LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

Caracterizacin fenotpica de microorganismos: pruebas bioqumicas

Fermentacin de los hidratos de carbono
Para estudiar la capacidad de un microorganismo de fermentar una determinada sustancia se
utiliza un medio base al cual se le agrega el sustrato filtrado. La concentracin final del sustrato
es de 0,5- 1%.
El medio posee adems un indicador de pH como por ejemplo azul de bromotimol y una campana
de Durham (para detectar produccin de gas).
En caso que el microorganismo sea capaz de fermentar el sustrato en estudio se observar
viraje del indicador hacia el color cido, para el azul de bromotimol ser amarillo. La produccin
de gas se evidenciar a travs de la formacin de una burbuja en la campanita de Durham.

Medio de cultivo

Extracto de carne
3 g/l
Peptona
5 g/l
Sc. Azul de Br Timol (16%) 1 ml
Hidrato de carbono
5 g/l
pH final: 7

Lecitinasa
En esta prueba se investiga la presencia de lecitinasa (un factor de virulencia) que acta sobre
la lecitina (fosfatidil colina) de la membrana citoplasmtica. Para la prueba se utilizan medios
slidos a los cuales se les agrega yema de huevo (que contiene lecitina). Las colonias con
actividad lecitinsica formarn un halo opaco a su alrededor.
Para el caso de Bacillus cereus, se utilizar el medio de Mossel al cual se le habr agregado una
suspensin de yema de huevo al 50% en NaCl 0,85%, a razn de 1ml de suspensin por cada 9 ml
de medio.
Hemlisis
Esta prueba est relacionada con la presencia de factores de virulencia llamados citolisinas que
son capaces de formar poros en la membrana citoplasmtica de diferentes clulas eucariticas.
Un sistema indicador adecuado lo constituyen los glbulos rojos ya que la lisis de stos
(hemlisis) es fcilmente demostrable. Para la realizacin de la prueba, se incorpora sangre de
oveja o carnero al 5% en un medio nutritivo slido estril, fundido y templado (55 C
aproximadamente). Las placas se secan a 37C y se siembra el microorganismo en estudio.

Interpretacin:

a)
hemlisis: destruccin parcial de los glbulos rojos acompaada por una coloracin
verdosa o parduzca.
b)
hemlisis: destruccin total de los glbulos rojos que se observa como una zona
transparente alrededor de la colonia.
c)
ausencia de hemlisis: no hay cambios visibles.
Triple azcar hierro- Agar TSI
Este medio permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar un hidrato de
carbono especfico incorporado a un medio bsico con o sin produccin de gas y de cido
sulfhdrico (SH2). El medio contiene tres azcares: lactosa (1%), sacarosa (1%) y glucosa (0.1%)
en una relacin de 10:10:1 g/ litro, respectivamente.
La degradacin del azcar con formacin de productos cidos se manifiesta por un cambio de
color del indicador (rojo de fenol) que vira del naranja al amarillo o al rojo en caso de
alcalinizacin. El tiosulfato es reducido a SH 2 que reacciona con la sal frrica produciendo S 3Fe2
color negro.

Medio de cultivo
(Composicin g/l)

Peptona de casena
Peptona de carne
Extracto de levadura
NaCl
Lactosa
Sacarosa
Glucosa
Citrato frrico y amonio
Tiosulfato de sodio
Rojo fenol
Agar

15
5
3
5
10
10
1
0,3
0,3
0,024
12
pH final 7,4

El medio se envasa de forma tal que la zona inferior sea recta y la superior en pico de flauta.
Los monosacridos en el pico de flauta son catabolizados por la va de la gliclisis hasta cido
pirvico y posteriormente es degradado por medio del ciclo de Krebs para dar CO 2, H2O y
energa. La regeneracin del NAD+ se realiza mediante la cadena respiratoria con O 2 como ltimo
aceptor de electrones.
En la zona recta del medio de cultivo, que posee baja concentracin de O 2, los monosacridos
tambin son metabolizados por la va de la gliclisis hasta cido pirvico pero luego son
convertidos en diversos productos finales estables como cido lctico y/u otros cidos
orgnicos, aldehdos, alcoholes, CO2, H2 y energa.
Para una correcta interpretacin de esta prueba es muy importante realizar la lectura luego de
18 a 24 hs. Lecturas prematuras o demoradas podrn conducir a interpretaciones errneas.

Interpretacin:
Luego de la incubacin pueden observarse:

Lectura (pico de flauta/profundidad)

Interpretacin

Alcalino/Acido, con o sin gas1 rojo/amarillo Fermenta la glucosa

Acido/Acido,
con
amarillo/amarillo

sin

gas

Alcalino/Alcalino o sin cambio o rojo/rojo

o Fermenta glucosa y lactosa (sacarosa2)

No fermentan
(sacarosa)

glucosa

ni

lactosa

La produccin de gas provoca un desplazamiento del medio del fondo del tubo o agrietamiento
del medio.
2
La incorporacin de sacarosa permite el reconocimiento del gnero Proteus. Estos
microorganismos no utilizan lactosa o lo hacen lentamente pero si pueden fermentar la
sacarosa.
1

La produccin de SH2 se evidencia por un ennegrecimiento del medio.

Prueba del Rojo de metilo

Esta prueba permite comprobar la capacidad de un microorganismo de producir y mantener
estables los productos terminales cidos de la fermentacin de la glucosa y vencer la capacidad
amortiguadora del sistema.
Se cultiva el microorganismo en estudio en el medio de Clark y Lubs, y se incuba a 37C durante
24 hs.
Medio de Clark y Lubs
(Composicin en g/l)

Polipeptona
Glucosa
Fosfato dipotsico
A.D. c.s.p.

7
5
5
1000ml

pH final

Para obtener un resultado vlido deber realizarse una primera lectura a las 24 hs y una segunda
luego de 2 a 5 das de incubacin a 37C.

Revelado:
Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar unas gotas de indicador Rojo de Metilo.
Interpretacin:
El rojo de metilo conserva su color rojo a valores bajos de pH ( 4,2) indicando que se han
producido cidos estables capaces de vencer la capacidad buffer del medio. Si el indicador vira
al amarillo la prueba de RM es negativa (pH 6).
Prueba de Voges-Proskauer
Esta prueba permite determinar la capacidad de algunos microorganismos de producir un
compuesto neutro, el acetilmetilcarbinol, a partir de la fermentacin de la glucosa.
La reaccin de VP se basa en la deteccin del acetilmetilcarbinol (acetona). En presencia de O 2
(atm) y lcali los productos finales neutros acetona y 2,3-butanodiol son oxidados a diacetilo,
que es el reactante para el color producido en la reaccin. El diacetilo reacciona con el ncleo
guanidinio de la arginina presente en la peptona, en medio alcalino, dando un color rojizo en la
superficie del medio.
La velocidad de desarrollo de color depende de la concentracin de acetona, por lo general el
color se produce de los 2 a 5 minutos, obtenindose la mxima intensidad de color luego de una
hora.
El medio de cultivo utilizado es el de Clark y Lubs, el cual se siembra y se incuba a 37C durante
24 hs.

Revelado:

Primero: Sobre una alcuota del medio desarrollado agregar 6gotas de una solucin alcohlica de
-naftol al 5% (acta como catalizador en la oxidacin de la acetona a diacetilo). Debe
adicionarse antes del lcali.
Segundo: Luego se agregan 2 gotas de una solucin de KOH o NaOH al 40%. Se agita el tubo
suavemente favoreciendo la oxidacin de la acetona por el O 2 atmosfrico.

Interpretacin:
Reaccin positiva: la aparicin de color rojo-rub en la superficie del medio indica la presencia de
acetona.
Reaccin negativa: color amarillo o cobrizo, corresponde al color de los reactivos.
Prueba del Indol
Permite determinar la capacidad de un microorganismo de degradar el aminocido triptofano
dando indol.
En el proceso de degradacin del aminocido triptofano intervienen diversas enzimas que
reciben el nombre de triptofanasas. Estas enzimas catalizan la reaccin de desaminacin,
atacando la molcula de Trp en su cadena lateral y dejando intacto el anillo aromtico en la
forma de indol.

Triptofanasa

L-Trp

Medio de cultivo: caldo triptona.

(Composicin g/l)

+ NH3 + CH3COCOOH
Indol

Extracto de carne
Peptona
Triptona
A.D. c.s.p.
final 7

Ac. pirvico

3
5
20
1000ml

pH

Se siembra un tubo de caldo e incuba a 37C durante 24hs.

Revelado:
Se utiliza el reactivo de Kovacs: p-dimetilaminobenzaldehdo en alcohol amlico y HCl. Agregar al
tubo desarrollado 5 gotas y agitar.

Interpretacin:
La aparicin de color rojo en la capa alcohlica se debe a la formacin de un compuesto de
condensacin entre el p-dimetilaminobenzaldehdo y el indol.
Prueba de oxidacin-fermentacin
Permite determinar el metabolismo oxidativo o fermentativo de un microorganismo sobre un
determinado hidrato de carbono
La fermentacin es un proceso metablico que no requiere O 2. Se caracteriza por la
fosforilacin inicial del hidrato de carbono (glucosa-6-fosfato) y requiere de un compuesto
orgnico como aceptor final de electrones.
Los procesos oxidativos son estrictamente aerbicos. El proceso de oxidacin directa del
hidrato de carbono, que se da en el grupo fluorescente del gnero Pseudomonas, no requiere de
la fosforilacin inicial del azcar. La glucosa se oxida a cido glucnico o 2-cetoglucnico y
posteriormente se fosforila y degrada a cido pirvico.
Medio de cultivo OF (base)
(Composicin en g/l)

Peptona
2
NaCl
5
K2HPO4
Azul de bromotimol 0,03
Agar
3
A. D. c.s.p.
1000 ml
7,1

0,3
pH final

Luego de esterilizar y enfriar a temperatura ambiente el media base, se le aade solucin del
azcar en agua destilada estril para obtener una concentracin final de 1%.
El medio utilizado es un agar semi-blando, que permite evidenciar movilidad y reducir la difusin
y dilucin de los cidos permitiendo su deteccin aun en pequeas cantidades ya que posee una
muy limitada capacidad buffer.
A partir del cultivo puro de 24 hs se inoculan con ansa recta dos tubos del medio OF.
Un tubo se inocula directamente ("Tubo con O2"). El segundo tubo es purgado previamente para
eliminar el O2 mediante el calentamiento a Bao de Mara durante 15 minutos. Luego se enfra
bajo canilla sin agitar y se siembra por puncin. Inmediatamente se cubre con 1 cm de parafina o
vaselina lquida estril ("Tubo sin O2").
Ambos tubos se incuban a 35C durante 48 hs. Algunos microorganismos requieren hasta 2
semanas de incubacin.
Interpretacin:

Tipo de metabolismo
"Tubo abierto"
"Tubo cerrado"
Oxidativo
Acidez (amarillo)*
Neutro (verde)
Fermentativo
Acidez (amarillo)
Acidez (amarillo)
Fermentativo
Neutro (verde)
Acidez (amarillo)
Inerte**
Neutro (verde)
Neutro (verde)
* Como se produce una pequea cantidad de cido, suele aparecer amarillo solo la superficie
del agar
** El microorganismo no metaboliza el carbohidrato o no es capaz de crecer en este medio
Prueba de la enzima citocromo oxidasa.
Esta prueba permite determinar la presencia de la enzima citocromo c oxidasa presente, entre
otras, en los gneros Pseudomonas y Aeromonas, y nos permite diferenciarlas del grupo oxidasa
negativa de la familia Enterobacteriaceae.
Esta enzima acta, en presencia de oxgeno, activando la oxidacin del citocromo "reducido" de
la cadena transportadora de electrones.
Citocromo reducido.
O2
H2O
oxidasa
Citocromo oxidado

Un sustrato artificial (reactivo) puede sustituir al dador natural (citocromo reducido) dentro de
la cadena transportadora.
Existen varios reactivos que pueden actuar como dadores artificiales de electrones: indofenol,
p-fenilendiamina, como ejemplo. Estos reactivos al ser oxidados dan un producto coloreado en
forma inmediata, indicando la presencia de la enzima.
Reactivo reducido

O2
oxidasa

Reactivo oxidado

H2O
Para la realizacin de la prueba se utilizan discos de papel que contienen el reactivo (la
naturaleza del reactivo vara con los distintos sistemas comerciales pero se trata de derivados
de la p-fenilendiamina).
Se prepara una suspensin densa del microorganismo en 0,2 ml de agua (destilada o corriente).
Colocar el disco en contacto con la suspensin, la aparicin de color rosado en menos de 1 minuto
indica Oxidasa Positivo.

Prueba de reduccin de Nitratos

Las bacterias pueden utilizar nitratos por asimilacin (reduccin del nitrato a amonaco que se
utiliza como fuente de nitrgeno), desasimilacin (cuando se utiliza como aceptor final en
ausencia de oxgeno, reducindose a nitrito) y desnitrificacin (cuando se convierte en
productos finales gaseosos, como nitrgeno, xido nitroso u xido de nitrgeno).
La reduccin de los nitratos ocurre generalmente en condiciones de baja tensin de oxgeno.
Para poner en evidencia la capacidad de reducir el nitrato se emplea el siguiente medio:
Caldo Nitrato
(Composicin (g/l))

Extracto de carne
Peptona
5
NO3K

3
1

Se envasa en tubos y se coloca una campanita de Durham. Se siembra con un inculo denso y se
incuba 24hs. Luego se determina la presencia de N2 , NH3 y NO2- .

Revelado e interpretacin:
Presencia de N2: se verifica la presencia de gas en la campanita.
Presencia de NH3: Agregar a una porcin del cultivo unas gotas del reactivo de Nessler
(iodomercuriato de potasio). Este reactivo, en presencia de iones amonio se descompone con
formacin de ioduro de dimercuriamonio que permite una determinacin colorimtrica de iones
amonio. Si se observa un precipitado color ladrillo rpidamente, indica un resultado positivo.
Presencia de NO2-: Agregar a una porcin del cultivo 2 gotas del reactivo Nit-1 (solucin
actica de cido sulfanlico) y luego 2 gotas del reactivo Nit-2 (solucin actica de alfa
dimetilnaftilamina).
NO3-

NO2- + c. Sulfanlico

Sal de diazonio + dimetilnaftilamina

Sal de diazonio
p sulfurobenceno azo naftilamina (color rojo)

La aparicin de un color rojo en la superficie indica reaccin positiva.

En caso de que esta reaccin sea negativa, se puede verificar la presencia del nitrato propio del
medio agregando una pizca de Zn. Dado que el Zn reduce el nitrato a nitrito, si el nitrato del
medio no fue reducido debera aparecer el color rojo confirmando una reaccin negativa. En el
caso de que el medio permanezca incoloro, la reaccin es positiva habindose metabolizado el
nitrato hacia otros productos no detectados con las reacciones anteriores.
Prueba de licuefaccin de la gelatina

Permite determinar la capacidad de un microorganismo de producir enzimas del tipo proteoltico

(gelatinasas).
Para poder ingresar a la clula bacteriana las protenas deben ser primero catabolizadas a
compuestos ms pequeos. Las enzimas exocelulares de tipo proteoltico, gelatinasas, son
secretadas por ciertas bacterias para desdoblar las protenas. El catabolismo puede ser
considerado en dos etapas:
Proteinasas

Protena + H2O

polipptidos
Peptidasas

Polipptidos + H2O

aminocidos

Medio de cultivo: Gelatina nutritiva

Composicin g/l

Extracto de carne
Peptona
Gelatina

3
5
12

Se envasa y esteriliza por Tyndallizacin. Se siembra por puncin. Luego se incuba a 37C
durante 24hs a 48 hs. Antes de la lectura se debe enfriar los tubos. Observar la presencia de
desarrollo y licuefaccin comparando con un tubo control.
Prueba de la Coagulasa
La coagulasa es capaz de activar especficamente la cascada de coagulacin por activacin
conformacional (no proteoltica) de la protrombina. Este proceso desencadena la conversin de
fibringeno en fibrina lo cual da lugar a la coagulacin an en presencia de anticoagulantes como
el citrato o el oxalato. El resultado es la formacin de cogulos o grumos cuando se mezcla una
suspensin bacteriana con plasma. Esta prueba se utiliza para diferenciar microorganismos del
gnero Staphylococcus:
(+) Staphylococcus aureus
(- ) Staphylococcus epidermis

Procedimiento e interpretacin:
-Prueba rpida en portaobjetos: se prepara una suspensin bien homognea del microorganismo
sobre el portaobjetos y se agrega una gota de plasma de conejo. Se mezclar suavemente con el
ansa y despus por rotacin. La prueba se considera positiva si hay aglutinacin microscpica.
-Prueba en tubo: en un tubo mezclar 0.5 ml de plasma de conejo y una ansada cargada de la
bacteria a ensayar. Rotar suavemente el tubo sin sacudir. Incubar a 35C 2-4 horas y observar
cada 30 minutos.

PRECAUCIN: no sacudir el tubo durante la observacin, inclnelo suavemente para ver el

cogulo. Si este no es visible al final de las 3 horas, djelo en la estufa por 24 hs.
La lectura a las 4 horas es fundamental porque puede suceder que las fibrinolisinas de S. aureus
lisen el cogulo luego de 18 horas de incubacin y de esta manera se produzca un test falso
negativo.
Prueba positiva: Cogulo completo o cogulo parcial (el cogulo no abarca completamente la
columna del fluido)
Prueba negativa: No hay formacin de cogulo, la suspensin permanece homognea
Presencia de la enzima catalasa
Esta enzima se encuentra en la mayora de las bacterias aerobias y anaerobias facultativas.
Es una hemo-protena. Uno de sus sustratos es el H 2O2 que se forma durante la degradacin de
los azcares. Este compuesto es txico si se acumula en la clula. Su descomposicin puede
producirse a travs de dos enzimas, catalasa y peroxidasa.
La prueba se realiza a partir de un cultivo del microorganismo en caldo nutritivo, agregando unas
gotas de agua oxigenada y observando la formacin de burbujas.
Es importante partir de cultivos libres de sangre ya que los glbulos rojos contienen la enzima.
Utilizacin del citrato como nica fuente de carbono
Esta prueba se realiza para determinar si un microorganismo es capaz de utilizar el citrato como
nica fuente de C y energa.
El citrato puede ser metabolizado mediante la enzima citrato oxalacetato liasa que lo desdobla
en acetato y oxalacetato (Ciclo reductivo de Krebs). Este ltimo es convertido luego en piruvato,
que proporciona as materias primas para la biosntesis.
Para evaluar la utilizacin del citrato se utiliza el medio de Simmons que contiene azul de
Bromotimol como indicador de pH, citrato y sales de amonio. Si la bacteria crece, eleva el pH y
hace virar el indicador de verde (pH 6.6) a azul (pH 7.7).
Las bacterias que utilizan el citrato como fuente de C utilizarn el amonio presente en el medio
de cultivo, como fuente de nitrgeno.
Medio de Simmons
(Composicin en g/l)

MgSO4
(NH4)H2PO4
K2HPO4
1
Citrato de Na
NaCl
Agar
Azul de Br timol

0,2
0,1
2
5
15
0,08

10

Se envasa, esteriliza y deja solidificar en posicin inclinada. Se siembra por estras con ansa
recta. Se incuba durante 24 hs.
La aparicin de desarrollo con intenso color azul indica un resultado positivo.
Hidrlisis del DNA
Esta prueba permite demostrar la presencia de la enzima DNAsa producida por los
microorganismos, mediante la hidrlisis del DNA contenido en el medio de cultivo.

Medio de cultivo
(Composicin g/l)

Extracto de carne
Peptona de casena
Peptona de carne
NaCl
DNA
Agar

5
10
5
5
2
15

A partir de un cultivo de 24 hs se siembra en la superficie del medio de cultivo contenido en

placa de Petri, con ansa en anillo en forma puntual (spot) sobre la placa. Se pueden sembrar
varios cultivos en una placa. Incubar durante 24 hs a 37C.

Revelado e interpretacin:
Se revela cubriendo la placa con una solucin de HCl 1N. El HCl provocar la precipitacin del
DNA intacto.
Ensayo positivo: se observa una zona clara alrededor del spot que contrasta con la turbidez del
medio (el cultivo produce DNAsa).
Ensayo negativo: ausencia de dicha zona clara.
El medio se puede modificar agregando azul de toluidina o verde de metilo en concentracin de
0.05 gr/lt. El mtodo tiene una ventaja que permite detectar la actividad de DNasa mediante la
transparencia del colorante alrededor de las colonias productoras de DNasa. NO se agrega
cido y las colonias se pueden recoger directamente de la placa para estudios posteriores.
Hidrlisis del almidn
Esta prueba pone en evidencia la capacidad del microorganismo del hidrolizar el almidn
presente en el medio de cultivo.
Infusin de carne
hidrolizado de casena
almidn
Agar

2
17.5
1.5
13

11

Medio de cultivo
(Composicin g/l)

Se siembra el microorganismo en la superficie del medio contenido en placa de Petri, mediante

una estra realizada con ansa en anillo. Se lleva a incubar 24 hs a 37C.

Revelado e interpretacin:
Se revela baando el desarrollo con una solucin I 2-Iodurada (Lugol al 5%).
El medio conteniendo almidn se teir de azul, contrastando con el halo incoloro que se observa
alrededor de la estra del cultivo capaz de hidrolizar el almidn.
Prueba de la Ureasa
Es particularmente til para diferenciar Proteus spp. de otros miembros de la familia
Enterobacteriaceae.
El medio de cultivo, formulado por Rustigian y Stuart, presenta bajo contenido de nutrientes y
alta capacidad buffer. El extracto de levadura es la nica fuente de carbono, nitrgeno,
vitaminas y cofactores, y aporta los nutrientes esenciales para el desarrollo bacteriano. Las
sales de fosfatos constituyen el sistema buffer, el rojo de fenol es el indicador de pH y la urea
es el sustrato de la enzima ureasa. Aquellas bacterias que poseen la enzima ureasa, pueden
utilizar el nitrgeno proveniente de la urea, la hidrolizan, liberando 2 molculas de amonaco y
dixido de carbono. Estos productos metablicos alcalinizan el medio, haciendo virar el indicador
rojo fenol del amarillo al rojo. Su uso, se recomienda para diferenciar Proteus spp. de otros
gneros. Para organismos que hidrolizan la urea lentamente, es recomendable usar el medio de
Christensen.
Urea
Fosfato
Medio
demonopotsico
cultivo
Fosfato disdico
(Composicin
g/l)
Extracto de levadura
Rojo fenol
pH final: 6.8 0.2

20
9.1
9.5
0.1
0.01

Incubacin
A 35-37 C, en aerobiosis. Observar las reacciones a las 8, 12, 24 y 48 horas de incubacin. Para
aquellos microorganismos que hidrolizan lentamente la urea, incubar hasta 72 horas. -La gran

12

capacidad buffer de este medio de cultivo, puede enmascarar la actividad uresica en bacterias
que hidrolizan lentamente la urea.
No calentar o sobrecalentar el medio de cultivo porque la urea se descompone fcilmente.
Produccin de pigmentos
Agar F:
Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de especies de
Pseudomonas spp. en base a la produccin de fluorescena. Conocido tambin como medio King B.
En el medio de cultivo, la triptena y la peptona de carne aportan los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, la concentracin de
fosfatos estimula la produccin de fluorescena e inhibe la produccin de piocianina y piorrubina.

agar F
(composicin en g/l)
Triptena
Peptona de carne
Fosfato dipotsico
Sulfato de magnesio
Agar
pH final: 7.2 0.2

10
10
1.5
1.5
15

Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril.

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas
spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Incubar durante 18-24 horas a 35-37C,
en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, reincubar a 25-30C, o dejar a 22 C y observar
diariamente hasta 7 das.

Interpretacin de resultados
Examinar las colonias bajo luz ultravioleta, a 260 nm. Se considera un resultado positivo la
observacin de fluorescena, que es un pigmento de color amarillo, amarillo-verdoso fluorescente
que rodea la colonia o que se extiende por todo el medio de cultivo debido a fenmenos de
difusin.
Limitaciones
Algunas cepas de P. fluorescens y P. putida solo producen fluorescena a temperatura ambiente,
y se pueden obtener resultados falsos negativos si el medio se incuba a 30-35C, por eso, ante la

13

ausencia de crecimiento luego de incubacin a 35-37C, se recomienda dejar los tubos

conteniendo el medio de cultivo a temperatura ambiente.

Agar P: Medio de cultivo utilizado para el aislamiento, la deteccin y la diferenciacin de

especies de Pseudomonas spp. en base a la produccin de piocianina. Conocido tambin como
medio King A. En el medio de cultivo, la peptona de gelatina aporta los nutrientes necesarios para
el desarrollo bacteriano, la glicerina favorece la produccin de pigmentos, las sales de magnesio
y potasio estimulan la produccin de piocianina y piorrubina e inhiben la produccin de
fluorescena.

agar P

Peptona de
(composicin
en gelatina
g/l)
Sulfato de potasio
Cloruro de magnesio
Agar
pH final: 7.0 0.2

20
10
1.4
15

Al medio, luego de esterilizado, se le agrega 10 ml de glicerina estril.

A partir de un cultivo puro de 18-24 horas, del cual se sospeche la presencia de Pseudomonas
spp., tomar una colonia y estriar la superficie del medio. Se incuba durante 18-24 horas a 35-37
C, en aerobiosis. Si no se observa crecimiento, re-incubar a 25-30 C, o dejar a 22 C y
observar diariamente hasta 7 das.

Interpretacin de resultados
Un resultado positivo se verifica por observacin de los pigmentos piocianina y/o piorrubina. La
produccin de piocianina se observa como una zona color azul, azul-verdoso que rodea la colonia,
o que se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusin del pigmento. La produccin

14

de piorrubina se observa como una zona de color rojo oscuro-pardo alrededor de la colonia o que
se extiende en todo el medio de cultivo debido a la difusin del pigmento.

Limitaciones
- La ausencia de piocianina no descarta que el microorganismo aislado sea P. aeruginosa. - Bajas
cantidades de piocianina pueden no ser evidenciadas, por eso, ante la sospecha de su presencia,
se recomienda agregar al medio de cultivo unas gotas de cloroformo, para exaltar la visualizacin
del pigmento.
- La presencia concomitante de piorrubina y/o piomelanina, puede afectar la visualizacin del
color caracterstico de la piocianina.
- La produccin de pigmento, puede aumentarse dejando los tubos conteniendo medio de cultivo a
22 C luego de haberlos incubado previamente toda la noche a 35-37 C.
Medio SIM
Es un medio semislido destinado a verificar la movilidad, produccin de indol y de sulfuro
de hidrgeno en un mismo tubo. Es til para diferenciar miembros de la familia
Enterobacteriaceae.

Fundamento: El triptfano es un aminocido constituyente de muchas peptonas, y

particularmente de la triptena, que puede ser oxidado por algunas bacterias para formar
indol. En el proceso interviene un conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol
producido se combina con el aldehdo del reactivo de Kovacs o de Erlich, para originar un
compuesto de color rojo. Las cepas mviles pueden apreciarse en este medio, por la
turbidez que producen alrededor de la puncin de siembra, mientras que aquellas cepas
productoras de sulfhdrico se distinguen por la formacin de un precipitado negro de
sulfuro de hierro a partir del tiosulfato siempre que el medio se mantenga a un pH mayor a
7.2.

Frmula (en gramos por litro)

Triptena
20.0
Peptona
6.1
Sulfato de hierro y 0.2

Instrucciones
Suspender 30 g del polvo por
litro de agua destilada. Mezclar
hasta
disolver;
calentar

15

amonio
Tiosulfato de sodio
Agar

0.2
3.5

agitando y hervir durante un

minuto. Distribuir unos 4 ml en
tubos de hemlisis y esterilizar
en autoclave a 121C durante 15
minutos. Solidificar en posicin
vertical.

pH final: 7.3 0.2

Siembra: A partir de un cultivo de 18-24 horas en medio slido, sembrar por puncin
profunda con aguja de inoculacin recta (no usar ansa con anillo). Se debe inocular el centro
del tubo, y la puncin debe abarcar 2 tercios de profundidad del medio de cultivo desde la
superficie.
Es
importante
que
la
siembra
se
realice
en
lnea
recta.
Incubacin:
Durante
24
horas,
a
35-37
C,
en
aerobiosis.
Luego de la incubacin, agregar 3-5 gotas de reactivo de Kovacs o de Erlich.
Resultados:
Cepas mviles: producen turbidez del medio, que se extiende mas all de la lnea de siembra.
Cepas inmviles: el crecimiento se observa solamente en la lnea de siembra.
Cepas SH2 positivas: ennegrecimiento a lo largo de la lnea de siembra o en todo el medio.
Cepas
SH2
negativas:
el
medio
permanece
sin
cambio
de
color.
Cepas indol positivas: desarrollo de color rojo luego de agregar el reactivo de Kovacs o de
Erlich.

Cepas indol negativas: sin cambio de color.

Limitaciones
-En las bacterias aerobias estrictas, que slo crecen en superficie, la movilidad puede ser
difcil de observar.
-Algunas bacterias productoras de melanina como M. morganii, pueden dar un color parduzco,
que no debe confundirse con el color negro debido a la produccin de cido sulfhdrico.
Caldo Mac Conkey.
Medio de cultivo selectivo, utilizado para la investigacin presuntiva de microorganismos
coliformes en aguas, alimentos y otros materiales de importancia sanitaria.

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Fundamento: En el medio de cultivo, la peptona es la fuente de aminocidos y de otros

factores de crecimiento, la lactosa es el hidrato de carbono fermentable, la bilis de buey
estimula el crecimiento de las bacterias coliformes e inhibe a gran parte de la flora gram
positiva, y el prpura de bromocresol es el indicador de pH.
Los coliformes, son microorganismos que fermentan la lactosa, con produccin de cido y gas.
Al acidificar el medio, se produce un viraje del indicador de pH del color prpura al amarillo.
Frmula (en gramos por litro)
Bilis de buey
5.0
Peptona
20.0
Lactosa
10.0
Prpura de
0.01
bromocresol

Instrucciones
Suspender 35 g de polvo por
litro de agua destilada. Disolver
y distribuir 10 ml por tubo con
campanita
de
Durham.
Esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos.

pH final: 7.3 0.2

Siembra:
Para recuento de coliformes totales, tcnica del Nmero Mas Probable:
Para el anlisis de muestras fluidas como el agua, sembrar por triplicado: 10 ml en caldo doble
concentracin y 1ml y 0,1 ml en caldo simple concentracin.
Nmero
de tubos
3
3
3

Volumen
de
la
muestra
10 ml
1 ml
0.1 ml

Volumen
de medio

Concentracin
del medio

10 ml
10 ml
10 ml

Doble
Simple
Simple

Para muestras slidas (alimentos, cosmticos, frmacos), efectuar diluciones seriadas 10 -1,
10-2 y 10-3 y sembrar cada dilucin por triplicado en medio de cultivo simple concentracin.

Nmero
de tubos
3

Dilucin
de
la
muestra
10-1

Volumen
de
la
muestra
1 ml

Volumen
de
medio
10 ml

Concentracin
del medio
Simple

17

3
3

10-2
10-3

1 ml
1 ml

10 ml
10 ml

Simple
Simple

Incubacin
Incubar los tubos 24-48 horas a 35-37 C.
Resultados
Se considera resultado positivo el viraje al amarillo del color del medio y la produccin de gas
Expresin de resultados: Para muestras de fluidos expresar el NMP por 100 ml de muestra, y
para muestras slidas, expresarlo por gramo de producto.

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