CURSO CULTIVO DE TEJIDOS VEGETALES

INFORMES DE LABORATORIO

JOHN JAIRO VIVEROS MUOZ

Dirigido a: Lic, Msc. ROOSEVELT ESCOBAR

UNIVERSIDAD NACIONAL DE COLOMBIA

FACULTAD DE CIENCIAS AGROPECUARIAS
PALMIRA
2012

PRACTICA N 1. RECONOCIMIENTO DEL LABORATORIO

DE CULTIVO DE TEJIDOS, NORMAS GENERALES DE
SEGURIDAD, PREPARACIN DE SOLUCIONES Y
MEDIOS DE CULTIVO
Objetivos:
1. Definir las normas de seguridad en el laboratorio
2. Conocer el laboratorio de CT de la U. Nacional de
Colombia, sede Palmira y sus reas funcionales
3. Reconocer los equipos bsicos fundamentales de un
laboratorio de CT.
4. Desarrollar habilidad para el manejo de las micro pipetas
5. Practicar la preparacin de soluciones y medios de
cultivo.
I.

Normas se seguridad en el laboratorio

Adems de las normas establecidas para el manejo de

laboratorio, existe un mtodo para trabajar en el laboratorio,
que reduce la probabilidad de que ocurran accidentes,
incluyendo la exposicin a productos txicos y de peligro
biolgico. Para ello se debe:

Practicar hbitos de prevencin

Usar siempre los equipos de proteccin personal
Usar la menor cantidad posible de compuestos que
permita llevar a cabo los objetivos propuestos
Siempre que sea posible, sustituir los compuestos
peligrosos por otros que no lo sean o lo sean menos y
Anticipar las posibles consecuencias del trabajo que se
est realizando en el laboratorio.

El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de

cultivo in vitro. En esencia, una autoclave es un recipiente en
el que se consigue exponer el material a esterilizar a
temperaturas superiores a la de ebullicin del agua, gracias a
aumentar la presin.
Funcionamiento:
El proceso completo de esterilizacin en una autoclave se
compone de diferentes fases:
1. Fase de purgado: A medida que la resistencia calienta el
agua del fondo del caldern, se va produciendo vapor que
desplaza el aire, hacindolo salir por la vlvula de
purgado que est abierta. Esta fase termina cuando se
alcanza la temperatura de esterilizacin.
2. Fase de esterilizacin: Una vez cerrada la vlvula de
purgado y alcanzada la temperatura de esterilizacin
previamente seleccionada se inicia el proceso de
esterilizacin.
3. Fase de descarga: Terminado el proceso de
esterilizacin, deja de funcionar la resistencia calefactora,
con lo que deja de producirse vapor y la presin y
temperatura del caldern empieza a bajar poco a poco.
b. Destilador :

Recordemos que prevenir es responsabilidad compartida y

que requiere de la colaboracin de todos los que se
encuentren en el laboratorio.
II.

Reconocimiento de equipo bsico

a. Autoclave:

El destilador de agua que se usa en el laboratorio purifica el

agua corriente, mediante procesos controlados de
vaporizacin y enfriamiento. Al aplicar energa trmica al agua
en fase lquida, luego de un proceso de calentamiento, se
convierte en vapor de agua. Esto permite separar las
molculas de agua, de las molculas de otras sustancias o
elementos que se encuentran mezclados o diluidos. El vapor
de agua se recolecta y se lleva a travs de un condensador,
donde el vapor se enfra y vuelve a la fase lquida. Entonces,
el condensado se recoge en un tanque de almacenamiento
diferente. El agua destilada presenta mejores caractersticas
de pureza comparada con el agua corriente; prcticamente se
encuentra libre desustancias que la contaminen.

m Potencimetro :
c.

La micropipeta es un instrumento de laboratorio empleado

para absorber y transferir pequeos volmenes de lquidos y
permitir su manejo en las distintas tcnicas cientficas. Los
volmenes captables por estos instrumentos varan segn el
modelo: los ms habituales, denominados p20, p200 y p1000,
admiten un mximo de 20, 200 y 1000 l, respectivamente.
Es de destacar que el uso de micropipetas permite emplear
distintos lquidos sin tener que lavar el aparato: para ello, se
emplean puntas desechables, de plstico, que habitualmente
son estriles. Existen varios tipos de puntas: por ejemplo, las
amarillas para pipetear volmenes pequeos (por ejemplo, 10
l), y las azules para pipetear volmenes grandes (por
ejemplo, 800 l).

d. Balanza de precisin:

Las balanzas de precisin son instrumentos de medicin que

permiten determinar la masa de un objeto con una precisin
de al menos 0,01 g. Las balanzas de precisin se clasifican
segn su resolucin en las siguientes categoras:

De precisin: divisin mnima 0,01 g. Capacidad de

pesada 10-20 kg.
Semi analtica: divisin mnima 0,001 g. Capacidad
de pesada 1-2 kg.
Analtica: divisin mnima 0,0001 g. Capacidad de
pesada 160-200 g.
Semi micro-analtica: divisin mnima 0,00001 g.
Capacidad de pesada 10-30 g.
Micro-analtica: divisin mnima 0,000001 g.
Capacidad de pesada 1-3 g.

e. Micropipetas :

f.

Plancha con agitador :

Una plancha con agitador magntico consiste de una

pequea barra magntica (llamada barra de agitacin) la cual
esta normalmente cubierta por una capa de plstico
(usualmente Tefln) y una placa debajo de la cual se tiene un
magneto rotatorio o una serie de electromagnetos dispuestos
en forma circular a fin de crear un campo magntico rotatorio.
Es muy frecuente que tal placa tenga un arreglo de
resistencias elctricas con la finalidad de dotarle de calor
necesario para calentar algunas soluciones qumicas.
g. Cmara de flujo laminar :

Una cmara de flujo laminar es un recinto que emplea un

ventilador para forzar el paso de aire a travs de un filtro
HEPA (High Efficiency Particulate Air) y proporcionar aire
limpio a la zona de trabajo libre de partculas de hasta 0.1
micras. Este tipo de equipos se fabrican en forma
generalmente prismtica con una nica cara libre (la frontal)
que da acceso al interior, donde se localiza la superficie de
trabajo, que normalmente permanece limpia y estril.
III.

toxico y un desionizador de agua. Adems, esta zona debe

tener un espacio para la autoclave, secadores u hornos.
3.

se realiza el trabajo de escisin, inoculacin y transferencia de

los explantes a los medios de cultivo. Dado que este trabajo
demanda de los ms altos niveles de limpieza ambiental, se
hace necesario la instalacin de cmaras de flujo horizontal o
vertical de aire, filtrado bajo presin. Las cmaras de flujo
laminar deben ubicarse de ser posible, en un lugar alejado de
las puertas y con un mnimo de corriente de aire, con el fin de
prolongar la vida til de los filtros.

Reconocimiento de las reas de un laboratorio de CT

y su diagrama de flujo (direccin)

Un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales debe ser

diseado para conseguir un flujo de materiales limpios entre
las diferentes reas que lo componen, es decir que la lnea de
flujo de limpieza, en lo posible no se vea interrumpido con
materiales contaminados o no esterilizados, segn muestra la
figura N 1.

4.

Z. cultivo

Z. de preparacin
medios

Z. Lavado

rea de incubacin o cuarto de crecimiento: los cultivos se

incuban en un cuarto apropiado o en gabinetes de crecimiento.
Este zona de incubacin o crecimiento in vitro debe
proporcionar un buen control de la temperatura (20-28C), de
la iluminacin (variable, segn las necesidades: 1000 a 1500
lux) y de la humedad relativa (70-80%). La regulacin de la
temperatura se puede lograr por medio de aparatos de aire
acondicionado. Es necesario tomar precauciones para evitar el
calentamiento excesivo, instalando alarmas y controles para
cortar la iluminacin cuando falle el aire acondicionado.

Fig. 1. Flujo de limpieza en un laboratorio de CT

Z. esterilizacin

rea de cultivo (transferencia): En esta zona del laboratorio

Sin embargo, el laboratorio de cultivos de tejidos vegetales de la

Universidad Nacional de Colombia, sede Palmira, no cumple
completamente con este diseo, es decir, que el flujo de materiales
limpios y contaminados se cruza entre el cuarto de crecimiento y el
rea de cultivo para poder depositar el material en el cuarto de
lavado y esterilizado; lo cual no lo hace ineficiente, sino que
demanda un manejo de material y de flujo un poco mas cuidadoso,
para minimizar los procesos de contaminacin cruzada de una
zona contaminada a una zona estril (Fig. n 2).

Cuarto
crecimiento

Esterilizacin

El laboratorio de CT debe disponer de reas destinadas a

funciones especficas, entre las principales tenemos:
1.

rea de preparacin: se utiliza principalmente para preparar

los medios de cultivo, debe proveer tambin un espacio para
almacenar los materiales de vidrio y plstico, y lo reactivos
qumicos. Este ambiente debe contar con mesas de trabajo
para la preparacin de los medios y para colocar balanzas, el
medidor de pH, las planchas calientes con agitacin, y otros
elementos; tambin debe incluir vitrinas, estanteras y espacio
para el equipo de refrigeracin.

2. rea de lavado y esterilizado: Puede estar constituido por

dos reas conectadas entre s, o por un solo ambiente, y
puede estar localizada dentro del rea general de preparacin.
Esta zona debe incluir por lo menos un lavadero grande con
agua caliente y fra y una fuente de agua de una buen grado de
pureza, preferiblemente agua doblemente destilada; para tal
efecto se debe usar un destilador de vidrio o de material no

IV.

Preparacin de un medio de cultivo

Formulacin del medio MS: MS (1962), 3% sacarosa, 1mg/L
tiamina, 100 mg/L m-inositol, pH 5.7-5.8, 0.2% Agar

1 

1
0.1
50

1  0.002  
Por lo tanto, necesito 2 mL de la solucin bsica n 1,
disueltos en la mitad del volumen final.

Solucin bsica 2:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:
C1 = 1000 X (concentracin stock)
V1 = ?
C2 = 1X (Concentracin medio basal MS)
V2 = 100 mL = 0.1 L
1000
1  1
0.1
1 

1
0.1
1000

1  0.0001 .  
a) Clculos soluciones bsicas para el medio basal MS
(1962)

Por lo tanto, necesito 0.1 mL de la solucin bsica n 2,

disueltos en la mitad del volumen final.

Para la obtencin de las cantidades correctas a emplear en la

preparacin del medio basal, utilizaremos la siguiente formula
que relaciona la concentracin y volumen iniciales para
obtener ya sea la concentracin o volumen final de la solucin
que necesitamos preparar.

Solucin bsica 3:

1 1 
2  2

Solucin bsica 1:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:
C1 = 50 X (concentracin stock)
V1 = ?
C2 = 1X (Concentracin medio basal MS)
V2 = 100 mL = 0.1 L
50
1  1
0.1

A partir de la formula establecida remplazamos los datos que

conocemos:
C1 = 1000 X (concentracin stock)
V1 = ?
C2 = 1X (Concentracin medio basal MS)
V2 = 100 mL = 0.1 L
1000
1  1
0.1
1 

1
0.1
1000

1  0.0001 .  
Por lo tanto, necesito 0.1 mL de la solucin bsica n 3,
disueltos en la mitad del volumen final.


Solucin bsica 4:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:

C1 = 100 ppm (stock) = 100 mg/L

V1 = ?
C2 = 1 mg/L (trabajo) =
V2 = 100 mL = 0.1 L
100/ 1  1/ 0.1

C1 = 344.8 X (concentracin stock)

V1 = ?
C2 = 1X (Concentracin medio basal MS)
V2 = 100 mL = 0.1 L

1 

1/ 0.1
100/

1  0.001  
344.8
1  1
0.1
1
0.1
1 
344.8

Por lo tanto, necesito 1 mL de tiamina, disueltos en la mitad

del volumen final.

Inositol:

1  0.00029 .  
Por lo tanto, necesito 0.29 mL de la solucin bsica n 4,
disueltos en la mitad del volumen final.

C1 = 8000 ppm (stock) = 8000 mg/L

V1 = ?
C2 = 100 mg/L (trabajo)
V2 = 100 mL = 0.1 L

Solucin bsica 5:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:
C1 = 200 X (concentracin stock)
V1 = ?
C2 = 1X (Concentracin medio basal MS)
V2 = 100 mL = 0.1 L
200
1  1
0.1
1 

A partir de la formula establecida remplazamos los datos que

conocemos:

1
0.1
200

1  0.0005 .  
Por lo tanto, necesito 0.5 mL de la solucin bsica n 5,
disueltos en la mitad del volumen final.
b) Clculos para la preparacin de las vitaminas

Tiamina:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:

8000/ 1  100/ 0.1

1 

100/ 0.1
8000/

1  0.00125 .  
Por lo tanto, necesito 1.25 mL de m-inositol, disueltos en la
mitad del volumen final.
c) Clculos para la preparacin de los reguladores de
crecimiento

Citoquinina BAP:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:
C1 = 100 ppm (stock) = 100 mg/L
V1 = ?
C2 = 3 mg/L (trabajo)
V2 = 100 mL = 0.1 L

100/ 1  3/ 0.1

1 

3/ 0.1
100/

1  0.003  
Por lo tanto, necesito 3 mL de BAP, disueltos en la mitad del
volumen final.

Por lo tanto, necesito 0.05 mL de GA3, disueltos en la mitad

del volumen final.
d) Fuente de Carbono y gelificante

Sacarosa 3%
100   !" #$%$&' 3%   )*

Auxina ANA:

Por lo tanto, necesito adicionar 3 gr de sacarosa, disueltos en

la mitad del volumen final.

A partir de la formula establecida remplazamos los datos que

conocemos:

Gel Rite 0.2%

C1 = 100 ppm (stock) = 100 mg/L

V1 = ?
C2 = 0.05mg/L (trabajo)
V2 = 100 mL = 0.1 L
100/ 1  0.05/ 0.1
1 

0.05/ 0.1
100/

1  0.00005 .  
Por lo tanto, necesito 0.05 mL de ANA, disueltos en la mitad
del volumen final.

Gigerelina GA3:
A partir de la formula establecida remplazamos los datos que
conocemos:
C1 = 100 ppm (stock) = 100 mg/L
V1 = ?
C2 = 0.05mg/L (trabajo)
V2 = 100 mL = 0.1 L
100/ 1  0.05/ 0.1
1 

0.05/ 0.1
100/

1  0.00005 .  

100   !" #$%$&' 0.2%  .  )*

Por lo tanto, necesito adicionar 0.2 gr de Gel Rite, disueltos
en la mitad del volumen final.
e) Preparacin del medio basal MS (1962)
Se determino que la cantidad de medio a preparar por
persona era de 100 ml (volumen final). Se procedi a medir
100 ml de agua destilada en una probeta, los cuales se
dividieron en dos partes iguales, a una de ellas se le quito la
cantidad de volumen que corresponda al volumen de las
soluciones basales y suplementos (2, 0.1, 0.1, 0.29, 0.5, 1,
1.25, 3, 0.05 y 0.05 mL), es decir se quito 8.34 mL de agua
destilada al medio que tendra reguladores de crecimiento y
5.24 mL de agua destilada al medio sin reguladores de
crecimiento; lo anterior con el propsito de no alterar el
volumen final y por ende las concentraciones finales en el
medio basal; paso seguido, se dispuso de esta cantidad de
agua en un beaker y se llevo a plancha de calentamiento y
agitacin, mientras se agitaba se le agrego las soluciones
bsicas, los suplementos correspondientes y la sacarosa
(3%). A continuacin, cuando la mezcla se homogeniz, se
corrigi el pH a 5.7 con una solucin de KOH 0.5 M (aprox. 60
L de KOH). La otra mitad de agua se dispuso en un beaker
y se llevo a calentamiento (120C) y agitacin (100 rpm), y se
procedi a agregar el gelificante, se mantuvo en agitacin y
calor hasta que se torno una mezcla homognea y sin
grumos. Posteriormente, se mezclaron las dos soluciones
elaboradas y se procedi a dispensar en recipientes limpios
(aprox. 25 ml/recipiente) los cuales se taparon con papel
aluminio, para su posterior proceso de esterilizado (121C y
104 KPa / 20 min.)

PRACTICA N 2. CULTIVO DE VIOLETAS O

BEGONIAS MEDIANTE SISTEMAS
ORGANOGNICOS (MORFOGNESIS)
Objetivos:

III.

Condiciones:
o Fotoperiodo = 16/8
o Temperatura = 28C

Fig. 3. Diagrama corte para obtencin explante de hoja

1. Practicar las tcnicas de desinfeccin y aislamiento

de explantes de hoja
2. Reconocer formacin de estructuras en vas
organognicas/morfognicas
I.

Diagrama de flujo

IV.

Resultados y anlisis

Este experimento se llevo a cabo durante 11 semanas,

en las cuales se hizo el seguimiento y registro de datos
semanalmente (desde el 8 de septiembre hasta el 16 de
noviembre). Este experimento se estableci de la
siguiente manera: se evalu los dos tipos de medio (con
o sin reguladores de crecimiento), dos recipientes por
tipo de medio y se sembraron al menos cuatro explantes
(axial y abaxial, distal y proximal) por recipiente (Fig.4).
Se repiti el experimento tres veces.

II.

Medios a comparar
1. MS (1962) completo: 3% sacarosa, 1 mg/L
tiamina, 100mg/L inositol, 3 mg/L BAP, 0.05
mg/L GA3, 0.05 mg/L ANA, pH 5.7-5.8, 0.25%
Gel Rite.
2. MS (1962) completo: 3% sacarosa, 1 mg/L
tiamina, 100mg/L inositol, pH 5.7-5.8, 0.25% Gel
Rite.

Durante este experimento se presento una

contaminacin variable, mostrando una alta
contaminacin en el primer experimento que fue
disminuyendo con las dos subsecuentes repeticiones.
Estos resultados se relacionan directamente con el
proceso de desinfeccin del explante y la manipulacin
de este, debido a que en el inicio de esta experiencia no
contaba con la prctica, exactitud y precisin necesaria
(Fig. 5a). As mismo, al parecer la contaminacin
tambin pudo estar mediada por el tipo de explante,
debido a que la hoja de violeta cuenta con tricomas, que
hace ms difcil el proceso de desinfeccin de su
superficie.

Fig 4. Cultivo de explantes de hoja de violeta

En cuanto al tipo de posicin (axial o abaxial) y de corte

(proximal y distal) del explante, hasta la fecha no se ha
presentado ningn tipo de respuesta que permita
diferenciar el efecto de estos sobre el desarrollo del
explante, sin embargo cabe resaltar que los recipientes
que an se mantienen en el cuarto de crecimiento no
han presentado contaminacin. As mismo, no se ha
evidenciado procesos de oxidacin.

V.
En trminos de medio basal, se present diferencia
entre el medio con reguladores y el medio desprovisto
de estos; aproximadamente a la cuarta semana de
iniciado el cultivo se presento respuesta en un recipiente
donde los explantes se haban sembrado en medio con
reguladores (Fig. 6), estos explantes viables y
competentes presentaron la formacin de un callo
organognico, que posteriormente al cabo de 10
semanas presento la iniciacin de brotes.

Fig. 5a. Explante de hoja de

violeta contaminado

Fig. 5b. Explantes

violeta viables

Conclusiones

La propagacin por hojas en violeta, no permiti una

limpieza profunda de su superficie, principalmente
mediado por la cantidad de tricomas presentes en
ella.

La contaminacin de los explantes se presento por

no respetar los tiempos de desinfeccin

Propagar violeta por medio de hojas no permite la

limpieza de enfermedades y su desinfeccin
requiere de un proceso adecuado, donde se evale
tiempos y concentraciones de las sustancias
empleadas para desinfectar.

La adicin de cido ctrico (100mg/L) ayudo a

controlar la oxidacin fenlica

El empleo de reguladores de crecimiento

efectivamente indujo la va de organognesis
indirecta en los explantes de hoja de violeta.

El medio MS, si no es manipulado correctamente, es

un medio propicio para la proliferacin de hongos y
bacterias.

Fig. 6. Callo organognico en

violeta

de

Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., Mroginski, L y Levitus, G. 2010. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II. Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa, ARGENBIO.
Edicin: Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria.

PRACTICA N 3. RESCATE DE EMBRIONES

Fig. 7. Semilla y embrin de yuca

Objetivos:
1. Practicar las tcnicas de desinfeccin y aislamiento
de embriones cigticos
2. Practicar las tcnicas de desinfeccin para obtener
embriones de fuentes maduras e inmaduras
I.

Diagrama de flujo: semilla madura de yuca

Segn instructivo estandarizado en el laboratorio de la

Universidad Nacional de Colombia, Sede Palmira para
aislar embriones inmaduros de papaya (Castelar, 2001)
Fig. 8. Procedimiento para romper la semilla de yuca

II.

Fig. 8

Fig. 7

Medio de cultivo 17N (Roca, 1984)

1/3 MS (1962), 25 mg/L Plantex (10:52:10), 3%

sacarosa, 100 mg/L m-inositol, 1 mg/L tiamina, 0.01mg/L
ANA, 0.01 mg/L GA3, 0.2 % Gel Rite.

Diagrama de flujo: semilla

papaya

inmadura de

Fig. 10. Embrin de la

semilla de papaya.

Fig. 9. Semillas inmaduras de

papaya

Fuente: Gil A.I and Miranda D. 2005. Agron. Colomb. Vol. 23. No.2.
http://www.sci.unal.edu.co/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S012099652005000200004&lng=es&nrm=iso

Medio de cultivo

MS (1962), 3% sacarosa, 100 mg/L m-inositol, 50mg/L

casena hidrolizada, 1 mg/L tiamina, 0.05 mg/L BAP,
0.25 mg/L AG3, pH 5.8, 0.2% Gel Rite.

III.

En esta prctica se logro controlar satisfactoriamente los

procesos de desinfeccin y manipulacin de los
explantes, lo cual se reflej en bajos ndices de
contaminacin, por lo menos 1 recipiente contaminado
de 4. Es de resaltar, que el explante sembrado, es decir
el embrin, se encuentra protegido de la mayora de los
agentes ambientales contaminantes, y que el protocolo
de desinfeccin externo evaluado fue adecuado.
Sin embargo, a pesar de que el explante no sufri
contaminacin, este no presento una respuesta
adecuada en el medio, de 8 embriones sembrados para
yuca y 8 para papaya, la conversin de estos a plntula
fue baja (4/8 para papaya y 1/8 para yuca)(fig. 12); al
parecer esta respuesta no esta influenciada por el Medio
de cultivo, sino por la manipulacin del embrin, que
pudo sufrir daos a momento de extraerlos y pasarlos al
medio, debido a que estos eran muy pequeos y
demandaba un manejo preciso.
Fig. 12. Embriones de papaya (a, b y c) y yuca (d) que
presentaron respuesta.

Resultados y anlisis

Esta practica se desarrollo durante 7 semanas, en las

cuales se hizo el seguimiento y registro de datos
semanalmente (desde el 5 de Octubre hasta el 16 de
noviembre). Este experimento se estableci de la
siguiente manera: se evalu el medio 17N para
establecimiento de embriones de yuca y el medio MS
para establecimiento de embriones de papaya (con
reguladores de crecimiento), dos recipientes por tipo de
medio y se sembraron al menos cuatro explantes
(embriones) por recipiente (Fig.11a y b). Se repiti el
experimento dos veces.

a)

c)

b)

d)

Fig. 11. Cultivo in vitro de embriones maduros e

inmaduros
a)

Yuca

b) papaya

Del mismo modo, se obtuvo que los explantes de

papaya presentaron la mayor tasa de conversin de
embriones inmaduros a plntulas (50%), esta respuesta
puede estar mediada por la proporcin de citoquinina
(BAP) y giberelina (GA3) que el medio contena, los que
regularon una respuesta efectiva, favoreciendo la
formacin de brotes y su elongacin.

Por el contrario, hasta la fecha no se present una

respuesta positiva en los embriones de yuca, slo un
explante respondi (formacin de brotes) al medio de
cultivo, el resto se perdieron por contaminacin y los que
restan parecen estar viables pero en latencia (color
blancos y no oxidados).
En cuanto al fotoperiodo, los resultados obtenidos hasta
ahora no permiten determinar si existe un efecto o
respuesta mediada por este. Sin embargo, es de esperar
que la combinacin de oscuridad, seguido de un
fotoperiodo 12/12, inicie la proliferacin y diferenciacin
celular en los embriones de yuca, pero este fenmeno
slo es observable cuando las condiciones del explante
son las adecuadas, lo que refuerza la idea de que los
embriones sufrieron daos mecnicos al momento de su
extraccin y subsiguiente siembra en el medio.

IV.

o La semilla botnica de yuca es un medio de

propagacin poco empleado y explotado para
obtener material vegetal
o Las semillas botnicas, son una fuente efectiva de
explantes sanos y libres de patgenos y
enfermedades.
o No se pudo determinar si el medio 17N era
adecuado para la germinacin y propagacin de
semillas maduras de yuca.
o El cultivo in vitro de embriones obtenidos de semilla
botnica, es una herramienta disponible para
obtener material vegetal sano y en tiempos
relativamente cortos

Conclusiones

o La semilla inmadura de papaya est constituida por

tres partes principales: la cubierta seminal, el
endospermo y el embrin.
o El medio basal MS fue efectivo para la obtencin
y elongacin de brotes en embriones inmaduros de
papaya.
o La combinacin de BAP y GA3, en el medios MS
resulto efectivo para la propagacin de papaya a
partir de embriones inmaduros
o Los embriones obtenidos de semilla botnica
maduras e inmaduras, son tejidos altamente
complejos que requieren una adecuada
manipulacin, para su extraccin y siembra en
medio basal.
o La siembra de embriones sexuales, es una de varias
vas para realizar la propagacin clonal in vitro,
aunque persiste un margen de variacin somaclonal
a evaluar.
Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., Mroginski, L y Levitus, G. 2010. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II. Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa, ARGENBIO.
Edicin: Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria.

PRACTICA N 4. DESINFECCIN Y AISLAMIENTO

DE YEMAS A PARTIR DE LAS CORONAS DE PIA

Fig. 14. Extraccin yemas laterales

Objetivos:
1. Reconocimiento de yemas de corona en pia
2. Practicar tcnicas de desinfeccin y aislamiento de
yemas de corona en pia
I.

Diagrama de flujo
III.
Fig. 13

Esta practica se desarrollo durante 6 semanas, en las

cuales se hizo el seguimiento y registro de datos
semanalmente (desde el 12 de Octubre hasta el 16 de
noviembre). Este experimento se estableci de la
siguiente manera: se evalu el medio 4E para
establecimiento de yemas apicales y laterales de pia,
se sembraron al menos cuatro explantes (yemas) por
recipiente (dos recipientes). Se repiti el experimento
dos veces.

Fig. 14

II.

Resultados y anlisis

Medio de cultivo (4E)

MS, 3% sacarosa, FitaGel 0.18%, pH 5.7, Treinta das,

fotoperiodo 16/8, T= 30C

Fig. 13. Extraccin hojas de la corona

Se evidencio la presencia de hongos y bacterias en la

fase de introduccin (principalmente en el primer
experimento), fue motivo de contaminacin al manejar
los explantes dentro de cmara y debido en otras
causas a la habilidad que tiene una persona para evitar
contaminacin externa, lo que influye en la eventual
presencia de patgenos en el tejido, sin embargo en la
repeticin del experimento fueron bajos los ndices de
contaminacin. Cabe resaltar que las yemas apicales
estn ms cubiertas que las yemas laterales por lo que
no garantiza una desinfeccin ptima de patgenos.
Fig. 15. Brotes de yema apical de pia

De los aproximadamente 16 explantes que fueron

sembrados en los dos experimentos, 4 de ellos
presentaron contaminacin por hongos (25 %). As
mismo, de los 12 explantes que fueron competentes,
slo 3 de ellos presentaron respuesta e iniciaron a
formar los primordios foliares (25%), el resto de los
explantes hasta el momento de la ltima toma de datos
no presentaban respuesta, pero tampoco contaminacin
(fig. 16). De los tres explantes que fueron capaces de
formar brotes, dos de ellos eran explantes de yemas
apicales (fig. 15) y slo uno era yema lateral.
Fig. 16. Cultivo in vitro de explantes (yemas laterales) de pia.

IV.

Conclusiones

El cultivo in vitro de yemas apicales y laterales, es
una tcnica que permite mejorar sustancialmente el
proceso de multiplicacin de pia

El material proveniente del campo o plazas de
mercado debe desinfectarse en condiciones de
invernadero antes de introducirlo a condiciones
aspticas.

El explante que mejor respondi a las condiciones
de desinfeccin, del medio y del ambiente fueron las
yemas apicales

El medio 4E, fue efectivo en la obtencin de
plntulas de pia in vitro, pero slo cuando el
explante provena de yemas apicales.

No fue posible evaluar la respuesta de los explantes
de yemas laterales al medio 4E

El color verde de los primordios de hojas de los
explantes se observ con mayor frecuencia en los
explantes que se tomaron de yemas apicales

Del mismo modo, en la presente investigacin, fue

mayor la contaminacin en yemas laterales que en
yemas apicales.
El medio de cultivo 4E, al parecer fue efectivo en la
induccin de brotes a partir de la yemas, que se
evidencio en mayor proporcin en las de origen apical
que las yemas laterales, por lo cual se presume que
existe una dominancia apical en este tipo de cultivo.
Para el desarrollo de los procesos de morfognesis in
vitro de pia es necesario lograr un balance adecuado
de los reguladores de crecimiento y por lo general se
consigue con las combinaciones ms simples, adems
de otras diferencias como es el empleo de una alta
concentracin de sacarosa que constituye un estmulo
adicional para la formacin de races y crecimiento de la
planta (Zamora y Jurez, 2008*)

*Zamora, A y Jurez, D. 2008. Micropropagacin en pia (Ananas comosus (L.) Merr.) CULTIVAR MD-2. Managua, Nicaragua. Universidad Nacional Agraria
Echenique, V., Rubinstein, C., Hopp, E., Mroginski, L y Levitus, G. 2010. Biotecnologa y Mejoramiento Vegetal II. Consejo Argentino para la Informacin y el Desarrollo de la Biotecnologa,
ARGENBIO. Edicin: Instituto Nacional de Tecnologa Agropecuaria.

PRACTICA N 5. EXTRACCIN DE MERISTEMOS DE

PAPA
Objetivos:
1. Reconocer el meristemo de papa
2. Practicar la tcnica de aislamiento y desinfeccin,
hasta la siembra del meristemo

I.

Antes de realizar el proceso de desinfeccin de los

meristemos, se coloc una papa en un recipiente con
agua, con el objetivo de estimular el surgimiento de
brotes (Fig. 17), este proceso tomo alrededor de dos
semanas. Posteriormente se llevo este material al
laboratorio.
Fig. 17. Brotes para la obtencin de meristemos en papa

Diagrama de flujo

Millyard, Khaty. 2008

II.

Medio de cultivo (4E)

MS, 3% sacarosa, FitaGel 0.18%, pH 5.7, Treinta das,

fotoperiodo 16/8, T= 30C

III.

Resultados y anlisis

Esta practica se desarrollo durante 8 semanas, en las

cuales se hizo el seguimiento y registro de datos
semanalmente (desde el 28 de septiembre hasta el 16
de noviembre). Este experimento se estableci de la
siguiente manera: se evalu el medio 4E para
establecimiento de meristemos de papa, se sembraron
al menos tres explantes (meristemos) por recipiente (dos
recipientes). Se repiti el experimento dos veces.

El establecimiento del primer experimento que se realizo

de esta prctica, resulto un poco ms arduo que las
anteriores, debido a que los meristemos fueron un
explante difcil de manipular y de obtener, sin embargo
se pudo conseguir un mnimo de 6 explantes, los cuales
se sembraron en el medio 4E y se le hizo el seguimiento
respectivo. Al cabo de 3 semanas no se present
ninguna respuesta en el tejido, aunque es de resaltar
que tampoco se presento contaminacin, al trmino de
la tercera semana los explantes parecan estar vivos
pues conservaban el color verde-morado que tenan al
principio; despus de la cuarta semana los explantes de
papa se tornaron de color caf y posteriormente se
ennegrecieron y murieron.
Este resultado al parecer puede ser explicado de dos
formas, la primera es que el proceso de obtencin y
desinfeccin del explante ocasiono un dao al tejido,
llevando a que este sufriera el fenmeno de oxidacin,
que impidi que los explantes fueran competentes; la
segunda explicacin se basa en reportes en papa que
han demostrado que el medio MS basal sin reguladores
no induce desarrollo de brotes; Novak y otros en 1980,
reportaron que el desarrollo de brotes a partir de
meristemos aislados fue pobre en medio basal sin
reguladores de crecimiento, y finalmente los explantes
murieron.

Con la repeticin del experimento se obtuvo diferentes

resultados, aunque la extraccin de los meristemos an
fue de cuidado y ardua, se pudo sembrar al menos ocho
explantes.
De los 8 explantes sembrados, tres de ellos presentaron
respuesta, a las cuatro semanas de ser cultivados en el
medio 4E los explantes de papa comenzaron a
presentar crecimiento (Fig. 18), lo que refuerza la idea
de que en el primer experimento la falta de respuesta
por parte de los explante fue por causa de su
manipulacin.
Fig. 18. Formacin de brotes a partir de meristemos de papa.

IV.

Conclusiones

Son muchos los factores que interactan para

contribuir al crecimiento exitoso de los meristemos.
Las diferencias de variedad y las condiciones de
cultivo pueden opacar el efecto de la composicin
del medio de cultivo.

Un medio satisfactorio para el cultivo de una
variedad de papa puede ser inadecuado para otra.

Los explantes de papa (meristemos) respondieron
bien al proceso de desinfeccin, aunque falta
determinar los tiempos y concentraciones efectivas
de las soluciones empleadas, para que el material
no sufra dao.

La obtencin de meristemos a partir de brotes de
papa, es una tcnica que requiere de prctica y
precisin, para ocasionar el menor dao al tejido.

En el medio de cultivo 4E no se pudo obtener
resultados que permitieran evaluar la efectividad del
explante usado, como mtodo para la propagacin
de material vegetal de papa.

Pulido, A. 2012

La falta de reguladores de crecimiento en el medio

empleado, pudo determinar una respuesta en los
explantes sembrados, debido a que la combinacin de
citoquinas, auxinas y giberelinas aumentan la
probabilidad de obtener brotes nuevos (Novak et al,
1980) en papa a travs de cultivo de meristemos.
Sin embargo, la falta de experticia en la tcnica de
cultivo de explantes de este tipo, no permiti que se
pudiera obtener datos claros para realizar un anlisis
satisfactorio del medio y del tipo de tejido que se utiliz.

NOVAK, F., ZADINA, J., HORACKOVA, V y MASKOVA, I. 1980. The effect of growth regulators on meristem tip development and in vitro multiplication of Solanum tuberosum L. plants. En: Potato Res.
Vol. 23, p. 155-166