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PROCESOS AVANZADOS

EN BIOTECNOLOGIA Y
BIOINGENIERIA
ESTERILIZACION
Dr. Raymundo Erazo
FQIQ - UNMSM

ESTERILIZACIN: AGENTES FSICOS


Calor
Los microorganismos son afectados,
en distinto grado, por la accin del
calor. Provoca desnaturalizacin de
protenas, fusin y desorganizacin
de las membranas y/o procesos
oxidativas irreversibles en ellas. La
efectividad depende de:
Temperatura y Tiempo de exposicin

Calor Hmedo
Desnaturaliza y coagula protenas,
por dos razones:
El agua es muy reactiva y muchas
estructuras biolgicas (DNA, RNA,
protenas, etc) se producen a partir
de reacciones que eliminan agua.
Las protenas tienen estructuras
secundarias y terciarias que se
estabilizan por uniones puente de
hidrgeno intramoleculares que
pueden ser reemplazadas y rotos
por el agua a altas temperaturas

El vapor de agua posee un


coeficiente de transferencia de
calor ms elevado que el aire. Esto
se explica por el calor latente y
sensible.
El autoclave es el aparato ms
comn utilizado en los laboratorios
para esterilizar tanto los cultivos y
las soluciones, etc. que no formen
emulsiones con el agua y que no se
desnaturalicen por encima de 100
C.

Ventajas
Alta velocidad de calentamiento y
penetracin.
Destruccin de bacterias y esporas
en corto tiempo.
No deja residuos txicos.
Hay un bajo deterioro del material
expuesto.
Econmico.

Desventajas
No permite esterilizar soluciones
que formen emulsiones con el agua.
Es corrosivo con ciertos materiales
e instrumentos metlicos.

Calor Seco
Produce:
Desecamiento de la clula.
Efectos txicos por niveles elevados
de electrolitos, procesos oxidativos y
fusin de membranas.
Por:
Transferencia de calor desde los
materiales a los microorganismos que
estn en contacto con stos. El aire
es mal conductor del calor, y penetra
ms lentamente que el vapor de agua
en materiales porosos.

La accin destructiva del calor


sobre protenas y lpidos requiere
mayor temperatura cuando el
material est seco o la actividad de
agua del medio es baja.
Esto se debe a que las protenas
se estabilizan por uniones puente
de hidrgeno intramoleculares que
son ms difciles de romper por el
calor seco.

La estufa de esterilizacin es usado


en los laboratorios para esterilizar por
calor seco.
Se requiere mayor temperatura y
tiempo que el autoclave.
La temperatura vara entre 120 y
180C.
A 140C se necesitan por lo menos 5
horas de exposicin, mientras que a
160C se requieren al menos 2 horas
de exposicin.

Ventajas
No es corrosivo para metales e
instrumentos.
Permite esterilizar sustancias en
polvo y no acuosas, as como de
sustancias viscosas no voltiles.

Desventajas
Mayor tiempo de esterilizacin,
respecto al calor hmedo.
Existen otros mtodos de eliminar
microorganismos por calor seco:
Incineracin: se utiliza para destruir
material descartable contaminado.
Accin directa de llama: elimina a
los microorganismos cuando se
lleva al rojo el material de metal
como ansas, lancetas, agujas de
diseccin.

Radiaciones
Su accin depende de:
Tipo de radiacin
Tiempo de exposicin
Dosis
Ionizantes
Producen iones y radicales libres que
alteran las bases de los cidos
nucleicos, estructuras proteicas y
lipdicas, y componentes esenciales
para la vida de los microorganismos.

Tienen gran penetrabilidad y se las


utiliza para esterilizar materiales
termolbiles (termosensibles) como
jeringas descartables, sondas, etc.
Se utilizan a escala industrial por
sus costos.
No se utilizan para medios de
cultivo o soluciones proteicas
porque producen alteraciones de
los componentes.

Ultravioletas
Afectan a las molculas de DNA de
los microorganismos debido a que
forman dmeros de pirimidinas
adyacentes que inducen errores en
la duplicacin y por lo tanto la
prdida de la viabilidad de las
clulas.
Son escasamente penetrantes y se
utilizan para superficies.

ESTERILIZACIN: AGENTES QUMICOS


Agentes esterilizantes, desinfectantes
y antispticos.
La efectividad de estos agentes
depende de las condiciones bajo las
que actan:
Concentracin: vara con el tipo de
agente y de microorganismo, pues una
misma concentracin del agente puede
producir un efecto diferente en
distintos microorganismos.

Tiempo: los microorganismos no son


susceptibles a un agente en la misma
forma, no todos los microorganismos
mueren al mismo tiempo.
pH: afecta a los microorganismos y a
los agentes qumicos. Por encima de
7 incrementa la carga negativa de los
microorganismos, incrementando la
concentracin del agente sobre la
clula. Tambin, determina el grado
de disociacin y la efectividad del
agente qumico, a menor disociacin
mayor permeabilidad y por lo tanto
mayor efectividad.

ESTERILIZACIN: FILTRACIN
Se usan membranas filtrantes con
poros de un tamao determinado.
El tamao del poro depender del
uso al que se va a someter la
muestra. Hay que tener en cuenta
que los filtros que se utilizan
generalmente en los laboratorios no
retienen virus ni micoplasmas,
estos ltimos estn en el lmite de
separacin segn el dimetro de
poro que se utilice.

Existen tres tipos bsicos de filtros:


Filtros profundos o Filtros de
profundidad:
consisten de un material fibroso o
granular
prensado,
plegado,
activado, o pegado dentro de los
canales de flujo. En este tipo de
filtros la retencin de las partculas
se produce por una combinacin de
absorcin y de retencin mecnica
en la matriz.

Membranas filtrantes:
tienen una estructura continua, y la
retencin se debe principalmente al
tamao de la partcula. Partculas
ms pequeas al tamao del poro
quedan retenidas en la matriz del
filtro debido a efectos electrostticos.

Filtros de huella de nucleacin


(Nucleoporo):
son pelculas muy delgadas de
policarbonato que son perforadas
por un tratamiento conjunto con
radiacin y sustancias qumicas.
Son filtros con orificios muy
regulares
que
atraviesan
la
membrana en forma vertical.
Funcionan como tamices, evitando
el paso de toda partcula con un
tamao mayor al del poro.

La filtracin se utiliza para esterilizar


emulsiones oleosas o soluciones
termolbiles.
Como: aceites, algunos tipos de
pomadas, soluciones oftlmicas,
soluciones intravenosas, drogas
diagnsticas, radiofrmacos, medios
para cultivos celulares, y soluciones
de antibiticos y vitaminas.

ESTERILIZACIN: CONCEPTO
ESTADSTICO
La muerte microbiana sigue un
comportamiento de tipo exponencial,
por lo que se hace asinttico y no se
llega a un valor de microorganismos
igual a cero.

N = N0 . e - kt
N = nmero de microorganismos
viables a tiempo t de exposicin.
N0 = nmero de microorganismos
viables iniciales.
k = tasa de muerte (min-1)
t = tiempo de exposicin al agente.
k depende de las condiciones de
esterilizacin: temperatura, humedad,
concentracin del agente qumico) y
de la resistencia del microorganismo
al proceso de esterilizacin.

Si esta ecuacin se transforma a


base 10 resulta:
N = N0 . 10 - t / D
En donde D (min) se denomina
tiempo de reduccin decimal, esto es
el tiempo requerido para reducir la
poblacin microbiana un 90% o un
orden de magnitud. El valor de D se
deduce cuando t = D y por lo tanto N
= 0.1N0. Comparando las ecuaciones
anteriores se llega a que:

D = ln 10 / K = 2.303 / K
D es inverso con k.
Graficando el logartmo del nmero
de microorganismos sobrevivientes
en funcin del tiempo de exposicin
a un agente esterilizante, se obtiene
una recta. La pendiente est dada
por -1/D y la ordenada al origen es
log N0.
La pendiente de la recta est
determinada por las condiciones de
esterilizacin y de la resistencia del
microorganismo.

Probabilidad de sobrevivencia:
cuando log N<0. Si la probabilidad
es -1, significa que hay 0.1
microorganismos
viables
por
unidad, o correctamente expresado
una unidad contaminada por cada
10 unidades idnticas procesadas.
Un producto se considera estril
cuando
la
probabilidad
de
encontrar unidades contaminadas
es menor o igual a 10-6, esto es una
unidad contaminada cada milln de
unidades idnticas procesadas.

Durante el proceso de esterilizacin


por calor debe tenerse en cuenta
que el tiempo de esterilizacin
comienza cuando se ha alcanzado
la temperatura ptima en el interior
del aparato (autoclave o estufa) y
que generalmente el contenido de
un
autoclave
puede
requerir
tiempos ms largos para alcanzar
la temperatura de esterilizacin.

ESTERILIZACION INDUSTRIAL
Todas las etapas deben operar con
cultivos libres de contaminantes,
desde el cultivo preliminar hasta el
fermentador de produccin.
El fermentador y su equipamiento,
as como el medio de cultivo
deben estar estriles antes de la
inoculacin.

Adems, el aire que se suministra


durante la fermentacin debe ser
estril y no deben existir roturas
mecnicas en el fermentador que
podran permitir la entrada de
microorganismos.
Tambin se deben esterilizar los
aditivos (antiespumantes), los cidos
y bases concentrados no es
necesario esterilizarlos.

Un
biorreactor
puede
ser
esterilizado,
destruyendo
los
microorganismos, por accin de
calor, radiacin o un producto
qumico o bien separando los
organismos viables mediante un
procedimiento fsico como la
filtracin.

Durante la fermentacin se deben


observar:
- Esterilidad en el medio de cultivo
- Esterilidad del aire que entra y
sale.
Es necesario una construccin
apropiada del biorreactor que
facilite la esterilizacin as como la
prevencin de la contaminacin
durante la fermentacin.

ESTERILIZACION DEL MEDIO DE


CULTIVO
Eliminar contaminantes presentes en el
medio de cultivo antes de la
inoculacin. Para instalaciones a gran
escala, el calor es el principal
mecanismo utilizado.
Un conjunto de factores influyen en el
xito de la esterilizacin por calor: el
nmero y tipo de microorganismos
presentes, la composicin del medio de
cultivo, el valor del pH y el tamao de
las partculas en suspensin.

La esterilizacin por filtracin se


utiliza frecuentemente para todos
los componentes de la solucin de
nutrientes que son sensibles al
calor
Las vitaminas, los antibiticos o
los componentes de la sangre son
ejemplos de compuestos lbiles al
calor que deben ser esterilizados
por filtracin

ESTERILIZACIN DISCONTINUA
La mayor parte de los medios de
cultivo se esterilizan en volmenes
discontinuos en el biorreactor a
121C.
Los tiempos de esterilizacin
aproximados pueden ser calculados
a partir de la naturaleza del medio y
del tamao del fermentador.

No solamente debe ser esterilizado


el medio nutritivo, sino tambin las
uniones, vlvulas y electrodos del
propio fermentador.
Por consiguiente, los tiempos de
esterilizacin
reales
son
significativamente ms largos que
los calculados y deben ser
determinados experimentalmente
para las soluciones especficas de
nutrientes
presentes
en
el
fermentador.

Un mtodo de esterilizacin es
inyectar vapor en la camisa del
fermentador o en los serpentines
interiores (esterilizacin indirecta).
Otro mtodo es inyectar vapor en
la propia solucin de nutrientes
(procedimiento directo), en cuyo
caso un pre-requisito es tener
vapor puro (libre de aditivos
qumicos).

Muchos suministros de vapor


industrial contienen productos
qumicos txicos derivados de
aditivos anticorrosivos utilizados
en el proceso de produccin del
vapor.
Adems, con la inyeccin directa
de vapor el condensado se
acumula dentro del fermentador y
de esta forma el volumen del
lquido aumenta durante el proceso
de esterilizacin

t1

t2

t3

t1: tiempo de calentamiento


hasta la
temperatura de
esterilizacin
t2: tiempo de esterilizacin
(mantenimiento)
t3:
tiempo de enfriamiento
tT: tiempo total del proceso
= t1 + t2 + t3

Valores tpicos
t1 1,5 - 2 h
t2 , 20 min
t3 1 - 1,5 h

LOS INCONVENIENTES DEL


PROCESO DE ESTERILIZACIN
DISCONTINUA
Se necesitan de 2 a 3 horas para
alcanzar
la
temperatura
de
esterilizacin (121C).
Se requieren otros 20 - 60 minutos
para el proceso real de muerte,
seguidos de enfriamiento durante
una hora.
Altos costos si no se recupera parte
de energa.

El calentamiento, esterilizacin y
enfriamiento no solamente matan a
los microorganismos, sino que
tambin alteran severamente la
solucin de nutrientes.
La decoloracin y los cambios en el
valor del pH se originan como
consecuencia de la caramelizacin
y la reaccin de Maillard. Las
vitaminas se destruyen y la calidad
del medio de cultivo se deteriora. La
extensin en la que es afectada la
fermentacin subsecuente depende
del organismo y del proceso.

dN

Ea

k .N A.e R.T .N

dt
siendo T una funcin del tiempo, T = f(t).
t

a
N
ln( ) k .dt A e R.T dt
N0
0
0

Definiendo como criterio de esterilizacin (Wang et al. p. 147)

N0
ln
N

Se puede realizar el clculo por zona.


Total Calentamie nto Mantenimiento Enfriamien to

Calentamiento

E
a
N0 1
ln A e R.T dt
N1 0

Mantenimiento

E
a
N1
ln A e R.T dt
N2 0

t2

Enfriamiento
N1:
N2:

3
a
N
2
ln A e R.T dt
N 0

microorganismos viables luego del calentamiento.


microorganismos viables luego del mantenimiento.

Variacin de k durante una esterilizacin


por lotes
140

2 .5

2 .0

100
1 .5
80
1 .0

k, min-1

Tem
mperatura , C

120

60

40

0 .5

20

0 .0
0

20

40
60
80 100 120 140 160
T ie m p o , h o r a s

Variacin de k durante la esterilizacin calculado segn la


siguiente ecuacin:

34100
9,5x1039e T

T en K

Variacin de N/N0 durante una


esterilizacin por lotes
130

log (N/N0)

Temperatura
110 (C)

-3
-6

90

-9
-12

70

-15

50

-18
-21

30

-24

10

Tiempo (min)
La mayor destruccin trmica de microorganismos se
produce en la etapa de mantenimiento
Valores tpicos de mantenimiento/ 0,6 - 0,8 .

Perfil temperatura - tiempo


Tipo de calentamiento
o enfriamiento
Vapor vivo directo
Calentamiento
elctrico
Calentamiento
indirecto con vapor

Ecuaciones temperatura vs tiempo

(19)

h.s
a.t

s
a

T T0 . 1

M.C p .T0
1 b
M

T T0 .( 1 a.t)

(20)

q
a
M.C p .T0

T TH .( 1 b.e a.t ) a

U.A
T0 TH
b

M.Cp
T

(21)

Enfriamiento con
fluido fro

T TCO .( 1 b.e

w.C p
a
M.Cp

a.t

(22)

T TCO
.1 exp U.A b 0
w.C
TCO

T: temperatura a un tiempo dado (K)


t:
tiempo (s)
T0: temperatura absoluta inicial del medio (K)
h: diferencia de entalpa entre el vapor y el medio (kcal/kg)
s: flujo msico de vapor (kg/s)
M: masa del medio a esterilizar (kg)
Cp: capacidad calrica del medio (kcal/kg C)
U: coeficiente global de transferencia de calor (kcal/m2s C)
TH: temperatura absoluta de la fuente de calor (K)
q: velocidad de transferencia de calor (kcal/s)
CP:
capacidad calrica del enfriante (kcal/kg C)
w: flujo msico del enfriante (kg/s)
TC0:
temperatura absoluta del enfriante

Cuando se usa vapor vivo, el consumo de vapor se puede estimar:


consumo de vapor (kg) = M.CP (T - T0)/,
con calor latente de vaporizacin (kcal/kg).
El uso de vapor directo permite mayor velocidad de calentamiento
pero diluye el medio (tpico 10- 20%) y puede introducir impurezas.

ESTERILIZACIN CONTINUA
La esterilizacin continua es la etapa
preliminar lgica en una fermentacin
continua a escala industrial. La razn
para esto se debe a la relacin
exponencial entre velocidad de muerte
y temperatura, que hace ms corto el
tiempo necesario para la eliminacin
completa de los organismos vivos
cuando se utiliza una temperatura ms
alta.

La esterilizacin continua se lleva a


cabo normalmente en 30-120 segundos
a 140 C.
El calentamiento del medio de cultivo
puede ser llevado a cabo mediante
inyeccin de vapor o mediante
intercambiadores de calor.
La esterilizacin con inyeccin de
vapor se hace inyectando vapor en la
solucin de nutrientes. La temperatura
se eleva rpidamente a 140 C y se
mantiene durante 30-120 segundos.

La formacin de condensados diluye


la solucin nutritiva; para corregir
esto la solucin caliente se bombea
a travs de una vlvula de expansin
a un vaporizador y el condensado se
retira mediante bombas de vaco.
La desventaja de este proceso es la
sensibilidad que presenta a cambios
en la viscosidad del medio y a
variaciones en la presin.

Uso de intercambiadores de calor: la


solucin de nutrientes, en el primer
intercambiador, se precalienta a 90120 C durante 20-30 segundos por la
solucin
nutritiva
previamente
esterilizada que sale.
En el segundo intercambiador, se
calienta indirectamente con vapor a
140 C durante 30-120 segundos en
una tubera de mantenimiento y
posteriormente
en
un
tercer
cambiador para refrigeracin a la
temperatura del fermentador por 2030 segundos.

Las soluciones que contienen


almidn, que se hacen viscosas
cuando se calientan, son difciles
de utilizar en procesos de
esterilizacin continua.
Antes de la esterilizacin real debe
llevarse a cabo una licuefacin e
hidrlisis parcial mediante cidos o
amilasas.

Si hay partculas en suspensin en la


solucin de nutrientes, los cortos
tiempos de esterilizacin en el
proceso
continuo
pueden
ser
insuficientes para que el calor
permanezca completamente a travs
de ellas.
El tiempo de calentamiento para
partculas de 1 mm es de 1 segundo;
para partculas de 1 cm es de 100
segundos. Es decir, el tamao de las
partculas debera estar restringido a
1-2 mm.

El calentamiento puede ser


realizado por:
inyeccin directa de vapor
intercambiador de calor.

Perfiles temperatura vs tiempo en


esterilizadores continuos.

Cuando el flujo es pistn, la velocidad del fluido sobre un


radio
dado es constante. El tiempo de residencia, es
el mismo para todas las porciones de medio. Todo el
medio tendr el mismo tiempo de exposicin
a
la
temperatura de esterilizacin.
Cuando el flujo no es pistn, el tiempo de residencia
medio calculado a partir de la velocidad media, no
siempre corresponder con el tiempo real de cada
porcin de medio.
Existen dos situaciones con
respecto a los valores medio de
velocidad y de tiempo
de exposicin:
porciones de medio con mayor velocidad que la media,
tiempo de
posicin menor, estarn sub-expuestas
y alcanzarn un menor nivel de muerte.
porciones de medio con menor velocidad, tiempo de
exposicin
mayor,
estarn
sobre-expuestas,
alcanzarn un nivel mayor de
muerte,
pero con
mayor destruccin de nutrientes.

F
A
Flujo pistn

umxima

Flujo turbulento

u
u mxima

0,82

Segn modelo de la 1/7 potencia de Prandtl


Flujo laminar

u
u mxima

0,5

u
u mxima

Re

Re : Nmero de Reynolds

u D

F: velocidad de flujo : densidad del medio de cultivo


A: rea transversal del cao : viscosidad del medio de cultivo
D:
dimetro del tubo
L:
largo del tubo
:
velocidad media

Para el diseo de un esterilizador continuo se debe conocer la distribucin


de tiempos de residencia, o bien la desviacin del rgimen de flujo
obtenido con respecto al flujo ideal tipo pistn.
Para estimar dicha desviacin y el diferente grado de destruccin trmica
se utiliza el modelo de dispersin, caracterizado por un parmetro, el
coeficiente de dispersin axial o turbulenta, Dz.

dz

Eje z
N

N - dN

Realizando un balance de microorganismos, considerando


variaciones por arrastre por flujo, dispersin axial y destruccin
trmica se tiene:

DZ puede ser estimada usando la correlacin


Intensidad
de mezcla (Dz/ D) vs Re (Bailey & Ollis, 2nd ed. p. 544, Lee,
p. 223). (Levenspiel 1958)

Definiendo el nmero de Peclet


(Pe), tambin referido como de
nmero Bodenstein (Bo):

Pe

Dz
uD

Bo

u .L

Dz

Cuando Dz 0 , Pe ,
el flujo se aproxima al flujo pistn.

Re

u D

Introduciendo en ecuacin 23 el modelo logartmico y los nmeros


adimensionales que se definen, se obtiene la ecuacin 25.

dN
k N
dt

z
z
L

N
N0

Definiendo el nmero de reaccin (NR), tambin referido como de


Damkhler (Da):

k L
NR Da
k.t
u

Siendo L largo del cao yt tiempo de residencia medio:

d2N
dz

Pe

dN
dz

Pe NR N

La solucin de la ecuacin diferencial es la siguiente:


N

N0

4 a e Pe 2

2 Pe a 2
Pe a 2
e

1 a
1a e
2

1/2

4 NR

a 1

Pe

Ecuacin 26 graficada

Pe

por Aiba et al. (1967).

N
N
0
Wang et al. p. 154,
Bailey & Ollis 2nd ed. p. 594,
Aiba et al. 2nd ed. p. 263

NR

Cuando Bo , se tiene flujo pistn y la ecuacin 26


se reduce a:

N e NR e k t
N0

Desde el punto de vista prctico se puede


considerar flujo pistn cuando Bo > 800 1000.
Cuando el flujo no es pistn, el nivel de
destruccin disminuye.
Para aproximarse a un flujo cercano al
modelo pistn, el esterilizador se disea:
usando caos largos y finos
menor Re en zona turbulenta.

Nivel de esterilizacin, Re y Bo (Pe) en funcin del


dimetro del tubo, para un volumen dado de
esterilizador

10-6

.
106

N
N0

10-7
10-8

105

10-9
104

Re

10-11
10-12

103

10-13
10-14

102

Bo

10-15
10-16

101
0

10

12

Dimetro del cao, cm

14

16

18

Re, Bo

N/N0

10-10

Datos
k = 8,6
min-1
F = 10
L/min
t = 4 min

esterilizan 10 m3
de un medio usando un
esterilizador continuo a un flujo de 10 L/min de
modo de tener un valor de N 0,001. Se tiene la
siguiente informacin:
Volumen del esterilizador = 20 L
Concentracin de microorganismos en el medio a
esterilizar = 102 /mL
Temperatura de esterilizacin = 140C
k = 9,5x1037.e-35000/T (min-1, T temperatura en K)
Estimar como afecta el valor de N alcanzado estas
situaciones:
El esterilizador se repar y qued con un largo un
10% menor
Se detect un error de calibracin y la temperatura
de esterilizacin es
138C en lugar de los 140C
ledos en el monitor.

Anlisis de una situacin


Luego de esterilizar 100 m3 de un medio de cultivo
sobrevive una espora. Se plaquean muestras de 1
mL del medio esterilizado. El microorganismo que
sobrevive tiene un tiempo de duplicacin de una
hora.
Que poblacin debe sobrevivir o desarrollarse
para poder ser detectada por plaqueo?

P
P:
M:
n:
N:
t:

1e

M .n

N 2t

probabilidad de detectar un microorganismo


volumen de la muestra, mL
concentracin de microorganismos viables, clulas/mL
nmero de clulas viables luego de un tiempo dado
tiempo, h

Tiempo, h

n, cl/mL

1,0x10-8

1,0x10-8

16

1,6x10-7

1,6x10-7

256

2,6x10-6

2,6x10-6

12

4,1x103

4,1x10-5

4,1x10-5

16

6,6x104

6.6x10-4

6,6x10-4

20

1,0x106

1,0x10-2

0,01

24

1,7x107

0,17

0,15

28

2,7x108

2,7

0,93

32

4,3x109

4,3

ASPECTOS CRTICOS A TENER EN


CUENTAS
Fallas en el ciclo temperatura - tiempo.
Residuos acumulados en grietas o cavidades y
no removidos durante la limpieza.
Medio de cultivo con alta concentracin de
slidos en
suspensin.
Medidores de temperatura descalibrados.
Mal funcionamiento de vlvulas, sellos, juntas.
Equipo mal mantenido.
Equipo mal operado.
Equipo no adecuadamente validado no (apto
para el uso pretendido).