BIODEGRADACIN DE NAFTALENO POR PSEUDOMONAS

AERUGINOSA AT18
Rosa Ma. Prez Silva1, Geovanni Abad Pea1, Arelis Abalos Rodrguez1, Alina
Maran Reyes 2, Rosa C. Bermdez Savn1
1

Centro de Estudios de Biotecnologa Industrial, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente,

2
Departamento de Qumica, Facultad de Ciencias Naturales, Universidad de Oriente

La contaminacin ambiental por hidrocarburos, es uno de los problemas ms significativos en la

actualidad. Una gran variedad de microorganismos son capaces de utilizar los hidrocarburos
como fuente de carbono y energa. En el trabajo se utiliza la cepaPseudomonas aeruginosa AT18
en la degradacin de naftaleno. Los ensayos de biodegradabilidad del naftaleno demostraron que
Pseudomonas aeruginosa AT18 tiene una actividad biodegradativa del 10 %. La adicin de
glucosa (2 % v/v, relacin 1:1) increment la biodegradacin del naftaleno en un 22 %. Pseudomonas
aeruginosa AT18 produce 1,35 g/L de ramnolpidos en presencia de naftaleno y hasta 6,15 g/L en
presencia de naftaleno ms glucosa.
Palabras clave: naftaleno, Pseudomonas aeruginosa, biodegradacin, biotensioactivos.
_____________________

The hydrocarbons contamination is at the present time one of the main environmental problems.
A great variety of microorganisms are able to use the hydrocarbons as energy and carbon source.
In work is utilized a Pseudomonas aeruginosa AT18 strain in naphthalene biodegradation. The
biodegradability assays in naphthalene proved that Pseudomonas aeruginosa AT18 degrades
reaching 10 % of biodegradation. The addition of glucose (2 % v/v, relationship 1:1) increases the
biodegradative activity of the strain in 22 %. Pseudomonas aeruginosa AT18 produces 1,35 g/L
rhamnolipids in presence of naphthalene and up to 6,15 g/L in naphthalene and glucose.
Key words: naphthalene, Pseudomonas aeruginosa, biodegradation, biosurfactants.

Introduccin
La contaminacin ambiental por hidrocarburos es serio problema en la actualidad.
Los hidrocarburos policclicos aromticos
(HPAs) son molculas que en su estructura contienen dos o ms anillos bencnicos fusionados,
pudiendo presentar sustituciones alqulicas,
hidroxlicas, de halgenos y de grupos nitro (NO2 ),
en cualesquiera de las posiciones del anillo /4,10/.
En su mayora son compuestos txicos,
carcingenos y mutgenos, y con una gran persistencia en los medios naturales al ser poco solubles en sistemas acuosos. Adems, son molculas
de difcil degradacin por las poblaciones
microbianas endgenas, por ello se les denomina
molculas recalcitrantes y son considerados contaminantes prioritarios.
Actualmente, se han descrito ms de cien
especies incluidas en treinta gneros de bacterias, hongos, levaduras y algas con capacidad de
utilizar hidrocarburos como nica fuente de car-

TECNOLOGA QUMICA Vol. XXIII, No. 3, 2003

bono y energa, la mayora de las cuales han sido

aisladas de medios acuticos y terrestres contaminados. Los gneros aislados con mayor frecuencia son: Pseudomonas, Anchromobacter,
Arthrobacter, Micrococcus, Nocardia, Vibrio,
Acinetobacter, Brevibacterium, Corynebacterium, Flavobacterium, Candida, Sporobelomyces,
Trichoderma, Mortierella, Aspergillus y Penicillum. /4/
El naftaleno es el poliaromtico con estructura ms sencilla. Presenta dos anillos bencnicos y
baja masa molecular (128,2 gmol-1). Su degradacin fue una de las primeras rutas estudiadas,
comprobndose desde el principio, que el crecimiento sobre este sustrato permita aislar salicilato
y 1,2- dihidro -1,2 - dihidroxinaftaleno del medio
de cultivo. Por induccin secuencial se demostr
que ambos son compuestos intermediarios en el
metabolismo del naftaleno (figura 1). Se conoce que Pseudomonas es capaz de convertir el
salicilato en catecol antes de la ruptura del
anillo. /10/

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naftaleno dixigenasa

OH
COOH
salicilato hidroxilasa

OH

Va orto

Succinil + Acetil CoA

OH
Va meta

Piruvato + Acetaldehdo

CICLO DE ACIDOS
TRICARBOXILICOS
Fig. 1 Degradacin del naftaleno.

En este trabajo se estudia la capacidad

biodegradativa sobre naftaleno de la cepa
Pseudomonas aeruginosa AT18, aislada de suelos contaminados con petrleo, al crecer sobre
ste como nica fuente de carbono y energa. Se
evala tambin la influencia de la glucosa sobre
la biodegradacin del naftaleno.

Materiales y mtodos
Microorganismo
Se utiliza la cepa bacteriana Pseudomonas
aeruginosa AT18, aislada de suelos contaminados con petrleo. La misma fue conservada en
cuas de Agar Triptona Soja (TSA) a 4 C con
subcultivos cada 15 d en el mismo medio.

Medios de cultivo y condiciones de inculo

Se utiliz un medio basal con naftaleno como
nica fuente de carbono (MN) y este mismo

22

medio suplementado con glucosa (MNG). La

composicin del medio basal en g L-1 fue: NaNO3 ,
3; KH 2 PO 4 , 0,5; CaCl2 , 0,01; KCl, 0,1;
FeSO4 .7H2 O, 0,01; MgSO4 .7H2 O, 0,5; extracto
de levadura, 0,01. Un 2 % (v/v) de naftaleno
finamente triturado y aadido aspticamente, se
emple como fuente de carbono en el medio MN.
El medio MNG contena como fuente de carbono
naftaleno ms glucosa 2 % (v/v) en relacin 1:1.
El pH fue ajustado a 6,8 en todos los casos. El
medio se esteriliz en autoclave vertical (BR-25)
a 121 o C durante 15 min.
Como inculo se utiliz un 2 % de una suspensin celular en solucin salina (NaCl, 0,9 %) de
DO 640nm" 2.
Los experimentos se realizaron por duplicados en matraces erlenmeyers de 250 mL de capacidad con 100 mL de medio durante 120 h. La
incubacin se realiz a temperatura ambiente con
agitacin orbital a 150 r/min. Las tomas de muestras fueron realizadas cada 8 h durante todo el
perodo de incubacin.

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Mtodos analticos
Crecimiento microbiano: La biomasa celular
se cuantific por el peso seco de las clulas de una
alcuota de 5 mL de cultivo durante 24 h a 105 C.
Degradacin de naftaleno: La biodegradacin
del naftaleno se sigue por la aparicin en el medio
de cultivo de su derivado hidroxilado cido
saliclico, intermediario de la degradacin (figura 1). Para ello se emplea el mtodo
espectrofotomtrico para la determinacin de
estructuras fenlicas con curva de calibracin
como procedimiento de clculo (y = 0,417 6x +
0,001 4, r = 0,995 4) /7/ y salicilato de sodio como
patrn.
Produccin de biotensioactivos: La
cuantificacin de los ramnolpidos (RLs) se evalu por el mtodo espectrofotomtrico de las
ramnosas, basado en la formacin de un complejo
coloreado por la reaccin entre el cido
tiogliclico y la ramnosa /5/, con curva de calibracin como procedimiento de clculo. (y =
0,02x + 0,012 8, r = 0,998 0).

Resultados y Discusin
Biodegradacin de naftaleno por la
Pseudomonas aeruginosa AT18
Es conocida la capacidad de Pseudomonas sp
para metabolizar oxidativamente hidrocarburos
aromticos /10/. La ruptura del anillo aromtico
se efecta por la accin de enzimas del tipo
oxigenasas, las cuales introducen tomos de oxgeno en el anillo. Durante la degradacin del
naftaleno se produce el cido saliclico (cido 2hidroxibenzoico). Este intermediario de metaruptura produce un complejo de color azul con el
reactivo de Folin Ciocalteu, lo cual permite su
determinacin espectrofotomtrica. Por la
estequiometra de la reaccin del cido saliclico
para formar salicilato; el contenido de salicilato
es equivalente al contenido de saliclico producido en la oxidacin del naftaleno. El naftaleno
consumido se determina entonces corrigiendo los
valores de cido saliclico con el factor 1,08, el
cual indica la conversin naftaleno/saliclico sobre la base de la reaccin de oxidacin:

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C10 H6 + 5O2 = C7 H6 O3 + 3CO2 + H2 O

(1)

El estudio cintico de la cepa Pseudomonas

aeruginosa AT18 se realiz con dos variantes:
medio ms naftaleno (MN) y medio ms naftaleno
ms glucosa (MNG).

Biodegradacin de naftaleno por

Pseudomonas aeruginosa AT18 en medio
MN
La biodegradacin del naftaleno por la cepa
Pseudomonas aeruginosa AT18 fue baja,
alcanzndose nicamente un 10 % de actividad
biodegradativa (figura 2). Se observ que la degradacin se estabiliza a las 64 h aproximadamente, tiempo en el que ya se ha alcanzado la fase
estacionaria de crecimiento (figura 2). La degradacin de compuestos aromticos por cultivos
puros es muy difcil, ya que la estructura qumica
de estas molculas condiciona tanto su toxicidad
como su baja solubilidad en agua /4/, hacindose
menos disponible para la clula. El naftaleno
posee dos anillos bencnicos fusionados (figura 1)
y una solubilidad de 31 mg L-1. Su degradacin
microbiana involucra la ruptura de uno de los
anillos y posterior oxidacin hasta la
mineralizacin. Pseudomonas aeruginosa GL1,
por ejemplo, no crece sobre poliaromticos, sin
embargo, es capaz de degradar los metabolitos de
oxidacin del fenantreno (cido o-ftlico) y
naftaleno (cido saliclico). /2/
La actividad biodegradativa sobre compuestos aromticos es mayor cuando se emplean cultivos mixtos y consorcios microbianos, en los
cuales se establece una interaccin entre las diferentes especies, que si bien es compleja, favorece la biodegradacin. Se ha descrito que el
consorcio microbiano AM degrada en 10 d el 13 %
de la fraccin aromtica del crudo de petrleo
Casablanca. El 100 % del naftaleno presente en
esta fraccin del crudo Casablanca fue consumido a los 20 d de incubacin /12/. Arino y colaboradores observaron que la presencia de
Pseudomonas aeruginosa GL1 dentro de un cultivo mixto de bacterias degradadoras de hidrocarburos poliaromticos (Rhodococcus erythopolis,
Bacillus cereus y Pseudomonas fluorescens), ace-

23

10
8
6

4
0,5

-1

1,5

RLs, Biomasa (g L )

% Biodegradacin, pH

12

2
0

0
0

16

32

48

64

80

96

112

Tiempo (h)

% Biodegradacin

pH

Biomasa

RLs

Fig. 2 Cintica de biodegradacin de Pseudomonas aeruginosa AT18 en medio MN.

leraba la degradacin de los poliaromticos presentes a partir de una relacin de comensalismo entre la
bacteria P. aeruginosa GL1 y el cultivo mixto. Esta
relacin de comensalismo se fundamenta en que
el cultivo mixto crece a expensas de los
poliaromticos, mientras que Pseudomonas degrada los metabolitos de meta ruptura estabilizando la
poblacin microbiana en el cultivo. /2/
El pH del medio desciende de 7 a 5 unidades
aproximadamente a las 32 h, descenso que se
detect paralelo al incremento de la oxidacin de
la fuente de carbono por P. aeruginosa AT18, de
2 a 4 g/L aproximadamente (figura 2). Este descenso del pH se debe a la acumulacin de cido
saliclico en el medio.
El crecimiento microbiano de la cepa P.
aeruginosa AT18 fue muy bajo, 0,77 g L-1 de
biomasa que representa un rendimiento de la
fuente de carbono (yx/c) del 4 %. Este bajo crecimiento puede explicarse por inhibicin de la
fuente de carbono y la presencia de cido saliclico
en el medio, as como la poca disponibilidad de la
fuente de carbono por la bacteria. Al finalizar el

24

crecimiento la actividad biodegradativa se

estabiliza (figura 2).
En el medio de cultivo se detect adems, la
presencia de tensioactivos por Pseudomonas
aeruginosa AT18 sobre naftaleno como nica fuente de carbono. La acumulacin de estas molculas
fue muy baja, 1,35 g/L de ramnolpidos, lo que
significa un 13 % de conversin del naftaleno a
ramnolpidos. Rendimientos de hasta 50 % se han
alcanzado con otras cepas de P. aeruginosa utilizando aceites vegetales como fuente de carbono /3,
6/, y a expensas de perodos muy largos de incubacin
240 h /8/. El diseo del medio de cultivo favorece el
incremento de los rendimientos de produccin. /1/

Degradacin de naftaleno por

Pseudomonas aeruginosa AT18 en medio
MNG
La actividad biodegradativa y el crecimiento
de la cepa en el medio MNG (figura 3) fue dos
veces mayor, 22 % y 1,73 g/L respectivamente,
que lo obtenido en el medio MN (figura 2).

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20
6
15
4
10
2

RLS, Biomasa (g L -1 )

% Biodegradacin, pH

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0
0

16

32

48

64

80

96

112

Tiempo (h)

% Biodegradcin

pH

RLs

Biomasa

Fig. 3 Cintica de biodegradacin de Pseudomonas aeruginosa AT18 en medio MNG.

El aumento de la actividad biodegradativa se

observ a las 40 h aproximadamente 4,2 %, tiempo a partir del cual el crecimiento de P. aeruginosa
AT18 es a expensas del naftaleno como se refleja
en la curva diuxica obtenida (figura 3). La glucosa acta como cosustrato, estimulando el crecimiento de la bacteria, que en paralelo es capaz de
oxidar el anillo aromtico. Esta especie de
cometabolismo es muy utilizada en la remocin
de contaminantes. /11/
La acumulacin de los productos de biodegradacin del naftaleno guarda una estrecha relacin con el descenso del pH. Similar a lo observado en el medio MN, el pH desciende alrededor de
las 32 h, al detectarse en el medio un incremento
de la biodegradacin del naftaleno; lo que significa una mayor acumulacin en el medio del
cido saliclico, intermediario de la oxidacin de
la fuente de carbono (figura 3).
En este medio, la acumulacin de tensioactivos
tambin fue superior, alcanzndose 6,5 g/L de
ramnolpidos, y se comprob que el incremento
en la biodegradacin del naftaleno en el medio

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MNG es proporcional a la produccin de

ramnolpidos por la cepa P. aeruginosa AT18
(figura 3). La acumulacin de ramnolpidos en el
medio favorece que el naftaleno est ms accesible a las clulas y pueda ser metabolizado.
Burkholderia sp en presencia de ramnolpidos
incrementa su actividad biodegradativa frente a
naftaleno en un 50 %. /9/
En la figura 4 se representan los porcentajes
de biodegradacin del naftaleno en medio MN y
MNG por Pseudomonas aeruginosa AT18. Se
observa que en el medio MN se detect el
inicio de la biodegradacin a las 16 h,
estabilizndose a partir de las 64 h en un 10 %.
En el medio MNG el comportamiento de la
cepa es diferente; se detect el inicio de la
actividad biodegradativa a las 32 h, la cual
contina aumentando hasta alcanzar el 22 % a
las 120 h de incubacin. Aunque la actividad
biodegradativa de Pseudomonas aeruginosa
AT18 en el medio MN se detect en las primeras 24 h, en el medio MNG se duplica finalmente la biodegradacin del naftaleno (figura 4).

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% Biodegradacin

25
20
15

10
5
0
0

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48

64

80

96

112

Tiempo (h)
MN

MNG

Fig. 4 Degradacin de naftaleno por P. aeruginosa AT18 en medio MN y MNG.

Conclusiones
La actividad biodegradativa de Pseudomo-nas aeruginosa AT18 en el medio MN fue del 10 %,
duplicndose la misma en el medio MNG (22 %).

Nomenclatura
MN Medio con Naftaleno
MNGMedio con Naftaleno ms glucosa
RLs sRamnolpidos

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