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NMR-Spektroskopie

8.10. 10.10.2012

NMR-Spektroskopie

NMR = Nuclear Magnetic Resonance spectroscopy oder


Kernspinresonanzspektroskopie
Kernspins im Magnetfeld
Spektroskopie: Absorption von Lichtquanten, deren
Frequenz (umgekehrte Wellenlnge) der Energiedifferenz
zwischen zwei Zustnden entsprechen
E = h
(h = Plancksches Wirkungsquantum, h = 6,63 10-34 Js )

Prinzip der NMR-Spektroskopie

Die meisten Atomkerne haben


einen
intrinsischen Drehimpuls I (Kernspin).

Die Gre des Kernspins kann nur


bestimmte Werte halb- oder ganzzahlige
Werte haben. Dies ist durch die
Spinquantenzahl I charakterisiert
(I = 0, 1/2, 1, 3/2, 2).

Die Spinquantenzahl ist charakteristisch


fr ein Isotop.

Der Spin (bewegte Ladung) ist bei


Atomkernen mit einem magnetischen
Moment verknpft.

| I | I ( I 1)

Die Magnetquantenzahl mZ
Quantenmechanik:
Ein Spin der Spinquantenzahl I kann im Magnetfeld (2I+1) stabile
Orientierungen einnehmen (stationre Zustnde) die durch die
Magnetquantenzahl mZ charakterisiert sind: mZ= -I, -I+1,-I+2I

I = 1/2

mZ
+ 1/2

= 54,7
- 1/2

I=1

mZ
+1

-1

= 45

Spin-1/2-Kerne

Kerne der Spinquantenzahl I= , sind


besonders gut geeignet fr die NMRSpektroskopie
Beispiele: 1H, 13C, 15N und 31P
Diese Kernspins knnen im ueren
Magnetfeld 2 Zustnde einnehmen,
die als (parallel zum ueren
Magnetfeld) und (antiparallel zum
ueren Magnetfeld) bezeichnet
werden.
Quantenmechanik: Die exakte
rumliche Ausrichtung eines
Kernspins kann nicht ermittelt werden
(Heisenberg)

Prinzip der NMR-Spektroskopie

B
E = hB0/2

Im Magnetfeld haben die Zustnde und unterschiedliche Energien

Die Energiedifferenz E zwischen zwei Zustnden ist proportional zum


Magnetfeld am Kernort

Auerdem hngt die Energiedifferenz von der Art des Kerns ab.

Das gyromagnetische Verhltnis gibt an, wie gro die


Energiedifferenz zwischen den beiden Eigenzustnden des Kernspins
in einem gegebenen Magnetfeld ist.

Ausgewhlte Isotope und ihre Kernspins


Isotop

Kernspin

Hufigkeit [%]

[107 rad T-1s-1]

1H

1/2

99.985

26.7519

2H

0.015

4.1066

10B

19.6

2.8746

11B

3/2

80.4

8.5843

13C

1/2

1.11

6.73

14N

99.6

7.2

15N

1/2

0.37

-2.71

17O

5/2

0.04

-3.63

19F

1/2

100

25.18

27Al

5/2

100

6.976

31P

1/2

100

10.8

73Ge

9/2

7.8

-0.9357

79Br

3/2

50.7

6.702

NB: 12C und 16O, die hufigsten Isotope dieser Elemente,


haben einen Kernspin I = 0 und geben damit kein NMR-Signal

NMR-Spektroskopie

Besetzungsunterschied zwischen und : BoltzmannVerteilung:

B0
E
exp
exp

N
kT
kT

Bei 300K und einem Feld von 18,8 T (800 MHz


Protonenfrequenz): N = 0,99987N
Auf 10000 Spins im -Zustand kommen 10001,3
Spins im -Zustand
NMR-Spektroskopie ist eine relativ unempfindliche
Methode!

NMR-Spektroskopie

Spektroskopie: Durch Einstrahlung von Lichtquanten


geeigneter Energie lsst sich ein System vom energiearmen
in den energiereichen Zustand berfhren.
Dabei werden Lichtquanten absorbiert.
Aus der Wellenlnge des absorbierten Lichtes kann auf die
Energiedifferenz zwischen den Zustnden geschlossen
werden ( Erkenntnisgewinn!):
E = h = h B0/2
= B0/2
Die Frequenz hngt vom ueren Magnetfeld ab (rfWellenbereich, bei 9,4 T ist die Resonanzfrequenz fr
Protonen 400 MHz, die hchste Frequenz ist 1GHz)
Welche Erkenntnis wollen wir denn aus dem NMR-Spektrum
gewinnen?

Chemische Verschiebung

E1

E2

2
1

E3

Im Molekl sind Atomkerne von


Elektronenhllen umgeben, die
das uere Magnetfeld
teilweise abschirmen. Diese
Abschirmung hngt von der
chemischen Umgebung ab.
Das Magnetfeld am Kernort
gibt Auskunft ber die
chemische Umgebung eines
Atomkerns.
chemische Verschiebung

Unterschiedliche
Resonanzfrequenzen fr
unterschiedliche Kerne

Die chemische Verschiebung ist


proportional zum angelegten Magnetfeld
4.7 T

9.4 T

Die chemische Verschiebung wird in ppm


angegeben

Referenzierung:

Die chemische Verschiebung einer Referenzsubstanz wird


willkrlich auf 0 ppm gesetzt (fr Protonen und 13C
Tetramethylsilan, TMS, fr 15N flssiges NH3)

ref
[ ppm] 10
ref
6

Damit ist unabhngig vom Magnetfeld

Puls-FT-NMR-Spektroskopie

Das Vektormodell (vereinfacht)

z-Magnetisierung als
Summe der einzelnen
magnetischen Momente
Im Gleichgewichtszustand
ist die makroskopische
Magnetisierung parallel
zum angelegten
Magnetfeld
n
n

exp(E / kT ) exp( hB0 / 2 kT )

Boltzmann Verteilung: bei 14.1 T: n/n 510-5

Vektormodell: magnetisches Moment

n
n

exp(E / kT ) exp( hB0 / 2 kT )

Boltzmann Verteilung: bei 14.1 T: n/n 510-5

Przession im Magnetfeld


M B0

dL
M r F
dt


dI

M
I B0 I B0 sin e
dt

Das magnetische Moment eines Kernspins fhrt zu einem Drehmoment M


(nderung des Drehimpulses mit der Zeit) senkrecht zum Drehimpuls I des
Kernspins.
Der Drehimpuls ndert seine Richtung, aber nicht seinen Betrag
Kreisbewegung (Przession) um die Richtung des angelegten Magnetfeldes
Przession mit der Larmorfrequenz des Kernspins

Wie kann der Magnetisierungsvektor von der


Richtung des ueren Magnetfeldes weggedreht
werden?

Indem man das Magnetfeld


kurzzeitig ausschaltet und
ein Magnetfeld senkrecht
dazu anlegt, um das der
Magnetisierungsvektor dann
przediert.

Der Rotationswinkel ist dann


proportional zur Zeit, die das Magnetfeld
angelegt wurde, und zur Strke des
Magnetfeldes.

Exkurs: Oszillierendes Magnetfeld

Ein oszillierendes Magnetfeld kann als Summe zweier in


entgegengesetzter Richtung rotierender Magnetfelder betrachtet
werden.

Rotierendes Koordinatensystem

Wenn ein Radiofrequenzfeld, das mit der Larmor-Frequenz eines


Kernspins oszilliert, sprt dieser rotierende Kernspin ein
konstantes Magnetfeld, das senkrecht zum ueren Magnetfeld
ist.

Kreisbewegung (freie Przession um die zAchse)


Die Kernspinmagnetisierung przediert im rotierenden
Koordinatensystem mit der Kreisfrequenz um die
Richtung des ueren Magnetfeldes.

M x M x cos t M y sin t
t
M y
M y cos t M x sin t

L 0 [rad / s ]
Mit der Larmorfrequenz L und der Rotationsfrequenz
des Koordinatensystems 0

Rf-Pulse

Durch das Einstrahlen kurzer,


intensiver Radiofrequenzpulse
der Intensitt B1 nahe der
Larmorfrequenz lsst sich der
makroskopische
Magnetisierungsvektor um die
Einstrahlrichtung rotieren.
Vorteil: RF-Pulse lassen sich
mit jeder beliebigen Phase und
fr definierte Zeiten einstrahlen
Das uere Magnetfeld muss
dazu nicht abgeschaltet
werden.

Wirkung von Radiofrequenzpulsen

Durch Einstrahlen von rf-Feldern mit


definierter Frequenz und Phase kann man
den Magnetisierungsvektor nach Belieben
manipulieren (Spin-Choreographie)

Transversale Magnetisierung

- und -Zustand sind nun


gleichbesetzt. Dafr zeigen
Kernspins nun Phasenkohrenz
(bevorzugte Ausrichtung in der
xy-Ebene)
Die transversale Magnetisierung
przediert (rotiert) in der xyEbene, und zwar jede
Komponente mit ihrer
Larmorfrequenz .
Rotierende
Magnetisierungsvektoren
induzieren einen Wechselstrom
in einer rf-Spule und kann somit
detektiert werden.

Fazit
Transversale Magnetisierung przediert mit der
Larmorfrequenz der Kernspins
Der Magnetisierungsvektor kann mit Hilfe von rf-Pulsen
von der Richtung des ueren Magnetfeldes weg rotiert
werden.
Wird der rf-Puls im rotierenden Koordinatensystem in
Richtung des Magnetisierungsvektors eingestrahlt, so
hat das rf-Feld keinen Einfluss (spin lock).

Free Induction Decay FID


Przedierende Magnetisierung erzeugt in einer rf-Spule
ein zeitabhngiges Signal, das freier Induktionszerfall
oder FID genannt wird.
Dieses Signal entspricht einer gedmpften Schwingung
mit mehreren Frequenzkomponenten (Akkord, der auf
dem Klavier angeschlagen oder auf der Gitarre gezupft
wird, Paukenschlag, Erdbebensto).
Das Signal klingt ab, weil
Die Spins mitunter aus dem Takt geraten (transversale
Relaxation)
Der Gleichgewichtszustand (berschu an -Spins ohne
Phasenkohrenz) wieder erreicht wird (longitudinale Relaxation)

Analyse der Frequenzkomponenten (FourierTransformation) ergibt das Spektrum.

NMR-Spektroskopie

E1

E2

2
1

E3

3
Unterschiedliche Resonanzfrequenzen
fr unterschiedliche Kerne

Fourier-Transformations-NMR /
rf-Pulse
z

rf-Puls

S() s(t) exp(it2)dt

+
1
+

Fourier-Transformation

Der freie Induktionszerfall (free


induction decay, FID) kann dargestellt
werden als die Summe aus
frequenzabhngigen Komponenten,
und deren einhllender Funktion

s (t ) f k (t ) exp(i 2 k t )
k

Die Oszillationsfrequenz k bestimmt


die Lage des k-ten Signals, die
Einhllende fk(t) die Linienform
Die Fourier-Transformation ist
umkehrbar

Jean-Baptiste Fourier, 1768-1830

Fourier-Transformation

Fourier-Paare
k = 50 Hz

k = 250 Hz

k = 1000 Hz

FT

Fourier-Paare: konstante Amplitude

s (t ) exp(i 2 t )

S ( ) ()
k = 100 Hz

k = 1000 Hz

Fourier-Paare: Exponenzieller Abfall


f (t ) exp( t )
= 1000 Hz

= 100 Hz

Fk ( )

2
2 2

Fourier-Paare: Exponenzieller Abfall


s (t ) exp(t ) exp(i 2 t )

S ( )

2
2
2

Fourier-Paare: Rechtecksfunktion
sin(2 )
1, if 0 t
Fk ( )
f (t )
2
0, if t
= 1 ms

= 2 ms

Fourier-Paare: Rechtecksfunktion
exp(i 2 t ), if 0 t
s (t )
0, if t
= 5 ms

sin(2 ( ) )
S ( )
2 ( )

Fazit FT-NMR
Je lnger der FID, umso schmaler das Signal
Die Oszillationsfrequenz bestimmt die Lage des
Signals
Die Linienform hngt von der Form des FID ab
Die Form des FID hngt unter anderem von der
Lebensdauer des Kernspinzustandes ab.

FT-NMR- wozu?

Groe Zeitersparnis: Statt alle Wellenlngen


einzeln durchzufahren (Dauer: Minuten) wird
mit einem einzigen kurzen Puls das gesamte
Spektrum angeregt (Dauer: wenige Sekunden)
Vor allem die NMR-Spektroskopie von Kernen
mit geringem gyromagnetischem Verhltnis und
geringer natrlicher Hufigkeit wird dadurch
ermglicht (13C NMR-Spektroskopie in
natrlicher Hufigkeit).
Wir erinnern uns: Das Signal-zu-RauschVerhltnis S/N ist proportional zum Quadrat der
Anzahl der aufgenommenen scans (das heit,
wenn wir in zwei Minuten 100 scans statt eines
scans aufnehmen knnen, steigern wir die
Empfindlichkeit um den Faktor 10)

Richard R.
Ernst,
Nobelpreis
1991

Das gepulste NMR-Experiment

Frage: Wie lange dauert es, bis wir den nchsten FID aufnehmen knnen?

Relaxation
Zwei Arten der Kernspinrelaxation:
T1: longitudinale Relaxation (Spin-Gitter-Relaxation)
beschreibt die Zeit, bis die Magnetisierung wieder den
Glechgewichtszustad erreicht hat (und der
Magnetisierungsvektor entlang der z-Richtung
ausgerichtet ist).
T2: transversale Relaxation (Spin-Spin-Relaxation)
beschreibt die Zeitkonstante, mit der der die spins
irreversibel (?!?) dephasieren (die Spins haben ihre
Phaseninformation verloren, unter Umstnden ist der
Gleichgewichtszustand aber noch nicht wieder erreicht).

Homogene Linienverbreiterung: kurze


Lebensdauer des Spinzustandes
exp(-at)

a=100Hz

a=1kHz

1/(1+(2/a)2

Inhomogene Linenverbreiterung:
Jeder Kernspin hat eine etwas andere
Larmorfrequenz

Rekapitulation: Przession
z

rf-Puls

z
y

2
+

+
Unterschiedliche Larmorfrequenzen unterschiedliche Przessionsfrequenzen

Inhomogene Linenverbreiterung:
Jeder Kernspin hat eine etwas andere
Larmorfrequenz

Inhomogene Linienverbreiterungen lassen sich


refokussieren homogene nicht
y
x

Inhomogen!

Homogen!

Spinecho

Homogene/Inhomogene Linienbreiten Lochbrennen


rf

Einstrahlung einer rf-Frequenz


sttigt alle bergnge dieser
Frequenz

Inhomogene Linienverbreiterung:
Lochbrennen

Homogene Linienverbreiterung:
Das gesamte Signal wird gesttigt

Fazit
Transversale Relaxation fhrt zu homogener
Linienverbreiterung
Wenn die Phaseninformation verloren ist, kann sie nicht
mehr zurckgewonnen werden.
Inhomogene Linienverbreiterungen knnen durch einen
180-Puls refokussiert werden (Spinecho).

NMR von Proteinen

Sekundre chemische Verschiebungen


Kernsorten in Proteinen
Labelling
Multidimensionale NMR-Spektroskopie:Prinzip
COSY, NOESY, Transfer, TOCSY

NH (Amidprotonen)

H,N-HSQC von
KanamycinKinase
(Protein mit 264
Aminosuren).
Jedes Signal
entspricht der
Amidgruppe einer
Aminosure.
(aufgenommen bei
21.1T, oder 900
MHz
Protonenfrequenz)
Dr. Matthias Stoldt

2D-NMR-Spektroskopie

2D-NMR
Prparation: Die Magnetisierung wird angeregt (in die
xy-Ebene gebracht)
Evolution: Die Magnetisierung przediert in der xyEbene, jede Komponente enthlt am Ende der
Evolution eine Phase, die proportional zur
Evolutionszeit und der Larmorfrequenz ist.
Mischen: Durch geeignete Radiofrequenzpulse kann
Magnetisierung zwischen verschiedenen Kernspins
bertragen werden. Dazu knnen J-Kopplungen oder
die rumliche Nachbarschaft ausgenutzt werden. Der
Transfer ist homo-oder heteronuklear mglich.
Detektion: Der FID wird aufgenommen.

2D-NMR-Spektroskopie

Dieser Vorgang wird


wiederholt, und mit linear
zunehmenden t1Evolutionszeiten
durchgefhrt.

2D-NMR-Spektroskopie

Fourier-Transformation in t2 ergibt eine Serie von Spektren. Jedes


Signal ist entlang t1 amplitudenmoduliert.
Projektion auf t1 ergibt

2D-NMR-Spektroskopie
ein Signal, das in t1
ebenfalls mit einer
charakteristischen
Frequenz oszilliert.
Dieses Signal lsst sich
selbstverstndlich auch in
t1 fourier-transformieren.

2D-Spektrum
Darstellung als
Hhenlinien

Informationsgehalt von 2D-Spektren

Wenn whrend des Mischens


Magnetisierung von einer
Spinart auf die andere
bertragen wurde, erscheint im
Spektrum ein
Kreuzkorrelationssignal
(Crosspeak), das in beiden
Dimensionen unterschiedliche
Frequenzen hat.
Die beiden Kernspins, die diese
Larmorfrequenzen haben,
stehen also in irgendeiner
Beziehung zueinander.
Z.B. J-Kopplung, aber auch
rumliche Nhe (je nach Art
der Mischsequenz)

2D NMR-Spektren
Es gibt ein groes Arsenal an verschiedenen 2DNMR-Experimenten, die sich in der Art der
Prparation und der Art des
Magnetisierungstransfers unterscheiden.

2D NMR-Spektren
Homonuklear: Der Magnetisierungstransfer erfolgt
zwischen Kernspins der gleichen Sorte (meist
Protonen)
Heteronuklear: Der Magnetisierungstransfer erfolgt
zwischen verschiedenen Kernspins (1H/13C oder
1H/15N)
Verschiedene Transfermechanismen fr die
Mischsequenz:
Durch Bindungen (Information ber die chemische Struktur)
Durch den Raum (Information ber die rumliche Struktur in
Proteinen)

Homonukleare 2D-NMR-Experimente
COSY (COrrelation SpectroscopY): Nutzt J-Kopplungen
aus, Kreuzkorrelationssignale zwischen Protonenspins,
die ber 3 Bindungen miteinander verbunden sind.
TOCSY (TOtal Correlation SpectroscopY):
Magnetisierungstransfer zwischen allen Kernspins, die
ber J-Kopplungen miteinander verbunden sind
NOESY (Nuclear Overhauser Effect SpectroscopY):
Transfer durch den Raum ber dipolare Kopplungen
(Abstandsinformation)

J-Kopplungen homonuklear: COSY

Frage: Welche Spinsysteme


liegen in diesem
Substanzgemisch vor?

TOCSY: TOtal Correlation SpectroscopY


Alle miteinander gekoppelten Protonen ergeben
Kreuzkorrelationssignale
Jede Aminosure gibt einen miteinander korrelierten
Signalsatz

TOCSY

Frage: Welche Spinsysteme


liegen in diesem
Substanzgemisch vor?
Und: Welches Spektrum sagt
mehr ber die Molekle aus:
das COSY oder das
TOCSY?

Einfachstes 2D-Spektrum: H,H COSY


(COrrelation SpectroscopY)
Zwischen Kernspins, die miteinander koppeln, gibt
es Kreuzkorrelationssignale.

1H

von 1-13C-Glucose

J(H,C) = 179 Hz J(H,C) = 167 Hz

H1

H1

Dr. Rudolf Hartmann

H,H-COSY von 1-13C-Glucose

2xH6
H6

H3 H3

H5
H4

H1
H1

H4

H5

H2

H1
H2
H1

Dr. Rudolf Hartmann

TOCSY von Valin

Abstandsinformation
J-Kopplungen geben Auskunft ber chemische
Struktur und sind daher fr die chemische Analyse
organischer Molekle sehr wertvoll
Die chemische Struktur von Proteinen sollte
allerdings bekannt sein, bevor es mit NMRSpektroskopie untersucht wird.
Wie bekommt man Abstandsinformation?
Wir erinnern uns: Atomkerne sind kleine
Magnetnadeln, die als solche auch ein Magnetfeld
um sich herum aufbauen.
Frage: Was spren Nachbarkernspins von diesem
Magnetfeld?

Dipolare Kopplungen

B0

Dipolare Kopplungen

B0

Fazit Dipolkopplungen
Das Magnetfeld, das ein Kernspin von seinem Nachbarn
sprt, hngt von drei Dingen ab
Dem Kernspinzustand des Nachbarn (mZ)
der Entfernung r der beiden Spins
der relativen Orientierung des Abstandsvektors zum ueren
Magnetfeld (charakterisiert durch den Winkel , zwischen r
und dem ueren Magnetfeld)

D mZ

B0

rAB

1 2
rAB

3cos 2 1

Wie macht sich die Dipolkopplung im NMRSpektrum bemerkbar?

In Flssig-NMR-Spektren: zunchst gar nicht.


Wir erinnern uns: NMR-Spektroskopie ist eine langsame
Methode und misst oft nur zeitliche Mittelwerte
Der Mittelwert der dipolaren Kopplung ber alle Orientierungen
ist 0
Fr Molekle mit einem Molekulargewicht < 30 kDa in wssriger
Lsung sind dipolare Kopplungen durch die schnelle
Reorientierung ausgemittelt (keine Aufspaltung)
Bei greren Proteinen: Linienverbreiterung (deshalb auch
Grenlimitierung), wenn die Ausmittelung zu langsam erfolgt.
Festkrper-NMR-Spektroskopie: Wenn die Molekle statisch im
Magnetfeld liegen, sind Dipolkopplungen sichtbar!

Kreuzrelaxation, NOE
2
2
2

c
3
W1I I S6

r
20
1 I2 c2

Normale Relaxation in den


Grundzustand (keine Crosspeaks)

c
1 I2 S2 2

W0
2 2
6
10
r
1 I S c
Nullquantenkreuzrelaxation
(groe Molekle )

Dipolar gekoppelte
(rumlich benachbarte)
Kernspins knnen durch den
Raum Magnetisierung
miteinander austauschen

c
3 I2 S2 2

W2
2 2
6
5
r
1 I S c
Doppelquantenkreuzrelaxation
(kleine Molekle )

2D NOESY-Spektroskopie

Kreuzrelaxation whrend der longitudinalen Mischzeit


fhrt zu Crosspeaks im 2D-Spektrum
Treten Crosspeaks auf, so wissen wir, dass diese
Kernspins rumlich benachbart sind
(Abstandsinformation).

Abstnde zwischen Protonen


NOE ~ rAB-6

rAB
Kreuzsignale:
- zuordnen
- kalibrieren
- quantifizieren
Ausschnitt aus einem 2D NOESY; zeigt
Kreuzsignale zwischen Amidprotonen
und aliphatischen Protonen

2D-NOESY- schematisch

Welches Proton ist zu wem


rumlich benachbart?
Abstnde sind wertvolle
Strukturinformationen.
Kennt man gengend
Abstnde, lsst sich daraus
die gesamte Moleklstruktur
rekonstruieren

Fazit 2D-NMR
Zweidimensionale NMR-Spektroskopie bietet ein Arsenal
an Mglichkeiten, Informationen ber Konnektivitten (JKopplungen) oder rumliche Nhe (Kopplungen durch
den Raum) in einem Molekl zu bekommen.
Die Methoden lassen sich noch erweitern:
Heteronuklearer Transfer (von H auf N oder C)
Dreidimensionale NMR-Spektroskopie: Das Spektrum ist ein Wrfel,
in dem jeder Punkt im Raum eine gewisse Signalintensitt hat.

Protein-Flssig-NMR-Spektroskopie

nicht auf Proteine beschrnkt:


-

Nukleinsuren (RNA, DNA)


Polysaccharide
Membransysteme
Moleklkomplexe
ganze Zellen (in cell NMR)

Aufbau Puls-FT-NMR-Spektrometer
-> in Jlich whrend Praktikum

Was verstehen wir unter 3D Proteinstruktur?


Warum experimentelle Bestimmung der Proteinstruktur?
Wie funktioniert das mit Flssig-NMR-Spektroskopie?
Ligandenbindung und NMR-Spektroskopie

Was verstehen wir unter 3D


Proteinstruktur?

Kartesische
(Raum)Koordinaten aller
Atome zusammen mit der
Kenntnis der kovalenten
(chemischen) Struktur
oder
Torsionswinkel zusammen
mit der Kenntnis der
kovalenten Struktur
Eigentlich Konformation!
Verschiedene Betrachtungsebenen:
- Primrstruktur (Aminosuresequenz, kovalente (chemische) Struktur
- Sekundrstruktur (Konformation des Proteinrckgrates
- Tertirstruktur (gesamte Struktur, Faltung)
- Quartrstruktur (Oligomere, Komplexe, supramolekulare Strukturen)

Warum experimentelle Bestimmung der


Proteinstruktur?

Proteinstruktur bestimmt
Funktion des Proteins

(Enzyme, Ionenkanle,
Rezeptoren, Strukturproteine,
Regulationsproteine etc.;
Proteinfehlfaltungen ->
Krankheiten)
Vertieftes Verstndnis nur
mit/durch die 3D Struktur

Wie funktioniert das mit Flssig-NMRSpektroskopie?


Prparation der Protein-NMR-Probe
Aufnahme der NMR-Spektren
Sequenzspezifische Resonanzzuordnung
(Proteinrckgrat)
Resonanzzuordnung der Seitenketten
Sammeln von Struktureinschrnkungen (NOEZuordnung, 3J, sekundre chem. Versch.)
Strukturrechnung
Strukturvalidierung und -interpretation

Protein-NMR-Probe
Konzentration: ca. 1 mM
Reinheit > 95%
ab ca. 50 Aminosurereste -> Isotopenanreicherung mit
13C und 15N: warum?
monodisperse Probe (keine Aggregation, keine
verschiedenen Zustnde)
langzeitstabil

Protein-NMR-Probe

Transformation

Protein-NMR-Probe

Protein-NMR-Probe

Zellaufschlu
Proteinreinigung (chromatographische Methoden)
Konzentrierung der Proteinprobe (Ultrafiltration)
Vorcharakterisierung der Probe (Reinheit: SDS-PAGE,
lichtspektroskopische Methoden, Lichtstreuung usw.)

13C/15N-Isotopenanreicherung:

spezielle, knstliche
Wachstumsmedien fr Bakterienkulturen ->
Minimalmedium, z.B. M9 (Kohlenstoffquelle z.B. 13CGlukose, Stickstoffquelle 15N-Ammoniumsalze)

Protein-NMR-Probe
Alternative Expressionssysteme:
- Hefe- oder Insektenzellkulturen (posttranslationale
Modifikationen eukaryotischer Proteine) -> sehr teuer
- Zellfreie Expression (Zellextrakte mit allen wichtigen
Komponenten)

Aufnahme NMR-Spektren
1D Protonenspektrum (Lieblingskern: hchste Empfindlichkeit)
P
methyl
aliphatic
H

backbone HN

aromatic
side-chain HN

Ausweg: 2D Protonen-Spektren
2D 1H-1H-TOCSY (28 Aminosurereste-Peptid, Zink-Finger)

Ausweg: 2D Protonen-Spektren
2D 1H-1H-COSY (128-aa Protein, Lysozym)

Ausweg: 2D Protonen-Spektren
2D 1H-1H-NOESY (85 aa, HPr)

Ausweg: Heteronukleare NMR


Ausweg: Hherdimensionale NMR

(15N) [ppm]

Ausweg: Heteronukleare NMR


1H-15N-Korrelations-Spektrum (HSQC)

(1H) [ppm]

(15N) [ppm]

Ausweg: Heteronukleare NMR


1H-15N-Korrelations-Spektrum (HSQC)

=1/(4*1JHN)
4=1/1JHN=1/90-95Hz=10-11 ms
(1H) [ppm]

Ausweg: Heteronukleare NMR


Ausweg: Hherdimensionale NMR
-> 3D Zuordnungsexperimente

Ausweg: Hherdimensionale NMR


-> 3D Zuordnungsexperimente

3D Zuordnungsexperimente

13C

15N
1H

3D HNCACB

3D Zuordnungsexperimente
C(i)

C(i-1)

C(i)
C(i-1)
3D HNCACB

3D Zuordnungsexperimente

3D Zuordnungsexperimente
2D (1H-15N)-HSQC zugeordnet!

3D Zuordnungsexperimente

Struktureinschrnkende Parameter
(experimentell aus NMR-Spektren!!)

Torsionswinkel-Einschrnkungen aus 3JKopplungskonstanten


Torsionswinkel-Einschrnkungen () aus chemischen
Verschiebungen des Rckgrates
Definition von Wasserstoffbrckenbindungen aus 1H/2HAustauschexperimenten (H/D-Austausch) oder aus hJKopplungskonstanten
1H-1H-Abstnde aus NOE-Korrelationen

Struktureinschrnkende Parameter
Torsionswinkel-Einschrnkungen aus 3J-Kopplungskonstanten -> Karplus-Beziehung
Beispiel: Torsionswinkel des Proteinrckgrates aus3JHN-H

J ( ) A cos 2 ( 60) B cos( 60) C

Struktureinschrnkende Parameter
Torsionswinkel-Einschrnkungen aus 3J-Kopplungskonstanten -> Karplus-Beziehung

Struktureinschrnkende Parameter

Torsionswinkel-Einschrnkungen () aus chemischen


Verschiebungen des Rckgrates: C, C, C, H u.a.
-> sekundre chemische Verschiebung (chemischer-Verschiebungs-Index, CSI)

Struktureinschrnkende Parameter

Definition von Wasserstoffbrckenbindungen aus 1H/2H-Austauschexperimenten (H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten

Struktureinschrnkende Parameter

Definition von Wasserstoffbrckenbindungen aus 1H/2H-Austauschexperimenten (H/D-Austausch) oder aus hJ-Kopplungskonstanten


2hJ

HN-C=0,5

Hz

Struktureinschrnkende Parameter

1H-1H-Abstnde

aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)


c
3 I2 S2 2

W
6
20
1 I2 c2
r
I
1

Normale Relaxation in den


Grundzustand (keine Crosspeaks)

c
1 I2 S2 2

W0
2 2
r6
10
1 I S c

Kern (nuclear)-OverhauserEffekt (enhancement)


Dipolar gekoppelte (rumlich
benachbarte) Kernspins knnen
durch den Raum Magnetisierung
miteinander austauschen

Nullquantenkreuzrelaxation
(groe Molekle )

c
3 I2 S2 2

W2
2
5
r6
1 I S c2
Doppelquantenkreuzrelaxation
(kleine Molekle )

Struktureinschrnkende Parameter

1H-1H-Abstnde

aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)

rAB < 5
Kreuzsignale:
- zuordnen
- kalibrieren
- quantifizieren

Struktureinschrnkende Parameter

1H-1H-Abstnde

aus NOE-Korrelationen (Kreuzrelaxation)

3D (1H-1H-15N)-NOESY-HSQC

INOE ~ r-6
1H

[ppm]

2D (1H-15N)-HSQC

Struktureinschrnkende Parameter
NOEs und Sekundrstruktur-Elemente: -Helix

Struktureinschrnkende Parameter
NOEs und Sekundrstruktur-Elemente: -Helix

Struktureinschrnkende Parameter
NOEs und Sekundrstruktur-Elemente: -Faltblatt parallel

Struktureinschrnkende Parameter
NOEs und Sekundrstruktur-Elemente: -Faltblatt antiparallel

Struktureinschrnkende Parameter
Sekundrstruktur-Elemente zusammen gefat

Strukturberechnung
Mglichst alle gemessenen NOEs zuordnen
1H

[ppm]

HNOE

HN

Strukturberechnung
1H

[ppm]

HN V275

Strukturberechnung
1H

[ppm]

HG1 V275
HG2 V275
HB V275

HA V275

Strukturberechnung
1H

[ppm]
HG1 V275
HG2 V275

A294
HB A294

P292
F295

HB V275
HBs F274
HA P292

HA V275

HA F274
HA F295
HD F274
HN A294
HN F295
HN V276

F274
V276

HN F274

HN V275

Strukturberechnung
Mglichst alle gemessenen NOEs zuordnen

Strukturberechnung
Die potenzielle Energie einer Modell-Struktur: Moleklmechanik / Kraftfeld

Strukturberechnung
Die potenzielle Energie einer Modell-Struktur: Moleklmechanik / Kraftfeld

Strukturberechnung
Die potenzielle Energie einer Modell-Struktur
plus zustzliches Potential (Energie) fr NOEAbstandseinschrnkungen

Strukturberechnung
Molekulardynamik-Simulation
Kinetische Energie folgt einem Temperaturprotokoll
Lsen der Newtonschen Bewegungsgleichungen fr alle
Atome i im Potentialfeld U
P
Koordinaten des Protein-Modells ndern sich mit t
Ziel: Minimierung der potenziellen Energie

Strukturberechnung
Molekulardynamik-Simulation

Movie!

Strukturberechnung
Strukturschar
cAMP-freie CNBD
Konformerenschar (15 Strukturen)
r.m.s. Abweichung zur mittleren Struktur:
Proteinrckgrat 0.037 nm
aller Schweratome 0.070 nm

Strukturberechnung
Validierung
- Anzahl und Strke von Verletzungen (Nichteinhalten) der
experimentellen Einscrnkungen
- Ramachandran-Plot (erlaubte -Bereiche)
- Allgemeine Geometrie der Struktur, van-der-WaalsZusammenste
- Machen lokale Interaktionen Sinn? (polare WW -> HBrckenbind., Salzbrcken; unplolare WW ->
hydrophober Kern)
- Beantwortet die Struktur biologische Fragen?
P

Bindungsstudien mit NMR


k on

.
koff gro

koff klein

P L P' L

k off

.
. ..

Bindungsstudien mit NMR

15N

chemische Verschiebung [ppm]

NMR-Titrationsexperiment von CNBD mit cAMP

CNBD
cAMP-frei
CNBD
+ 250 M cAMP

1H

chemische Verschiebung [ppm]

Bindungsstudien mit NMR


-> starker Binder (hohe Affinitt): zwei komplette Strukturen lsen!
cAMP-freie CNBD

cAMP-gebundene CNBD

Bindungsstudien mit NMR


-> schwchere Binder (geringere Affinitt): Mapping des Bindeepitops sehr
schnell mglich!

Titrationsexperimente mit 15N-Protein und unmarkiertem Ligand


(natrliche Isotopenhufigkeit)

NMR-Struktur
(GABAA-Rezeptor
assoziierte Protein
GABARAP)

InteraktionsPartner (Trp)

Interaktionsanalyse

Zeitskalen

Alle
Zustandsnderungen,
die langsamer als die
spektrale Zeitskala
sind, fhren dazu,
dass im Spektrum
zwei getrennte
Signale beobachtet
werden.

Alle Zustandsnderungen,
die schneller als die
spektrale Zeitskala sind,
fhren dazu, dass im
Spektrum ein Mittelwert
beobachtet wird (z.B.
Entkopplung, dipolare
Kopplungen, Austausch
von Protonen)

From M.H. Levitt, Spin Dynamics

Wechselwirkungen
Zeeman-Wechselwirkung HZ: Wechselwirkung mit dem
ueren Magnetfeld
Chemische Verschiebung HCS: Modulation des ueren
Magnetfeldes durch die Elektronenhlle
Magnetfelder benachbarter Kernspins, die im Magnetfeld
unterschiedliche stationre Zustnde einnehmen
knnen:
Durch den Raum (Dipolkopplungen) HD
ber Bindungen vermittelt (indirekte, oder JKopplungen) HJ

NMR Wechselwirkungen sind


orientierungsabhngig

rk

B0

NMR Wechselwirkungen
hngen von der Orientierung
im Magnetfeld ab

Sie werden durch einen


orientierungsabhngigen
Tensor reprsentiert

I A B0
A11

A A12
A
13

A21
A22
A23

A31

A32
A33

Beispiel chemische Verschiebung

CS

B B0

BxCS xx
CS
By yx
BzCS zx

xy xz 0 xz B0

yy yz 0 yz B0
zy zz B0 zz B0

Tensoren

Tensoren reprsentieren Vektortransformationen (Drehungen, Streckungen)


Tensoren beschreiben die Wechselwirkungen zweier vektorieller Gren in
Abhngigkeit der Orientierung
Die Spur eines Tensors (A11+ A22+ A33) ist orientierungsunabhngig
Fr drei Orientierungen beschreibt der Tensor eine Streckung ohne
Drehung.
z
In diesem Fall liegt der Tensor in Diagonalenform vor

Axx

A 0
0

0
Ayy
0

0
Azz

Axx, Ayy und Azz sind die drei Tensorhauptwerte


Ein Tensor wird durch drei Tensorhauptwerte sowie
drei Winkel, die ihn im Raum orientieren, vollstndig
charakterisiert.

Tensoren

Jeder Tensor ist durch drei Hauptwerte Axx, Ayy und Azz sowie drei Winkel,
die ihn relativ zum Bezugskoordinatensystem orientieren, charakterisiert.

Alternativ zu den drei Werten Axx, Ayy und Azz lassen sich auch drei andere
charakterisitsche Gren angeben, die die Form des Tensors anschaulicher
wieder geben und folgendermaen von den drei Tensorhauptwerten
abhngen:

Der isotrope Wert Aiso= 1/3(Axx+Ayy+Azz)

Azz

Konvention |Azz-Aiso| |Axx-Aiso| |Ayy-Aiso|

Die Anisotropie A = Azz - Aiso

Die Asymmetrie = (Ayy - Axx)/A

Axx

Ayy

Chemische Verschiebungs-Anisotropie
Die chemische Verschiebung hngt von der Orientierung des Molekls im
Magnetfeld ab (CSA = Chemical Shift Anisotropy)

obs

1 3
iso (3cos 2 k 1) kk
3 k 1

Pulverspektrum (Summe ber alle


Orientierungen)
CSA Tensor ist ein Ma fr die
Elektronenverteilung

Chemische Verschiebungs-Anisotropie
xx yy

yy

>0
zz

xx

xx yy
0

zz

yy

zz

yy

0.5
xx

zz
xx

xx

zz
yy

zz

yy

0.5

xx

1
zz

Dipolare Kopplungen

B0

Dipolare Kopplungen

B0

Dipolare Kopplungen

H ~
D

1 2
r

(1 3cos )
2

Dipolare Kopplungen
B0

H ~
D

r
1 2
r3

(1 3cos 2 )

Pulverspektrum
eines isolierten
Spinpaares

Reduktion der Linienbreiten (I): Orientierte Proben


Alle Molekle werden gleich
ausgerichtet (Einkristall,
Lipiddoppelschicht, auf
Glasplatten aufgetragen)
Chemische Verschiebung
und Dipolkopplung geben
Aufschluss auf Orientierung
des Tensors (und damit auch
des Molekls)

Linienverschmlerung(I): Orientierung

Einkristall in verschiedenen Orientierungen (31P-Spektrum)


Naito, A.; Sastry, D. L.; McDowell, C. A. Chem. Phys. Lett. 1985, 115, 19.

Orientierte Proben
PISEMA : 2D Correlationspekrum (dipolare NH-Kopplung) (Abstand bekannt)
mit 15N Verschiebung korelliert (CSA tensor bekannt)
Orientierungen aller AMidgruppen.

15N

CP

Homonuclear
Decoupling

DEC
15N

CP

t1

t2

M. Bak, J.T. Rasmussen, N.Nielsen, J. Magn.


Reson. 2000, 147, 296-330.

NH Dipolar Coupling

1H

Powder Spectrum

Chemical Shift

Orientierte Lipiddoppelschichten

Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.

PISEMA Spektren Orienter Helices


=0

60

NH dipolar coupling (kHz)

Circular patterns
(PISA Wheels)
depend on the tilt
angle of the helix
axis

30

250

90

150
50
250
15N Chemical Shift (ppm)

Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.

150

50

PISA Wheels of Membrane Proteins


Residue-type labeling of amino
acids facilitates sequential
assignments
full

Ile

simulated

Ala

Opella, S.J., Marassi F.M.., Chem. Rev. 2004, 104, 3587-3606.

Val

Leu

Reduktion der Linienbreiten: Magic Angle


Spinning
obs

1 3
iso (3cos 2 k 1) kk
3 k 1

54.7

Imitation der Brownschen


Molekularbewegung durch
schnelle Rotation um den
magischen Winkel

arccos

1
54.7
3

HD ~

1 2
r3

(1 3cos 2 )

Magic-Angle Spinning (MAS)

>: isotropes Signal (wie in Lsung)

Inhomogene Linienbreiten (z.B. CSA):


Rotationsseitenbanden im Abstand
nrot von der isotropen chemischen
Verschiebung

Homogene Verbreiterungen (Netzwerk


dipolar gekoppelter Kerne):
Keine vollstndige Elimination der
Linienverbreiterungen;
Spindiffusionseffekte

Rotationsseitenbanden: Warum?
z

rf-Puls

z
y

2
+

+
Unterschiedliche Resonanzfrequenzen unterschiedliche Przessionsfrequenzen

Anisotrope Verschiebungen-Der statische


Fall

Verschiedene Orientierungen

y
x

MAS

y
x

Rotationsechos

2 kHz

4 kHz

Rotationsechos und Rotationsseitenbanden

rot

rot

FT

rot

Rotationsechos und die zugehrigen


Seitenbanden
2 kHz

4 kHz

Rotationsechos (Glycin, simuliert)

Magic Angle Spinning Zwischenbilanz

Magic-Angle-Spinning eliminiert anisotrope Linienverbreiterungen

Ist die Rotationsfrequenz kleiner als die Anisotropie, so treten


Rotationsseitenbanden im Abstand nrot auf.

Dies gilt exakt nur fr inhomogene Linienverbreiterungen


(Chemische Verschiebungsanisotropie, Dipolkopplungen zwischen
isolierten Spinpaaren).

Homogene Linienverbreiterungen (homonukleare Dipolkopplungen


in einem Netzwerk stark gekoppelter Spins) lassen sich durch
Magic-Angle-Spinning nicht vollstndig eliminieren.

Inhomogene Linienverbreiterung

jedes Molekl hat eine definierte Resonanzfrequenz

Homogene Linienverbreiterung: kurze


Lebensdauer des Spinzustandes
exp(-at)

a=100Hz

a=1kHz

1/(1+(2/a)2

Inhomogene Linienverbreiterungen lassen sich


refokussieren homogene nicht
y
x

Inhomogen!

Homogen!

Homogene/Inhomogene Linienbreiten Lochbrennen


rf

Einstrahlung einer rf-Frequenz


sttigt alle bergnge dieser
Frequenz

Inhomogene Linienverbreiterung:
Lochbrennen

Homogene Linienverbreiterung:
Das gesamte Signal wird gesttigt

Netzwerk homonuklearer dipolar


gekoppelter Spins

Flip-flop-bergnge
(Nullquantenbergnge)

Je strker die dipolare Kopplung


(je grer das gyromagnetische
Verhltnis und je hher die Dichte
an Kernspins), desto
wahrscheinlicher ist so ein
bergang.

Im 3D-Netzwerk wird
Magnetisierung sehr schnell
ausgetauscht und durch die
gesamte Probe weitergereicht.
Spindiffusion.

Vor allem Protonen (hohes


gyromagnetisches Verhltnis,
hohe Dichte).

H ~
D

1 2
r3

Dipolkopplungen-isoliertes Spinpaar

y
x

Dipolkopplungen - Netzwerk

y
x

Protonen in der Festkrper-NMRSpektroskopie

800 MHz, Rotationsfrequenz: 20 kHz

NH

Aromaten
+ NH3

CO2+H N
3

H
2H

HH
1 HN +
H1

DQ(SPC5)

H2
NH2

Konsequenzen
Hochauflsende Festkrper-NMR-Spektroskopie von
Protonen ist oft nicht realisierbar
Stattdessen: 13C und 15N Isotopenmarkierung
Heteronukleare Kopplung zum Protonennetzwerk macht
auch 13C- und 15N-Linienbreiten homogen
Protonenentkopplung
Einstrahlung von rf-Strahlung auf dem 1H-Kanal whrend der
Evolutions-und Detektionsperioden
Dadurch wechseln die Protonen so hufig ihren Spinzustand,
dass benachbarte 13C- und 15N Kerne nur noch einen gemittelten
Duchschnittsuzstand sehen.

Protonen in der Festkrper-NMRSpektroskopie

800 MHz, Rotationsfrequenz: 20 kHz

NH

Aromaten
+ NH3

CO2H

+H N
3

2H
HH

1 HN +
H1

DQ(SPC5)

H2
NH2

13C-Spektrum mit high-power


C
Protonenentkopplung

CO

Isotopenmarkierung

Kurze Peptide, Festphasensynthese:


Vollstndig markierte Aminosuren oder spezifisch isotopenmarkierte Aminosuren
knnen beliebig und sequenzspezifisch eingefhrt werden.
Abstandsmessung zwischen einzelnen Spins mglich

Rekombinant exprimierte Proteine:


Minimalmedium aus isotopenmarkierten Nhrstoffen; markierte Isotope werden
statistisch eingebaut.*

*Geib, K. H.; Bonhoeffer, K. F., Z Phys Chem. A 1936, 175, 459-468.

Festkrper-NMR:
Experimente

A. Pines
E. Hahn

J.S. Waugh

Kreuzpolarisation (Cross Polarisation CP)

1H

X
1H

90

,RF

S,RF

Signalverstrkung

Umgehen der oft langen T1Relaxation fr Heterokerne

Selektion bestimmter
Spinpaare

Spinlock der 1HMagnetisierung

Durch gleichzeitiges
Einstrahlen eines rf-Feldes auf
dem X-Kanal wird der
Polarisationstransfer auf X
begnstigt, wenn I,RF = S,RF

CP MAS

1H

90

,RF

S,RF
Magnetisierungstransfer ist
mglich, wenn:

I-S/R=-2

-1

Hartmann-Hahn-Bedingung

CP MAS

1I 1S kR , k 1,2

Abstandsmessung ist mglich

IS=MAS

Signal buildup
700

1H

1.5

600

2.5

3.5 Distance

in

500

400
300
200
100
0

Mixing time [ms]

Cross-Polarization 2D
I

t1

Entkopplung

CP

t2

CP

HETCOR-Spektren:
Korrelation zwischen dipolar
gekoppelten Kernen

CP fr heteronuklearen Transfer
Selektiver Transfer auf CO oder C
mglich: Specific-CP

N/C transfer:
intraresidue N/C
correlation

N/CO transfer:
interresidue N/C
correlation

Baldus, M.; Petkova, A. T.; Herzfeld, J.; Griffin, R. G. Mol. Phys. 1998, 95, 1197-1207.

2D Spektren

Tripeptid AGG (Ala-Gly-Gly)

Wiedereinkopplung (Recoupling)
obs

1 3
iso (3cos 2 k 1) kk
3 k 1

54.7

Imitation der Brownschen


Molekularbewegung durch
schnelle Rotation um den
magischen Winkel

arccos

1
54.7
3

HD ~

1 2
r3

(1 3cos 2 )

Dipolar Recoupling
Homonuklear:

Double-quantum Hamiltonian:

Rotational resonance
rotary resonance
HORROR
RFDR
C-Sequences (SPC5, POST-C7 ect)
R-sequences (R18, R14)

HDQ =deff (I1+I2+ + I1-I2-)

Heteronuklear:
REDOR

Zero-quantum Hamiltonian:
HZQ = deff (I1+I2- + I1-I2+)

Idee: Wird die periodische


Modulation der
Dipolkopplung mit einer
zweiten periodischen
Modulation berlagert, so
wird die Ausmittelung
aufgehoben.

Heteronukleare Wiedereinkopplung

2 180-Pulse pro Rotorperiode

Dipolkopplungen-isoliertes Spinpaar

y
x

REDOR Recoupling

y
x

REDOR Abstandsmessung

15N

Abstandsmessung

13C
REDOR Signal:
dephasiert aufgrund der
Dipolkopplung

13C

Rotational Resonance (RR)

R.G. Griffin

13C

13C 2
RR Bedingung

Symmetrie-basierte
Pulssequenzen
M. H. Levitt
C-Sequenzen

R-Sequenzen

Homonuclear Dipolar Recoupling:


Longitudinal Mixing
exc

t1

Recoupling

t2

Diagonal peaks: I(1,1) = I(2,2) = cos2(defftmix)


Cross-peaks: I(1,2) = I(2,1) = sin2(defftmix)

k
k

Doppelquantenspektroskopie
1
DQ excitation

rec

2
t1

DQ reconversion

t2

2
1
0
-1
-2

p11 + p22 = -rec


p1 = 2
p2 = -1
1 = {0,90,180,270}4
2 = {0}4 {90}4 {180}4 {270}4
rec= {0,180}2 {90,270}2 {180,0}2 {270,90}2

Ohne t1-Evolutionszeit:
Doppelquantenfilter (siehe Praktikum)

Doppelquantenspektroskopie
1

rec

DQ excitation

t1

DQ reconversion

2+3

t2

Keine Diagonalsignale.

1+3
1+2

Cross-Relaxation (Spin Diffusion)

exc

t1

mix

t2

Spin-Diffusion: Austausch von Magnetisierung


zwischen dipolar gekoppelten Kernen
Protonen
Heterokerne: keine Protonenentkopplung
whrend des Mischens

Fazit

Im Festkrper sind chemische Verschiebung und dipolare


Kopplungen zwischen den Kernspins abhngig von der Orientierung
des Molekls im Magnetfeld.

MAS eliminiert die anisotrope Linienverbreiterung.

Die Ausmittelung durch MAS kann durch rotor-synchronisierte rfFelder ausgeschaltet werden.

Wechselwirkungen knnen so kurzzeitig ein- und ausgeschaltet


werden. Groes Arsenal an Mglichkeiten.

Festkrper-NMR-Spektroskopie von
Biomoleklen Wozu?

Rntgenkristallographie setzt kristalline Proben voraus

Flssig-NMR setzt lsliche Proben voraus

Proteine in ihrer natrlichen Umgebung sind oft weder lslich noch


kristallin. (Membranproteine, Protzeinaggregate, molekulare
Komplexe mit groer Masse)

MAS NMR von extensiv isotopenmarkierten


Proteinen
Erster Schritt: sequenzielle Zuordnung

Beispiel: 140 Proteinfibrille aus einem Protein mit 140-Aminosuren (-Synuclein)

Heise, H.; Hoyer, W.; Becker, S.; Andronesi, O. C.; Riedel, D.; Baldus, M., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2005, 102, 15871-15876.

2D Homonukleare 13C Korrelationsspektroskopie

Homonuklear:
SD, DQ-mixing
Intraresidue transfer
-> spin systems

Einquantenkorrelation
CO
C
C

Doppelquantenkorrelation
CO

20
40
60
160
180

Luca, S.; Heise, H.; Baldus, M. Acc. Chem. Res. 2003, 36, 858-865.

C
Tripeptid:
Ala-Gly-Gly

Die Zukunft: Sensitivity, sensitivity,


sensitivity
Grter Nachteil der NMR-Spektroskopie: die geringe
Empfindlichkeit
Boltzmann:
N/N ~ exp(-E/kT)
600 MHz, RT: auf 500000 -spins kommen 500001
spins im -Zustand.

DNP
Dynamic Nuclear Polarization (historischer Name, nicht
wirklich aussagekrftig): Magnetisierung wird von
Elektronen auf Kernspins bertragen
Der Original-Overhauser-Effekt beruht auf dem
Magnetisierungstransfer von Elektronen auf Kernspins
durch Kreuzrelaxation (Elektronen-Kern-NOESY)
Overhauser-Effekt: Doppelquanten-Kreuzrelaxation
Solid-Effekt: Verbotene bergnge werden angeregt
Cross-Effekt/Thermal mixing: Dreispinprozess