Trabajo Prctico II

Mtodos espectrofotomtricos para la

determinacin de concentraciones de
macromolculas.

Eivers Mara del Mar

Graa Karen
Merlo Santiago

Objetivos
1. Conocer los principales mtodos de cuantificacin de protenas.
2. Construir una recta de calibracin con una solucin de albmina de suero bovino como
protena patrn para cada uno de los mtodos de Bradford y Lowry.
3. Determinar la linealidad, la sensibilidad, el lmite de deteccin y el rango de cada uno de
los mtodos ensayados.
4. Determinar la concentracin total de protenas en una muestra incgnita.

Metodologa
Para la realizacin de esta prctica se realizaron dos curvas de calibracin, con el fin de
determinar la concentracin de distintas muestras incgnita. Para realizar una de las curvas se
sigui el mtodo de Bradford, y para la otra, el de Lowry.
Mtodo de Bradford
:
Para el protocolo de Bradford se utiliz una solucin patrn de seroalbmina bovina (BSA) en
concentracin 0,5 mg/ml, as como tambin el Reactivo de Bradford (modificado), el cual consta
de 40 mg de Coomassie Brilliant Blue G 250, 50 ml de etanol y 100 ml de cido fosfrico 85%
completados con agua destilada.
Siguiendo el mtodo, se confeccionaron dos series de ocho tubos, en los cuales se agregaron 2
ml del reactivo de Bradford a 0,1 ml de solucin proteica. Cinco de los ocho tubos cubrieron el
rango de entre 5 y 25 g de protena (para lo cual se realizaron diluciones de la solucin patrn de
BSA), uno de los ocho se utiliz como blanco y a cada uno de los otros dos se les agreg una
muestra incgnita diferente. A nuestro grupo le fueron asignadas las muestras A y D. El contenido
de cada tubo se detalla en la Tabla 1.
Luego cada tubo se agit en el vrtex y, pasados dos minutos, se midi la absorbancia a 595 nm.
Una vez medidas las absorbancias de todos los tubos, se construy una curva de calibracin
utilizando dichos valores de absorbancia y la masa proteica de cada tubo. Los valores de
absorbancia graficados fueron el resultado de realizar el promedio de cada par de absorbancias
obtenidas a una misma masa de protena.
Utilizando el valor de la pendiente de la curva (p), se calcul el valor de la masa de protenas en
las muestras incgnita, despejando de la siguiente manera:
P endiente = Absorbancia/gdeprotenas
gdeprotenas = Absorbancia/P endiente

Tabla 1
. Tabla resumen del protocolo de Bradford, con el contenido de cada tubo correspondientes diluciones
de la solucin patrn de BSA.

Mtodo de Lowry
:
Se procedi de manera anloga para cuantificar otra solucin incgnita mediante el mtodo de
Lowry.
Para este se utiliz una solucin patrn de BSA en concentracin 0,5 mg/ml, el Reactivo de
Folin-Cicateau, el cual es una mezcla de fosfomolibdato y fototungstano, y una solucin alcalina.
Dicha solucin alcalina se compone de solucin de tartrato de sodio y potasio al 2%, solucin de
Cu
SO
.5H
O al 1% y solucin de Na
CO
al 2% en NaOH 0,1 N, en relacin 0,1:0,1:10
2
4
2
2
3
respectivamente.
Siguiendo el protocolo de Lowry, se confeccionaron dos series de siete tubos. Cinco de ellos
cubrieron el rango de 25 g a 125 g de protena (para lo cual se realizaron diluciones de la
solucin patrn de BSA), uno constituy el blanco y al restante se le agreg una solucin incgnita.
El contenido de cada tubo se detalla en la Tabla 2.
A cada uno de los cuales se le agregaron 2 ml de la solucin alcalina de cobre. Luego se agitaron
los tubos en el vrtex y se los dej reposar durante 10 minutos a temperatura ambiente.
Finalmente, se agregaron a los tubos 0,2 ml del reactivo de Folin y, luego de agitarlos nuevamente
en el vrtex, se los dej reposar 30 minutos a temperatura ambiente. Pasados los 30 minutos, se
midi la absorbancia de cada uno de los tubos a 660 nm.
Una vez medidas las absorbancias de todos los tubos, se construy una curva de calibracin
utilizando dichos valores de absorbancia y la masa proteica de cada tubo. Al igual que en el
mtodo anterior, los valores de absorbancia graficados fueron el resultado de realizar el promedio
de cada par de absorbancias obtenidas a una misma masa de protena.
Utilizando el valor de la pendiente de la curva (p), se calcul el valor de la masa de protenas en
la muestras incgnita, despejando de manera anloga a la de la curva de Bradford.

Tabla 2
. Tabla resumen del protocolo de Lowry, con el contenido de cada tubo correspondientes diluciones de la
solucin patrn de BSA.

Finalmente, con las ecuaciones de las curvas obtenidas mediante ambos mtodos, se procedi a
calcular la masa proteica contenida en cada una de las soluciones incgnita.

Resultados
Mtodo de Bradford
:
Con los resultados obtenido a travs de la aplicacin del mtodo de Bradford se realiz el
siguiente grfico (los datos utilizados para la realizacin de la curva de calibracin se detallan en la
Tabla 5 ubicada en la seccion Anexo):

Grfico 1.
Promedio de absorbancias a 595nm obtenidas en ambas series vs masa de protenas.

A travs de la ecuacin obtenida luego de realizar un ajuste lineal se pudo calcular la

concentracin de ambas muestra incgnitas:

Muestra Incgnita A:
Absorbancia de la muestra A = 0,380
Absorbancia de la muestra A = 0,400
Absorbancia de la muestra A - Absorbancia del blanco = -0,016
Absorbancia de la muestra A - Absorbancia del blanco = 0,003
Promedio de ambas absorbancias = -0,007
0, 007 = 0, 02X
X = 0, 35g = 0, 00035mg
0, 00035mg 0, 1ml
0, 0035mg 1ml
[MuestraA] = 0, 00mg
ml
Muestra Incgnita D:
Absorbancia de la muestra D = 0,890
Absorbancia de la muestra D = 0,928
Absorbancia de la muestra D - Absorbancia del blanco = 0,494
Absorbancia de la muestra D - Absorbancia del blanco = 0,531
Promedio de ambas absorbancias = 0,513
0, 513 = 0, 02X
X = 25, 65g = 0, 02565mg
0, 02565mg 0, 1ml
0, 2565mg 1ml
[MuestraD] = 0, 26mg
ml

En la prctica, para evitar todos estos clculos y pasajes de unidades se suele calcular un
factor el cual al ser multiplicado por la absorbancia de la muestra incgnita nos da
directamente la concentracin expresada en mg/ml. A continuacin se calcular dicho factor
y multiplicar por la absorbancia de la muestra D para ver si se llega al mismo resultado:
0, 513 = 0, 02X
0, 513x1/0, 02 = X(g)
4

0, 513x50 = X(g)
0, 513x50/1000 = X(mg)
0, 513x0, 05 = X(mg)
0, 513x0, 05/0, 1ml = X(mg/ml)
0, 513x0, 5 = X(mg/ml)
F actor = 0, 5
[MuestraD] = 0, 26mg
ml
Mtodo de Lowry
:
Con los resultados obtenido a travs de la aplicacin del mtodo de Lowry se realiz el siguiente
grfico (los datos utilizados para la realizacin de la curva de calibracin se detallan en la Tabla 8
ubicada en la seccion Anexo):

Grfico 2.
Promedio de absorbancias a 660nm obtenidas en ambas series vs. masa de protenas.

A travs de la ecuacin obtenida luego de realizar un ajuste lineal se pudo calcular la

concentracin de la muestra incgnita:

Absorbancia de la muestra = 0,353

Absorbancia de la muestra = 0,344
Absorbancia de la muestra - Absorbancia del blanco = 0,315
Absorbancia de la muestra - Absorbancia del blanco = 0,313
Promedio de ambas absorbancias = 0,314
5

0, 314 = 0, 004X
X = 78, 5g = 0, 0785mg
0, 0785mg 0, 4ml
0, 196mg 1ml
mg

[MuestraIncgnita] = 0, 20 ml
Ahora calculamos el factor pero para el mtodo de Lowry:

0, 314 = 0, 004X
0, 314x1/0, 004 = X(g)
0, 314x250 = X(g)
0, 314x250/1000 = X(mg)
0, 314x0, 25 = X(mg)
0, 314x0, 25/0, 4ml = X(mg/ml)
0, 314x0, 625 = X(mg/ml)
F actor = 0, 625
[MuestraD] = 0, 20mg
ml

Discusin
Mtodo de Bradford
Este mtodo nos permite cuantificar protenas en una determinada muestra ya que involucra la
fijacin de la protena a un colorante (Coomassie Blue) por interacciones electrostticas. El
colorante libre, que presenta una coloracin rojiza, se torna azul cuando interacciona con la
protena, ms precisamente con sus aminocidos bsicos: lisina y arginina. Cuando ocurre esta
unin, el espectro de absorcin se modifica y es la magnitud que se mide en el laboratorio para
cuantificar dichas concentraciones. Se trabaj a 595 nm ya que es la longitud de onda en la cul el
colorante en su forma aninica presenta su pico de absorbancia.
Muestra A:
El promedio de las absorbancias medidas dio como resultado un nmero negativo (-0,007)
.
Si bien
un espectrofotmetro no puede darnos un valor negativo de absorbancia, un
Abs si puede ser
menor a cero ya que es un valor relativo a la absorbancia del blanco. En este caso no es un
resultado coherente

ya que la absorbancia medida de la muestra de la primer serie result menor

que la del blanco, que se trataba slo del solvente. Esto se pudo deber a un error de pipeteo o a
un error del espectrofotmetro; con respecto al pequeo nmero obtenido como resultado del
promedio de las absorbancias de las muestras incgnitas pertenecientes a ambas series se lo
puede atribuir a que la muestra incgnita se trataba del blanco o bien que la muestra posea
menor cantidad de protena que el lmite de deteccin. Es decir, una cantidad tan pequea de
protena la cual no entraba en el rango detectable del espectrofotmetro.
6

Al calcular la concentracin de protena en la muestra A utilizando este valor negativo de

absorbancia, se llega a un valor de 0,00mg/ml. Esto significa que efectivamente la muestra D no
contena protena, pero que debido a un error de los mencionados anteriormente, presentaba una
absorbancia menor a la del blanco.

Muestra D
:
La masa calculada en la muestra incgnita D mediante Bradford arroj un resultado de 25, 65g
de protena
.
Esta masa cae por fuera de la curva de calibracin que se construy, lo que significa
que en esa zona de la curva se pierde la linealidad y por lo tanto no se cumple la ley de
Lambert-Beer.
Haber aproximado la concentracin de la muestra D mediante la ecuacin de la lnea de
tendencia implica un aporte muy grande de error en los resultados. Para obtener resultados ms
fidedignos se debera repetir la experiencia diluyendo a la mitad la muestra incgnita de forma tal
que la absorbancia caiga dentro del rango de la curva de calibracin.
Mtodo de Lowry
2+
En este mtodo, la coloracin ocurre por la formacin de un complejo entre el Cu
y los
nitrgenos de los enlaces peptdicos. Para resaltar el color de esta reaccin y aumentar la
sensibilidad se utiliz el reactivo de Folin-Ciocalteau, que se reduce en presencia de los residuos
de aminocidos tirosina y triptfano dando un color azul. Este reactivo se descompone en
solucin, por lo que hay que agitar inmediatamente el tubo de ensayo una vez que se lo agrega
para que reaccione con la BSA.
La reaccin que ocurre con la protena no es estequiomtrica, por lo que no existe una correlacin
entre las molaridades de reactivos y productos, pero si es una reaccin reproducible que nos
permite hacer una comparacin con un estndar y de esta forma calcular la concentracin de
protena en la muestra.
La solucin alcalina que se utiliza en la reaccin (ver su composicin en Metodologa) se prepara
en un cierto orden, mezclando en un principio Tartrato de sodio y potasio con Sulfato de cobre
pentahidratado, y finalmente agregando carbonato de sodio. Este orden se debe a que el tartrato
que se incorpora primero cumple la funcin de mantener al cobre en solucin y evitar que
precipite con el agregado posterior de carbonato de sodio. Si el orden fuera otro, precipitara el
cobre evitando as que participe de la reaccin.

Muestra Incgnita:
Se cometi un error al pipetear agua en exceso en el tubo 3 de la segunda serie para el mtodo de
Lowry. Si bien no era mucho el volumen de agua en exceso, podra haber afectado nuestros
resultados. Al analizar los resultados obtenidos se observ que al realizar el promedio de las
absorbancias para el tubo 3 por duplicado y al graficar la lnea de tendencia se redujo este error,
ya que teniendo en cuenta o no el punto correspondiente a este tubo, la variacin en la ecuacin
7

de la recta era despreciable. Por lo tanto se decidi tenerlo en cuenta dentro de nuestros valores
al graficar.
Con este mtodo, se obtuvo una masa de protena en la muestra de 78, 5g
, cuyo valor caa
dentro del rango de la curva de calibracin realizada en el cual se cumpla la ley de Lambert-Beer.
En este trabajo se logr complir con los objetivos. Aprendimos a construir una curva de
calibracin a partir de una solucin patrn, y utilizando esta herramienta pudimos calcular
concentraciones de protena en determinadas muestras incgnitas por mtodos como el de
Bradford o Lowry.
Si bien ambos mtodos se utilizan en la prctica, tienen aplicaciones distintas dependiendo de la
concentracin proteica con la que voy a trabajar y de la estructura primaria de la protena en
cuestin:
El mtodo de Bradford tiene un rango de trabajo de 0,1 a 10 g de protena/ml, fuera del cul se
pierde la linealidad. Presenta menor lmite de deteccin que Lowry, por lo que se lo puede usar
para discriminar cantidades pequeas de protena. Presenta la ventaja de ser un mtodo
compatible con agentes reductores y til cuando se necesita rapidez en la coloracin.
El mtodo de Lowry tiene un rango de 1 a 100 g de protena/ml, por lo tanto cubre un rango
mayor que el de Bradford, pero a su vez tiene menos sensibilidad ya que su pendiente en la lnea
de tendencia es menor y no podramos distinguir entre dos valores de absorbancia para dos
concentraciones muy cercanas pero distintas.
Ambos mtodos presentan interferencias de distintas sustancias que interfieren en el dosaje de
protenas. Para Lowry las sustancias involucradas son los derivados aminados, los componentes de
ciertos buffers, EDTA, SDS, Tritn X-100, cidos grasos, nucletidos, sales, azcares, mientras que
para el mtodo de Bradford interfieren en mayor medida los detergentes.
Es necesario destacar que cualquiera de los dos mtodos puede resultarnos ms o menos til
dependiendo de qu tipo de aminocidos contenga la protena a analizar. Por ejemplo, si se
poseen dos patrones de protenas que difieren en el contenido de tirosina y triptofano, dos
aminocidos con grupos aromticos en su estructura, una curva de calibracin realizada con el
mtodo de Lowry resulta ms til para el patrn que posea ms cantidad de estos aminocidos
que una realizada con el mtodo de Bradford. Esta diferencia se debe a que los grupos
cromognicos que intervienen principalmente en el mtodo de Lowry son el triptofano y la
tirosina. Es as que las absorciones mximas se obtendrn con protenas que contengan estos
aminocidos, y por lo tanto las curvas de calibracin realizadas con patrones de estas protenas
sern ideales para averiguar concentraciones de soluciones incgnita. De la misma manera, si se
poseen dos patrones que difieren en la cantidad de aminocidos bsicos, es conveniente realizar
una curva de calibracin del patrn con mayor cantidad de ellos mediante el mtodo de Bradford.
Esto se debe a que este mtodo aprovecha la unin del colorante Coomassie Blue a las protenas,
y estudios sugieren que est unin slo se realiza si la protena contiene grupos funcionales
bsicos. Garantizando la unin al colorante, se garantiza una buena absorcin a 595 nm que
permitir obtener una curva de calibracin til para la cuantificacin de otras protenas.

Anexo
Datos utilizados para la realizacin de las curvas de calibracin.
Mtodo de Bradford

Tabla 3.
Datos obtenidos de la primera serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro.

Tabla 4.
Datos obtenidos de la segunda serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro.

Tabla 5.
Datos obtenidos como resultado del promedio de ambas series.

Mtodo de Lowry

Tabla 6.
Datos obtenidos de la primera serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro.

Tabla 7.
Datos obtenidos de la segunda serie como resultado de la medicin con un espectrofotmetro. *Hubo un
error en la preparacin de este tubo ya que se coloc ms agua que la que informa el protocolo.

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Tabla 8.
Datos obtenidos como resultado del promedio de ambas series.

Bibliografa.
-

Gua de trabajos prcticos

. Qumica Biolgica, 1er cuatrimestre de 2015
. Departamento de
Qumica Biolgica, FCEyN, UBA. 2015.

Anexo Terico. Qumica Biolgica, 1er cuatrimestre de 2015. Mtodos para la

cuantificacin de protenas.

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