MANUAL DE

ANDROLOGIA
E MANIPULAO DE
SMEN EQUINO

PROF. DR. FREDERICO OZANAM PAPA

PROF. DR. MARCO ANTONIO ALVARENGA
DR. JOS ANTONIO DELLAQUA JR.
MS. GABRIEL AUGUSTO MONTEIRO

2011
05-12

NDICE
1. ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO EQINO

04

2. ENDOCRINOLOGIA DA REPRODUO DO GARANHO

05

3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO GARANHO

3.1 PNIS E PREPCIO

07
07
08
10

3.2. TESTCULOS
3.3. EPIDDIMO, GLDULAS ANEXAS E CONDUTOS ESPERMTICOS
4. EXAME ANDROLGICO
4.1 INTRODUO
4.2 MATERIAL NECESSRIO
4.3 SEQUNCIA DO EXAME
5

12
12
12
13

ULTRASSONOGRAFIA APLICADA AO EXAME ANDROLGICO

14

5.1 INDRODUO
14
5.2 ANATOMIA ULTRASSONOGRFICA DO ESCROTO,
TESTCULO, EPIDDIMO E FUNCULO ESPERMTICO
14
5.3 EXAME ULTRASSONOGRFICO DO ESCROTO, TESTCULO, EPIDDIMO
E FUNCULO ESPERMTICO
16
6

COLHEITA DO SMEN
6.1 ANLISE DO SMEN
6.1.1 EXAMES IMEDIATOS
6.1.2 EXAMES MEDIATOS
6.1.3 CMARA DE NEUBAUER

19
19

19
20
21

6.2 PADRES DE PATOLOGIAS ESPERMTICAS

6.3 PRINCIPAIS CAUSAS DAS PATOLOGIAS ESPERMTICAS
6.4 MODELO DE LAUDO DE EXAME ANDROLGICO
6.5 CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE SMEN DE
GARANHES DESCRITOS POR VRIOS PESQUISADORES

7. METODOLOGIA BSICA PARA REFRIGERAO DE SMEN

7.1 DILUIO
7.2 REFRIGERAO
7.3 INSEMINAO

8. CONGELAO DE SMEN
8.1
8.2
8.3
8.4
8.5

INTRODUO
MATERIAL NECESSRIO
SEQUNCIA PARA CONGELAO
LAUDO PARA SMEN CONGELADO
PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA MEMBRANA
PLASMTICA

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29
31

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32
32
33
36
37

9.

AUTORES

40

10. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

41

ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO

42

ANEXO 2- MONTAGEM DA BOTUBOX PASSO A PASSO

43

ANEXO 3- MONTAGEM DA BOTUTANIER PASSO A PASSO

44

ANEXO 4-COMO UTILIZAR O BOTU-IA?

45

ANEXO 5- COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL

46

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1.ANATOMIA DO SISTEMA GENITAL MASCULINO

GARANHO

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2.

ENDOCRINOLOGIA
GARANHO

DA

REPRODUO

DO

Para que os testculos possam produzir espermatozides de maneira contnua

necessrio que o eixo hipotlamo hipfise gnadas, esteja em sincronia, de tal forma
que os hormnios envolvidos para esta finalidade sejam liberados em quantidades
adequadas.
O hipotlamo uma regio cerebral localizada no diencfalo, responsvel pela
liberao de GnRH. Este hormnio peptdico via sistema porta hiposisrio vai at a
hipfise, onde reconhecido pelas clulas l presentes desencadeando a secreo das
gonadotrofinas (FSH e LH) que atravs corrente da sangnea se dirigem at os testculos,
resultando na produo de esterides (estrgeno e testosterona), que participam da
formao dos espermatozides.
Os hormnios envolvidos na reproduo so liberados atravs de retroalimentao
positiva ou negativa, conforme a necessidade. Sua produo estimulada ou inibida, de
maneira a se manter concentraes adequadas para a plena produo espermtica.
Nos testculos h a presena de dois tipos de clulas. As clulas de Leydig que
produzem testosterona pelo estmulo do LH, testosterona esta que ligada por uma
protena ligadora de andrgenos (ABP) a luz das clulas de Srtoli (estimulada pelo FSH)
produtoras da ABP e responsveis pelo controle da espermatognese.
Conforme h um aumento das concentraes de testosterona circulante, ocorre
uma retroalimentao negativa a nvel do hipotlamo resultando numa diminuio dos
pulsos de liberao de GnRH desencadeando uma menor liberao de gonadotrofina (LH)
que diminui a produo de testosterona pelos testculos. Quando existe a necessidade de
uma maior produo deste hormnio ocorre uma retroalimentao positiva e os nveis
testosterona so novamente restabelecidos.
Outro hormnio que participa dos processos de regulao da secreo de GnRH
a inibina produzida pelas clulas de Srtoli, ela promove uma maior ou menor liberao dos
pulsos de GnRH que diminuem ou aumentam a secreo do FSH afetando a produo da
ABP e da prpria inibina.
de grande importncia o conhecimento deste mecanismo para um bom
diagnstico de alteraes reprodutivas que possam vir a afetar o macho prejudicando sua
funo reprodutiva e qualidade espermtica.
Segue abaixo o esquema do eixo hipotlamo - hipfise gnadas.

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NEUROENCDOCRINE AND ANATOMY AND FUNCTION. Proposed positive(+)

and (-) feedback control of hormone production and release in the stallion. VNO
,Vomeronasal organ: GnRh, gonadotropin-releasing hormone: LH, luteinizing hormone;
PRL prolactin; FSH, follicle-stimulating hormone; T, testosterone; E, estrogens; I,
inhibin; A, activin. Potencial external influences on hypothalamic secretion are also cted.
(Adapta also Adapted from Pickett,B.W.,Amann,R.P.,McKinnon,A.O.,et al: Management
of the stallion for maximum reproductive efficiency. II. Animal Reproduction Laboratory
General Series Bulletin n 05,Fort Collins,CO: Colorado State University,1989,p1) (Equine
Breeding Management and Artificial Insemination, Juan C. Samper, second edition).

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3. PATOLOGIAS DO SISTEMA REPRODUTIVO DO

GARANHO
3.1

PNIS E PREPCIO

Fimose
Incapacidade de expor o pnis comumente, podendo ser congnito ou adquirida, por
traumas ou infeces. Tratamento: cirrgico.

Parafimose
Dificuldade de retrao do pnis, principalmente devido a leses de medula, leses
do msculo retrator do pnis, estenose. Tratamento: limpeza de leses no pnis, compressas
de gua fria, aumento do dimetro do stio prepucial.

Balanopostite
Inflamao do pnis (balanite) e prepcio (postite), freqentemente ocorrem
simultaneamente balanopostite. Agentes causadores: P. aeroginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma,
Ureaplasma, Chlamydia, Protozoa , Virus, , Sendo mais comum em garanhes as leses
parasitrias causadas por Habronema ou mesmo miases ou tambm por traumatismos.
Tratamento: Retirada da causa, tratamento antibacteriano (infeces secundrias) com
antibiticos sistmicos de eliminao pela urina, ivermectina (infeces parasitrias),
organofosforado (habronemose).

Hematoma peniano
Geralmente devido a ruptura da tnica albugnea, por traumas no momento da
cpula, freqentemente o hematoma ocorre no dorso do pnis, a identificao da patologia
dada pela inspeo e palpao. Tratamento: o tempo de recuperao esta diretamente
envolvido com a evoluo do quadro, hidroterapia (ducha 3 x ao dia), puno se necessrio,
colocar suspensrio, anti-inflamatrios no esteride, antibiticoterapia

Edema prepucial
Traumatismos, picada de insetos ou ofdios. Tratamento: baseado nos agentes
causadores.
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Lacerao prepucial
Leses traumticas no prepcio, dependendo da extenso e tempo de evoluo
sutura com plastia local almejando evitar alteraes no stio prepucial, se o tempo de
evoluo for maior que 24hs ferida j contaminada tratamento tpico (limpeza, agentes
desinfetantes, ducha e repelentes), cicatrizao por segunda inteno.

3.2 TESTCULOS
Degenerao testicular
Condio adquirida decorrente de fatores que afetam a homeostase testicular.
Muitos deles envolvendo alteraes da termorregulao testicular como piques febris , o
processo de degenerao classificado em graus I, II e III, quanto maior o grau maior a
severidade da patologia. Podem tambm ser de origem medicamentosa ( Anabolizantes e
corticoesterides ). O prognstico bom a no ser nos casos onde j houve perda de massa
testicular e formao de tecido conjuntivo. Tratamento: retirada da causa e tempo mnimo
de 60 dias.

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Hipoplasia e aplasia testicular

A aplasia testicular a ausncia de um ou dos dois testculos de rara incidncia.
J a hipoplasia (diminuio do tamanho testicular) uni ou bilateral mais comumente
encontrada, ambas patologias so de origem gentica causadas por um gene recessivo de
penetrncia incompleta. Tratamento: por se tratar de uma patologia de origem gentica
deve-se afastar o animal da reproduo.
Para se diferenciar um quadro de hipoplasia testicular de uma degenerao
necessita-se de uma anamnese bem detalhada. Nos casos de degenerao os testculos
tinham tamanho normais, nas hipoplasias sempre foram pequenos e as alteraes do
ejaculado no se alteram como no caso da Degenerao Testicular,

Orquite
Freqentemente causada por uma infeco ou traumatismo e associada a
epididimite.
Aguda: aparecimento sbito, presena de aumento de temperatura local, dor,
aumento de volume, perda da funo, animal se locomove pouco. Causas infecciosas mais
comuns nos equinos so: P. aeroginosa, Klebsiella pneumoniae, Streptococcus spp,
Staphilococcus spp., B. abortus, E. coli, Mycoplasma , Ureaplasma , Chlamydia,
Protozoa, Virus. Tratamento: Ducha, antiinflamatrio sistmico (Sulfa +Trimetropin,
Enrofloxacina).
Crnica: aumento de volume, alterao da consistncia e perda da sensibilidade
dolorosa acentuada.

Neoplasias testiculares
Os tumores testiculares so raros, os mais comumente diagnosticados em
garanhes so os seminomas (de clulas germinativas), sendo encontrados tambm os
tumores das clulas intersticiais (clulas de Leydig) e os tumores das clulas de Sertoli.
Diagnstico: Acomete idosos, superfcie dura e irregular, leses circulares a Ultrasonografia. Tratamento: retirada cirrgica do testculo afetado.

Hrnia inguino-escrotal
Presena de contedo abdominal na bolsa escrotal, pode haver presena de alas
sem prejuzo do trnsito intestinal, entretanto pode ocorrer o encarceramento das alas com
parada do trnsito intestinal. Testculo aumentado e frio dor aguda e intensa, Tratamento:
cirrgico com retirada do testculo do lado acometido e fechamento do anel.

Rotao testicular
O testculo afetado mantm seu posicionamento horizontal em relao ao eixo
cranio-caudal do animal, porm com giro de 180o observado pela alterao de localizao

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da cauda do epiddimo em relao parede abdominal. Tratamento: depende do grau de

rotao, podendo dispensar interveno desde que no haja interferncia na qualidade
seminal do garanho ou exigir o reposicionamento do testculo com utilizao de sedao
ou at procedimento cirrgico.

Toro Testicular
No testculo afetado, observa-se um giro no eixo longitudinal de modo que nos
casos de toro de 90 a cauda do epiddimo estar em posio lateral ou medial e nos
casos de toro de 180 a cauda do epiddimo estar em posio cranial. Dependendo do
grau de toro pode haver comprometimento circulatrio e, nesses casos, o tratamento
cirrgico com a retirada do testculo afetado.

3.3. EPIDDIMO, GLNDULAS ANEXAS E CONDUTOS

ESPERMTICOS
EPIDDIMO:
a)Defeitos congnitos:
Aplasia Segmentar: todo ou parte do epiddimo, vasos deferentes ou vesculas
seminais podem estar ausentes.
Hipoplasia : geralmente acompanha a hipoplasia testicular.

b)Granuloma Espermtico: obstrues congnitas dos ductos e se encontram na

cabea do epiddimo. Os granulomas podem alcanar tamanho suficiente para obstruir
outros tubos eferentes.

c)Espermatocele: Dilatao cstica do condutodo epiddimo, com acmulo de

espermatozides. Ocluso congnita ou adquirida. As espermatoceles progridem para
granulomas. O esperma condensado na espermatocele ou no granuloma tem uma cor
amarela e de consistncia caseosa como pus na infeco por Corinebacterium spp.

d)Epididimite: Esta afeco s vezes coexiste com a orquite .A fibrose inflamatria

produz na fase crnica endurecimento e aumento de volume do epiddimo, sobretudo do
corpo. Pode haver aderncia entre as capas parietal e visceral da tnica vaginal com
obliterao parcial ou total. Epididimites: mais freqente na cauda .
Infeces do epiddimo pelos agentes=> Strep Beta Hemoltico,P. aeroginosa, Klebsiella
pneumoniae, Streptococcus spp, Staphilococcus spp., B. abortus, Mycoplasma ,
Ureaplasma , Chlamydia, Protozoa , Virus.
Sintomas: podem ser agudos ou crnicos como dor, temperatura elevada, sensibilidade,
tumefao da cauda do epiddimo. Ndulos no conduto deferente facilmente perceptveis
palpao=>obliterao=>azoospermia,
quando os dois condutos estiverem afetados.

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Geralmente a infeco atinge=>testculos e as vesculas seminais. Diminui a libido pelo

componente Dor ,podendo haver piospermia.
Diagnstico: exame bacteriolgico, Ultra-sonografia alteraes a palpao.
Prognstico: grave por agentes especficos , reservado devido obliterao dos condutos e
aspermia.
Tratamento: Especficos: sulfa+ trimetropin , Cloranfenicol .

CONDUTOS ESPERMTICOS:
a) Espermiostasia: Azoospermia de origem excretora devido obliterao total ou
parcial da vias espermticas, cuja etiologia pode ser:
traumtica, infecciosa e hereditria.
Leses: cabea epiddimo bastante espessa e saliente , corpo duro e com
superfcie irregular, cauda distendida e saliente na base do testculo. Ao corte estas
estruturas apresentam material caseoso, seco, branco, aglomerado celular denso: numerosos
espermatozides alterados e ou anormais, restos clulas epiteliais e grandes clulas
macrfagas.
Patogenia: Com o estreitamento das vias , congnito ou adquirida, o smen no pode ser
expulso e se acumula nos segmentos do epiddimo e depois nos tubos seminferos inclusive
provocando alterao na espermatogenese. Geralmente ocorre espermofagia .
Sintomas: fertilidade baixa em 1 ou 2 anos , instalando-se a seguir a esterilidade. A libido
mantido , a ejaculao mnima e constituida por secrees vesico uretrais
Prognstico: negativo. Os de origem hereditria devem ser descartados. Unilaterais de
outras origens devem sofrer castrao do testculo afetado.

b) Fstula Uretral: Traumas na poro do pnis=>hemospermia grave.

Diagnstico: Exame de smen e Endoscopia.
Tratamento: Cauterizao, Cirurgia e Tratamento com antibiticos e sulfas.

GLNDULAS ANEXAS:
a) Vesiculite: Inflamao aguda e crnica.
Causa de perda econmica prematura em touros: reduo da qualidade do smen e da
motilidade ps-descongelao.
Idade pode ser fator predisponente .
Causa: Bactrias, Vrus, Chlamydia, Fungos e Protozorios., Staphilococcus spp.,
Streptococcus spp., Escherichia coli, Leptospira interrogans , Proteus mirabilis , Clamydia
psittaci, Candida guilliermondii ,Pseudomonas aeroginosa, Klebsiella pneumoniae,
Ureaplasma.
Em geral no apresenta dor (mico, defecao e ejaculao). Smen: piospermia, sem
alterao da motilidade imediata, havendo diminuio da viabilidade aps algum tempo.
Palpao: difcil diagnstico de vesiculite, abscedao: rara, Ultrasom: dificil diagnstico

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pelas caractersticas da vescula seminal => antes da cobertura repleta (anecica), aps
ejaculao => vazia.
Tratamento clnico: antibioticoterapia sistmica aps antibiograma, muitos antibiticos no
conseguem penetrar na luz da glndula em concentrao teraputica. Antibiticos precisam
ter alta solubilidade em lipdeos, baixo peso molecular, afinidade por protenas plasmticas,
pKa alto, pH alto (Sulfa +Trimetropin, Enrofloxacina, Cloranfenicol).
Endoscopia: lavagem (5x) da glndula com soluo salina e antibiticos (ticarcilina sdica
ou ampicilina sdica).
Remoo Cirrgica: no usada rotineiramente, podendo apresentar complicaes psoperatrias como: hemorragias, infeces e leses nos nervos plvicos (ligados ejaculao).

4.EXAME ANDROLGICO
4.1. INTRODUO
O exame androlgico reflete as atuais condies reprodutivas de um macho. O
potencial reprodutivo do animal deve ser verificado sempre quando este for para
exposies, iniciar uma estao de monta, diagnostico de sub ou infertilidade, ocorrncia da
puberdade, destinado a criopreservao de smen, etc.
A avaliao destina-se a observao das condies semiolgicas, bem como as
condies de sanidade, alteraes genticas, sade geral, deficincias na cpula por
alteraes locomotoras ou alteraes do sistema genital (impotncia coeundi) e problemas
espermticos (impotncia generandi).
O laudo de um exame androlgico nunca definitivo (para o resto da vida
reprodutiva), sempre deve-se levar em considerao que o animal logo aps o exame pode
vir a sofrer de alguma patologia que leve-o a depreciaes em sua qualidade espermtica,
por isso o laudo no deve ser emitido com uma validade superior a 60 dias (tempo em que
ocorre a espermatognese mais o trnsito epididimrio).

4.2. MATERIAL NECESSRIO

A)
B)
C)
D)
E)
F)
G)
H)
I)
J)

ficha para anotaes + caneta

paqumetro
fita mtrica
luva de palpao
vagina artificial
copo coletor
microscpio
mesa aquecedora (37C)
lminas e lamnulas
cmara de Neubauer

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K) vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker)

L) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20l ou palheta de 0,5ml
M) corantes para patologia espermtica

4.3. SEQNCIA DO EXAME

A) Identificao do animal:
Nome, registro, idade, raa
B) Identificao do proprietrio:
Nome, endereo, telefone, nome da propriedade
C) Exame do animal:

Anamnese (animal estabulado ou a campo, quanto tempo se cobrir, doenas

anteriores, medicamentos aplicados)
Exame clnico geral (verificao dos parmetros respiratrio, cardaco, digestivo,
aprumos, sensibilidade na coluna)
Exame clnico especfico do aparelho reprodutivo (padres normais)

Prepcio sem nenhuma alterao, edema, leses etc.

Pnis sem nenhuma alterao, escaras, edema, hematoma, forma.
Glndulas anexas Palpao retal (somente dever ser realizada a palpao retal se ficar
constatado quadro de piospermia ou hemospermia).
Testculos e Bolsa escrotal Observa-se bem o escroto, se no h feridas, bernes, edema,
varicocele (dilataes vasculares), ento palpa-se os testculos que no eqino tm a
forma ovide e posicionamento horizontal em relao ao animal. Devem ter mobilidade
dentro da bolsa, ausncia de dor a palpao, simetria, consistncia fibroelstica. Devem
ser feitas mensuraes individuais de cada testculo, que demonstram com maior
exatido a verdadeira massa testicular, devendo ser realizadas com o auxlio de um
paqumetro. Comprimento 5 a 12cm (do polo proximal at o polo distal do testculo),
largura 4 a 8 cm (medida latero-madial, na poro mdia do testculo), altura 4 a 8 cm
(medida infero-superior, na poro mdia do testculo).
Epiddimos Devem ser palpados verificando sua presena, sensibilidade, forma e
localizao (cabea acoplada ao polo cranial, corpo localizado na face medial dos
testculos e cauda geralmente bem definida na regio caudal dos testculos, apresentado
consistncia fibro-eslstica de tamanho variando de 1x1 a 3x3, conforme idade do
animal e freqncia de ejaculados).

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5. ULTRASSONOGRAFIA APLICADA AO EXAME

ANDROLGICO EM GARANHES
5.1 INTRODUO
A ultrassonografia um mtodo diagnstico no invasivo que fornece importantes
informaes sobre a arquitetura interna de rgos. Embora o exame ultrassonogrfico do
trato reprodutivo de guas seja utilizado h mais de 30 anos, este exame no
rotineiramente utilizado na avaliao dos rgos genitais de garanhes durante o exame
androlgico, sendo somente requerido quando h suspeita de algum processo patolgico
especfico.
A ultrassonografia do trato reprodutivo de garanhes uma excelente ferramenta no
diagnstico de inmeras condies patolgicas como granuloma espermtico, epididimites,
criptorquidismo, varicocele, estruturas csticas do epiddimo, aumento da espessura da
tnica vaginal e neoplasias testiculares. Alm disso, este exame permite aferies exatas de
medidas tais como altura, largura e comprimento, bem como rea transversal e
circunferncia na parte mais larga de cada testculo, medidas estas utilizadas para estimar
volume testicular e produo diria de espermatozides.

5.2
ANATOMIA
ULTRASSONOGRFICA
DO
ESCROTO,
TESTCULO, EPIDDIMO E FUNCULO ESPERMTICO
Um garanho normal possui dois testculos localizados na regio inguinal, cada um
com formato elipside, orientados longitudinalmente no eixo horizontal com um cordo
espermtico localizado cranio-dorsal (LOVE, 1992; TURNER, 1998). O funculo
espermtico recoberto pela tnica albugnea e contm a artria testicular, plexo
pampiniforme e ducto deferente (Figura 1).
A artria testicular forma ramificaes sobre a superfcie do testculo, que se
estendem para o parnquima testicular e retornam no plexo pampiniforme do funculo
espermtico para o abdmen (TURNER, 1998). A regio cranial do testculo
ligeiramente mais elevada do que a poro caudal (LOVE, 1992).
O sangue drenado do testculo pela veia central, podendo este vaso, muitas vezes,
ser visualizado no corte transversal (Figura 2), especialmente em testculos maiores
(LOVE, 1992). A veia central atravessa a tnica albugnea, ramificando-se para a formao
do plexo pampiniforme.

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Figura 1- Representao esquemtica da orientao do testculo, epiddimo, funculo espermtico e estruturas

ultrasonogrficas importantes.

A avaliao ultrassonogrfica de estase venosa dentro dos vasos do funculo

espermtico, pode ter significado clnico na avaliao do suprimento sanguneo testicular
(LOVE, 1992). Distenso anormal das veias do plexo pampiniforme rara em garanhes,
sendo esta condio denominada varicocele (CHENIER, 2009).

Figura 2 O esquema esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequncia) foi colocado no testculo
para avaliao da veia central. Na imagem ultrassonogrfica (direita) de um testculo normal (corte transversal), a veia
central aparece como uma estrutura anecica com formato circular (seta).

O epiddimo um rgo alongado, enovelado, localizado na superfcie do testculo

(SULLIVAN et al., 2005). Ele pode ser dividido anatomicamente em trs segmentos:
cabea, intimamente ligada regio crnio-dorsal do testculo; corpo, que se encontra
horizontalmente disposto na superfcie dorso-lateral do testculo; cauda, responsvel pelo
armazenamento dos espermatozides, formado por um ducto epididimrio com a forma
cilndrica que se estende na regio caudal do testculo (LOVE, 1992) que com auxlio do
ligamento espesso (ligamento da cauda do epiddimo), mantm-se firmemente fixado ao
testculo. O ducto deferente uma continuao do ducto da cauda do epiddimo (TURNER,
1998).
A tnica albugnea uma forte cpsula fibrosa que est intimamente associada com
a superfcie do testculo, produzindo delicada compresso do parnquima testicular. Os
septos que se estendem no parnquima, a partir do interior da cpsula, no juntam para
formar um mediastino visivelmente distinto. (DYCE et al., 2005). Por isso no garanho no

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 possvel a distino do mediastino testicular presente em outras espcies, como em

humanos, bovinos, sunos e caninos (CARTEE et al., 1986).
A tnica vaginal visceral est intimamente justaposta tnica albugnea em torno
do testculo, epiddimo e funculo espermtico. A prxima camada externa a tnica
vaginal parietal que a continuao do peritnio parietal. Entre as duas camadas vaginais
existe uma pequena quantidade de lquido peritoneal (TURNER, 1998).

5.3 EXAME ULTRASSONOGRFICO DO ESCROTO, TESTCULO,

EPIDDIMO E FUNCULO ESPERMTICO
O exame ultrassonogrfico desta regio normalmente realizado com o animal em
estao e devidamente contido, tendo em vista que o examinador dever colocar-se em uma
posio potencialmente perigosa em frente aos membros plvicos do garanho. A maioria
dos garanhes so mais facilmente manipulados aps a colheita de smen, pois eles esto
mais relaxados e toleram melhor a manipulao (LOVE, 1992; TURNER, 1998;
CHENIER, 2009).
O transdutor linear ou setorial de 5.0 ou 7.5MHz ir fornecer imagens de boa
qualidade para avaliao dos rgos genitais externos (TURNER, 1998; CHENIER, 2009).
A utilizao de transdutor convexo ou linear fornece imagem de melhor qualidade para
avaliao do epiddimo (CHENIER, 2009). A aplicao de gel no local ou a utilizao de
um distanciador (standoff pad), melhoram a qualidade da imagem por aumentarem o
contato com a pele (LOVE, 1992).
Para realizao do exame dos testculos o examinador deve posicionar-se
lateralmente ao animal em estao, empurrando o testculo contralateral dorsalmente,
facilitando assim, a apreenso do funculo espermtico do testculo a ser examinado (Figura
4).
Aps manter o testculo na posio ventral do escroto a probe colocada na posio
vertical, iniciando o escaneamento da regio cranial para regio caudal (LOVE, 1992).

Figura 5 Exame ultrassonogrfico dos testculos e epiddimos.

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O funculo espermtico mais facilmente visualizado pela colocao da probe na

posio horizontal, bem prximo ao testculo (Figura 6).

Figura 6 Exame ultrassonogrfico do funculo espermtico.

O plexo pampiniforme apresenta-se como uma imagem manchada heterognea, e a

artria testicular identificada em cortes (CHENIER, 2009) com aspecto de queijo suo
(LOVE, 1992; Figura 7).

Figura 7 O esquema esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequncia) foi colocado para avaliao
do funculo espermtico. Na imagem ultrassonogrfica (direita) a artria testicular identificada como estruturas
anecicas em cortes (seta branca), e o plexo pampiniforme como uma estrutura heterognea envolvendo a artria (seta
preta).

Em um posicionamento transversal possvel distinguir vasos sanguneos do

funculo espermtico e a cabea do epiddimo. A veia central pode ser vista em alguns
casos e no deve ser considerada patolgica. A medida que a probe deslocada
caudalmente os vasos do funculo espermtico so perdidos de vista, e a veia central tornase mais reduzida em dimetro (LOVE, 1992; Figura 8).

Figura 8 O esquema esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequncia) foi colocado no testculo
para avaliao da veia central. Na imagem ultrassonogrfica (corte longitudinal), a veia central aparece como uma
estrutura anecica (setas), que diminui em dimetro medida que segue para a regio caudal.

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17

O corpo do epiddimo pode ser mais identificado na superfcie dorso-lateral do testculo,

sendo, melhor observado quando, colocado em contraste com os vasos do funculo espermtico, e
torna-se menos perceptvel quando a probe deslocada caudalmente (LOVE, 1992; Figura 9). Duas
manchas brancas (reflexo especular) so observadas na regio dorsal e ventral da superfcie do
corpo do epiddimo (LOVE, 1992).

Figura 9 O esquema esquerda demonstra que o transdutor linear (5 MHz de frequncia) foi colocado na superfcie
dorso-lateral do testculo para avaliao do corpo do epiddimo. Na imagem ultrassonogrfica o corpo do epiddimo
(setas) apresenta-se hipoecico em relao ao parnquima testicular normal.

A cauda do epiddimo identificada quando a probe colocada na posio caudal

ao testculo com os feixes voltados na direo cranial (Figura 10). O lmen do ducto
epididimrio pode ser visualizado na cauda do epiddimo, devido ao seu maior tamanho
nesse local. A textura do epiddimo varia de anecica para hipoecica com relao ao
parnquima testicular (TURNER, 1998).

Figura 10 O esquema demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequncia na imagem esquerda e 7,5 MHz de
frequncia na imagem direita) foi colocado para avaliao da cauda do epiddimo. Na imagem ultrassonogrfica,
observa-se a cauda do epiddimo (setas) hipoecica em relao ao parnquima testicular. A presena de lquido na
cavidade vaginal facilita o exame.

Em certas posies possvel visualizar ramos da artria testicular (Figura 11),

sendo esses vasos maiores e mais proeminentes prximo cauda do epiddimo. O
parnquima testicular normal possui textura homognea (LOVE, 1992).

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18

Figura 11 O esquema esquerda demonstra como o transdutor linear (5 MHz de frequncia) foi colocado no testculo,
possibilitando a vizualizao dos ramos da artria testicular (setas).

6. COLHEITA DO SMEN
A colheita do smen efetuada por auxlio de vagina artificial, onde o animal deve
ter um condicionamento prvio para que este monte em uma gua em cio ou em manequim.

Colheita com vagina artificial: a vagina artificial modelo Botucatu composta de um

tubo rgido, uma mucosa de ltex, um copo coletor protegido de luz e alteraes de
temperatura. (Anexo1). A vagina deve preenchida com gua quente, para permanecer
com temperatura de 42-45C para colheita. O animal condicionado saltando sobre o
manequim, deve ter o pnis desviado e introduzido na vagina artificial. A constatao
da ejaculao pode ser verificada com as seguintes caractersticas:
Movimento da cauda para cima e para baixo/ contrao dos msculos perianais/
sapatear/ fluxo pulstil uretral da ejaculao.

6.1. ANLISE DO SMEN

6.1.1 EXAMES IMEDIATOS
Logo aps a colheita o smen deve ser analisado segundo suas caractersticas
macro e microscpicas.

Volume = Podendo variar de 20 100ml

Cor = desde branco acizentado at um branco leitoso.
Densidade = Varia do tipo aquoso at leitoso diretamente relacionado com a
concentrao espermtica
Odor = Sui-generis
Motilidade espermtica = Se faz uma pequena gota de smen entre lmina e
lamnula aquecidas a 37C e realiza-se a visualizao em microscpio com
aumento de 200 vezes. A motilidade espermtica analisada segundo uma
escala de porcentagem variando de 0 a 100% (Motilidade Total=MT,

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19

porcentagem de clulas mveis). Caso a amostra esteja muito concentrada

deve-se realizar uma diluio em meio diluidor (por ex. Kenney), esta diluio
pode ser 1:1 ( Motilidade ideal 70%)

Vigor espermtico = Concomitantemente com a motilidade espermtica se

avalia o vigor espermtico na escala de 0 a 5 (velocidade com que o
espermatozide se desloca, quanto maior a velocidade maior o valor).
(Vigor ideal 3)

6.1.2. EXAMES MEDIATOS

So realizados no momento da colheita, entretanto podem ser analisados
posteriormente.

Concentrao espermtica = Retira-se do volume ejaculado uma

alquota de 10l utilizando-se uma micropipeta e coloca-se em um tubo de
ensaio contendo 190 l de gua destilada aquecida ou 1 gota de smen em 19
gotas de gua destilada (diluio 1:20). Aps boa homogeneizao, monta-se
uma Cmara de Neubauer (ver esquemas), preenchendo seus 2 retculos,
conta-se todos os espermatozoides presentes em 5 quadrados de cada retculo
(vide exemplo), sendo que a variao entre cada uma dos lados da cmara
(retculos) no pode ser mais que 10% (se for maior repete-se a operao).
Aps a operao calcula-se a mdia aritmtica, o valor encontrado
representado pela letra (n).

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20

6.1.3 CMARA DE NEUBAUER

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21

A concentrao espermtica mdia para um garanho adulto colhido na vagina

artificial de 0,1-0,2x109 espermatozides por ml. (100 a 200 milhes/ml)
Ex:. De um dos lados da Cmara de Neubauer = Retculo

=
Esquema da contagem dos sptz :
diagonal (quadrados pretos) ou
cantos + centro (crculos azuis).

Contveis
No contveis

Neste exemplo temos 12 espermatozides azuis que devero ser contados para
efeito de clculo, os mesmos localizam-se nos quadrados cinzas e sobre as linhas, relativos
aos cinco quadrados representados, levando-se em considerao o posicionamento da
cabea. Espermatozides que apresentam apenas a cauda dentro do quadrado no so
contados.
Aps a contagem das clulas espermticas (n),utilizamos a seguinte frmula para
clculo da concentrao espermtica.

Concentrao espermtica =

1
10
n

5*
*
25

espermatozides/mm3
x

1
20

= Nmero mdio de clulas contadas nos dois lados da Cmara de Neubauer

1 = Altura entre a lamnula e a Cmara de Neubauer em mm

10

*5=

Mdia (x ) de 5 quadrados de 1 retculo + 5 quadrados do 2 retculo

5 x 1 = 5 quadrados contados x a rea do quadrado 1 mm2

25
25
1
= Diluio realizada (1 gota de smen em 19 gotas de gua dest. ou 10L de
20
smen em 190L de gua dest.)

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O resultado encontrado referente a concentrao de espermatozides no

ejaculado por mm3, para converter esse dado para mL, basta multiplic-lo por 103 (1000).
Ex:. Foram contadas 100 clulas de um lado cmara=retculo (em cinco
quadrados) e 104 clulas do outro lado (variao entre os lados menor que 10%), tirase a mdia aritmtica, o n = 102 (espermatozides), colocando-se na frmula,
adotando a diluio de 1/20, temos:

102

Concentrao espermtica =

1
10

5
25

, resolvendo a equao
x

1
20

Concentrao espermtica = 102 x 103 espermatozides por mm3, convertendo

para ml (x103), a concentrao espermtica desse touro foi de 102 x 106 espermatozides
por ml.
Dica Sempre que a diluio efetuada for de 1/20, basta multiplicar o n (nmero
mdio contado nos retculos) por milho (106 )e tem-se direto a concentrao por ml. No
exemplo passado n = (102) multiplicado por 106, tem-se 102 x 106 espermatozides por
ml. (102 milhes/ml)

Preparo de material para anlise de Patologia espermtica =

Coloca-se uma gota de smen em uma lmina e realiza-se um esfregao, fixase o esfregao em metanol e cora-se a lmina com corantes Ex:. Karras
modificado por Papa et al (1998) (2 minutos no Rosa Bengala, lava-se a lmina
em gua corrente fraca, ento pe-se 1 min no Tanino, lava-se novamente e 30
segundos no Azul Vitria, lava-se a lmina, deixa secar, observa-se em
microscopia de luz (ptica) aumento de 1000x). Conta-se 200 clulas,
percorrendo a lmina de forma homognea como mostra o esquema abaixo e
classificando os espermatozides conforme suas patologias, obtendo no final
as porcentagens de espermatozides normais e de cada patologia.

Esquema de como se deve percorrer a lmina para leitura de patologia

espermtica.

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23

6.3 PADRES DE PATOLOGIA ESPERMTICA

As patologias espermticas so divididas em Defeitos Maiores, relacionados com a
infertilidade e Defeitos Menores no interferem diretamente sobre a fertilidade.

DEFEITOS MAIORES

1. Acrossomo:
2. Patologia da cabea:
Subdesenvolvida ..............................................................
Isolada patolgica ............................................................
Estreita na base................................................................
Piriforme..........................................................................
Pequena anormal .............................................................
Contorno anormal ............................................................
Pouch formation ...........................................................
3. Gota proximal:
4. Formas teratolgicas:
5. Defeito de pea intermediria:
(Desfibrilao, fratura, edema, pseudogota) ........................
6. Patologia da cauda:
Fortemente dobrada ou enrolada.........................................
Dobrada com gota..............................................................
Enrolada na cabea............................................................
7. Formas duplas:

DEFEITOS MENORES

1. Patologia da cabea:
Delgada ............................................................................
Gigante, curta, larga, peq. normal....................................
Isolada normal...................................................................
2. Patologia da cauda e implantao:
Retro e abaxial, oblquo.....................................................
Dobrada ou enrolada.........................................................
3. Gota Citop. Distal:

Esquema das patologias espermticas encontradas:

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A = Patologias de Acrossomo

B = Patologias de Cabea

C = Patologias de Insero de
Cauda

D = Patologias de Pea
Intermediria

E = Patologias de Cauda

F = Formas Teratolgicas

Elementos figurados do smen (Modificado de Mies Filho,1982).

Descrio das patologias do quadro anterior:

A) = Acrossomo
A1 = normal
A2 = grande
A3 = com grnulos
A4 = oblquo
A5 = pequeno
A6a = sptz s/ acrossomo
A6b = solto
A7a e b = deformaes
B) = Cabea
B1a, b e c = normal
B2 = estreita

B3 = piriforme
B4 = lanciforme
B5 = raquetiforme
B6 = globuliforme
B7 = gigante
B8 = an
C) = Insero
C1 = normal
C2 = reta
C3 = invertida
C4 = estreita
C5 = larga

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C6 = simtrica
C7 = excntrica (abaxial)
C8 = paraxial
C9 = retroaxial
C10 = rutura do colo
C11 = ausncia gentica
da cabea
D) = Pea Intermediria (PI)
D1 = normal
D2 = curta
D3 = comprida
D4 = estreita

25

D5 = disforme
E2 = gota distal
D6a e b = ruturada
E3 = gota presa na cauda
D7 = repregueada
E4 = gota presa na PI
D8 = tipo axial
E5 = fortemente dobrada
D9a e b = tipo fibrilar
E) = Cauda
E1 = gota proximal
Elementos figurados do smen
(Modificado de Mies Filho,1982).

E6 = espiraliforme
E7 = enrolada cabea
E8 = rudimentar
F) = formas duplas

a) espermatozides normais
b) gotas livres
c) anormalidades primrias
d a h) anormalidades secundrias
d) cabeas isoladas
e) gotas proximais
f) gotas distais
g) cauda dobrada com gota
h) acrossomas livres
i) formaes ciliares (medusas)
k) clulas epiteliais de descamao
l) clulas linhagem espermtica =
casos de degenerao testicular
m) hemcias
n) picitos

6.4 Principais causas das patologias espermticas

A) Cabea
Acrossomo = As alteraes no acrossomo como: forma irregular, enrugado ou
destacado, podem ser devido ao choque trmico, manipulao indevida ou senilidade.
A presena de um grnulo no acrossomo, o denominado Knobbed sperm, pode
ser origem hereditria ou relacionado a degenerao testicular e est ligado diretamente
com a infertilidade do animal quando encontrado em grande quantidade.
O Pouch formation, (diadema defect) caracterizado pela presena de vacolos na
regio equatorial da cabea no mais no acrossomo, formando um colar na cabea do
espermatozide so invaginaes da membrana nuclear devido a rarefao da cromatina,
apresentam relao direta com a presena de hipoplasia ou degenerao testicular.
Alteraes na forma da cabea como: estreita na base, piriforme, lanciforme,
an, so patologias de origem testicular podendo ser oriundas de hipoplasia ou degenerao
testicular. Sendo mais comum em cavalos as cabeas sub-desenvolvidas nos casos de
Degenerao Testicular,

B) Colo
Defeitos de insero como: Abaxial, paraxial e retroaxial, so devido a presena
de goteira, falha na formao do espermatozide. A localizao da goteira definir o
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26

tipo da insero. A insero abaxial (mais encontrada nos eqinos e considerada como
normal para cavalos), pode no afetar a fertilidade, pois o espermatozide tende a se
adaptar com o movimento e conseguir um deslocamento compatvel com a fertilizao. As
inseres paraxial e retroaxial apresentam uma maior relao com a infertilidade pois
impossibilitam o deslocamento necessrio do espermatozide para a fecundao.
Gotas citoplasmticas proximais ou distais so restos de citoplasma que so o
nutriente do espermatozide durante o trnsito epididimrio. O espermatozide durante sua
maturao pelo epiddimo permanece trs dias na cabea do epiddimo ainda com a
presena da gota, posteriormente fica um dia no corpo e finalmente seis dias na cauda onde
deve se desprender desta gota; teorias afirmam que existem enzimas ativadoras no
epiddimo, que dissolveriam a gota. A presena de gotas em grades quantidades podem ser
devido: 1) animal imaturo, que comeou a produo a pouco tempo, nestes casos colheitas
seriadas resolvem, um animal que est h muito tempo em descanso sexual tambm pode
vir a apresentar gotas, devido a um diminuio no trnsito epididimrio, da mesma forma
colheitas peridicas levam ao desaparecimento da patologia; 2) disfuno epididimria
devido a alteraes de temperatura (deficincia na termorregulao) levando a um
desequilbrio inico Na+ e K+, causando alteraes no ciclo de maturao; 3) degenerao
testicular, levando a disfuno epididimria; 4) hipoplasia testicular, por se tratar de uma
patologia hereditria a gota sempre ir aparecer no ejaculado.

C) Pea Intermediria
Corkscrew defect (defeito em saca rolha), devido a degenerao do plasmalema,
afetando a regio das mitocndrias que fica com aspecto rugoso, podendo dificultar a sada
da gota e mais grave afetando a conformao das microfibrilas que podem se soltar
patologia vista em animais idosos.
Cabea destacada (isolada), goteira rasa quando se forma podendo ser
decorrente de problema de insero paraxial ou de origem gentica.
Forma duplas da PI e/ou cauda, origem hereditria.

D) Cauda
Enrolada, fortemente enrolada, dobrada e fortemente dobrada, so devidas a
uma diminuio no nmero de microfibrilas 3 ou 4 (Dag defect) neste caso sendo de carter
hereditrio, estes animais apresentam elevado nvel de Zn no smen. Outra causa da
apresentao de defeitos de cauda no espermatozides pode ser devido a choque osmtico
ou trmico e disfunes de epiddimo.

E) Outras anormalidades
Aglutinao de cabea (head aglutination), os espermatozides chegam em
blocos ao epiddimo, e neste local h presena de antiaglutininas que promovem a
separao das clulas, uma disfuno epididimria pode levar ao desenvolvimento desta
patologia.
Espermatozides subdesenvolvidos, animais imaturos ou processos interferindo
na espermatognese (de animais maduros) havendo a liberao no ejaculado de clulas
primordiais espermatcitos, espermatognias, espermtides.
Medusa, restos ciliares do epiddimo por disfuno epididimria, geralmente nos
casos de recuperao de degenerao testicular.

27

Pseudogota, semelhante a gota citoplasmtica, porm situada na poro mdia da

PI, e apresentando tamanho maior que a gota tradicional devido ao envolvimento de 1 ou 2
camadas de mitocndrias.

28

6.5 MODELO DO LAUDO DE EXAME ANDROLGICO

fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA BOTUCATU

Dep. de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria

18618 - 000 - Botucatu/ SP - Rubio Junior - Fone/FAX (14)6802 6249/6326

A.)

CERTIFICADO ANDROLGICO
IDENTIFICAO DO REPRODUTOR

Nome:
Raa:
Proprietrio:
Endereo:
B.)
EXAME CLNICO
1. Histrico:
2. Geral:
3. Sistema Genital Prepcio:

Idade:
Propriedade:

Testculos:

Registro:

Pnis:
Esquerdo

Direito
Dimenses (comp., larg. alt.)cm
Simetria
Forma
Posio
Consistncia
Sensibilidade Dolorosa
Mobilidade
Epiddimo
Genitlia interna:
4. Comportamento sexual (libido):
C.)
ESPERMIOGRAMA
I. Mtodo de coleta: Vagina Artificial
Data:
Horrio:
II. Caractersticas do ejaculado:
1. Volume ejaculado :
ml
5. Motilidade
:
2. Cor
:
6. Vigor (0-5)
:
3. Aspecto
:
7. Concentr. (x106/mm3) :
4. Turbilhonamento : 8. Total esperm. (x109) :
III. Caractersticas morfolgicas (anexo I):
a. Defeitos maiores: %
b. Defeitos menores:
%
Total:
%
IV. Outros elementos:
(1. Medusa, 2. Clulas primordiais, 3. Clulas gigantes, 4. Leuccitos, 5. Hemcias, 6.
No detectados
Clulas epiteliais, 7. Cristais de urina, 8. Bactrias.)
D.) OBSERVAO:
E.) CONCLUSO:
------------------------------------------------

Local, ........... Data, .../..../......

Md. Veterinrio Responsvel

CRMV

29

fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU

Dep. de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria

18618 - 000 - Botucatu/SP - Rubio Junior - Fone/FAX (014) 821.2121 - Ramal 2249/2326

CERTIFICADO DE EXAME ANDROLGICO - (ANEXO I)

NOME:

REGISTRO:

I.) MORFOLOGIA ESPERMTICA (KARRAS Mod. PAPA et alii,1987)

A.- TOTAL DE DEFEITOS MAIORES:

1. Patologia da cabea:
Subdesenvolvida :
Isolada patolgica :
Estreita na base
:
Piriforme
:
Pequena anormal :
Contorno anormal :
Pouch formation :
2. Acrossomo
:
3. Gota proximal
:

B.-TOTAL DOS DEFEITOS MENORES:

4. Formas teratolgicas

5. Defeito de pea intermediria (Desfibrilao,

fratura, edema, pseudogota) :
6. Patologia da cauda
:
Fortemente dobrada ou enrolada:
Dobrada com gota
:
Enrolada na cabea
:
7. Formas duplas
:

1. Patologia da cabea:
Delgada
:
Gigante, curta, larga, peq. anormal:
Isolada normal
:
C - TOTAL DE FORMAS ANORMAIS:
II.) OUTROS ELEMENTOS:
1. Medusa
:
2.Clulas primordiais:
3. Clulas gigantes :
4. Leuccitos
:

2. Patologia da cauda e implantao:

Retro e abaxial, oblquo
:
Dobrada ou enrolada
:
3. Gota Citop. Distal
:
%

5. Hemcias
:
6. Clulas epiteliais:
7. Cristais
:
8. Bactrias
:

III.) EXAMES COMPLEMENTARES (Termoresistncia, espermocultura, outros):

Local, ........... Data, .../..../......

----------------------------------Med. Veterinrio Responsvel

CRMV

30

6.6

CARACTERSTICAS MORFOLGICAS DE SMEN DE

GARANHES DESCRITOS POR VRIOS PESQUISADORES

Caractersticas
Espermatozides
normais (%)
Cabeas anornais
Cabeas destacadas
Gota citoplasmatica
proximal
Gota citoplasmatica
distal
Pea intermediria
anormal
Cauda anormal

Dowsett and Pattle

No relatado

Pickett et al
51 ( 15 )

Jasko et al
52.5 (20.1 )

7.1 (5.9 )
2.6 ( 4.8 )
13.1 ( 10.3 )

9(8)
5(6)
3(5)

6.4 ( 6.9 )
1.3 ( 1.7 )
15.5 ( 11 )

8.1 ( 11.7 )

3(4)

13.5 ( 11.4 )

No relatado

11 (11)

7.4 ( 7.1 )

10.9 ( 9.2 )

20 (13 )

2.4 ( 3.9 )

7. METODOLOGIA BSICA PARA REFRIGERAO DE

SMEN
7.1 Diluio:

Diluir smen com meio base de Leite (Botu-Smen/Botupharma), contendo como

antibiticos de preferncia uma associao de Amikacina e Penicilina cristalina,
podendo ser utilizada a gentamicina.
Diluir no mnimo o smen fresco com 2 partes de meio (Ideal 3:1 Meio: Smen).
Utilizar dose inseminante com 1 bilho de espermatozides viveis.
Diluir a uma concentrao entre 20 e 50 de milhes de espermatozides por ml..
Envasar em recipiente plstico BOTU-IA (Botupharma) (ANEXO 4) com a menor
quantidade de ar possvel.
OBS: Para garanhes que no refrigeram bem a utilizao do diluente Botu-Turbo
(Botupharma) uma opo adequada, devendo com este diluente o transporte ser
realizado a 5C.

7.2 Refrigerao:

Colocar em recipiente adequado. Lembrando-se que quando do resfriamento at 5C

deve-se utilizar Containers adequados como o Equitainer ou seus similares nacionais
Botutainer (Anexo3) e Botuflex (Anexo1),seguindo regras indicadas pelo fabricante
para montar o sistema. Este sistema permite manter a temperatura de 5C por um
perodo mximo de 48 horas

31

Para resfriamento entre 15 e 20C podemos utilizar Botuflex ou Botu-Box

(Botupharma) (Anexo2).
Manter fonte de gelo biolgica congelada por pelo menos 24 horas em Freezer (-10C).
No manter o smen por um perodo de tempo superior a 24 horas quando refrigerado a
15C.

7.3 Inseminao:

De preferncia inseminar antes de 24 horas de refrigerao, queda de fertilidade

esperada quando da refrigerao por mais que 24 hs.
Inseminar a cada 24 horas.
Aplicar HCG ou GnRH(deslorelina) para induzir ovulao e garantir s uma IA.
No necessrio aquecer em banho-maria . Insemine o smen resfriado utilizando o
Botu-IA (Anexo4).
Para a avaliao necessrio aquecer por pelo menos 5 minutos a 37C
As inseminaes com smen fresco devem ser realizadas utilizando-se entre 500 a
1000x106 sptz viveis.
As amostras com smen refrigerado devem conter 1000x106 sptz viveis .

8. CONGELAO DE SMEN
8.1 INTRODUO
A congelao do smen trouxe vrios benefcios ao sistema de produo dos
eqinos, facilitando o armazenamento por perodo indeterminado e a comercializao deste
material gentico, controlando doenas sexualmente transmissveis e principalmente
acelerando o ganho gentico.
Nos eqinos esta tcnica vem sendo aperfeioada, e j apresenta resultados
satisfatrios de fertilidade com novos diluentes e crioprotetores.

8.2 MATERIAL NECESSRIO

A)
B)
C)
D)
E)
F)

vagina artificial (modelo Botupharma)

microscpio
mesa aquecedora
vidraria (proveta de 100ml, tubo de ensaio, becker)
lmina e lamnula
palhetas de 0,25 ou 0,5ml (identificadas)

32

G) Cmara de Neubauer
H) pipeta de Sahli ou micropipeta de 20l (10 a 100L)
I) lcool polivinlico ou bolinhas de metal ou vidro para lacrar palhetas
J) diluente para congelao (BOTU-CRIO)
K) uma geladeira (no local) a 5C para estabilizao
L) termmetro
M) caixa de isopor 37 a 45L (45cm Comprimento x 36cm Largurax 38cm Altura)
N) grade para as palhetas (local onde so colocadas as palhetas p/ estabilizao), (modelo
Botupharma)
O) suporte para manter a grade de palhetas acima do nvel do N2 (modelo Botupharma)
P) botijo de N2 (no local)
Q) Banho-Maria

8.3 SEQUNCIA PARA CONGELAO

a) Preparo do laboratrio
Antes de iniciar a colheita do smen para congelao, preparar os materiais no
laboratrio ou sala onde ser realizada a congelao. Aferir a geladeira se est entre 4 e
6C, podendo tambm utilizar o sistema (Botutainer ou Botuflex para refrigerao a
5C). Descongelar os diluentes e coloc-los no banho Maria a 37C, separar um tubo de
ensaio ou Eppendorf com 19 gotas de gua destilada ou 190L de gua destilada para a
concentrao espermtica que ser acrescido de uma gota (01) ou 10 L de smen
respectivamente, caracterizando uma diluio de 1:20 (uma parte de smen para 19 partes
de gua destilada).
b) Colheita do Semn
O smen pode ser colhido com a vagina artificial, modelo (modelo Botupharma) .
- Anlise dos parmetros macro e microscpicos do smen.
-

Clculo do nmero de palhetas a serem congeladas: Cada palheta deve conter 100
milhes de espermatozides viveis. Desta forma para o clculo do nmero de
palhetas basta dividir por 100 o nmero total de espermatozides viveis do
ejaculado.

Ex: Um ejaculado de 50 mL com motilidade total de 80% e concentrao

espermtica de 100 milhes por mL. Total de espermatozides viveis neste
ejaculado: 50 mL x 100 milhes x 80% = 4 bilhes de espermatozides viveis
dividido por 100 milhes = 40 palhetas.

33

Centrifugao: deve ser feita para eliminar o plasma seminal, com smen diludo
na proporo de 1:1 com Botu-Semen (Botupharma) 600xg ou 2200 rpm por 10
minutos (Ex. centrfuga da Fanem/Baby/n2 por 10 minutos).

Clculo do volume final de ressuspenso: cada palheta contm 0,5mL, ou seja,

multiplicar o nmero de palhetas por 0,5 que o volume final da suspenso com o
diluente de congelao.

Ressuspenso: Aps a parada da centrfuga, o sobrenadante de cada frasco deve ser

imediatamente desprezado e os pellets devem ser ressuspendidos no diluidor de
congelao Botu-Crio (Botupharma), previamente aquecido e calculado.

Envasamento: Deve ser feito em palhetas de 0,5mL.

Estabilizao: 20 minutos em refrigerador a 5oC.

Resfriamento rpido: 15 a 20 minutos em vapor de nitrognio, mantendo entre 3 e

6 cm acima do nvel do nitrognio lquido, em caixa isopor trmica tampada (37 a
45 litros).

Congelao: imerso das doses no nitrognio lquido.

Descongelao: Sempre retira-se uma palheta da partida congelada para avaliao

do procedimento. Esta palheta pode ser descongelada em Banho-maria a 46C por
20 segundos e em seguida imergir a 37C. Aguardar de 1 a 2 minutos ps
descongelao a temperatura de 37C para avaliao definitiva. Colocar o contedo
de uma dose (0,5 ou 0,25mL) num eppendorf de 1,5 a 2,0mL e mant-lo no Banhoseco a 37C ou sobre a mesa aquecedora para anlise dos parmetros.

Anlise do smen ps-descongelao: Retirando-se a palheta do Banho-maria,

deve-se sec-la bem com uma pano ou toalha de papel, para evitar que alguma gota
de gua entre em contato com o smen, posiciona-se a bolha para ponta da palheta e
corta-se com uma tesoura na poro onde se localiza o lacre (lcool polivinlico).
Verifica-se a motilidade, vigor, a concentrao e faz-se um esfregao, para anlise
da patologia espermtica ou utiliza-se uma preparao com 40l de soluo de
trabalho para fluorescncia com 10l de smen. Caso no possua microscpio de
epi-fluorescncia, a amostra congelada poder ser enviada a Faculdade para anlise.
Recomenda-se os seguintes requisitos para que uma dose congelada esteja
apta inseminao artificial.
Motilidade total
50%
Vigor 3
Porcentagem de patologia espermtica aceita:
Defeitos menores
20%
Defeitos maiores 20%
Defeitos Totais
40%

34

CUIDADOS NA INSEMINAO COM SMEN CONGELADO

Programe o momento da ovulao com HCG e ou GnRH(deslorelina).

Inseminar entre 12 horas antes at no mximo 6 horas aps a ovulao.

No diluir a dose inseminante, pois isto pode ser altamente lesivo e provocar
dano osmtico.

Sempre que houver dvidas sobre a manipulao do smen ps-descongelao,

consulte um profissional mais experiente para orient-lo(a).

35

8.4 LAUDO UTILIZADO PARA SMEN CONGELADO

fmvz-unesp
FACULDADE DE MEDICINA VETERINRIA E ZOOTECNIA - BOTUCATU
Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria
18618 -000 - Botucatu/SP -RubioJunior- Fone/FAX (014)6802-6.249//6326

LAUDO DE ANLISE FISCAL DO SMEN CONGELADO DE EQUINO

I.-)

IDENTIFICAO
ESTABELECIMENTO

PROPRIETRIO:
NOME DO REPRODUTOR:
PARTIDA:
II.-)

RAA:

EMBALAGEM:

Data:

EXAME FSICO PS-DESCONGELAO:

MTODO DE DESCONGELAO:
VOLUME DA DOSE:
TOTAL DE ESPERMATOZIDES DA DOSE:
ANLISE SUBJETIVA DA MOTILIDADE ESPERMTICA :
VIGOR (0-5):
ANLISE COMPUTADORIZADA ( HTM-IVOS 10)
ANLISE DA INTEGRIDADE DA MEMBRANA PELA FLUORESCNCIA:

V.-)

OBSERVAO:

VI.-) CONCLUSES:

Local, ...............Data...............

Med. Veterinrio Responsvel

CRMV

36

8.5 PROVAS LABORATORIAIS DE INTEGRIDADE DA

MEMBRANA PLAMTICA
Atualmente, um fator de grande importncia pesquisado pela sociedade cientfica,
a integridade da membrana plasmtica (IMP) do espermatozide na ps-descongelao.
As coloraes simples como o Karras por exemplo no conseguem identificar se a
membrana plasmtica esta integra ou no. Assim sendo foram desenvolvidas provas que
possibilitam identificar essa integridade como:

8.5.1 Colorao supra-vital utilizando eosina

uma prova simples onde se coloca uma gota de smen na extremidade de
uma lmina + uma gota deste corante, homogeneiza-se bem as gotas e realiza-se
um esfregao. Aps a secagem da lmina leva-se ao microscpio em aumento de
400 vezes e conta-se 200 clulas, sendo que os espermatozides que estiverem
com a colorao vermelha estavam com a membrana lesada e permitiram a entrada
do corante os demais que no se coraram so classificados como ntegros e o valor
expresso em porcentagem.

Espermatozides vermelhos: Membrana Citoplasmtica lesada

Espermatozides brancos: Membrana Citoplasmtica ntegra

37

8.5.2 Choque osmtico (Dell'Aqua Jr., et al, 2002)

Outra prova bem simples de ser realizada, submete-se o espermatozide a
um estresse osmtico utilizando gua destilada aquecida a 37C, coloca-se uma
gota de smen em 19 gotas desta gua destilada e conta-se tambm 200 clulas,
sendo que as que apresentarem dobramento de cauda so consideradas ntegras e
as que permanecerem retas lesadas. A fisiologia do processo que as membranas
ntegras comeam a receber um grande influxo de gua pois a gua vai do meio
menos concentrado no caso a gua que tem osmolaridade 0, para o gradiente mais
concentrado no caso a clula espermtica com osmolaridade prximo de
280Mosmol e esse excesso de presso dentro da clula faz com que esta se
deforme dobrando a cauda. As clulas que no tinham a membrana ntegra no
fazem esta troca osmtica e permanecem esticadas, o resultado expresso em
porcentagem, descontando-se os espermatozides que j apresentavam caudas
dobradas como patologia espermtica. Ex. 60% de clulas dobraram a cauda aps
o choque osmtico e o touro tinha 5% de caudas dobradas ou enroladas como
patologia espermtica, logo conclumos que este animal tem 55% de clulas com
integridade de membrana plasmtica.

Espermatozides com caudas enroladas: Membrana Citoplasmtica ntegra.

Espermatozides com caudas retas: Membrana Citoplasmtica lesada.
Obs. No esquecer as caudas dobradas ou enroladas ejaculadas. Fazer o teste com formol-salina
para descartar os espermatozides com defeitos ejaculados.

38

8.5.3 Sondas fluorescentes

uma tcnica mais refinada, que necessita de um microscpio de
epifluorescncia, cujo o custo elevado, porm pode-se destinar a dose a um
centro que possua esse equipamento para realizao do exame. So utilizados duas
sondas fluorescentes (corantes), um um ster de carboxifluorescena substncia
apolar que penetra em membrana ntegra, ela metabolizada no citoplasma do
espermatozide por esterases l presentes e transformado em fluorescena que no
consegue sair da clula e emite uma colorao verde. O outro corante uma
substncia polar que no consegue penetrar em membrana ntegra. S o faz
quando ela est lesada ao penetr-la atinge o ncleo do espermatozide e libera um
RNAm que codificar as organelas a produzirem uma fluorescncia vermelha.
Ento as clulas que se coram de verde so as com membrana ntegra e as que
expressarem cor vermelha apresentam algum tipo de leso em sua membrana.

Espermatozides verdes: Membrana Citoplasmtica ntegra.

Espermatozides vermelhos : Membrana Citoplasmtica lesada.

39

9. AUTORES
Prof. Dr. Frederico Ozanam Papa - Professor Titular do
Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria da
FMVZ, UNESP Botucatu - SP- PhD e Ps-Doutorado em
Reproduo Animal - Hannover- Alemanha.
Email: papa@fmvz.unesp.br
Prof. Dr. Marco Antonio Alvarenga - Professor Adjunto do
Departamento de Reproduo Animal e Radiologia Veterinria da
FMVZ, UNESP Botucatu - SP PhD em Reproduo Animal - Ps Doutorado-Universidade do Colorado - USA
Email: malvarenga@fmvz.unesp.br
Dr. Jos Antonio Dell'Aqua Junior - Mdico Veterinrio,
Mestrado, Doutorando e Ps-Doutorando na rea de Reproduo
Animal FMVZ, UNESP Botucatu - SP
Email: dellaquajunior@uol.com.br
Ms. Gabriel Augusto Monteiro - Mdico Veterinrio, Residncia,
Mestrado e Doutorando na rea de Reproduo Animal FMVZ,
UNESP Botucatu - SP
Email: monteiroga@yahoo.com.br

VEDADA A CPIA OU MESMO UTILIZAO EM CURSOS

DE REPRODUO EQINA DESTE MANUAL, SEM PRVIA
AUTORIZAO DOS AUTORES.

40

10. REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS

Angus O. McKinnon and James L. Voss. Equine Reproduction, Lea & Febiger,
Philadelphia,London, 1993.
Antonio Mies Filho. Reproduo dos Animais, 6 Edio Sulina, Porto Alegre-RS.
CARTEE, R.E.; POWE, T.A.; GRAY, B.W.; HUDSON, R.S.; KUHLERS, D.L.
Ultrasonographic evaluation of normal boar testicles. Am J Vet Res, v.47, n.12, p.25432544, 1986.
CHENIER, T.S. Anatomy and physical examination of the stallion. In SAMPER, C.S.
Equine breedins management and artificial insemination. 2 Ed, p.1-17, 2009.
DYCE, K.M.; SACK, W.O.; WENSING, C.J.G. Tratado de anatomia veterinria, 3 ed,
2005, 567p.
HAFEZ, E. S. E., HAFEZ, B. In: Reproduo Animal. 7.ed. Barueri:Manole, 2004
LOVE, C.C. Ultrasonographic evaluation of the testis, epididymis, and spermatic cord
of the stallion. Vet Clin North Am Equine Pract. n.8, v.1, p.167-182, 1992.
PAPA, F.O.; ALVARENGA, M.A.; CARVALHO, I.M.; BICUDO, S.D.; RAMIRES,
P.R.N.; LOPES, M.D. Colorao espermtica segundo karras modificado pelo emprego do
barbatimo (Stryphnodendrum barbatiman). Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinria
e Zootecnia, v.40, p.115-23, 1988.
PAPA, F.O., MELO, C.M.; FIORATTI E.G.; DELLAQUA, J.A.; ZAHN, F.S.;
ALVARENGA, M.A. Freezing of stallion epididymal sperm. Animal Reproduction
Science, v.107, p.293-301, 2008.
SAMPER, J.C. Management and fertility of mares bred with frozen semen. Animal
Reproduction Science, v. 68 p. 219-228, 2001.
SAMPER, J.C; PYCOCK, J.F.; MCKINNON, A.O. Current Therapy in Equine
Reproduction.1st.Ed, Saunders, Philadelphia, PA, 2007.
TURNER, R.M. Ultrasonography of the genital tract of the stallion. In: REEF, V.B.
Equine Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998.
SULLIVAN, R.; SAEZ, F.; GIROUARD, J.; FRENETTE, G. Role of exosomes in sperm
maturation during the transit along the male reproductive tract. Blood Cells, Molecules, &
Diseases, v.35, p.1-10, 2005.
TURNER, R.M. Ultrasonography of the genital tract of the stallion. In: REEF, V.B.
Equine Diagnostic Ultrasound. 446-479, 1998.

41

ANEXO 1- MONTAGEM DA BOTUFLEX PASSO A PASSO

PPASSA PASSO PASSO

ACONDICIONAR AS DOSES DE
SMEN DENTRO DA BOTUFLEX

COLOCAR O GELO NA BOTUFLEX

TEMPERATURA= 15C UTILIZE 1
GELO

IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE

CONGELADOS POR NO MNIMO 48 HORAS

TEMPERATURA= 5C
UTILIZE 2 GELOS

INTRODUZIR A BOTUFLEX
NA CARTOLINA

ACOPLAR A TAMPA

BOTUFLEX NA CARTOLINA
PRONTA PARA ENVIO

42

ANEXO 2 - MONTAGEM DA BOTUBOX PASSO A PASSO

COLOCAR O GELO NA BOTUBOX

GELO COLOCADO NA
BOTUBOX
IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE
CONGELADOS POR NO MINIMO 48 HORAS

ACONDICIONAR A DOSE DE
SMEN DENTRO DA BOTUBOX
DOSE DE SMEN
ACONDICIONADA
DENTRO DA BOTUBOX

ACOPLAR A TAMPA

43

ANEXO 3-MONTAGEM DA BOTUTAINER PASSO

A PASSO

COLOCAR O RECIPIENTE TERMO

PROTETOR DENTRO DA BOTUTAINER

COLOCAR OS GELOS DENTRO DA

BOTUTAINER

IMPORTANTE UTILIZAR GELOS PREVIAMENTE

CONGELADOS POR NO MINIMO 48 HORAS

ACONDICIONAR AS DOSES DE SEMEN

DENTRO DO RECIPIENTE TRMICO

DOSES DE SEMEN E GELOS

ACONDICIONADOS DENTRO DO
RECIPIENTE TRMICO

BOTUTAINER FECHADO E PRONTO

PARA ENVIO DO SEMEN

44

ANEXO 4

COMO UTILIZAR O BOTU-IA?

FAA A DILUIO DO SEMEN

COM O DILUENTE UTILIZANDO A
GRADUAO DO BOTU-IA
QUANDO
SE
UTILIZA
O
BOTU-IA
PARA
TRANSPORTE DE SEMEN, PODE-SE RETIRAR O AR
EXCEDENTE DO FRASCO

NO MOMENTO DA INSEMINAO
CORTE A PONTA DO BOTU-IA

ACOPLE A PONTA DO BOTU-IA

NA PIPETA

COM A PIPETA NO INTERIOR DO UTERO DA GUA POSICIONE O BOTU-IA PARA CIMA E

PRESSIONE O FRASCO PARA INTRODUZIR O SMEN.

45

ANEXO 5 COMO MONTAR A VAGINA ARTIFICIAL

2

1
3
7

FIG.1) COMPONENTES DA V.A.: (1)

Tubo Rgido, (2) Mucosa de Latex, (3)
Mucosa Plstica, (4) Anis de Latex, (5)
Camisa interna, (6 e 7) Copo coletor e
tampa respect.

FIG.2) INTRODUZIR A MUCOSA DE

LATEX NO TUBO RGIDO E
PREND-LA COM ANIS (N4,FIG.1),
PARA QUE NO VAZE A GUA.

FIGS.3 e 4) INTRODUZIR A MUCOSA DE PLSTICO EXTERNAMENTE A MUCOSA

DE LATEX E PREND-LA.

FIGS.5 e 6) ACOPLAR O COPO COLETOR NA MUCOSA PLSTICA, FIXANDO-A

COM A TAMPA.
Obs. CORTAR DOIS (2) ANIS DA MUCOSA DE LATX APROX. 4 CM, PARA FIXLA NO TUBO RGIDO (n4, FIG.1).
ANTES DE FIXAR O COPO COLETOR NA MUCOSA PLSTICA, INTRODUZIR A
CAMISA PLSTICA DENTRO DO COPO ( n5 FIG.1).
.

46