Influencia del pH y temperatura en la

produccin de galacturonasas por

Aspergillus fumigatus
Resumen
La produccin de poligalacturonasas (PG) por Aspergillus fumigatus LB-01-AP fue
evaluada en procesos sumergidos a diferentes a diferentes concentraciones de
pectina, glucosa y valores iniciales de pH del medio. Las mayores actividades de
endo- y exo-poligalacturonasas fueron reportadas en medio sin glucosa y con 20
gL-1 de pectina ctrica, a un pH inicial de 4.0. En cuanto al efecto de la temperatura
sobre la accin enzimtica, se encontr que el intervalo entre 40 y 60C es el ideal
para la endo-PG, mientras que para la exo-PG la mayor actividad fue medida a
60C. Cuando las enzimas experimentales crudas fueron expuestas a distintas
temperaturas por ms de 150 min, se observ que alrededor del 70% de la
actividad de endo-PG a 50C se conserv. Ambas poligalacturonasas mostraron
mayor termoestabilidad que la descrita usualmente en la literatura para enzimas
producidas por otras especies del gnero Aspergillus.Adems, las preparaciones
enzimticas obtenidas probaron ser libres de micotoxinas, evidenciando un uso
potencial de estas enzimas en aplicaciones industriales.

1. Introduccin
La importancia de enzimas microbianas en aplicaciones biotecnolgicas ha
crecido significantemente en las ltimas dos dcadas. Enzimas de hongos pueden
ser industrialmente producidas mediante cultivos sumergidos y en estado slido. A
pesar de que ambos procesos han cobrado mritos, cerca del 90% de todas las
enzimas industriales son producidas en medio lquido debido a varias ventajas
durante el proceso, sobre el cultivo slido (Holker, Hofer y Lenz, 2004). Las
mayores ventajas encontradas en cultivos sumergidos son las facilidades en
aumentar proporcionalmente y controlar parmetros como pH, temperatura,
transferencia de oxgeno y humedad (Couto y Sanroman, 2006).
Poligalacturonasas fngicas (PG) son particularmente importantes para la industria
alimentaria, principalmente en la clarificacin de jugos frutales (Sandri,Fontana,
Barfknecht, y Silveira, 2011) y vinos (Mojsov, Ziberoski, Bozinovic, y Petreska,
2011).

La produccin de galacturonasas es usualmente realizada por hongos

pertenecientes al gnero Aspergillus. Los miembros de ste gnero presentan
como caracterstica general alta actividad del complejo pectinoltico, con varias
especies referenciadas como productores enzimticos: Aspergillus japonicus
(Teixeira, Lima-Filho, y Durn, 2000), Aspergillus awamori (Blandino, Iqbalsyah,
Pandiella, Cantero, y Webb, 2002), Aspergillus nidulans (Maccabbe, Orejas,
Tamayo, Villanueva, y Ramn, 2002), Aspergillus oryzae (Fontana y Silveira,
2012), Aspergillus niger (Sandri, Lorenzoni, Fontana, y Silveira, 2013), Aspergillus
sojae (Tari, Dogan, y Gogus, 2008), y Aspergillus fumigatus (Baffi, Romo-Snchez,
beda-Iranz, y Briones-P+erez, 2012) han sido usados en la produccin de
enzimas pectinolticas.
En general, la produccin fermentativa de estas enzimas requiere especial
atencin en la composicin del medio de cultivo, ya que puede contener
compuestos involucrados en la induccin, represin o inhibicin de la formacin
enzimtica y secresin de todas las cepas de inters (Tari et al., 2008).
De acuerdo con Fontana y Silveira (2012b), la produccin de PG por A. oryzae es
especialmente dependiente de la composicin del medio de cultivo (glucosa y
pectina) y de la variacin de pH durante el proceso. Solis-Pereyra, Favela-Torres,
Vienegra-Gonzlez, y Gutirrez-Rojas (1993) y Acua-Arguelles, Gutirrez-Rojas,
Vienegra-Gonzlez, y Favela-Torres (1995) tambin reportaron que un exceso de
glucosa en medio de cultivo slido redujo la formacin de pectinasas por A. niger.
Estos autores sostuvieron que ste resultado fue debido a una fuerte baja en el pH
del medio en lugar de una represin catablica o inhibicin del crecimiento.
Texeira et al. (2000) describieron el efecto represivo de altas concentraciones de
glucosa, pectina y sacarosa en todas las enzimas evaluadas en cultivo de A.
japonicus. Las condiciones del cultivo tales como fuente de carbono y pH estn
relacionadas con la expresin de genes codificantes de enzimas pectinolticas
(Bazolli, Ribon, Queiroz, y Arajo, 2006; Trigu-Lahiani y Gargouri, 2007).
Considerando las oportunidades prometedoras que las especies de Aspergillus
pueden ofrecer a la industria alimentaria, el presente estudio se llev a cabo para
evaluar la produccin de endo- y exo-PG, dos enzimas del grupo
poligalacturonasa, mediante una cepa de A. fumigatus en experimentos realizados
a diferentes concentraciones de pectina y glucosa y valores de pH. En la
interpretacin de los resultados, la sntesis de PG, consumo de carbohidratos,
crecimiento de la biomasa, y la presencia de micotoxinas fueron considerados.
Adems, el pH ideal, temperatura y termoestabilidad para la endo- y exo-PG
producidas fueron evaluados.

2. Materiales y mtodos
2.1. Microorganismos
A. fumigatus LB-01-AP de la coleccin de cultivos del Instituto de Tecnologa de la
Universidad de Caxias du Sul (Brasil) fue empleado en los experimentos. La cepa
fue propagada en medio agar glicerina, incubada a 30C por cinco das. Luego de
este perodo, los cultivos esporulados fueron almacenados a 4C o usados para la
inoculacin de los medios de cultivo.
2.2.

Medios de cultivo

El medio de produccin bsico (WBE) para la endo- y exo-poligalacturonasa (PG)

fue el descrito por Fontana, Polidoro, y Silveira (2009). El medio fue preparado de
la siguiente manera: 500 mL de extracto acuoso de 80 g de salvado de trigo, 20 g
de pectina ctrica (Eskisa S.A., Brasil), 22 g de glucosa, 0,05 g de extracto de
levadura, 5,0 g de (NH4)2SO4, 0,5 g de MgSO4, 2,5 g de KH2PO4, 6,3x10-4 g de
FeSO4 7H2O, 6,2x10-4 g de ZnSO4, 1x10-5 g de MnSO4, y agua destilada QS 1 L
[18]. El extracto de salvado de trigo fue preparado moliendo finamente (malla 80)
80 g de salvado de trigo (Moinho Nordeste, Antonio Prado, Brasil) y mezclando el
polvo obtenido en 500 mL de agua destilada. La mezcla fue autoclavada a 1 atm
por 1 min. Luego de enfriar, la mezcla se filtr y el extracto fue usado para
preparar el medio WBE. Este medio y sus variaciones fueron autoclavadas a 1 atm
por 20 min antes de la inoculacin.
Los efectos de las variaciones en la composicin del medio de cultivo en la
produccin de galacturonasas fueron evaluados en pruebas con matraz de
agitacin. La evaluacin de las distintas concentraciones de glucosa (0,5, 10, 15,
20, 25 y 30 g L-1) as como la fuente de carbono fue realizada con una
concentracin de pectina inicial de 20 g L -1, mientras que las pruebas sobre la
influencia de la concentracin de pectina (0, 5, 10, 15, y 20 g L -1) en el proceso
fueron llevadas a cabo en medio sin glucosa. En estas pruebas, el pH inicial del
medio fue ajustado a 4,0 con la adicin de HCl 2N o NaOH 3M.
2.3.

Condiciones de cultivo

Las pruebas con matraz de agitacin para evaluar la composicin del medio y pH
fueron llevadas a cabo en matraces Erlenmeyer de 500 mL que contenan 100 mL
de medio y cubiertos con una fina capa de algodn y gasa. Los medios fueron
inoculados con una suspensin de esporas de A. fumigatus LB-01-AP, para
obtener una concentracin inicial de 10 6 esporas L-1, y los matraces fueron
incubados a 28C y a 200 rpm en un agitador recproco (B. BRAUN BIOTECH
modelo CERTOMAT, Alemania). A partir de la definicin de la composicin del
medio de cultivo, diferentes valores de pH (3,0; 4,0; 5,0; 6,0; y 7,0) fueron

examinados. Los resultados fueron comparados en trminos de actividad

enzimtica promedio obtenidos en cuatro pruebas.
En experimentos con bioreactor, un equipo B. BRAUN BIOTECH, modelo
BIOSTAT B (Alemania), con un volumen total de 5 L y un volumen de trabajo de
3,2 L, fue utilizado. El sistema est equipado con tres turbinas con seis cuchillas
planas de 6 cm de dimetro. Durante los cultivos, la velocidad de agitacin vari
de 200 a 700 rpm y el flujo de aire especfico vari entre 0,2 y 2,5 volumen de aire
por volumen de medio por minuto (vvm) a fin de mantener disuelta la
concentracin de oxgeno sobre el mnimo de 30% de saturacin en los medios.
Los medios para el cultivo en bioreactor fueron inoculados segn lo descrito para
pruebas de matraz de agitacin. La temperatura se mantuvo a 28C durante los
cultivos. En el bioreactor fueron evaluadas tres condiciones de pH en los medios
de cultivo; C1, pH inicial de 3,0 y sin control durante el proceso; C2, pH incial de
4,0 y sin control durante el proceso; C3, pH inicial de 4,0, sin controlarlo hasta que
alcance el valor mnimo y despus el pH fue controlado hasta un mximo de 3,5.
Alcuotas fueron colectadas perodicamente, centrifugadas por 10 min a 10000
rpm. El pellet fue usado para determinar la biomasa y el supernadante fue
almacenado a 4C para anlisis subsecuentes de la actividad de endo- y exo- PG.

2.4.

Pruebas enzimticas

El pH y temperatura ideal para PG fueron determinados en las enzimas

experimentales. El pH de reaccin fue ensayado usando distintas soluciones
buffer: biftalato de potasio (pH 2,5; 3,0; 4,0 y 5,0) y fosfato de potasio (pH 6,0 y
7,0), especificando otras condiciones estndar. La temperatura de reaccin fue
ensayada usando diferentes temperaturas (20-80C), especificando otras
condiciones estndar.
La termoestabilidad de ambas enzimas fue evaluada variando la temperatura de
20 a 70C. En las pruebas de termoestabilidad, el tiempo mximo de exposicin
enzimtica para cada temperatura evaluada fue de 150 min, siendo sacadas cada
15 minutos las muestras durante la primera hora de prueba y luego cada 30 min.
La actividad residual de la endo y exo-PG es expresada en porcentaje.
2.5.

Mtodos analticos

La concentracin de azcares reductoras en los medios de cultivo fue determinada

por el mtodo DNS (cido 3,5 di-nitro-saliclico) (Miller, 1959).
La actividad de endo-PG fue determinada midiendo el decrecimiento de la
viscosidad de una solucin estndar de pectina ctrica (ESKISA S.A.) al 0,63%

(p/v), en 0,05 M de buffer acetato pH 4,0. El anlisis fue llevado a cabo usando 3,2
mL de muestra diluda en 14,8 mL de solucin de pectina ctrica, y la reaccin se
realiz a 30C por 30 min. Luego del tiempo de reaccin, la viscosidad de la
mezcla de reaccin fue medida usando un viscosmetro (BROOKFIELD
ENGINEERING, USA) modelo DV-II+. Una unidad endo-PG fue definida como la
cantidad de enzima que causa una disminucin del 50% de la viscosidad de la
solucin, bajo las condiciones de la reaccin (Gainvors et al., 2000). La actividad
endo-PG es expresada en unidades por mL de medio (U mL -1).
La actividad exo-PG fue medida en una mezcla de reaccin que contena 50 L de
muestra apropiadamente diluda y 2 mL de cido poligalacturnico (SIGMA, USA)
en 0,1 M de buffer acetato (pH 4), siendo llevada a cabo la reaccin a 35C por 30
min. El cido galacturnico liberado en la reaccin fue cuantificado por el mtodo
Somogyi (1952). Una unidad de exo-PG fue definida como la cantidad de enzima
que lleva a la liberacin de 1 mol de cido galacturnico por minuto por mL de
enzima experimental, bajo las condiciones de reaccin (Couri y Farias, 1995). La
acividad exo-PG es expresada en unidades por mL (U mL-1).
Las esporas a ser usadas para la inoculacin de los medios de cultivo fueron
enumeradas por conteo directo utilizando una cmara de Neubauer, como lo
previamente descrito po Solis-Pereyra et al. (1993). La biomasa fue determinada
gravimtricamente filtrando un volumen conocido de medio de cultivo a travs de
una membrana de celulosa con tamao de poro de 0,45-m (MILLIPORE, USA) y
secada a 90C por 24 h. La biomasa es expresada en gramos de masa seca por
litro (g L-1).
La presencia potencial de aflatoxinas totales (B1, B2, G1, G2) en la enzima
experimental (EE) fue evaluada mediante inmunoensayo enzimtico utilizando
anticuerpos monoclonales- ELISA (NEOGEN) (Newsome, 1996).

2.6.

Anlisis estadsticos

Todas las pruebas estadsticas fueron realizadas mediante anlisis de la varianza

(ANOVA unidireccional) y prueba post-hoc de Turqua, usando un nivel de
probabilidad bajo 5% (p< 0,05).

3. Resultados y discusin
3.1. Efecto de la glucosa y pectina, y pH inicial en el cultivo de A. fumigatus
LB-01-AP

Inicialmente, los efectos de aadir distintas cantidad de glucosa al medio WBE

fueron evaluados en experimentos con matraz de agitacin, cuyos resultados son
mostrados en la Tabla 1. Como lo sealado en la Tabla 1, la adicin de ms de 15
g L-1 de glucosa al medio favoreci el crecimiento de A. fumigatus LB-01-AP, el
cual alcanz 13,3 g L-1. Por otra parte, bajo la presencia de glucosa, la sntesis de
la enzima disminuy y mostr actividades cada vez ms pequeas de endo- y exoPG a medida que la concentracin de glucosa aadida al medio aumentaba, y
mayores actividades enzimticas (40 y 32 U mL -1) fueron obtenidas en ausencia
de este carbohidrato. Resultados similares fueron observados por Fawole y
Odunfa (2003) quienes concluyeron que un incremento en la concentracin de
azcar del medio de cultivo promueve el crecimiento celulares pero inhibive la
produccin de PG. Por otra parte, Fontana y Silveira (2012b), mientras evaluaban
la produccin de endo- y exo-PG por A. oryzae IPT 301 a diferentes
concentraciones de glucosa (0-30 g L-1), encontraron que concentraciones por
sobre los 10 g L-1 de este carbohidrato resultaron en un incremento substancial en
la actividad enzimtica comparada con el control (sin glucosa). En la Tabla 1, se
puede observar que en la condicin G0 se determin una concentracin de 3,7 g
L-1 de azcares reductoras las cuales son derivadas a partir de la degradacin de
almidn presente en el salvado de trigo.
El proceso fue luego evaluado en matraces de agitacin en medio WBE que
contenan diferentes concentraciones de pectina sin adicin de glucosa (Tabla 2).
En el medio sin pectina, la produccin de las PGs estudiadas fue menor (endo-PG
0,7 U mL-1, exo-PG 6,0 U mL-1). Al usar 20 g L-1 de pectina, se obtuvieron mayores
actividades de endo- (42 U mL-1) y exo-PG (36 U mL-1), indicando que la
produccin enzimtica por este microorganismo es fuertemente afectada por la
presencia de este inductor. Fontana y Silveira (2012b) ya haban reportado que un
incremento de la pectina en el medio de cultivo para producir endo- y exo-PGs de
A. oryzae IPT 301 result en un aumento de la actividad enzimtica.
Los datos tambin indicaban que la pectina no solo induce la produccin
enzimtica, sino que tambin estimulaba la produccin enzimtica, ya que a mayor
concentracin de pectina en el medio, mayor la biomasa. Fontana, Salvador, y
Silveira (2005) observaron en cultivos slidos de A. niger que un incremento de
hasta 16% de pectina en el medio de cultivo resultaba en un aumento de biomasa
cuando era comparada con el medio sin el inductor y en medio con altas
concentraciones como en este estudio. Quizs un incremento pequeo en la
concentracin de pectina podra resultar en mayores actividades enzimticas. Sin
embargo, a mayor concentracin del inductor en el medio de cultivo, menor la
transferencia de oxgeno de la fase gaseosa a la fase lquida debido al significante

incremento en la viscosidad, la cual hace ms difcil controlar el proceso de

fermentacin.
Menores actividades enzimticas en presencia de glucosa y el efecto positivo de la
presencia de pectina pueden ser asociados con la expresin de genes codificantes
de enzimas pectinolticas. Whitehead, Shieh, Cleveland, Cary, y Dean (1995) ya
han mostrado la regulacin de dos genes codificantes de endopoligalacturonasas,
pecA y pecB, de Apergillus flavus.Los autores observaron que la expresin era
mayor cuando el micelio creca en pectina comparado con la expresin en glucosa
y concluyeron que los genes pecA y pecB son controlados por el mecanismo
inductivo de la pectina.
Es posible que los resultados discutidos hasta el momento, especialmente
aquellos mostrados en la Tabla 1, han sido tambin muy afectados por los perfiles
de variacin de pH de cada prueba. Por otra parte, una disminucin demasiado
grande en el pH puede producir un ambiente inadecuado para la produccin
enzimtica por el microorganismo- como pudo haber sido el caso en el presente
estudio- en el medio de cultivo con glucosa (Tabla 1). Por lo tanto, pruebas
adicionales fueron llevadas a cabo en matraces con agitacin sin adicin de
glucosa en los medios y con 20 g L -1 de pectina, donde pH inciales entre 3,0 y 7,0
fueron evaluados. Como lo sealado en la Tabla 3, valores de pH ms altos
incrementaron moderadamente la biomasa de A. fumigatus, pero no promovieron
la produccin enzimtica. Con un pH inicial en el rango 5,0-7,0, hubo un efecto
claramente negativo en la sntesis de PG, especialmente en la formacin de endoPG. Por otra parte, valores iniciales bajos de pH (3,0 y 4,0) resultaron en
actividades mayores de endo y exo-PG, mostrando que para A. fumigatus LB39 la
produccin de biomasa y de enzimas ocurren a distintos valores de pH. Los datos
en este estudio corroboran aquellos reportados por Malvessi y Silveira (2004) y
Fontana y Silveira (2012) en estudios con A. oryzae , donde encontraron que la
sntesis de estas enzimas es mayor a pH cercano a 3,0, mientras que el
crecimiento ocurra preferentemente a un pH sobre 4,0.
Las pruebas subsecuentes fueron realizadas en un bioreactor de mezcla
completa, y en un medio con 20 g L -1 de pectina, bajo distintas condiciones de pH
(pruebas C1, C2, y C3 detallas en la seccin materiales y mtodos). Fig. 1
muestra las variaciones en la biomasa durante estos cultivos.
Como lo observado en la Fig. 1, durante las primeras 24 h de cultivo, los perfiles
de biomasa en relacin al tiempo oscil de lineal a exponencial, seguido por un
perodo de disminucin de la velocidad de crecimiento, coincidiendo con una
disminucin en el pH, y cerca de las 44-48 h, comenz la fase estacionaria de los
cultivos. Durante las horas finales del proceso (ms de 60 h de cultivo), la biomasa

disminuy con el tiempo, probablemente debido a la lisis celular producida por la

falta de algunos nutrientes. La mxima biomasa registrada bajo las condiciones
C1, C2, y C3 fueron 12,8; 13,5; y 13,5 g L -1, respectivamente, las cuales son
consistentes con los valores encontrados en los ensayos con matraces.
Fig. 2 muestras las actividades de endo y exo-PG y la variacin de pH durante el
cultivo a distintos pHs. Se puede observar que las mayores actividades de endoPG (81 U mL-1) se obtuvo en la condicin C3, seguida por las condiciones C1 (74
U mL-1) y C2 (58 U mL-1).
En cuanto a exo-PG, la mejor condicin de crecimiento fue tambin C3 (49 U mL 1
), con menores valores en las condiciones restantes (Fig. 2A y B).
Los valores de pH disminuyeron significantemente luego de 24 h del proceso,
seguido por un intenso crecimiento celular, y mayores valores a partir de
aproximadamente 60 h de proceso. En la condicin C1, la tendencia del aumento
de pH durante las horas finales de cultivo fue mucho menos intensa, alcanzando
2,5, mientras que en las pruebas con pH inicial 4,0 (C2 y C3) se observ lo
opuesto, con un pH mximo de 4,9 en C2, y pH 3,5 (automticamente controlado)
en C3 (Fig. 2C). De acuerdo con Bailey y Tahtiharju (2003), durante el crecimiento
de hongos filamentosos ocurre un decrecimiento de pH y consumo de
carbohidratos, y luego de finalizar la fuente de carbono se observa un incremento
en el pH.
Los resultados del cultivo en bioreactor confirmaron aquello, de manera similar a
otras especies del gnero Aspergillus, la produccin de PG por A. fumigatus LB01-AP depende del perfil de variacin de pH durante el cultivo. En las tres
condiciones probadas, valores de pH suficientemente bajos (menores que 3,0)
fueron determinados para que exista una formacin significantes de
poligalacturonasas y, por ende, actividades similares de endo- y exo-PGs fueron
determinadas entre 48 y 60h, durante las cuales ocurrieron los menores valores de
pH y las fases estacionarias de crecimiento.
Las diferencias ms significantes en la actividad enzimtica ocurrieron a partir de
las 60 h, cuando la ya mencionada tendencia de aumentar el pH tambin tom
lugar. De acuerdo con Chung, Lee, y Li (1992), los cambios de pH en los medios
de cultivo son resultado del consumo de sustrato. Cuando los iones amonio son
usados por los microorganismos, los medios son acidificados y cuando el
nitrgeno orgnico (aminocidos y pptidos) es asimilado, los medios son
alcalinizados.
Al comparar las tres condiciones testeadas, observamos que para la endo-PG los
mayores valores se obtuvieron en los experimentos C1 y C3, a menores valores

de pH como en la condicin C2, mientras que para la exo-PG la condicin C3

condujo a la mayor actividad. Estudios previos nos permiti proponer hiptesis
para explicar la relacin entre la actividad de poligalacturonasas, especialmente
endo-PG, y el pH en las etapas finales del proceso. En cultivos de A. oryzae con y
sin control de pH durante la etapa final del proceso, Malvessi y Silveira (2004)
encontraron que las actividades de las poligalacturonasas fueron preservadas
cuando el incremento de pH estaba limitado a valores cercanos a 3,0, mientras
que en el proceso sin control de pH los valores enzimticos disminuyeron
significantemente. Los autores sugirieron que esta disminucin de las actividades
estaba relacionada con el incremento de los valores de pH, lo cual pudo haber
favorecido la actividad de proteasas, las cuales podran haber sido liberadas al
medio, con la capacidad de degradar pectinasas presentes en los cultivos. Otra
posibilidad sera el decrecimiento en la estabilidad de estas enzimas al
incrementar los valores de pH. En cuanto a esto ltimo, Mohsen, Bazaraa, y
Doukani (2009) determinaron actividades significativamente disminuidas para
pectinasas purificadas de A. niger en pruebas en las cuales las enzimas han sido
previamente expuestas a valores de pH entre 3,0 y 8,0 hasta un mximo de 3,5 h.
Martnez-vila, Wicke, Aguilar, Rodrguez-Herrera, y Contreras-Esquivel (2009)
evaluaron la produccin de poligalacturonasas por Aspergillus kawachii en cultivos
en estado slido y obtuvieron alta produccin de PG cidas en pH 4,3.
3.2.

Influencia del pH y temperatura en las actividades de poligalacturonasas

producidas por A. fumigatus LB-01-AP

Fig. 3 muestra las variaciones de endo y exo-PG de acuerdo al pH del medio de

reaccin. No se puede observar diferencia significante en la actividad de endo-PG
cuando la reaccin es llevada a cabo a pH 4,0 o 5,0, siendo estos los mejores
valores para la actividad de endo-PG producida por A. fumigatus LB-01-AP.
Comparado con lo observado para endo-PG, la respuesta de la actividad
enzimtica de exo-PG ante la variacin de pH mostr un rango relativamente
amplio, entre 4,0 y 6,0, con un pick de actividad a 5,0. Este resultado es similar al
descrito por Sandri et al. (2013) quien observ que el pH ptimo para la actividad
de pectinasas de A. niger LB23 fue 4,0.
El efecto de la temperatura (20-80C) sobre las poligalacturonasas se muestra en
la Fig. 4. Para la endo-PG, las mayores actividades fueron determinadas entre 40
y 60C, con valores cerca de un 40% mayor que aquellos observados a 30C, una
temperatura normalmente utilizada para evaluar la actividad de esta enzima. Con
respecto a exo-PG, la actividad enzimtica mejor a una temperatura de 60C.
Sandri et al. (2013) concluyeron que temperaturas cercanas a 50C fueron las
mejores para la actividad de enzimas pectinolticas presentes en la enzima
experimental de A. niger LB23.

Las pruebas indican que temperaturas de 50C resultaron en altas actividades de

poligalacturonasas especialmente endo-PG, una enzima que tiene un rol ms
importante que la exo-PG en reducir la viscosidad de los jugos de fruta-, lo cual es
interesante desde el punto de vista industrial. Sin embargo, cuando se evala la
temperatura ptima para la aplicacin de estas enzimas en procesos de la
industria alimentaria, uno debe tomas en cuenta adems la duracin del
tratamiento enzimtico del producto y la estabilidad de la preparacin,
considerando el efecto combinado de la temperatura y el tiempo. Al analizar los
perfiles de actividad de poligalacturonasas de A. fumigatus LB-01-AP incubadas
entre 20C y 70C por hasta 150 min (Fig. 5), vemos una significante disminucin
en los valores enzimticos a mayores temperaturas (60 y 70C). Sin embargo, las
PGs presentes en la enzima experimental mostraron una estabilidad relativamente
alta a 50C, con la endo-PG manteniendo aproximadamente el 70% de su
actividad luego de 120 min a esta temperatura. Hendges, Montanari, Malvessi, y
Silveira (2011) evaluaron la termoestabilidad de endo-PG producida por A.niger
T0005/007-2, y encontraron que cuando se utilizada la temperatura de 50C, una
disminucin de cerca del 50% de la actividad enzimtica fue observada luego de
120 min de tratamiento.
Otro factor importante para el uso de pectinasas en la industria alimenticia es la
ausencia de aflatoxinas. En consecuencia, la enzima experimental producida por
A. fumigatus LB-01-AP no mostr aflatoxinas totales bajo las condiciones
estudiadas (B1, B2, G1, G2) a un lmite de deteccin de 2 g/kg. En resumen, los
resultados del efecto de temperatura y tiempo de pre incubacin sobre las
poligalacturonasas producidas por A. fumigatus LB-01-AP confirma un gran
potencial para la aplicacin industrial de estas preparaciones bajo temperaturas
relativamente altas, como ocurre a menudo en la industria de jugos y bebidas.

Agradecimientos
Los autores estn agradecidos con el Conselho Nacional de Desenvolvimento
Cientfico e Tecnolgico (CNPq), la Coordenaao de Aperfeioamento de Pessoal
de Nvel Superior (CAPES), la Fundacao de Amparo Pesquisa do Estado do Rio
Grande do Sul (FAPERGS) (Grant no. 1/1134-1) y la Universidade de Caxias do
Sul (UCS) para el apoyo financiero de este trabajo.

Tabla 1.
Resultados obtenidos en cultivos sumeridos de Aspergillus fumigatus LB-01-AP en
medios con diferentes concentraciones de glucosa y 20 g L -1 de pectina, pH inicial
4,0, luego de 96 h de cultivo.
S0, concentracin inicial de azcares reductoras; S cons., concentracin consumida
de azcares reductoras; Xmax, mxima concentracin celular; txmax, tiempo para
alcanzar la Xmax; pHmin, mnimo valor de pH; pH final, valor de pH luego de 96 h de
cultivo; Endo-PGmax, mxima actividad de endo-PG; Exo-PGmax, mxima actividad
de exo-PG; tPGmax, tiempo para alcanzar endo-PGmax y exo-PGmax.
G0.G5.G10.G15.G20.G25.G30-glucosa: 0. 5. 10. 15. 20. 25 y 30 g L -1.
Tabla 2.
Resultados obtenidos en cultivos sumergidos de Aspergillus fumigatus LB-01-AP
en medios con diferentes concentraciones de pectina en medios libres de glucosa,
pH inicial 4,0, luego de 96 h de cultivo.
S0, concentracin inicial de azcares reductoras; S cons., concentracin consumida
de azcares reductoras; Xmax, mxima concentracin celular; txmax, tiempo para
alcanzar la Xmax; pHmin, mnimo valor de pH; pH final, valor de pH luego de 96 h de
cultivo; Endo-PGmax, mxima actividad de endo-PG; Exo-PGmax, mxima actividad
de exo-PG; tPGmax, tiempo para alcanzar endo-PGmax y exo-PGmax.
P0.P5.P10.P15.P20- pectina: 0. 5. 10. 15 y 20 g L-1.
Tabla 3.
Resultados obtenidos en cultivos sumergidos de Aspergillus fumigatus LB-01-AP a
diferentes pH iniciales, en medio con 20 g L-1 de pectina, luego de 96 h de cultivo.
S0, concentracin inicial de azcares reductoras; S cons., concentracin consumida
de azcares reductoras; Xmax, mxima concentracin celular; txmax, tiempo para
alcanzar la Xmax; pHmin, mnimo valor de pH; pH final, valor de pH luego de 96 h de
cultivo; Endo-PGmax, mxima actividad de endo-PG; Exo-PGmax, mxima actividad
de exo-PG; tPGmax, tiempo para alcanzar endo-PGmax y exo-PGmax.
pH 3. pH 4. pH5. pH 6 y pH 7- valores de pH incial del medio.
Fig. 1. Variacin de la concentracin de biomasa durante el cultivo de Aspergillus
fumigatus LB-01-AP en medio WBE sin adicin de glucosa. Los valores
corresponden al promedio de tres pruebas. C1- medio con pH inicial 3,0 y sin
control durante el proceso. C2- medio con pH inicial 4,0 y sin control durante el

proceso. C3- medio con pH inicial 4,0, con un valor mnimo sin control, y luego con
p mximo controlado a 3,5.
Fig. 2. Variacin de la actividad de endo-PG (A) y exo-PG (B), y del pH (C)
durante el cultivo de Aspergillus fumigatus LB-01-AP en medio WBE sin adicin de
glucosa. Los valores corresponden al promedio de tres pruebas. C1- medio con
pH inicial 3,0 y sin control durante el proceso. C2- medio con pH inicial 4,0 y sin
control durante el proceso. C3- medio con pH inicial 4,0, con un valor mnimo sin
control, y luego con p mximo controlado a 3,5.
Fig. 3. Efecto del pH sobre las actividades de endo-PG (A) y exo-PG (B)
producidas por Aspergillus fumigatus LB-01-AP, manteniendo las condiciones
estndar restantes de cada anlisis. Los valores corresponden al promedio de tres
pruebas. Los tratamientos con la misma letra no difieren estadsticamente en un
5% (p<0,05).
Fig. 4. Efecto la temperatura sobre las actividades de endo-PG (A) y exo-PG (B)
producidas por Aspergillus fumigatus LB-01-AP, manteniendo las condiciones
estndar restantes de cada anlisis. Los valores corresponden al promedio de tres
pruebas. Los tratamientos con la misma letra no difieren estadsticamente en un
5% (p<0,05).
Fig. 5. Efecto la temperatura y tiempo de pre incubacin sobre las actividades de
endo-PG (A) y exo-PG (B) producidas por Aspergillus fumigatus LB-01-AP,
manteniendo las condiciones estndar restantes de cada anlisis. Los valores
corresponden al promedio de tres pruebas. (Cuadrado slido) 20C; (cuadrado
abierto) 30C; (crculo slido) 40C; (crculo abierto) 50C; (tringulo slido) 60C;
(tringulo abierto) 70C.