INSTITUTO TECNOLGICO DE

LOS MOCHIS

LICENCIATURA EN BIOLOGA

Microbiologa

Anteproyecto:

Aislamiento y cultivo de microorganismos amilolticos

Integrantes:
Soto Luque Carlos Manuel
Valdez Fonseca Dalia Zuzet
Mendoza Grajeda Jess O.
Rivera Jess Rosario
Lpez Dimas Carlos

M.C. Ochoa Hernndez Mara

Los Mochis, Sinaloa a 20 de marzo de 2015.

Introduccin
Los microorganismos amilolticos tienen un gran impacto en el ambiente donde se
encuentren, ya que son capaces de degradar grandes cantidades de almidn. El
almidn es un polisacrido de alto peso molecular ramificado, es una fuente
energtica pura de vegetales, principalmente, los tubrculos. Generalmente se
sabe que los microorganismos con capacidad degradante amiloltica son las
bacterias, hongos y levaduras. El microorganismo husped se selecciona de un
grupo formado por las levaduras de los gneros Saccharomyces,
Schizosaccharomyces, Schwanniomyces o Kluyveromyces o las bacterias del
gnero Zymomonas o los mohos del gnero Aspergillus (Zoraya, et. al. 2006).
En el presente trabajo se realiza el estudio de cepas microbianas de un nicho
ecolgico muy presente en nuestra regin, siendo el suelo agrcola, productoras
de enzimas amilolticas. Los criterios utilizados para el aislamiento y cultivo de las
cepas, son el crecimiento sobre los medios preparados manualmente con almidn
y la positividad frente al test de lugol.

Objetivos

Aislar y cultivar microorganismos amilolticos de suelo agrcola.

Identificar microorganismos aislados.

Justificacin
En la industria alimentaria, la utilizacin en enzimas en la produccin de alimentos
es, hoy en da, un recurso indispensable. Las enzimas son las encargadas de
transformar molculas grandes en compuestos de menor tamao o viceversa pero
con la finalidad de apresurar procesos qumicos. El uso de enzimas amilolticas se
aplica mayormente en la produccin de jarabes o productos de alto contenido de
azcar, incluso en edulcorantes.
El aislamiento de microorganismos amilolticos permitir dar el paso para la
produccin y obtencin masiva de enzimas degradadoras de almidn a partir de
cepas puras, con la confiabilidad de que la extraccin de estas es segura para su
consumo. Dicho eso, la misma produccin de enzimas con organismos
biosintsicos es un mtodo de ahorro en costos para las industrias o usos
domsticos. Tambin aplica la investigacin de estos microorganismos si resultan
ser patgenos para el suelo en donde se encuentren, aprovechndose de
especies ricas en almidn.

Antecedentes
En 2006, investigadores del Instituto de Ciencia Animal, Cuba, realizaron un
proyecto de aislacin y seleccin de microorganismos con capacidad degradante
de almidn. Se utiliz como medio de cultivo, boniato fresco rallado. Este es
conocido como batata o papa dulce, en nuestra regin se conoce como camote.
Se ajust el medio a distintas variaciones de pH colocndose en cuatro ambientes
distintos por un periodo de 5 das. Se realizaron extracciones de los
microorganismos aerobios y se sembraron en un medio, cuya nica fuente
energtica era el almidn. Posteriormente se incubaron a 30C por siete das.
Se seleccionaron las cepas con mayor crecimiento y se determin su capacidad
amiloltica por la formacin de halos de digestin, despus de una tincin de lugol
en el medio.
Los microorganismos se compararon con cepas de referencia, Aspergillus oryzae
y Aspergillus niger. De proyecto se obtuvieron 32 cepas puras, de ellas 31.2% con
mayor capacidad amiloltica que las de referencia. Los hongos fueron los que
presentaron mayores ndices de potencia, en segundo lugar, estuvieron las
bacterias y las levaduras mostraron potencia como las cepas de referencia.
En 2004, el departamento de Biotecnologa de la Universidad de Antioquia realiz
un aislamiento de 13 cepas amilolticas de tres fuentes, de almidn de maz,
almidn de papa y almidn de yuca. La preparacin de los medios const de
utilizar 100 g de una de las 3 muestras y se mezcl en 900 ml de solucin salina
hasta homogeneizar realizando diluciones seriadas en tubos que contenan 9 ml
de agua peptonada.
Con base en el crecimiento sobre los medios modificados con almidn, la
positividad frente al test de Lugol, y los aspectos morfolgicos de los
microorganismos, se hizo el aislamiento de las cepas. Se sembraron por
agotamiento en el medio slido en el que anteriormente se haba dejado y se
incubaron por 24 horas a 30C. Las cepas positivas fueron sembradas en 5 ml de
respectivo medio lquido e incubadas a 30C por 24 hr. Y posteriormente se
crioconservaron en glicerol al 30% a -20C.

Material y mtodo
Se tomar una muestra de aprox. 50 gr de suelo agrcola en donde se siembre
papa. Con una balanza granataria se pesar 10 gr del suelo y se colocar en un
matraz Erlenmeyer con 90 ml de agua estril. Esto se agitar 40 veces o hasta
que tenga una apariencia homognea.
Se preparar una serie de diluciones desde 10 -1 hasta 10-5, para esto, se
dispondr de 10 cajas de Petri estriles y 4 tubos de ensayo (etiquetados de 10 -2 a

10-5 respectivamente). Del matraz (marcado como 10 -1), con una pipeta de 5 ml se
tomar 3 ml de la solucin, de los cuales 2 ml se utilizarn para dos cajas de Petri
(1 ml c/u) y el mililitro restante se aadir a un tubo de ensayo con 9 ml de agua
estril tapado con tapn de algodn (etiquetado: 10 -2), este se agitar 40 veces y
de l se tomar 3 ml con una pipeta, repitiendo los pasos anteriores para todos los
tubos y cajas de Petri.
Las cajas de Petri sern destinadas para los medios de cultivo. Una de las dos
cajas de cada tubo o del matraz, se utilizar para un medio de cultivo a base
almidn-agar para bacterias, y la segunda caja, para el mismo tipo de medio de
cultivo pero este se acidificar con cido tartrico para el aislamiento de hongos.
Para la elaboracin de los medios de cultivo agar-almidn, se preparar
manualmente con extracto de carne (3 gr.) o triptona (10 gr.), almidn soluble (10
g.), NaCl (5 gr.) y agar (12 gr.) en 1 000 ml de agua destilada. Se disolvern los
componentes en un matraz con los 1 000 ml de agua aadiendo al final el agar,
agitando ligera y constantemente. Al hervir durante 1 minuto, el medio se
autoclavar a 121C durante 15 minutos y al retirar de la autoclave se dispondr
de las cajas Petri con la muestra del suelo disuelto en ellas para su rpida
preparacin evitando por mucho tiempo el contacto con el ambiente. Los medios
de cultivo ya preparados se incubaran a 37C durante 5 das.
Para la determinacin de si una colonia es amiloltica, se colocar una gota de
lugol directamente para observar el vire de color. Si la zona de la colonia es
incolora resulta positivo ante accin amiloltica y si la zona vira a azul-prpura, es
negativo a dicha accin.
Se aislar una cepa pura de una colonia de cada medio de cultivo en un tubo de
agar-almidn inclinado para observar directamente la morfologa colonial y
microscpica individual de cada colonia.
Para la morfologa microscpica se tomar una pequea muestra con un asa
bacteriolgica y en un portaobjetos con una gota de agua se mezclar la muestra
y se har un frotis en este. Se secar al aire e inmediatamente se fijar a la flama
hasta una temperatura soportable en el dorso de la mano. Se aplicar la tincin
de Gram para la observacin. Para esto, al fijar a la flama, se le colocar una gota
de cristal-violeta a la muestra y se dejar reposar durante 1 minuto. Se lavar
indirectamente y se le aplicar 1 gota de Lugol, dejando reposar un minuto y se
enjuagar. A continuacin, se le aplicar 1 gota de alcohol-cetona para desecar la
muestra durante 1 minuto y se enjuagar. Por ltimo, se le aplicar 1 gota de
Safranina a la muestra dejando actuar durante 1 minuto, se enjuagar y se
observar al microscopio con el objetivo 100X utilizando aceite de inmersin.
Se evidenciar lo observado y se describir la morfologa microscpica de cada
colonia destacable en los medios de cultivo.

Se determinar e identificar, mediante bibliografa y comparacin, las especies

aisladas en los medios, las que sean amilolticas.

Bibliografa

Quintero, R., (1998). Aplicaciones de la Biotecnologa en la industria

alimentaria. Medelln, Universidad de Antoquia. 210 pp.
Snchez, C., y C., Figueroa. (2004). Produccin de maltodextrinas a partir
de almidn de yuca, utilizando la enzima alfa amilasa. Ingeniera Qumica.
Pp 416.
Snchez, C., Meja, C., Figueroa, M., Esquivia, M., Agudelo, L., Zapata, N.
y M., Gmez. (2004). Estudio de cepas nativas amilolticas [en lnea].
Recuperado
el
20
de
marzo
de
2015
de
http://www.scielo.org.co/pdf/vitae/v12n2/v12n2a03
Zoraya-Rodrguez, R., Boucourt, J., Rodrguez, N., Albelo, O., Nuez, F., y
R., Herrera (2006). Aislamiento y seleccin de microorganismos con
capacidad de degradar el almidn. Revista Cubana de Ciencia Agrcola,
vol. 40, nm. 3, pp. 349-354. Instituto de Ciencia Animal. Cuba.