UNIVERSIDAD NACIONAL AUTONNOMA

DE MXICO
FACULTAD DE CIENCIAS
Qumica Orgnica 5064
Alejo Salinas Mara del Roco
Prctica 6 Cromatografa en Columna (CC)
Introduccin
La cromatografa en columna se emplea para la separacin de mezclas o
purificacin de sustancias a escala preparativa. Como fase estacionaria se usa,
generalmente, gel de slice o almina dentro de una columna.
La eleccin del disolvente es crucial para una buena separacin. Dicho
disolvente pasa a travs de la columna por efecto de la gravedad o bien por
aplicacin de presin (cromatografa flash). La columna se prepara mezclando
el soporte con disolvente y se rellena la columna poniendo en el fondo de sta
un poco de algodn o lana de vidrio, para evitar que la slica o la almina
queden retenidas en la columna y que el disolvente se engrasada hasta el nivel
del soporte. A continuacin se introduce la muestra por la parte superior de la
columna y se eluye con el disolvente elegido, recogindose por lo general en
tubos de ensayo.
Una columna de cromatografa es un tubo de vidrio relleno con una sustancia
slida de propiedades adsorbentes constituida por pequeas partculas: gel de
slice y almina son las ms usadas. Este relleno es lo que se conoce en
cromatografa como la fase estacionaria.
A travs de la columna se har pasar una corriente de un disolvente o mezcla
de disolventes denominada eluyente y/o fase mvil. La mezcla de
compuestos a separar se disuelve en una pequea cantidad de disolvente y se
coloca sobre el adsorbente, en la parte superior de la columna, quedando
adsorbida por el mismo. A continuacin se pasa un flujo de eluyente a travs
de la columna. Los compuestos constituyentes de la mezcla son arrastrados
por el eluyente a su paso, hacindoles avanzar a lo largo de la columna. Sin
embargo, no todos los compuestos avanzan a la misma velocidad, y esta es
precisamente la clave de la cromatografa.
Algunos compuestos se ven ms fuertemente retenidos por el adsorbente (fase
estacionaria) y por lo tanto avanzarn ms despacio. Por el contrario, otros
apenas son retenidos y avanzarn a mayor velocidad.

En general se dice que la separacin en la cromatografa se basa en la afinidad

diferencial de los distintos compuestos por la fase mvil o la fase estacionaria.

Gua de estudio

Investigar los diferentes soportes (fases estacionarias) empleados en la

cromatografa en columna, as como su uso ms comn para la
separacin de compuestos.
Como fase estacionaria se usa, generalmente, gel de slice o almina
dentro de una columna. La eleccin del disolvente es crucial para una
buena separacin. La gran porosidad del gel de slice, que le otorga
alrededor de 800 m/g de superficie especfica, le convierte en un
absorbente de agua. Por este motivo se utiliza para reducir la humedad
en espacio.

Describir dos usos industriales en los que se emplee la CC.

En la separacin de colorantes, protenas y en separaciones de
componentes de plantas medicinales.

Resumir un artculo de investigacin cientfica en el que se emplee la

separacin cromatogrfica durante la parte experimental.
Un cambio con mala pata
La anemia flaciforme es una enfermedad afecta concretamente a la
hemoglobina, la molcula encargada del transporte de oxgeno, y hace
que forme grandes agregados fibrosos que se extienden a travs de los
hemates deformndolos, de manera que pueden taponar los finos
capilares e impedir el flujo sanguneo. Y por qu el nombre de anemia?
Pues porque los hemates falciformes son menos eficientes en el
transporte de oxgeno y, adems, no permanecen mucho tiempo en la
sangre, lo que encaja con la definicin de anemia de baja concentracin
de hemoglobina.
El origen de la enfermedad fue propuesto por Linus Pauling en 1949. Su
hiptesis era que estaba causada por una variacin especfica
aminoacdica de una cadena de hemoglobina (la hemoglobina es una
protena formada por cuatro cadenas de aminocidos).
La demostracin de la teora de Pauling vino de la mano de Vernon
Ingram en 1956. Mediante una cromatografa en dos dimensiones, que
consiste bsicamente en la separacin de protenas por masa y carga,
observ que, en la posicin 6 de la cadena de la hemoglobina mutada,
haba una valina en vez de un glutamato. A la forma mutada se la llam
hemoglobina S por sicke (hoz).

Ahora bien, cmo puede un cambio en un nico aminocido cambiar la

estructura y funcionalidad de una protena entera con ms de 500
aminocidos? El glutamato de la hemoglobina sana es un aminocido
cargado negativamente a pH fisiolgico, mientras que la valina de la
hemoglobina mutada es hidrofbica, es decir, sin carga. Resulta que la
posicin donde se encuentra es un lugar estratgico y, cuando la
hemoglobina no est unida a oxgeno, la valina forma un enlace
hidrofbico con dos aminocidos de la cadena vecina: la fenilalanina 85
y la valina 88 (recordad que la hemoglobina est formada por cuatro
cadenas de aminocidos). Este enlace hidrofbico funciona como una
especie de parche adhesivo que hace que la hemoglobina cambie su
conformacin y precipite formando el agregado.
Por qu estos enlaces hidrofbicos no se forman cuando la hemoglobina
s est unida a oxgeno? La hemoglobina es una protena alostrica, lo
que significa que la unin a ciertas molculas hace cambiar su
conformacin. Es el caso del oxgeno, que cuando se une a la
hemoglobina hace que sus cadenas se separen y que su estructura se
relaje, ya que las interacciones internas se hacen ms dbiles. As,
cuando la hemoglobina mutada est unida a oxgeno, la valina
defectuosa est ms lejos de sus cadenas vecinas y no se produce el
enlace hidrofbico. Pero cuando sta se desprende del oxigeno, la
estructura se vuelve compacta y s se produce la unin, con lo que la
hemoglobina precipita.
Hoy sabemos que la enfermedad est producida por una mutacin en un
gen del cromosoma 11, concretamente por la sustitucin de una adenina
por una timina, lo que hace que se sintetize la valina en vez del
glutmato que correspondera.
El origen de esta enfermedad no es ms que la sustitucin de una
adenina por una timina en el ADN.
Bioqumica, editorial Reverte. Jeremy M. Berg, John L. Tymoczko, Lubert
Stryer. Sexta edicin.

Describir la metodologa par seleccionar el eluyente adecuado para una

CC.
La eleccin del eluyente depender lgicamente del componente que se
Eter de petrleo.
Etanol.
Eter dietlico.
Cloroformo.*
Ciclohexano.
Metanol.
Acetato de etilo.
Diclorometano.
Tetracloruro de carbono.*
Agua.
Piridina.
cido actico.
Benceno.*

va a separar y del material en que la separacin se lleva a cabo.

Principales eluyentes en orden creciente de polaridad:

*compuestos cancergenos.
Para la eleccin del eluyente hay que estudiar la polaridad del
componente y probar con eluyentes cada vez menos polares.

a) Toque de la muestra sin aplicar ningn eluyente.

b) Aplicando un eluyente poco polar.
c) Aplicando un eluyente ms polar.
Al aplicar en primer lugar eluyentes poco polares, podemos seguir
utilizando la misma placa para aplicar otros eluyentes ms polares, hasta
dar con el ms apropiado.
Otra tcnica para realizar la eleccin del eluyente consiste en sembrar
varias muestras distanciadas suficientemente, y aplicar con un tubo
capilar distintos eluyentes sobre el centro de cada muestra. Esto permite
desarrollar cada eluyente radialmente por capilaridad, de forma que se
aprecie el eluyente con el cual la separacin se realiza de una manera
ms eficaz.
Objetivos
a) Realizar la CC para la separacin y aislamiento de los componentes
cloroflicos de un extracto obtenido a partir de una muestra vegetal.

b) Conocer las caractersticas de la CC y los factores que en ella

intervienen.
c) Dar seguimiento a la separacin del extracto en CC, mediante CCF.
d) Identificar las diferencias y similitudes entre la CCF y la CC.
Material

Material
1 Columna cromatogrfica.
1 Matraz bola de 250 mL.
6 Matraces Erlenmeyer de 50 mL.
1 Vaso de precipitado de 500 mL.
1 Trozo de manguera.
1 Rotavapor.
2 Pinzas de 3 dedos (Se sustituy una por la
pinza Mohr)
3 Pipetas Pasteur.

10 Frascos de vidrio de 20 a 25
mL.
1 Cmara de desarrollo de CCF.
1 Soporte universal.
1 Embudo.
1 Agitador.
Placas cromatogrficas.
Capilares.
Fibra de vidrio.

Procedimiento
-

Se coloc un pequeo trozo de fibra de vidrio en el extremo inferior

dentro de la columna cromatogrfica.
Se sujet la columna en posicin vertical a un soporte universal
utilizando una pinza de tres dedos.
Se coloc un matraz Erlenmeyer en la parte inferior de la columna y un
embudo en la parte superior.
En un vaso de precipitado el profesor prepar una suspensin de gel de
slica con el eluyente, en este caso se utiliz un compuesto clorado
(Metanol).
Se aadi la suspensin preparada por la parte superior de la columna
con ayuda del embudo, procurando que la mezcla permaneciera lo ms
homogneamente posible.
Se dej fluir el disolvente, permitiendo una sedimentacin del adsobente
para que ste se compacte adecuadamente, procurando que no se
formaran burbujas y evitando que se secara el gel de slice.
Se dej que el eluyente bajara hasta una altura sobre el adsobente de 2
a 4 mm y se cerr la manguera de la columna para que dejara de fluir.
Con ayuda de la pipeta Pasteur y la varilla de vidri, se aadi el
extracto hexnico de la muestra vegetal de la CCF procurando que esta
bajara por las paredes.
Se abri la manguera y se continu con la adicin de eluyente por la
parte superior para desarrollar la columna hasta colectar el primer color
o banda formada por la separacin.

Se repiti el paso anterior hasta la obtencin de 6 componentes

cloroflicos.
Se realiz CCF de las fracciones obtenidas a fin de analizar la separacin.

Anlisis de resultados
Despus de realizar la CCF con cada una de las fracciones obtenidas en la CC
se realiz el revelado de placas las cuales no mostraron una buena separacin
de los pigmentos cloroflicos esto lo podemos contribuir a que en la CC no se
realiz de manera correcta, esto se puede deber a diversos factores como un
vaciado deficiente en la columna de la slica gel y esta pudo no haber quedado
homognea como deba, un exceso de eluyente al momento de colocar los
extractos vegetales, esto factores entre otros pudieron haber contribuido a una
mala recoleccin delos componentes cloroflicos que se vieron reflejados al
realizar el revelado de placas.
Cuestionario
1. Discuta la importancia de la polaridad y cmo interviene este factor
durante la separacin por CC.
Las fuerzas con las que los solutos interactan con el adsorbente son el
resultado de la polaridad de los mismos. Un eluyente muy polar tiene
una fuerza de elucin grande para compuestos de naturaleza polar; un
compuesto anlogo ocurre con especies no polares, esto se ve reflejado
al momento de realizar el revelado de placas.

2. Discuta la importancia de complementar con CCF el proceso de

separacin por columna.
Es importante complementar con CCF porque en el momento de hacer el
revelado de las columnas cromatogrficas se pueden estudiar e
identificar con mayor precisin los pigmentos que se deseaban separar.
3. Analice las CCF de las fracciones obtenidas y evale la separacin en
funcin a la polaridad de los pigmentos.
Los pigmentos que se separaron, Carotenos, Xantofilas, Clorofila a y
Clorofila b tienen carcter apolar, aunque su grado de polaridad vara en
funcin de su composicin qumica. De esta forma, existe un gradiente
de polaridad desde el ms apolar al menos apolar.
Esta propiedad permite su separacin, y su distinto color su
identificacin.
4. Identifique los diferentes pigmentos cloroflicos separados.
Carotenos, Xantofilas, Clorofila a y Clorofila b.
5. Defina los siguientes trminos:
- Eluyente. Es la palabra utilizada en mtodos cromatogrficos de
separacin para referirse a la sustancia (puede ser puro, mezcla de
varias o disolucin) que se aade en una columna cromatogrfica para
"hacer correr" nuestro producto de inters.
- Fase mvil. Es la fase que se mueve en direccin definida, es donde la
muestra analizada/separada y el disolvente se mueven por el interior de
la columna
- Fase estacionaria. Es la sustancia que est fija en una posicin en el
procedimiento de la cromatografa. Un ejemplo es la capa de slica en la
cromatografa en capa fina.
- Factor de separacin. Es una razn de distribucin dividida por otra, es
una medida de la habilidad del sistema para separarse en dos solutos.
- Resolucin. La resolucin en cromatografa es crtica. Una columna con
gran resolucin es una columna que soporta un gran nmero de platos
tericos por metro. El grado de separacin o resolucin de dos bandas
adyacentes se define como la distancia entre los picos (o centros)
dividida entre el ancho promedio de las bandas. La resolucin mnima
aceptable en mezclas sencillas es 1.0 una resolucin de 1.5 representa
separacin a la lnea base
- Platos tericos en cromatografa. Es el volumen requerido por una
molcula para establecer un equilibrio entre ella, la matriz y la fase
mvil en el sistema. Cada plato terico representa un equilibrio terico
de distribucin del soluto entre las fases. El nmero total de platos
tericos de una columna representa el poder de separacin de la
columna. Una buena columna tiene un nmero alto de platos tericos.

6. Investigue cmo se detectan los compuestos no coloridos.

Si los compuestos separados no son coloreados es necesario revelar la
posicin de dichos compuestos, para ello existen dos tipos de mtodos:

Mtodos qumicos.

Mtodos fsicos.
Mtodos qumicos
Consisten en realizar una reaccin qumica entre un reactivo revelador y
los componentes separados, para ello se pulveriza la placa con los
reactivos reveladores con la ayuda de un pulverizador de vidrio y una
pera de goma, o mediante un dispositivo que proporcione aire
comprimido.
Es preferible pulverizar con las placas en posicin horizontal. Si el
reactivo revelador es peligroso o muy corrosivo, la pulverizacin deber
realizarse en una vitrina de gases bien ventilada.
La pulverizacin se realizar poco a poco. En cromatografa en capa fina
no puede realizarse el baado del cromatograma (en cromatografa en
papel s).
Generalmente se utiliza como reactivo revelador yodo, el cual forma
complejos coloreados con los componentes orgnicos (con tonos
amarillo-marrn), pero las manchas desaparecen con el tiempo con lo
que es conveniente sealar las manchas aparecidas.
Otro reactivo revelador bastante utilizado es el cido sulfrico, que
reacciona con los componentes orgnicos produciendo manchas negras.
El tamao de las manchas no est relacionado con la cantidad de
componente separado.
Adems de estos reveladores generales, existen otros especficos:

2,4 - dinitrofenilhidracina (para aldehidos y cetonas).

Verde de bromocresol (para cidos carboxlicos).

Paradimetil aminobenzaldehido (para aminas).

Ninhidrina (para aminocidos).

Mtodos fsicos.
El ms comn consiste en aadir al adsorbente un indicador
fluorescente. De tal forma que al colocar la placa bajo una lmpara
ultravioleta, y dependiendo del indicador y de la longitud de onda,
aparecen manchas fluorescentes en las zonas en las que hay
componentes, o en otros casos aparece toda la placa fluorescente
excepto donde hay componentes.

Algunos compuestos poseen cierta fluorescencia (aunque no es normal)

con lo que pueden ser detectados directamente en una lmpara de
ultravioleta.
Conclusiones
Cuando se realiza cualquier tipo de cromatografa, ya se en columna o en capa
fina es importante escoger el eluyente con la polaridad requerida para poder
separar de manera eficiente los compuestos, en este caso pigmentos
cloroflicos, que se desean obtener. Mucho de esto tambin va a depender de
los grupos funcionales con los que se est trabajando.
La correcta preparacin del adsorbente tambin es muy importante ya que
este es el que va a reducir la humedad del medio dndonos oportunidad de
recolectar los pigmentos deseados del extracto vegetal.
Otra cosa con la que se debe tener cuidado es al momento de realizar la CCF
para complementar los datos de la CC es que se realice una buena aplicacin
de las fracciones obtenidas en la CC a las cromatoplacas para que el eluyente
indicado muestre una separacin eficiente de los pigmentos.
Bibliografa
Mayo, D.W. 1991. Microscale Techniques for the organic laboratory. John Wiley
& Sons, Inc. New York. Pp 138-142
http://www.textoscientificos.com/quimica/cromatografia/capa-fina
http://es.scribd.com/doc/14172697/6-Cromatografia-en-Columna