: 7,99 seg
Tiempo de repeticin: 8,99 seg
Angulo de pulso: 30
Temperatura 297 K
Nmero de espectros acumulados (NS): 16
Equilibracin (DS): 2

DMSO2
H(O CH2CH2

Alcohol polivinlico
PHE 03904

1,87

U09-010403

Group Peak
1

End (ppm/Hz)

Area

CH2OH

3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00

3.67 1833.3

3.50 1751.1 5.2618E+010 100.00

3.09 1544.1

2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00

3.09 1544.1

2.96 1482.3 2.0914E+010 100.00

2.20 1099.6

1.19

596.7 1.4652E+011 100.00

2.20 1099.6

1.19

596.7 1.4652E+011 100.00

1.10

551.5

0.87

435.0 5.9783E+010 100.00

1.10

550.9

1.05

527.4 1.7317E+008

0.29

1.10

551.5

0.87

435.0 5.9319E+010

99.22

1.00

498.0

0.87

435.6 2.9107E+008

0.49

1
4

CH3

Area %

3.67 1833.3

)nOH

Start (ppm/Hz)

CH2OH
1.0375
1.0246

0,36
1.6024
1.5900
1.5452

0,90

PEG 400 (n = 8 o 9)

2.0018
1.9846

3.0382

3.3524
3.3388
3.3293
3.3157

3.6379
3.6293
3.6195
3.6009
3.5973
3.5453
3.5354
3.5268
3.4516
3.4435
3.4284
3.4203

3.8784

3.9342

%P/V
Propilenglicol

CHCH2

)n

OH

4.0

3.8

3.6

3.4

3.2

3.0

2.8

2.6

2.4
(ppm)

2.2

2.0

1.8

1.6

1.4

1.2

1.0

17

Algunas fuentes de error intrnsecas a mtodos cromatogrficos y RMN

cuantitativo
fuente de error

RMN

HPLC / GC

diferente factor de
respuesta entre sustancia
a cuantificar y estndar
d referencia
de
f
i

Para ncleos distintos de 1H,

medir espectros sin NOE
Medir T1 previamente y usar
tiempos de repeticin > 9T1

usar como estndar de ref. un patrn

de ttulo conocido de la sustancia a
cuantificar (no siempre disponible)

ttulo incorrecto o dudoso

del estndar de referencia

Cambiar por otro estndar (otro

proveedor u otra sustancia de
referencia), determinar ttulo
contra otro estndar diferente

Buscar otro proveedor del mismo

estndar (no siempre posible)

superposicin de pico de
sustancia a cuantificar
con una impureza
desconocida

Hacer el clculo con ms de una

seal de la muestra o con ms de
un ncleo presente en la muestra
Utilizar RMN 2D homo o
heteronuclear para confirmar
pureza de pico

Cambio de condiciones (columna,

solvente, temperaturas)
Acoplar a espectrometra de masa y
determinar el espectro en distintas
partes del mismo pico (no siempre
posible en HPLC)
Acoplar a RMN (solo para HPLC)

Detector contaminado,
sangrado de columnas,
picos fantasmas

--------No se aplica----------

Cambiar/acondicionar columna
limpiar detector, inyector, etc.

RMN cuantitativo (QNMR)

Ventajas

No requiere estndares del compuesto principal ni de las impurezas

No requiere separar el compuesto principal ni las impurezas

Puede identificar y cuantificar impurezas nuevas o inesperadas

En general no hay impurezas invisibles

Es simple, preciso y econmico

No es destructivo (la muestra una vez preparada puede reanalizarse)

No hay desgaste o deterioro de columnas, etc.

Desventajas

Se requieren espectrmetros de RMN de alto campo que son costosos (20 a 30 veces
el precio de un GC o HPLC)

La operacin de los espectrmetros requiere personal especialmente entrenado y

con buenos conocimientos de la teora del mtodo

El mantenimiento de los espectrmetros requiere insumos cuyo consumo es

permanente e independiente del uso (helio y nitrgeno lquidos)

18

Seleccin de bibliografa de RMN cuantitativo

U. Holzgrabe et al, J. Pharm. Biomed. Anal., 1998, 17, 557-616 (review)
G. F. Pauli, Phytochem. Anal., 2001, 12, 28-42 (review)
R. J. Wells et al, J. Agric. Food. Chem., 2002, 50, 3366-3374
T. S. Al-Deen et al, Anal. Chim. Acta, 2002, 474, 125-135
T. S. Al-Deen, et al, Accred. Qual. Assur., 2004, 9, 5563
R J
R.
J. Wells et al
al, Accred.
Accred Q
Qual.
al Ass
Assur.,
r 2004,
2004 9,
9 450456
450 456
G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2005, 68, 133-149 (review)
G. F. Pauli et al, J. Nat. Prod., 2007, 70, 589-595
NMR Spectroscopy in Pharmaceutical Analysis 2008, Elsevier

19