Degradación Enzimática de OPs Por Paraoxonasa

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DEGRADACIN ENZIMTICA DE XENOBITICOS:

el ejemplo de los insecticidas organofosforados
1
RESUMEN
El objetivo general de esta actividad es observar, monitorizar y caracterizar la biodegradacin

enzimtica de insecticidas organofosforados en un sistema biolgico modelo. Para ello se estudiar
los efectos de cationes divalentes, agentes quelantes y reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre
la actividad paraoxonasa de suero de conejo. Se utilizar como substrato modelo el organofosforado
paraoxon, que es el metabolito txico del insecticida parathion.
b.
FUNDAMENTOS:
LOS
COMPUESTOS ORGANOFOSFORADOS
(ver guin de prctica sobre hidrlisis qumica de organofosforados)
3
FOSFOTRIESTERASAS: LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN COMPUESTOS

ORGANOFOSFORADOS
3.1
Las esterasas que hidrolizan organofosforados
Segn la clasificacin actual de la IUB las enzimas que hidrolizan compuestos organofosforados
(OPs) se hayan encuadradas en el grupo 3.1.8 que se denomina hidrolasas de tristeres fosfricos o
fosfotriesterasas.
Normalmente las fosfotriesterasas se nombran de acuerdo con el substrato que hidrolizan. En la
siguiente figura se muestran las reacciones catalizadas por algunas fosfotriesterasas conocidas como
son la DFPasa, tabunasa, paraoxonasa y diclorovos (DDVP) hidrolasa. La figura muestra como la
hidrlisis del OP da lugar a la liberacin del grupo saliente (F -, CN-, p-nitrofenol y metanol
respectivamente) y a la generacin de un residuo fosfrico.
Universidad Miguel Hernndez. Divisin de Toxicologa. Edificio Vinalop

Avenida de la Universidad s/n 03202. ELCHE (ALICANTE). SPAIN
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O
(i
C3H7O)2 P F
DFPasa
O
(i
C3H7O)2 P OH
FH
DFP
C2H5O
C2H5O O
P CN
Tabunasa
O
P OH
CNH
(CH3)2N
(CH3)2N
TABUN
O
(C2H5O)2
P O
NO2
Paraoxonasa
(C2H5O)2
P OH
NO2
HO
PARAOXON
CH3O
O
P
CH3O
3.2
OCH
DDVP
CCl2
DDVPasa
CH3O
O
P
OCH
CCl2
HO
CH3OH
Distribucin de fosfotriesterasas entre especies y tejidos
Las fosfotriesterasas se encuentran ampliamente distribuidas en tejidos animales. La primera

demostracin de la existencia de una actividad fosfotriesterasa fue realizada en 1946, se describi la
capacidad del suero humano y de conejo de hidrolizar el dialquilfluorofosfato. La hidrlisis del
paraoxon fue estudiada en detalle en 1953. Estas primeras observaciones demostraron que los OPs
pueden ser hidrolizados por una gran variedad de materiales biolgicos. Es de destacar la gran
variabilidad existente entre especies e incluso entre tejidos de la misma especie. No todos los tejidos
de una misma especie hidrolizan los mismos OPs ni la misma actividad fosfotriesterasa se presenta
en el mismo tejido de todas las especies.
En general los mayores niveles de actividades fosfotriesterasas han sido descritos en mamferos. La
actividad fosfotriesterasa mejor estudiada en mamfero corresponde a la paraoxonasa, que en
presencia del catin Ca2+ hidroliza el insecticida paraoxon, metabolito txico del parathion. Esta
actividad ha sido estudiada principalmente plasma e hgado de mamfero.
La mayora de las aves estudiadas muestran escasa o nula actividad fosfotriesterasa. As, no se
detect actividad hidroltica de paraoxon ni de metil pirimifos-oxon en: cormorn, ganso, codorniz,
frailecillo, alca, pjaro bobo, gaviota, paloma, mirlo, estornino, gorrin y grajo. No obstante en los
aos 90 se han detectado actividades hidrolizantes de algunos fosforamidatos y de
diisopropilfluorofosfato (DFP) en tejidos de aves.
Adems de mamferos y aves tambin se han descrito fosfotriesterasas en peces como la trucha
Salmo trutta y la carpa Cyprinus carpio; en moluscos como el calamar Loligo pealei y Todarodes
pacificus steenstrup y el mejilln Mytilus edulis; y en bacterias como Pseudomonas diminuta,
Rhizobium y Bradyrhizobium, halfilas, Escherichia coli, Streptomyces lividans, Achromobacter sp.
y Tetrahymena thermophila.
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3.3 Distribucin subcelular

La actividad hidrolizante de sarin en conejo, cobaya, mono, rata y ratn se encontr
fundamentalmente en la fraccin soluble de hgado y rin.
La fraccin soluble del homogeneizado de hgado, rin y cerebro de rata contuvo el 80-90% de la
actividad DFPasa. Asimismo, tambin se ha descrito en hgado de rata una actividad capaz de
hidrolizar sarin, soman, tabun y DFP con un 85% de actividad en la fraccin soluble y el 15%
restante en la fraccin particulada. La fraccin soluble de hgado y rin de gallina ha mostrado
contener actividad DFPasa. La actividad paraoxonasa ha sido descrita mayoritariamente en la
fraccin particulada de hgado de rata.
Aunque no existen muchos datos parece claro que las actividades fosfotriesterasas se reparten en
distintas fracciones celulares hepticas, si bien parece que en la fraccin soluble de hgado se
localizan preferentemente las actividades hidrolizantes de DFP y compuestos anlogos, y la
actividad hidrolizante de paraoxon y compuestos relacionados estructuralmente con l se localiza
preferentemente en la fraccin particuladas de hgado.
3.4
Estereoselectividad de las fosfotriesterasas
La estereoselectividad en la hidrlisis de los OPs puede ser debida a la hidrlisis de un solo

estereoismero o a la hidrlisis ms rpida de uno de ellos que del resto. La hidrlisis
estereoespecfica de los ismeros del cianofenfos en ratas es debida a la selectividad de las
arilesterasas por el anlogo oxon(-). Sin embargo, la hidrlisis estereoespecfica del soman en
plasma humano se debe a la diferente velocidad de hidrlisis de sus estereoismeros. Estos ltimos
datos contradicen lo publicado por otros autores para hgado de rata, tejido en el cual todos los
ismeros del soman son hidrolizados a la misma velocidad. No obstante, numerosos autores han
demostrado la hidrlisis estereoespecfica del soman en tejidos de rata, cobaya y marmota.
Se ha encontrado una fosfotriesterasa en Escherichia coli que hidroliz soman. La bacteria present
tres isoenzimas, de las cuales una era estereoespecfica y las otras dos no. Se ha tratado de explicar
las discrepancias sobre la estereoespecificidad de la degradacin del soman basndose en las
diferentes fuentes de tejido utilizadas. Es decir, que la estereoespecificidad dependera de si se
utilizaban homogeneizados donde pudieran estar actuando varias isoenzimas o de si se utilizaban
protenas ms o menos purificadas.
Otra fosfotriesterasa en la que ha sido descrita estereoespecificidad es la encontrada en
Pseudomonas diminuta que slo hidroliz el ismero S p del O-etil p-nitrofenil fenilfosfonotioato
(EPN) y 100 veces ms rpido los enantimeros S del acefato y del metamidofos que sus
correspondientes enantimeros R.

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3.5
Activadores e inhibidores de las fosfotriesterasas
Diferentes fosfotriesterasas muestran diferentes respuestas a activadores e inhibidores. As, el

patrn de respuesta a stos ha sido empleado frecuentemente para diferenciar entre actividades
fosfotriesterasas. Siempre que se ha descrito una actividad nueva se ha intentado establecer su
similitud con la actividad paraoxonasa, ya que esta actividad es la ms conocida y estudiada a todos
los niveles (bioqumicos, moleculares, genticos etc.).
La actividad de la mayora de las fosfotriesterasas depende en gran medida de la presencia en el
medio de reaccin de cationes inorgnicos que pueden actuar como inhibidores o activadores.
Algunos cationes juegan el papel de cofactores, lo cual es una diferencia importante respecto a las
carboxilesterasas, ya que stas ltimas son menos sensibles a la accin de los iones y no requieren
cofactores. El hecho de que las fosfotriesterasas sean sensibles a agentes quelantes y que su
actividad, a veces dependa de la concentracin de iones divalentes en el medio de reaccin es
compatible con la posibilidad de que se trate de metalo-enzimas.
3.6
El calcio en las fosfotriesterasas de mamfero
Se ha sugerido que el calcio puede desempear dos papeles en la hidrlisis de paraoxon por
paraoxonasa. El Ca2+ sera requerido principalmente para mantener la conformacin del centro
activo y, el calcio libre (o dbilmente asociado con la fosfotriesterasa) facilitara la retirada del
residuo dietilfosfato del centro activo de la enzima, probablemente a travs de la polarizacin del
enlace P=O del paraoxon.
La actividad paraoxonasa de plasma e hgado de rata dependi de la presencia de Ca 2+ en el medio.
Cuando el catin fue retirado del medio mediante incubacin con cido etilendiaminotetractico
(EDTA) la actividad result inhibida. La reactivacin de la enzima por adicin de Ca 2+ tras
inhibicin por EDTA fue un proceso dependiente de tiempo, los porcentajes de recuperacin de
actividad disminuyeron cuando aument el tiempo transcurrido entre la inhibicin y la adicin de
Ca2+, lo que sugiere la necesidad del Ca2+ para el mantenimiento de la conformacin de la protena.
Resultados similares han sido descritos para la paraoxonasa de hgado humano.
3.7
Otros cationes
La fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta posee dos tomos de Zn2+ unidos a su centro activo
que resultaron ser necesarios para la actividad cataltica. Estos tomos pudieron ser sustituidos por
Mn2+, Co2+, Ni2+, Cd2+ o Mn2+ sin una prdida significativa de actividad. La actividad
fosfotriesterasa de esta bacteria result inhibida tras la incubacin con agentes quelantes. La
actividad se recuper tras la adicin de hasta 10 equivalentes estequiomtricos metal/protena.
En algunas ocasiones los cationes resultan ser inhibidores de las actividades fosfotriesterasas. En
plasma humano, las actividades hidrolizantes de paraoxon y diclorovos (O,O-dimetil
2,2-diclorovinil fosfato) fueron inhibidas por CdSO4, HgCl2 y AgNO3 y EDTA, aunque dichas
actividades fueron restablecidas adicionando concentraciones de Ca 2+ equivalentes a las de EDTA.
El Cu(SO4) a la concentracin 1 mM fue un fuerte inhibidor (64%) de una parathion hidrolasa de
origen bacteriano. El ion Zn2+ a la concentracin de 0.4 mM inhibi hasta un 69% una
fosfotriesterasa de bacteria halfila.
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La actividad hidrolizante de paraoxon en plasma humano present dos poblaciones fenotpicas bien
diferenciadas, la de tipo A (baja actividad) y la de tipo B (alta actividad), cuya distribucin es de
aproximadamente un 50% de ambos tipos en raza caucasiana. La actividad tipo A result poco
estimulada por NaCl 1 M mientras que la actividad tipo B fue fuertemente estimulada por esta alta
concentracin de sal. La actividad paraoxonasa de ambas poblaciones resultaron estimuladas por
fosfatidilcolina. Este compuesto aument la Vmax sin alterar la Km de la reaccin.
3.8
Reactivos de tioles y otros compuestos orgnicos
Debido a que algunas fosfotriesterasas son inhibidas por reactivos bloqueantes de grupos tioles se
ha sugerido que estas protenas podran presentar residuos de cistena en su centro activo.
Tambin se ha descrito el efecto inhibidor de determinadas cetonas como la 2,5-hexanodiona o
metilvinilcetona y sus homlogos.
El OP mipafox result poseer un efecto inhibidor (70-90%) en algunas fosfotriesterasas bacterianas.
3.9
Funcin de las fosfotriesterasas
Funcin biolgica de las fosfotriesterasas

A pesar del gran nmero de estudios realizados sobre fosfotriesterasas su funcin biolgica continua
desconocida. En ningn caso se ha descrito un sustrato endgeno pero parece clara su funcin en la
destoxificacin de xenobiticos organofosforados. Estas actividades no parecen vitales para la salud
ya que en un estudio realizado con suero humano se comprob que los individuos que carecan de
actividad paraoxonasa no presentaban ningn desorden aparente.
Se ha propuesto que las fosfotriesterasas podran haber evolucionado para metabolizar los OPs y los
halometabolitos que existen en la naturaleza, como los anlogos de la alanina, el cido 2-aminoetil
fosfnico y varios fosfonatos que se encuentran libres en las clulas y se incorporan a los
glicerofosfolpodos, esfingofosfolpidos y fosfoprotenas.
La actividad paraoxonasa ha sido detectada en mamferos asociada a la fraccin de lipoprotenas de
alta densidad. Esto ha llevado a sugerir la posibilidad de utilizar los niveles de actividad
fosfotriesterasa como indicativo de la susceptibilidad al desarrollo de la arteriosclerosis coronaria.
La importancia del descubrimiento de baja actividad fosfotriesterasa en suero de pacientes con la
enfermedad del "ojo de pez" (caracterizada por una opacidad corneal muy acusada y por
alteraciones en las lipoprotenas plasmticas) es desconocida.
Papel de las fosfotriesterasas en la destoxificacin de organofosforados
Existe una correlacin entre los niveles de actividad fosfotriesterasa y la resistencia a los efectos
txicos de los OPs. As, las aves presentan bajos niveles de actividad fosfotriesterasa y son
particularmente sensibles a los efectos txicos de los OPs. Sin embargo, los mamferos presentan
mayores niveles de actividades hidrolizantes de OPs y son ms resistentes a sus efectos txicos.
Ms pruebas de la correlacin entre niveles de fosfotriesterasas y susceptibilidad a efectos txicos
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de OPs es el hecho de que en estudios morfolgicos con ovejas tratadas con haloxon se observ que
aquellos animales con alta actividad fosfotriesterasa no mostraban ningn signo de polineuropata
retardada. Adems estas enzimas han sido utilizadas con xito en el laboratorio para la profilaxis de
intoxicaciones por OPs.
Se han realizado estudios sobre la posible aplicacin biotecnolgica de fosfotriesterasas purificadas
e inmovilizadas en trietil agarosa para la eliminacin de residuos de OPs en agua, para la deteccin
de la presencia de stos, e incluso para la destruccin de arsenales de armas qumicas. Aplicando
este sistema a la fosfotriesterasa de Pseudomonas diminuta se consigui que la enzima inmovilizada
presentara unos parmetros cinticos comparables a los de la enzima en estado soluble aunque la
efectividad de la hidrlisis fue menor en la enzima inmovilizada. A pesar de ello, el hecho de que se
pudo alcanzar altas concentraciones de enzima disponible aumentando la superficie de nailon
permiti que se pudieran hidrolizar altas cantidades de substratos.
4
OBJETIVOS
4.1
Objetivo general
El alumno estudiar la biodegradacin enzimtica de insecticidas organofosforados en un sistema

biolgico modelo caracterizando los efectos de cationes divalentes, agentes quelantes y reactivos
bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo.
4.2
Objetivos especficos
El alumno deber ser capaz de...
Aprender la tcnica de determinacin colorimtrica de la actividad paraoxonasa.

Comprender la necesidad de realizar una recta patrn para el clculo de la actividad enzimtica.
Calcular la actividad enzimtica a partir de las mediciones de absorbancia.
Estudiar el efecto de la incubacin con EDTA, Ca 2+, Cu2+ y p-hidroximercuriobenzoato sobre la
actividad paraoxonasa de suero de conejo.
FOSFOTRIESTERASA OBJETO DE ESTUDIO
Se estudiar la actividad hidrolizante de paraoxon en suero de conejo. La siguiente figura muestra la

reaccin catalizada por la paraoxonasa. En la siguiente figura se observa cmo la fosfotriesterasa
hidroliza el paraoxon liberando p-nitrofenol y cido dietilfosfrico:
O
(C 2H5O)2 P O
NO2
Paraoxonasa
(C 2H5O)2 P OH
HO
NO2
PARAOXON

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6
PRECAUCIONES
Deben respetarse las normas generales de seguridad aplicables en cualquier laboratorio y puestos de
trabajo y las normas especficas indicadas en el laboratorio en donde se realiza la actividad.
En casos de duda debe siempre consultar al profesor o responsable del laboratorio. Debe informar
de cualquier anomala que observe, rotura de material o situaciones de peligro para los dems
usuarios.
7
PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL
7.1
Determinacin del p-nitrofenol liberado
Como se muestra en la figura anterior, la hidrlisis enzimtica de paraoxon genera p-nitrofenol. La

cantidad de p-nitrofenol liberado se utilizar para monitorizar y cuantificar la hidrlisis del
paraoxon. Cuando el p-nitrofenol se desprotona forma el ion p-nitrofenolato, que es un compuesto
de color amarillo y que, por lo tanto, absorbe a una longitud de onda en torno a 400 nm.
Preparacin de los patrones de la curva de calibrado a partir de una disolucin 100 M de pnitrofenol en Tris 50 mM pH 8.0
Concentracin de p-nitrofenol (M)
Volumen (L)
p-nitrofenol 100 M (en H2O)

Tris 50 mM pH 8.0
10
20
30
40
50
60
70
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
5000
4500
4000
3500
3000
2500
2000
1500
Resultados experimentales
Absorbancia de los Patrones
0 M
10 M
(Blanco)
1
0
0,248
Pendiente del modelo lineal (y = ax)
Coeficiente regresin de lineal (R2)
Medida N
20 M
30 M
40 M
50 M
60 M
70 M
0,515
0,754
0,978
1,208
Y=0,0235X
R2 = 0,9941
1,406
1,569
Determina la absorbancia a 400 nm de las disoluciones patrn de p-nitrofenol (0 70 M). Se

representar la media de la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol, tras restar el valor del
blanco, frente a la concentracin conocida de dichos patrones, para construir una curva de
calibrado. A partir de sta y de las absorbancias de las muestras, se calcular la concentracin de pnitrofenol generado durante la hidrlisis (ANEXO I).

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7.2
Reactivacin por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por
EDTA
Se inhibir la actividad paraoxonasa de suero de conejo incubando la enzima con EDTA a
diferentes tiempos (0, 5 y 30 min). Tras ello, se tratar de reactivar la enzima adicionando Ca 2+
suficiente para neutralizar el EDTA. Inicie el programa de tiempos que se muestra a continuacin
en tres tubos (tubo 1, 2 y 3) mantenindolos a 37C.
Programa de Tiempos 1 (Temperatura = 37 C), = 400 nm
Tiempo (min)
Tubo
Accin
1, 2 y 3 Aadir 100 L suero conejo (1:10) Contiene la enzima
1, 2 y 3 Aadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0 Ion cambia de color a pH=8
0
1
Aadir 100 L EDTA 5 mM
0+
1
Aadir 800 L Ca2+ 5 mM
2
2
4
3
7
2
10
1
Aadir 1000 L paraoxon 4 mM Sustrato
11
1
Medir Absorbancia 1
17
2
Aadir 1000 L paraoxon 4 mM
18
2
Medir Absorbancia 1
26
1
Medir Absorbancia 2
33
2
Medir Absorbancia 2
34
3
44
3
Aadir 1000 L paraoxon 4 mM
45
3
Medir Absorbancia 1
60
3
Medir Absorbancia 2
Resumen de Tiempos
Tiempo (min)
Tubo
1
2
3
EDTA
0
2
4
Adicin
Ca2+
0+
7
34
Datos Experimentales
Muestra (Tris 50 mM pH 8.0)
Pxn
10
17
44
Medida de Absorbancia
1
2
11
26
18
33
45
60
Absorbancia
400 nm, T = 37C
2+
Tubo 1: 0 min EDTA + Reactivacin Ca

Tubo 2: 5 min EDTA + Reactivacin Ca2+
Tubo 3: 30 min EDTA + Reactivacin Ca2+
1
0,721
0,743
0,728
2
0,936
0,932
0,876

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7.3
Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo
Se determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo

con Cu2+ 1 mM durante 60 minutos.
2+
Absorbancia
400 nm, T = 37C
1
0,781
0,745
2+
Cu C (Ca 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.0)

Cu2+ T (Cu2+ 1 mM en Ca2+ 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.0)
2
1,113
0,914
7.4
Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de
suero de conejo
con p-hidroximercuriobenzoato 1 mM durante 60 minutos.
MB C (Ca2+ 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.0)
MB T (p-OHMB 1 mM en Ca2+ 0.5 mM Tris 50 mM pH 8.0)
7.5
Absorbancia
400 nm, T = 37C
1
2
0,764
1,110
0,767
0,939
Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

con EDTA 1 mM durante 10 minutos.
EDTA C (Tris 50 mM pH 8.0)
EDTA T (EDTA 1 mM en Tris 50 mM pH 8.0)
Absorbancia
400 nm, T = 37C
1
0,821
0,780
2
1,061
0,767

Tel: (+34)965222157; Fax: (+34)966658511
10
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Tiempo (min)
Tubo
Accin
Cu2+ C y T
Aadir 100 L suero conejo (1:10)
Cu2+ C y T
Aadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0
2+
0
Cu C
0+
Cu2+ C
2+
2
Cu T
2+
2+
Cu T
Aadir 600 L Cu2+ 5 mM
20
20+
22
22+
MB C y T
MB C y T
MB C
MB C
MB T
MB T

Aadir 600 L p-OHMB 5 mM
30
30+
32
32 +
40
41
42
43
56
58
EDTA C y T
EDTA C y T
EDTA C
EDTA C
EDTA T
EDTA T
EDTA C
EDTA C
EDTA T
EDTA T
EDTA C
EDTA T

Aadir 1000 L de paraoxon 4 mM
Medir Absorbancia 1
Medir Absorbancia 1
Medir Absorbancia 2
Medir Absorbancia 2
60
61
62
63
76
78
Cu2+ C
Cu2+ C
Cu2+ T
Cu2+ T
Cu2+ C
Cu2+ T

Medir Absorbancia 1
Medir Absorbancia 1
Medir Absorbancia 2
Medir Absorbancia 2
80
81
82
83
96
98
MB C
MB C
MB T
MB T
MB C
MB T

Medir Absorbancia 1
Medir Absorbancia 1
Medir Absorbancia 2
Medir Absorbancia 2

Tel: (+34)965222157; Fax: (+34)966658511
11
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7.6
Efecto de la especie sobre la actividad paraoxonasa
Se comparar la actividad paraoxonasa en suero de conejo y de pollo.
Tiempo (min)
Tubo
Accin
Pollo
Aadir 100 L suero pollo (1:10)
Pollo
Aadir 300 L Ca 5 mM
Pollo
Conejo
Conejo
Aadir 300 L Ca 5 mM
Conejo
0
Pollo
1
Pollo
Medir Absorbancia
2
Conejo
3
Conejo
Medir Absorbancia
6
Pollo
Medir Absorbancia
8
Conejo
Medir Absorbancia
11
Pollo
Medir Absorbancia
13
Conejo
Medir Absorbancia
16
Pollo
Medir Absorbancia
18
Conejo
Medir Absorbancia
21
Pollo
Medir Absorbancia
23
Conejo
Medir Absorbancia
26
Pollo
Medir Absorbancia
28
Conejo
Medir Absorbancia
31
Pollo
Medir Absorbancia
33
Conejo
Medir Absorbancia
36
Pollo
Medir Absorbancia
38
Conejo
Medir Absorbancia
41
Pollo
Medir Absorbancia
43
Conejo
Medir Absorbancia
46
Pollo
Medir Absorbancia
48
Conejo
Medir Absorbancia
Resultados
Tiempo
1
6
11
16
21
26
31
36
41
46
Pollo
[p-nitrofenol]
Absorbancia
C (M)
0,683
29,064
0,670
28,511
0,680
28,936
0,675
28,723
0,658
28
0,673
28,638
0,711
30,255
0,658
28
0,740
31,489
0,681
28,979
Tiempo
1
6
11
16
21
26
31
36
41
46
Conejo
[p-nitrofenol]
Absorbancia
C (M)
0,691
29,404
0, 814
34,638
0,976
41,532
1,055
44,894
1,165
49,574
1,288
54,809
1,419
60,383
1,515
64,468
1,590
67,659
1,645
70
A partir de la curva de calibrado (C = Abs/0,0235) y de las absorbancias de las muestras, se

calcular la concentracin de p-nitrofenol generado durante la reaccin de biotransformacin
(ANEXO I).

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Divisin Toxicologa
INFORME FINAL
Elabore un informe final sobre el trabajo realizado, incluyendo las respuestas a las cuestiones que se
plantean a continuacin. Aada cualquier otro comentario que considere pertinente.
(1)
En el experimento de reactivacin por Ca2+, Cul es la razn concentracin de calcio /

concentracin de EDTA en el volumen de reaccin enzimtica? Representar en una figura de
barras la actividad enzimtica en funcin del tiempo de incubacin en presencia de EDTA.
Qu se observa? Cmo podra justificar estos resultados?
Ca / EDTA = ((800*5)/4)/((100*5)/4) = 1000/125 = 8 =8/1
(2)
Represente en una grfica de barras las actividades enzimticas de las muestras control y
ensayadas en presencia de Cu2+ 1 mM. Cul es el efecto del Cu2+? Cmo podra justificar
estos resultados?
Muestra
Cu2+ C
Cu2+ T
Muestra
Cu2+ C
Cu2+ T
Absorbancia
1
2
0,781
1,113
0,745
0,914
Act enzimtica
C2-C1
C*4/15
14,128
3,767
7,192
1,917
C. (C = Abs/0,0235)
1
2
33,234
47,362
31,702
38,894
Act. Relativa
Act.enz/ 10-2
376,7
191,787
El Cu+2 es un inhibidor competitivo , produciendo una menor actividad.

(3)
ensayadas en presencia de p-hidroximercuriobenzoato 1 mM. Cul es el efecto del phidroximercuriobenzoato? Cmo podra justificar estos resultados?
Muestra
MB C
MB T
Muestra
MB C
MB T
Absorbancia
1
2
0,764
1,110
0,767
0,939
Act enzimtica
C2-C1
C*4/15
14,723
3,926
7,319
1,952
C. (C = Abs/0,0235)
1
2
32,511
47,234
32,638
39,957
Act. Relativa
Act.enz/ 10-2
392,613
195,173
El Mg +2 se une al grupo tiol de la enzima e impide la actividad , deduciendo que hay una
cisteina SH. No debera producirse actividad.
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Divisin Toxicologa
(4)
ensayadas en presencia de EDTA 1 mM. Cul es el efecto del EDTA sobre la actividad
paraoxonasa de suero de conejo? Cmo se justifican estos resultados?
Muestra
EDTA C
EDTA T
Muestra
EDTA C
EDTA T
(5)
Absorbancia
1
0,821
0,780
2
1,061
0,767
Act enzimtica
C2-C1
C*4/15
10,213
2,723
-0,553
-0,147
C. (C = Abs/0,0235)
1
2
34,936
45,149
33,191
32,638
Act. Relativa
Act.enz/ 10-2
272,346
-14,746
El EDTA inhibe la enzima, debido a que se une al Ca+2, necesario para unir el sustrato a la
enzima.
Hay dos tipos de calcio uno de alta afinidad y que facilita la cantividad en el centro activo y
que es secuestrado por el EDTA y otro que mantiene la estructura tridimensional de la
enzima, si es secuestrado por el EDTA , la enzima se desnaturaliza.
Representa en una misma grfica la concentracin de p-nitrofenol producido como
consecuencia de la actividad paraoxonasa cuando se utiliza suero de pollo y conejo. Cmo
podra justificar estos resultados? Qu especie ser ms susceptible a la exposicin al
organofosforado paraoxon? Explica por qu.
En el pollo no se produce tanta hidrolisis del paroxon porque no tiene enzima , por lo que ser
ms sensible

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ANEXO I
CLCULO DE ACTIVIDAD ENZIMTICA
La actividad enzimtica se expresar utilizando la unidad internacional.
Unidad Internacional (UI o U): cantidad de enzima que transforma 1 micromol (mol) de sustrato por minuto de
reaccin en las condiciones de ensayo. En la presente prctica el producto coloreado que se forma es p-nitrofenol que se
cuantifica midiendo la absorbancia a 400 nm.
1 UNIDAD = 1 U = 1 mol / min
La actividad enzimtica se define mediante la siguiente expresin:
Act
n
n
t ti t0
(Exp. 1)
Donde n es el incremento en el nmero de moles p-nitrofenol entre el tiempo inicial (t0) y el tiempo i (ti).
Teniendo en cuenta que los datos obtenidos en la prctica son medidas de absorbancia de p-nitrofenoly tiempo,
emplearemos la definicin de concentracin y la ley de Lambert-Beer con el fin de obtener una expresin que permita
calcular la actividad enzimtica.
En primer lugar, la concentracin se define con la expresin que se muestra a continuacin:
n
V
(Exp. 2)
Donde c es la concentracin, n el nmero de moles de p-nitrofenol y V es el volumen de la disolucin. Por lo que se

desprende que:
n
V
(Exp. 3)
Despejando n de la definicin de concentracin (Exp. 3) y sustituyendo en la definicin de actividad enzimtica (Exp.

1) obtenemos:
Act
V c V c
t
ti t0
(Exp. 4)
Con el fin de conocer C para cada muestra, se representar la absorbancia de los patrones de p-nitrofenol frente a la
concentracin conocida de dichos patrones, obteniendo un modelo lineal (Exp. 5ab).
Abs aC b
( Abs b)
C
a
(Exp. 5a)
(Exp. 5b)
Donde Abs es la absorbancia, C la concentracin, y tanto a como b dos constantes obtenidas mediante el ajuste lineal.
La absorbancia medida para cada muestra se introducir en el modelo lineal (Exp. 5b) para calcular la concentracin, y
a continuacin se calcular el incremento de concentracin (C = C2 C1) para cada muestra.

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__________________________________________________________________
Divisin Toxicologa
Introduciendo el valor calculado c en la Exp. 4 y sustituyendo el valor del volumen total de reaccin obtenemos la
actividad enzimtica a partir de los datos de absorbancia y tiempo obtenidos en el laboratorio.
Con el objeto de calcular la actividad enzimtica relativa al volumen de suero utilizado (medido en mL) emplearemos la
expresin:
Act rel
Act
Vs
(Exp. 6)
Donde Vs es el volumen de suero utilizado inicialmente. Sustituyendo la actividad enzimtica (Act) de la Exp. 4 en la
Exp. 6 obtenemos:
Actrel
V C
V C
Vs t Vs (ti t0 )
(Exp. 7)

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16
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Divisin Toxicologa
RESUMEN:
Determinacin de la actividad enzimtica relativa al volumen de suero utilizado
V
Volumen de reaccin enzimtica, (4 mL = 410-3 L)
C
Concentracin (M) calculada a partir de la absorbancia de la muestra (Abs) y
del modelo lineal obtenido con los patrones (Exp. 5ab):
Abs aC b C
C
( Abs b)
a
C = C2 C1; Incremento de concentracin de p-nitrofenol producido por

paroxonasa (M)*
Volumen de suero inicial (10L = 10-2 mL)**
Tiempo de medida en el momento i (medida de laboratorio)***
Tiempo de medida inicial (medida de laboratorio)***
Vs
ti
T0
Actividad enzimtica
relativa (Exp. 7)
Act rel
V C
V C
Vs t Vs (ti t0 )
* C calculada mediante la curva de calibrado (M).

** Las unidades de la actividad enzimtica relativa son molmin-1mL-1, y en consecuencia el valor del volumen de
suero inicial que se introduce en la Exp. 7 tiene como unidades el mL.
*** Introducir en la Exp. 7 la medida de tiempo en minutos.
PATRONES
Absorbancia de los Patrones
Medida N
1
Media-Bl.
0 M
(Blanco)
0
0 M
0
10 M
20 M
50 M
60 M
70 M
0,248
0,515
0,754
0,978
1,208
Pendiente del modelo lineal (y = ax)
20 M
30 M
40 M
50 M
21,914
32,085
41,617
51,404
1,406
1,569
60 M
59,829
70 M
66,766
10 M
10,553
MUESTRAS PROBLEMA
Tubo
Absorbancia
1
2
30 M
40 M
[p-nitrofenol]
C1 (M)
C2 (M)
C (M)
Reactivacin por Ca2+ de la actividad paraoxonasa de suero de conejo inhibida por EDTA
0 min
0,721 0,936
30,681
39,829
9,148
5 min
0,743 0,932 31,61702128 39,65957447 8,042553191
30 min
0,728 0,876 30,9787234 37,27659574 6,29787234
Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo
Cu2+ C
0,781 1,113
33,234
Cu2+ T
0,745 0,914
31,702
47,362
38,894
14,128
7,192
Act. Enz. Rel.

(molmin-1mL1
)
243,968
214,4680851
167,9432624
376,7
191,787
Efecto de reactivos bloqueantes de grupos tioles sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo
MB C
0,764 1,110
32,511
47,234
14,723
MB T
0,767 0,939
32,638
39,957
7,319
392,613
195,173
Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

EDTA C
0,821 1,061
34,936
45,149
EDTA T
0,780 0,767
33,191
32,638
272,346
-14,746
10,213
-0,553

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Degradación Enzimática de OPs Por Paraoxonasa

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DEGRADACIN ENZIMTICA DE XENOBITICOS:

El objetivo general de esta actividad es observar, monitorizar y caracterizar la biodegradacin

FOSFOTRIESTERASAS: LAS ENZIMAS QUE HIDROLIZAN COMPUESTOS

Las esterasas que hidrolizan organofosforados

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Distribucin de fosfotriesterasas entre especies y tejidos

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Reactivos de tioles y otros compuestos orgnicos

Funcin de las fosfotriesterasas

Funcin biolgica de las fosfotriesterasas

El alumno estudiar la biodegradacin enzimtica de insecticidas organofosforados en un sistema

El alumno deber ser capaz de...

Aprender la tcnica de determinacin colorimtrica de la actividad paraoxonasa.

Se estudiar la actividad hidrolizante de paraoxon en suero de conejo. La siguiente figura muestra la

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Determinacin del p-nitrofenol liberado

Como se muestra en la figura anterior, la hidrlisis enzimtica de paraoxon genera p-nitrofenol. La

p-nitrofenol 100 M (en H2O)

Determina la absorbancia a 400 nm de las disoluciones patrn de p-nitrofenol (0 70 M). Se

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1, 2 y 3 Aadir 2000 L Tris 50 mM pH 8.0 Ion cambia de color a pH=8

Tubo 1: 0 min EDTA + Reactivacin Ca

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Efecto del Cu2+ sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Se determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo

Cu C (Ca 0.5 mM en Tris 50 mM pH 8.0)

Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

Se determinar cmo afecta a la actividad paraoxonasa la incubacin a 37 C de suero de conejo

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Aadir 100 L suero conejo (1:10)

Aadir 100 L suero conejo (1:10)

Aadir 1000 L de paraoxon 4 mM

Aadir 1000 L de paraoxon 4 mM

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A partir de la curva de calibrado (C = Abs/0,0235) y de las absorbancias de las muestras, se

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En el experimento de reactivacin por Ca2+, Cul es la razn concentracin de calcio /

El Cu+2 es un inhibidor competitivo , produciendo una menor actividad.

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Donde c es la concentracin, n el nmero de moles de p-nitrofenol y V es el volumen de la disolucin. Por lo que se

Despejando n de la definicin de concentracin (Exp. 3) y sustituyendo en la definicin de actividad enzimtica (Exp.

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C = C2 C1; Incremento de concentracin de p-nitrofenol producido por

* C calculada mediante la curva de calibrado (M).

Act. Enz. Rel.

Efecto de agentes quelantes sobre la actividad paraoxonasa de suero de conejo

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