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Ps-graduao
Processos
Qumicos
em
e
Tecnologia
Bioqumicos
de
para
ORIENTADOR:
Prof. Nei Pereira Jr, PhD
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EQ/UFRJ 2011
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F ICHA
C ATALO GRFICA
Tese (Doutorado em Cincias) Universidade Federal do Rio de Janeiro UFRJ, Escola de Qumica, Programa de Ps-Graduao em Tecnologia de
Processos Qumicos e Bioqumicos, 2011.
Orientador: Nei Pereira Jr., PhD.
1.
2.
3.
4.
cido succnico
Fermentao
Bagao de cana-de-aucar
Gs carbnico
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"A cada dia que vivo, mais me conveno de que o desperdcio da vida
est no amor que no damos, nas foras que no usamos, na prudncia
egosta que nada arrisca."
Carlos Drummond de Andrade
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vii
AGRADECIMENTOS
Ao meu querido orientador, Professor Nei Pereira Jr, pelo presente concedido atravs da
possibilidade de fazer parte de uma jornada de conhecimentos e vivenciar experincias,
bastante sustentadoras, no mbito profissional e pessoal. Saber enxergar, sem ressalvas, a
potencialidade de cada aluno e acrescent-los em sua rotina de trabalho, de forma
enriquecedora, um privilgio daqueles que possuem uma racionalidade intuitiva, contribuindo
imensamente para elevar o potencial de nossa Universidade. Diante de tanto talento e
contribuio, palavras a mais se tornam mera redundncia. No obstante, qualquer tentativa de
registrar minha gratido, em algumas linhas, no suficiente para estimar a imensido de
minha admirao, respeito e inspirao. Porm, cada pgina traz consigo a presena sensvel
de uma felicidade invisvel, silenciosa, sempre motivada e direcionada por uma orientao de
notvel qualidade, excelncia e singularidade;
Ao Departamento de Engenharia Bioqumica e seus funcionrios, especialmente ao tcnico Luiz
Cludio, pelo fundamental apoio no ambiente de trabalho e pela indispensvel atuao
administrativa. Alm do convvio, amizade e confiana conquistados ao longo dos ltimos anos,
de forma incisiva e verdadeira;
minha famlia, pela gratificante oportunidade de solidificar diversos valores pessoais de
carter, envolvendo acertos e erros no educantrio terrestre, contribuindo para o meu
crescimento e amadurecimento;
minha querida e saudosa me, Lucia Helena Ribeiro Borges, pela constncia de seus
ensinamentos repletos de amor, carinho e incentivos. Mesmo ausente, fisicamente neste plano,
conforta e emana a vibrao que alimenta a minha f e esperana, ajudando a superar de forma
obstinada toda e qualquer provao;
Aos companheiros de trabalho, Patrcia, Flvia, Vernica, Eleandro, Liliana, Mariana, Ludmylla,
Fabio, Diogo, Carolina, Paulo, Vanessa, Roberto, Gabriel, Jorge, Graziela e a todos aqueles
que fizeram parte de gratas recordaes;
Danielle Silveira dos Santos, particularmente, pela presena inevitavelmente sustentadora em
todos os momentos aparentemente difceis, contribuindo efetivamente para formulao e
definio do real significado das palavras amizade e confiana;
Ao Programa de Ps-graduao em Tecnologia de Processos Qumicos e Bioqumicos da
Escola de Qumica da UFRJ, pela agradvel recepo e convivncia diria;
Ao CNPq, FAPERJ e PETROBRAS pelo apoio financeiro.
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viii
RESUMO
BORGES, Elcio Ribeiro. Desenvolvimento de um processo para produo de cido
succnico por Actinobacillus succinogenes. Orientador: Nei Pereira Jr. Escola de Qumica Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2011.
5-1
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ix
ABSTRACT
BORGES, Elcio Ribeiro. Development of a process for succinic acid production by
Actinobacillus succinogenes. Supervisor: Nei Pereira Jr. High School of Federal
University of Rio de Janeiro Brazil , 2011.
substrate
and
product
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SMARIO
AGRADECIMENTOS ........................................................................................................ VII
RESUMO ......................................................................................................................... VIII
ABSTRACT........................................................................................................................ IX
SMARIO ........................................................................................................................... X
CAPTULO 1 .......................................................................................................................1
APRESENTAO DO TEMA DA TESE..............................................................................1
CAPTULO 2 .......................................................................................................................6
REVISO BIBLIOGRFICA ................................................................................................6
2.1. cidos orgnicos......................................................................................................7
2.1.1. Aspectos histricos ...........................................................................................8
2.1.2. Comercializao................................................................................................8
2.1.3. cidos orgnicos como blocos de construo.................................................12
2.2. cido succnico ......................................................................................................15
2.2.1. Aplicaes do cido succnico.........................................................................16
2.2.2. Biopolmeros, bioplsticos e plsticos biodegradveis ....................................20
2.2.2.1. O Potencial das inovaes de base biotecnolgica em biopolmeros...........23
2.3. Aspectos mercadolgicos da produo mundial de cido succnico ......................24
2.4. Processos de produo de cido succnico ...........................................................26
2.4.1. Rota qumica ...................................................................................................26
2.4.2. Rota fermentativa ...........................................................................................27
2.4.2.1. Matrias-primas utilizadas na produo de cido succnico .........................28
2.4.3. Materiais lignocelulsicos................................................................................30
2.4.3.1. Celulose .......................................................................................................32
2.4.3.2. A Lignina ......................................................................................................33
2.4.3.3. A Frao Hemicelulsica..............................................................................33
2.4.4. Materiais lignocelulsicos e o contexto de biorrefinaria...................................34
2.4.5. Bagao de cana-de-acar .............................................................................35
2.4.6. Tipos de Pr-Tratamento.................................................................................36
2.4.6.1. Pr-tratamento cido ....................................................................................38
2.4.6.1.1. Inibidores do processo de fermentao.....................................................39
2.4.6.1.2. Processos de Destoxificao.....................................................................40
2.4.6.1.3. Pr-tratamento alcalino .............................................................................41
2.4.6.1.4. Hidrlise enzimtica da celulose ...............................................................41
2.4.7. Sacarificao e fermentao simultneas (SSF) .............................................44
2.4.8. Sacarificao com co-fermentao simultneas (SSCF).................................45
2.4.9. Microrganismos produtores de cido succnico ..............................................46
2.4.9.1. Metabolismo na produo de cido succnico ..............................................49
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xi
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xii
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5.10. Evoluo dos experimentos desenvolvidos na produo de cido succnico ..... 166
5.11. Comparao entre os processos a partir do hidrolisado hemicelulsico e SSF . 168
5.12. Desenvolvimento de um modelo para produo de cido succnico .................. 170
5.12.1. Classificao do perfil para o crescimento celular ....................................... 170
5.12.2. Classificao para o perfil de formao de produto e subprodutos ............. 175
5.12.3. Classificao do perfil de consumo de substrato......................................... 175
5.13. Consideraes finais .......................................................................................... 176
CAPTULO 6 ...................................................................................................................... 178
CONCLUSES ................................................................................................................... 178
6.1. Concluses .......................................................................................................... 178
6.2. Sugestes ............................................................................................................ 181
CAPTULO 7 ...................................................................................................................... 182
REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS ......................................................................................... 182
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xiv
LISTA DE FIGURAS
105
Figura 5.2. Peridicos com maior nmero de publicaes e os temas mais estudados, at 2010 . 106
Figura 5.3. Observao microscpica das linhagens Actinobacillus succinogenes ....................... 107
Figura 5.4. Cintica de crescimento do cultivo de ativao da bactria A. succinogenes .............. 109
Figura 5.5. Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico (xilose)...................................... 110
Figura 5.6. Cintica de crescimento do inculo em meio sinttico (glicose).................................... 110
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xv
Figura 5.7. Cintica de crescimento do inculo contendo hidrolisado hemicelulsico diludo......... 111
Figura 5.8. Cintica de fermentao de em meio sinttico .............................................................. 112
Figura 5.9. Perfil de crescimento celular a partir das estratgias de propagao celular................ 113
Figura 5.10. Efeitos de diferentes fontes de carbono na produo de biomassa ........................... 115
Figura 5.11. Produo de biomassa em meio, com xilose, em diferentes razes C:N.................... 116
Figura 5.12. Produo de biomassa em meio, com glicose, em diferentes razes C:N.................. 116
Figura 5.13. Efeitos de diferentes fontes de carbono na concentrao de AS ................................ 118
Figura 5.14. Efeitos de diferentes fontes de carbono na concentrao de AS (histograma)........... 118
Figura 5.15. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, do PFF 24-1 ..................... 123
Figura 5.16. Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variveis ......................................... 124
Figura 5.17. Superfcie de resposta mostrando o efeito da interao entre as variveis. ............... 125
Figura 5.18. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, para o DCCR................... 131
Figura.5.19.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para xilose ........................... 132
Figura.5.20.Superfcie de resposta dos efeitos combinados (DCCR) para glicose.. ....................... 133
Figura 5.21. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (24h) .......................... 139
Figura 5.22. Diagrama de Pareto para os efeitos estimados pelo PFF 2 5-1 (48h) .......................... 140
Figura 5.23. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de glicose ......... 141
Figura 5.24. Superfcie de resposta da concentrao de cido succnico a partir de xilose ........... 141
Figura 5.25. Fermentao em meio sinttico, com 22,0 g.L-1 de xilose ........................................... 143
Figura 5.26. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao. ................ 145
Figura 5.27. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 22,0 g.L-1 de xilose........................ 146
Figura 5.28. Fermentao em meio sinttico, com 52,0 g.L-1 de xilose ........................................... 148
Figura 5.29. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao ................. 149
Figura 5.30. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 52,0 g.L-1 de xilose........................ 151
Figura 5.31. Fermentao em meio sinttico, com 80,0 g.L-1 de xilose ........................................... 152
Figura 5.32. Fermentao em meio sinttico de composio definida aps otimizao ................. 154
Figura 5.33. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com 80,0 g.L-1 de xilose ........................ 155
Figura 5.34. Concentrao final de produto e subprodutos do processo SSF ................................ 161
Figura 5.35. Perfil cintico do processo SSF, em frascos agitados. ................................................ 162
Figura 5.36. Perfil cintico do processo de fermentao, em biorreator.......................................... 163
Figura 5.37. Perfil cintico do processo SSF com concentrao de glicose igual a 81,0 g.L-1 ........ 164
Figura 5.38. Evoluo da produo de cido succnico com o decorrer do trabalho ...................... 168
Figura 5.39. Avaliao dos efeitos da concentrao inicial de glicose sob a tx de cresc ................ 172
Figura 5.40. Perfil cintico de formao de cido succnico, crescimento celular e consumo de
substrato (glicose). ........................................................................................................................... 173
Figura 5.41. Perfil cintico da formao dos cidos actico, frmico e ltico .................................. 174
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xvi
LISTA DE TABELAS
Tabela 2.1. Pontos de ebulio, frmulas moleculares e constantes (Ka) . ..............................................7
Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos ..........................................8
Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica ............................................13
Tabela 2.4. Candidatos em potencial como blocos de construo ..........................................................13
Tabela 2.5. Valores de produtividade e rendimento de alguns cidos orgnicos ...................................14
Tabela 2.6 . Caractersticas do cido succnico .......................................................................................16
Tabela 2.7. Composio de resduos agro-industriais .............................................................................31
Tabela 2.8. Constituintes bsicos de alguns materiais lignocelulsicos ..................................................31
Tabela 2.9. Parmetros para aplicao de processos de separao ......................................................53
Tabela 2.10. Tipos de modelos usados em processos microbianos........................................................59
Tabela 2.11. Modelos cinticos no estruturados . ..................................................................................62
Tabela 2.12. Modelos para formao de produto metablico inibitrio....................................................64
Tabela 2.13. Valores encontrados e calculados para diferentes estratgias de fermentao.................68
Tabela 4.1. Meio de manuteno (TSA)...................................................................................................79
Tabela 4.2. Composio do meio utilizado para pr-inculo....................................................................79
Tabela 4 3. Composio do meio de crescimento utilizado para inculo ................................................82
Tabela 4.4. Composio do meio sinttico para fermentao .................................................................82
Tabela 4.5. Composio qumica do meio lquido com diferentes razes C:N........................................87
Tabela 4.6. Parmetros e nveis usados no PFF 24-1 ...............................................................................89
Tabela 4.7. Parmetros e nveis usados no DCCR..................................................................................90
Tabela 4.8. Variveis analisadas no PFF e nveis codificados e reais. ...................................................90
Tabela 4.9. Composio do meio de fermentao, aps estudos de otimizao ....................................91
Tabela 4.10. Condies operacionais do cromatgrafo .........................................................................100
Tabela 4.11. Condies operacionais do cromatgrafo (cidos orgnicos) ..........................................101
Tabela 5.1. Parmetros relevantes nos processos de propagao de clulas de A. succinogenes. ...111
Tabela 5. 2. Variveis de Resposta na Avaliao do Efeito da Aclimatao ........................................114
Tabela 5.3. Influncia da concentrao inicial de substrato e da razo C:N no crescimento celular. ..117
Tabela 5.4. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para xilose......119
Tabela 5.5. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para glicose....120
Tabela 5.6. Anlise de varincia (ANOVA), no PFF 241 para xilose como fonte de carbono..............122
Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA), no PFF 241 para glicose como fonte de carbono............122
Tabela 5.8. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (xilose) ....127
Tabela 5.9. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos dos nutrientes do meio (glicose) ..128
Tabela 5.10. Anlise de varincia (ANOVA) para xilose como fonte de carbono.................................129
Tabela 5.11. Anlise de varincia (ANOVA) para glicose como fonte de carbono...............................130
Tabela 5.12. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para glicose ..............135
Tabela 5.13. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 para xilose ................135
Tabela 5.14. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 glicose (24h)................136
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xvii
Tabela 5.15. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 xilose(24h)...................137
Tabela 5.16. Efeitos estimados do p lanejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para glicose (48h) ......138
Tabela 5.17. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 para xilose (48h)..........138
Tabela 5.18. Variveis de resposta obtidos para meio sinttico e hidrolisado hemicelulsico..............157
Tabela 5.19. Concentrao final de produto e subprodutos dos processos de fermentao ..............159
Tabela 5.20. Variveis de resposta e concentrao de produto e subprodutos pelo processo SSF. ..165
Tabela 5.21. Resultados finais e evoluo do processo para a produo de cido succnico ............167
Tabela 5.22. Produo de cido succnico a partir dos hidrolisados hemicelulsico e celulsico .......169
Tabela 5.23. Valores obtidos dos parmetros cinticos de fermentao..............................................171
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xviii
SIGLAS
ABS: Absorvncia;
AIE: Agncia Internacional de Energia;
ANOVA: Anlise de varincia;
ARD: Agro-industrie Recherches e Dveloppements;
AS: cido succnico;
AA: cido actico;
AS: cido frmico;
AL: cido ltico;
ATP: Adenosina trifosfato;
ATP: Adenosina trifosfato;
ATP: Adenosina trifosfato;
BHT: Butirolactona;
CBH: Celobiohidrolases;
CIP: Institut Pasteur Collection;
CM: Concentrao mxima;
CTA: Triacetato de celulose;
DCCCF: Delineamento composto Central de Faces-centradas;
DCCR: Delineamento Composto Central Rotacional;
DNP: Diversified Natural Products;
DOE: Departamento de Energias do EUA;
DSP: Processo de Separao e Purificao;
EBMP: Membranas bipolares de eletrodilise;
ED: Eletrodilise;
EDO: Equaes diferenciais ordinrias;
EDP: Equaes diferenciais parciais;
EL: Extrato de levedura;
ELL: Extrao lquido-lquido;
EMP: Embden-Meyerhof Pathway;
EVOH: Copolmero de etileno e lcool vinlico;
GL: Graus de Liberdade;
GT: Grupo de trabalho;
GT-6: Grupo de trabalho;
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xix
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xx
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xxi
NOMENCLATURA MATEMTICA
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xxii
Letras gregas
-1
max: taxa especfica mxima de crescimento (h );
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CAPTULO 1
APRESENTAO DO TEMA DA TESE
envolve
um
pequeno
nmero
de
molculas
intermedirias
versteis,
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-
---
famlia de substncias qumicas derivadas, obtidas por meio de converses biolgicas ou,
mais freqentemente, por reaes qumicas tradicionais, em um esquema muito similar ao
que ocorre na indstria petroqumica atual (LYND et al., 1999). Nestes termos, um exemplo
de intermedirio-base que tem sido bastante reportado na literatura o cido butanodiico,
conhecido como cido succnico (WERPY & PETERSON, 2004). Sendo passvel de
obteno por rota fermentativa, este cido tem o potencial para se tornar uma comoditie,
produzido em larga escala, podendo se constituir na base para o fornecimento de uma
srie de substncias intermedirias e produtos finais importantes na indstria qumica,
principalmente de biopolmeros a partir de succinato, alm de ser um componente chave
na produo de mais de 30 produtos comercialmete importantes, na indstria de alimentos,
farmacutica e de cosmticos (MCKINLAY et al., 2007; ZEIKUS & JAIN, 1999; SONG &
LEE, 2005).
Cabe ressaltar que o cido succnico pode substituir mais de 250 produtos qumicos
derivados do benzeno, que conhecidamente carcinognico por todas as rotas de
exposio (KERMANSHAHI et al., 2005). Somado a sua importncia como bloco de
construo para o segmento industrial, uma vantagem adicional desta substncia qumica
reside na sua produo por fermentao, a qual ocorre com consumo de CO2, fornecendo
uma alternativa interessante para o problema de seqestro do carbono (VAN DER WERF
& GUETLER, 1997).
A maioria dos cidos orgnicos existentes no mercado produzida via sntese
qumica, gerando altos nveis de poluio. A evoluo do mercado mundial dos produtos
derivados de matrias-primas agro-industriais est obrigando as empresas do Setor
Qumico a incorporar novas tecnologias para alcanar maiores ndices de qualidade e
eficincia. Na busca por produtos finais mais competitivos e rentveis, como por exemplo,
cidos orgnicos e plsticos biodegradveis, o setor industrial vem sendo compelido a
incorporar inovaes tecnolgicas, desenvolvimentos de novos sistemas produtivos e de
equipamentos para processos que protejem o meio ambiente e gerem menor quantidade
de poluentes (CORDOBA, 2001).
O Frum de Competitividade em Biotecnologia foi constitudo para definir as aes
necessrias inscrio da rea de Biotecnologia entre as vrias opes estratgicas da
Poltica Industrial, Tecnolgica e de Comrcio Exterior. O GT-6 vem avaliando o segmento
da Biotecnologia Industrial e Outras Aplicaes, que tem como referncia a classificao
de Biotecnologia Branca (White Biotechnology), como o setor que aplica recursos naturais
para a produo industrial de bioprodutos de interesse comercial. As profundas alteraes
ocorridas no setor agroindustrial com apropriao de novas tecnologias e a formao de
grandes clusters de cadeia produtiva das culturas extensivas de soja, cana-de-acar e
milho (produo de sementes ou mudas, plantio, colheita e beneficiamento) tm
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-
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Biorrefinarias pertencem
categoria
dos
agronegcios,
devendo
ser
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
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Este trabalho faz parte de uma das linhas de pesquisas desenvolvidas nos
Laboratrios de Desenvolvimento de Bioprocessos Escola de Qumica/ UFRJ, sob a
coordenao do Prof. Dr. Nei Pereira Jr., intitulada Valorizao de Resduos
Lignocelulsicos para o Aproveitamento Integral de Biomassas Residuais por Via
Biotecnolgica.
No que se refere produo internacional, o nmero de pesquisas vm se
destacando, de forma gradativa, ao longo dos ltimos anos, com diferentes tipos de
microrganismos. Em relao ao cenrio nacional, possvel constatar alguns trabalhos em
andamento acerca da produo de cido succnico nas universidades de grande potencial.
Organizao do trabalho
O presente trabalho encontra-se estruturado em 7 captulos e uma seo final,
intitulada Anexos, incluindo os artigos publicados em peridicos internacionais. O captulo
dois apresenta a Reviso Bibliogrfica dos aspectos relevantes ao assunto tratado,
ressaltando a importncia da produo de cido succnico e suas potenciais utilizaes,
alm de abordar aspectos cientficos, tecnolgicos e econmicos. Neste captulo, tambm
so descritos, de forma sucinta, alguns fundamentos da modelagem matemtica de
processos biotecnolgicos, incluindo mtodos matemticos freqentemente utilizados para
resoluo destes modelos, alm de tcnicas para otimizao e controle de processos.
No captulo trs, intitulado Justificativas e Objetivos, so apresentados os motivos
que levaram ao desenvolvimento desta tese, bem como os objetivos especficos
desenvolvidos.
O captulo quatro refere-se descrio dos Materiais e Mtodos utilizados para a
execuo deste trabalho, como por exemplo, detalhamento das metodologias experimental
e analtica adotadas, bem como das tcnicas de planejamento experimental para a anlise
dos resultados.
Os Resultados e Discusso relativos s principais anlises conduzidas encontramse no quinto captulo. Para a otimizao dos parmetros e condies de processo, foram
desenvolvidos planejamentos seqenciais para a realizao dos experimentos com maior
grau de confiabilidade. Foi avaliada a hierarquia de efeitos estimados sobre a varivel de
resposta do processo, bem como apresentados os estudos iniciais dos parmetros
cinticos para a modelagem do processo visando produo de cido succnico, mediante
o estudo do comportamento microbiano durante a fermentao. No captulo seis so
registradas as Concluses e Sugestes do presente trabalho.
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Borges, E.R. & Pereira Jr., N. Succinic acid production from sugarcane bagasse
hemicellulose hydrolysate by Actinobacillus succinogenes. Journal of Industrial
Microbiology & Biotechnology, v. 13, p. 1-11, 2010.
2.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Study of succinic acid production by
Actinobacillus succinogenes. Jornal of Life Sciences, v. 4, p. 5-12, 2010.
Trabalhos completos em congressos nacionais:
1.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr., N. Uso de biomassas para produo de
cio succnico por Actinobacillus succinogenes. IX SHEB - Seminrio de Hidrlise
Enzimtica e Biomassas, Maring-PR, 23 -27/11/2009.
2.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Recuperao e purificao de cido
succnico obtido por um processo biotecnolgico. XXXIV ENEMP - Congresso
Brasileiro de Sistemas Particulados, Campinas SP, 18 a 21/10/09.
3.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R & Pereira Jr, N. Estudo das variveis de processo na
produo de cido succnico por Actinobacillus succinogenes. XVII SINAFERM
Simpsio Nacional de Bioprocessos, Natal RN.
4.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Produo de cido succnico por
Actinobacillus succinogenes a partir do hidrolisado da frao hemicelulsica do
bagao de cana-de-acar. XVIII SINAFERM Simpsio Nacional de
Bioprocessos, Caxias do Sul RS. 24 a 27/07/2011. Situao: Aceito
Participao em eventos
1.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncias das Variveis de
Processo na Produo de cido Succnico por Actinobacillus succinogenes. XXXI
Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica, Artstica e Cultural da UFRJ, Rio
de Janeiro.
2.
Borges, E.R.; Souza, L.B.R. & Pereira Jr, N. Influncia da Razo C:N no
Crescimento Celular e Biossntese de Metablitos Durante a Produo de cido
Orgnico. XXX Jornada Giulio Massarani de Iniciao Cientfica, Artstica e
Cultural da UFRJ, Rio de Janeiro.
3.
Borges, E.R. & Pereira Jr, N. Succinic Acid Production from Sugarcane Bagasse
by Actinobacilus succinogene. 32nd Symposium on Biotechnology for Fuels and
Chemicals. 2010. Orlando/Flrida.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
CAPTULO 2
REVISO BIBLIOGRFICA
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
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Frmula molecular
P.E/C
Ka
HCOOH
100,5
1,80X10-4
CH3COOH
118
1,75x10-5
CH3CH2COOH
141
1,34 x10-5
CH3CH2CH2COOH
164
1,52 x10-5
Pentanico (valrico)
CH3(CH2)3COOH
187
1,44 x10-5
Hexanico (caprico)
CH3(CH2)4COOH
205
Octanico (caprlico)
CH3(CH2)6COOH
239
CH3(CH2)8COOH
269
Metanico (frmico)
Etanico (actico)
Propanco (propinico)
Butanico (butrico)
cidos dicarboxlicos
Butanodiico (succnico,P.F.187C)
HOOC(CH2)2COOH
235
K = 6,2 x 10-5
K = 2,3 x 10-6
HOOC(CH 2)3COOH
303
K = 4,6 x 10-5
K = 3,7 x 10-6
HOOC(CH 2)4COOH
340
K = 3,8 x 10-5
K = 3,8 x 10-6
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
descoberta
dos
cidos
orgnicos
est
intimamente
relacionada
ao
desenvolvimento da qumica experimental. Neste contexto, Carl Wilhelm Scheele (17421786), um notvel qumico experimental sueco, desempenhou um papel primordial. Dentre
os 15 a 20 mil experimentos atribudos a ele, esto as descobertas de compostos
orgnicos de natureza cida (cidos carboxlicos e fenis), como os cidos tartrico (2,3
dihidroxibutanodiico), mlico (2-hidroxibutanodiico), lctico (2-hidroxipropanico), oxlico
(etanodiico), rico, glico (3,4,5-trihidroxibenzico) e ctrico (2-hidroxipropan-1,2,3tricarboxlico) (FIORUCCI et al., 2002). Scheele fez uso de reaes e tcnicas que at
ento estavam intimamente relacionadas com a Qumica Inorgnica (extraes por
solventes, formaes de sais, diferenas de solubilidade). Uma atribuio destas
descobertas e seus respectivos autores esto descritas na Tabela 2.2.
Tabela 2.2. Ano de descoberta e/ou isolamento de alguns cidos orgnicos e seus
respectivo descobridores.
cido
Data
Pesquisador
Frmico
1500
H. Brunschwigk
Benzico
1556
M. Nostredame
Fonte descoberta
Destilao por arraste de vapor de solues
contendo formigas
Sublimao da goma do benjoim (resina extrada
do benjoeiro)
Sublimao do mbar (resina vegetal fssil)
Do resduo de fermentao do vinho
Do tratamento do ndigo com cido ntrico
Isolado do trevo azedo (oxalis)
Oxidao do acar com cido ntrico
Fermentao do leite azedo
Dos resduos da urina
Dos sucos de frutas ctricas
Extrado do suco de ma
Das nozes da Gala
2.1.2. Comercializao
---
sabor azedo caracterstico foi o primeiro critrio para classificao destes compostos. Na
indstria alimentcia, os cidos so adicionados por diferentes propsitos, aos alimentos.
As funes mais importantes dessa adio so: conservantes devido participao em
sistemas tampo, a habilidade de produzir um sabor azedo (onde o gerador o on
hidrognio ou hidrnio - H3O+) e tambm, como acidulante, devido capacidade de
modificar e intensificar o sabor de outros condimentos.
Como conservantes, atuam como sequestrantes de ons metlicos atravs do on
carboxila, evitando a catlise de reaes de oxidao nos alimentos (GITIRANA, 2007). A
adio de acidulantes comumente destinada s bebidas gasosas, principalmente aquelas
s quais se procura dar sabor parecido ao das frutas; estas bebidas j apresentam leve
teor cido, pelo CO2 que encerram em forma de cido carbnico (H2CO3). O pequeno grau
de acidez dado pelos acidulantes faz com que estes sejam empregados como recursos de
melhoria de sabores. Entre outros produtos em que os acidulantes so empregados, podese destacar: gelias artificiais, sorvetes, balas, ps para coberturas, produtos de
confeitaria, etc. Os cidos orgnicos comumente usados na indstria de alimentos so os
cidos: actico, ltico, ctrico, mlico, fumrico, succnico e tartrico (FENNEMA, 1985). Os
cidos, frmico e actico tm cheiro intenso, irritante e paladar azedo. O cido fosfrico
(H3PO4) o nico cido inorgnico empregado extensivamente como acidulante alimentar.
Os cidos de quatro a oito tomos de carbono tm odores desagradveis, como os
cidos caprico (hexanico), caprlico (octanico) e cprico (decanico). Entretanto, em
pequenas concentraes, os cidos carboxlicos so responsveis por muitas fragrncias.
Os cidos, benzico, cinmico (3-fenil-2-propenico), mirstico (tetradecanico) e
isovalrico (3-metilbutanico) esto presentes em leos essenciais, que so leos volteis,
odorferos, de origem vegetal (SHREVE & BRINK, 1980).
Uma grande parte dos cidos orgnicos, oriundos de microrganismos, ou como
intermedirios naturais em caminhos metablicos principais podem contribuir para o
avano nas produes biotecnolgicas a partir de fontes renovveis. Por causa dos grupos
funcionais dos cidos orgnicos, estas molculas so extremamente teis para a indstria
qumica. Por exemplo, cido succinico poderia susbtituir o anidrido maleico, que possui um
mercado bastante amplo na petroqumica (WERPY & PETERSEN, 2004).
Os cidos orgnicos so amplamente usados na indstria de alimentos como
aditivos. Como agentes de processamento, so adicionados para controlar a alcalinidade
de muitos produtos podendo agir como tampes ou simplesmente como agentes
neutralizantes. Como conservantes, podem atuar desde agentes antimicrobianos at
antioxidantes. Algumas caractersticas desses cidos orgnicos so abordadas a seguir:
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
10
---
11
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
12
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
13
com produtos finais mais competitivos e rentveis, como o cido succnico (DELHOMME et
al., 2009) A produo de cidos orgnicos amplamente utilizada em escala industrial,
sendo limitada a produo de cidos de origem microbiana, a qual vem apresentando
vantagens econmicas sobre a sntese qumica destes compostos (MATTEY, 1992).
Tabela 2.3. Blocos primrios produzidos por rota fermentativa ou qumica
Blocos de construo
cido succnico, fumrico e mlico
cido 2,5 furanodicarboxlico
cido 3 hidrxipropinico
cido asprtico
cido glucrico
cido glutmico
cido itacnico
cido levulnico
3-hidrxibutirolactona
glicerol
sorbitol
Xilitol/ arabinitol
Fonte: Top Value Added Chemicals from Biomass (DOE/GO-2006). U.S. Department of Energy
Candidatos em potencial
Monxido de carbono & Hidrognio
(gs de sntese)
nenhum
Glicerol, cido 3-hidrxipropinico, cido
propinico, cido ltico
Acetona, cido asprtico, cido fumrico,
3-hidroxibutirolactona, cido malnico,
cido succnico, treonina
Arabinotil, furfural, cido glutmico, cido itacnico,
cido levulnico, prolina, xilitol,cido xilnico
.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
14
Qp
(g/L.h)
Yp/s
(g/g)
Fonte de
Carbono
Microrganismo
Estratgias
de conduo
Referncias
cido ctrico
150
----
----
Glicose
Aspergillus niger
113.5
----
0,71
Beterraba,
melao
Aspergillus niger
(LOTFY et al.,
2007)
114
0,61
0,76
Melao de
cana
Aspergillus niger
40
0,1
0,99
n-Parafina
Yarrowia lipolytica
(CROLLA, 2004)
42,9
----
0,56
Glicose
Yarrowia lipolytica
(PAPANIKOLAOU,
2006)
140
0,73
0,82
Sacarose
Yarrowia lipolytica
(FORSTER, 2007)
----
----
Lactobacillus
rhamnosus
Extrao em
processo
contnuo
Frascos
agitados
(IKRAM et al.,
2004)
cido ltico
5,4
67,1
52/144
----
----
Lactobacillus spp.
Batelada e
Reciclo de
clulas
----
3,1
Protena
Lactobacillus spp.
Eletrodilise
(HOFVENDAHL &
HAN, 2000)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
15
P
(g/L)
Qp
(g/L.h)
Yp/s
(g/g)
Fonte de
Carbono
Microrganismo
Estratgias
de conduo
Referncias
29
----
0,78
Farinha de
lentilha
Lactobacillus
amylophilus
-----
40
0,63
0,95
Bagao de
mandioca
Lactobacillus
delbrueckii
Imobilizao
58
0,6
0,58
Xilose
Pichia stipitis
Hemicelulose
de bagao de
cana
51.7
----
0,68
Aveia
Rhizopus oryzae
Estratgia de
biorrefinaria
(KOUTINAS et al.,
2007)
95
2,2
0,80
Glicose
Rhizopus spp.
Airlift (escala
industrial)
122
----
0,61
Caldo de
cana
Saccharomyces
cerevisiae
Cultura
neutralizada
(SAITOH et al.,
2005)
70
----
0,93
Glicose
Saccharomyces
cerevisiae
pH baixo
cido succnico
35.6
1,01
0,82
Trigo
Actinobacillus
succinogenes
Hidrlise/
Batelada
52
1,8
0,76
Glicose
Mannheimia
succiniciproducens
----
43
0,72
0,53
Glicose
Escherichia coli
Batelada
58.3
1,08
0,62
Glicose
Escherichia coli
Batelada
alimentada
55.2
1,15
----
Melao de
cana
Actinobacillus
succinogenes
Batelada
83
10,4
0,89
Glicose
Anaerobiospirillum
succiniciproducens
Batelada
Eletrodilise
(MEYNIAL, 2008)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
16
Nomes comuns
Massa molecular
Aparncia
Gravidade especfica
Ponto de fuso
Ponto de ebulio
Volatilidade
Outras informaes
118,09 u
Cristal inodoro/incolor
1,572 (200C /40C)
184-1880C
2350C
0 (210C)
Combustvel e corrosivo
Fonte: www.gadiv.com
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
17
solvente para diminuir poluies txicas. Este composto conhecido como solvente
verde;
---
18
alimentos, podendo ser utilizado no lugar do glutamato de sdio (CAROLE et al., 2004).
Outros sais do cido podem ser utilizados como aditivos no cultivo de plantas e na
alimentao animal, atuando como precursor de protenas, fontes de energia e
estimulantes de crescimento. Em alguns aminocidos usado para produzir substncias
com qualidades de protenas de soja.
III. Indstria farmacutica: O cido succnico utilizado na produo de frmacos,
antibiticos, aminocidos, vitaminas, sedativos, medicamentos anticoncepcionais e
medicinais combatendo inflamaes, espasmos, artrites e at mesmo o cncer. O mercado
destas substncias est acima de 400 milhes de dlares ao ano (ZEIKUS, 1999).
O esquema de blocos, ilustrado na Figura 2.2, apresenta essas e outras aplicaes
do cido succinico, consideradas importantes.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
19
Hidrlise
Especialidades
Substncias Qumicas
cido adpico
Substitutos de Sal
Solventes
Estimuladores para
crescimento de plantas
1,4-Butanodiol
Acidulantes
4,4 steres
Polisteres
Solventes Verdes
Tetrahidrofurano
Dimetil/Dietil
Succinato
cido
-Butirolactona
Detergentes e
surfactantes
Succnico
2-Pirrolidiona
cido
Produtos
farmacutico
Succinimida
4-Aminobutanico
Anidrido maleico
Maleimida
Hidroxisuccinimida
Inibidores de
corroso
cido maleico
cido itacnico
cido mlico
cido fumrico
cido Asprtico
Figura 2.2. Produtos obtidos a partir do cido succnico, como uma comoditie em potencial. (JOERI et al., 2010; CUKALOVIC &
STEVENS, 2008 e DELHOMME et al., 2009)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
20
composies
de
monmeros,
estrutura
macromolecular
diferentes
decompondo-se
em
curto
espao
de
tempo,
em
ambientes
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
21
Cabe ressaltar que, apesar das caractersticas interessantes dos biopolmeros, tais
como biodegradabilidade e o uso de recursos renovveis, muitos ainda no apresentam
propriedades fsicas idnticas aos polmeros petroqumicos (por exemplo, maior fragilidade
e decomposio muito rpida) e, em especial, tm custos de produo elevados, ainda que
em queda nos ltimos anos (COUTINHO et al., 2004). A questo do preo , de fato, a
principal desvantagem. Biopolmeros como o PLA encontram-se na faixa de 3,00-4,00/kg,
o PHA em 3,50-5,00/kg e os compostos do amido em 2,00-4,00/kg, enquanto o preo
dos plsticos sintticos est atualmente em 1,00/kg.
O PBS um polister aliftico sinttico obtido atravs da copolimerizao do 1,4
butanodiol (BDO) com cido succnico, ambos produzidos por fermentao. Munoz-Guerra
et al. (2005) publicaram a sntese de copolisteres aliftico-aromticos obtidos pela reao
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
22
em massa do PET com o poli (succinato de 1,4 butileno) (PBS) em diferentes propores
de cada homopolmero (KINT et al., 2003). A reao do PET ps-consumo com polisteres
alifticos destaca-se por ser um meio simples e de baixo custo para a produo de novos
termoplsticos com propriedades intermedirias entre os polisteres aromticos e
alifticos, aliado vantagem destes copolmeros serem biodegradveis.
O PET um material que possui excelentes propriedades trmicas e mecnicas, o
que o torna um dos polmeros mais utilizados atualmente, sendo amplamente empregado
na fabricao de embalagens de alimentos e bebidas. A elevada produo mundial,
estimada em 26 milhes de toneladas no ano de 2000 com previso de alcanar um total
de 55 milhes de toneladas em 2010 (FRADET & TESSIER, 2003), aliada estabilidade
qumica responsvel, juntamente com outros fatores, pelo acmulo crescente deste
polmero nos aterros sanitrios. Apesar de o PET ser incuo ao corpo humano, devido
sua excelente resistncia a agentes biolgicos e atmosfricos, ele torna-se nocivo ao meio
ambiente (KINT & MUNOZ, 1999).
Fatores econmicos e ambientais advogam em favor da reciclagem em grande
escala do PET, de maneira similar ao que j acontece atualmente com materiais
convencionais como vidro, papel e metal (LOUP et al., 2003). Muitos trabalhos vm sendo
realizados
visando
obter
copolmeros
com
propriedades
trmicas
mecnicas
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
23
Figura 2.4. Estruturas possveis para os copolmeros PET-co-PES. Fonte: (PIRES et al., 2005)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
24
com base na frutose do bagao de ma. Como regra geral, essas iniciativas resultam de
projetos cooperativos de pesquisa de empresas de menor porte com universidades.
Na rea de polmeros fabricados com base em matrias-primas renovveis (os
polmeros verdes), por outro lado, as iniciativas so de grandes grupos, tradicionais
empresas qumicas como a multinacional Dow Qumica ou a maior empresa petroqumica
brasileira, a Braskem (grupo Odebrecht), por meio da busca de alternativas ao petrleo,
com projetos para produo de polietileno verde, ou seja, o polietileno convencional
polimerizado a partir do etileno obtido do etanol da cana-de-acar e no da nafta
petroqumica (VALOR, 2007). A primeira est buscando parceria com o fabricante da
matria-prima da cana-de-acar (Crystalsev), para produo de 350 mil t/a de polietileno
verde, enquanto a Braskem objetiva produzir de 100 mil a 200 mil t/a de polietileno do
etanol da cana adquirido do mercado (DCI, 2007). Os dois investimentos so tpicos
projetos da alcoolqumica, que, embora sem envolver inovaes tecnolgicas radicais
como os biopolmeros, esto em consonncia com a tendncia mundial de valorizao de
matrias-primas renovveis.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
25
O mercado global para cido succnico, incluindo rota biotecnolgica e qumica, foi
projetado para crescer a uma taxa anual de 23.5% entre 2006 e 2015, estimando-se
alcanar em torno 144.7 mil toneladas nos prximos cinco anos. Este crescimento pode ser
justificado pelos interesses acerca da sua posio de destaque como bloco de construo.
Em um relatrio publicado, atravs do Mercado Global, foi descrito um total de 27 grandes
empresas que esto empenhadas em consolidar a produo em larga escala de cido
succnico, como a ARD (Agro-Industrie Recherches et Dveloppements, Frana), Anhui
Sanxin Chemical Co., Ltd.(China), Anqing Hexing Chemical Co., Ltd. (China), BASF SE
(Alemanha), Bio-amber S.A.S (Frana), DNP Green Technology, Inc.(EUA), Kawasaki
Kasei Chemicals Ltd.(Japo), e a MBI International, Myriant Technologies, LLC (EUA),
Roquette Frres S.A. (Frana) e a Royal DSM N.V.
A Royal DSM N.V e a Roquette criaram uma aliana estratgica para comercializar
cido succnico em escala industrial, at o final de 2011, a partir de um processo de
fermentao com fontes renovveis (glicose) e suprimento de CO2. Desde 2009, uma
planta piloto para demonstrao foi inaugurada em Pomacle (Frana) (KIDWELL et al.,
2008 e SCOTT et al., 2009). Uma integrao com a DNP Tecnologia Verde e a ARD
(BioAmber), anunciou uma capacidade de produo anual de 2.000 toneladas.
No incio de 2011, a BioAmber entrou em acordo exclusivo de licenciamento de
tecnologia com a CELEXION para produzir cido succnico e cido adpico, a partir de
fontes renovveis, aumentando sua infra-estrutura. A empresa tambm criou uma unidade
de P&D em Plymouth (Minnesota) com uma considervel eficincia em seus processos
fermentativos, em qumica analtica e biologia molecular (BIOAMBER, 2011).
No mesmo perodo, a Myriant Technologies (Myriant) e a Davy Process Technology
(Davy), uma empresa Johnson Matthey, assinaram um memorando de entendimento,
sobre a utilizao de cido succnico como matria-prima para a obteno de 1,4butanodiol e gama-butirolactona (GBL), visando minimizar os custos de recuperao e
purificao do cido succnico, na etapa de Downstream. Nos ultimos quinze anos, as
empresas Davy desenvolveram uma tecnologia baseada em butanodiol obtido pelo
anidrido maleico e, licenciou mais de meio milho de toneladas de capacidade anual sobre
a produo das diferentes misturas de tetraidrofurano (THF), butanodiol (BDO) e gamabutirolactona (GBL) (MYRIANT, 2011).
No obstante, mais uma aliana, almejando licenciamento no perodo entre 2010 e
2011, foi criada entre a Myriant Technologies LLC e a Uhde, para estudos de engenharia,
de obteno e construo de uma planta industrial. As empresas comearam, inclusive, a
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
26
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
27
obteno do cido maleico (CORNIL & LAPPE, 2002). Em seguida, atravs de sua
hidrogenao obtido o cido succnico (ZEIKUS et al., 1999), conforme mostra a Figura
2.5.
Oxidao
Especi
Hidrogenao
Figura 2.5. Sntese qumica para obteno do cido succnico (ZEIKUS et al.,1999)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
28
fermentao
est
se
tornando
cada
vez
mais,
parte
integrante
do
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
29
2010), resduos de talo de milho (corn stover) (LI et al., 2010), alcachofra e topinambo de
Jerusalm (REN et al., 2008); trigo (DORADO et al., 2009), milhocina (AGARWAL et al.,
2006); palha de trigo (DU et al., 2008) e hidrolisado do sake (CHEN et al., 2010).
A viabilidade tcnica, os balanos mssicos e energticos e a economicidade so
aspectos relevantes que devem ser considerados na escolha da matria-prima. Dessa
forma, as matrias-primas para bioprocessos podem ser agrupadas em funo da estrutura
e complexidade molecular dos substratos (reagentes primrios dos quais o produto
obtido). Em algumas, os substratos encontram-se na forma polimrica, e sua hidrlise
prvia ser necessria, caso o agente biolgico no seja capaz de sintetizar enzimas que
catalisam a despolimerizao desses substratos (PEREIRA, 1991). Assim, essas matriasprimas podem conter:
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
30
JR,
2009).
Estes
componentes
esto
associados
uma
estrutura
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
31
Celulose
Hemicelulose
Lignina
Extrativos
Cinzas
Bagao de cana
33-36
28-30
18-20
4-6
2-4,8
Palha de arroz
32-37
19-24
9-13
4-5
12-18
Sabugo de milho
34-36
16-24
15-19
2-6
2-4
Palha de trigo
30-33
22-28
14-18
3-7
3-7
Palha de sorgo
34-36
25-26
25-26
Jornal impresso
40-55
25-40
18-30
Madeiras
~50
~20
15-20
At 10
At 5
Fonte: SUN & CHENG (2002), PANDEY et al. (2000), OLSSON & HAHN-HGERDAL (1996)
Palha
de
trigo
Palha
Bagao
Semente
de
de
de
arroz
cana
algodo
Glicdeos (%)
Glicose
39,0
36,6
41,0
38,1
Manose
0,3
0,8
1,8
Galactose
0,8
4,4
Xilose
14,8
Arabinose
4,2
Jornal
impresso
Resduos
urbanos
20,0
64,4
40,0
n.d.
4,1
16,6
8,0
0,4
1,1
0,1
n.d.
n.d.
19,2
14,8
23,3
4,6
4,6
14,0
4,4
4,5
4,5
4,3
0,5
4,0
Outros (%)
Lignina
15,1
14,5
9,9
18,4
17,6
21,0
20,0
Cinzas
4,3
9,6
4,4
4,8
14,8
0,4
1,0
Protenas
4,0
4,0
n.d.
n.d. medidas no determinadas
Fonte: LEE (1998)
4,0
4,0
n.d.
n.d.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
32
2.4.3.1. Celulose
Figura 2.8. Disposio das molculas de glicose, unidas por ligaes Glicosdicas (1)
(COUGHLAN, 1985 apud LEMOS, 2001); Estrutura simplificada da Celulose (2)
(PEREIRA Jr., 1991)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
33
2.4.3.2. A Lignina
-D-manose,
-D-glicose,
-L-arabinose,
-D-galactose
Adicionalmente,
podem
ser
encontrados
cidos
como
-D-
---
34
xilana
componente
majoritrio
do
complexo
hemicelulsico,
constituindo entre 15% e 30% da massa seca de madeiras e resduos agroindustriais. Depois da celulose as xilanas constituem a mais abundante fonte de
carboidratos das plantas. As xilanas correspondem a 15-30% da massa seca total
nas madeiras duras, formadas, principalmente, por glucouranoxilanas, e a 7-12%
das madeiras macias, formadas, principalmente, por galactoglucomananas e
arabinoglucouranoxilana (CARAMEZ, 1999).
No caso do pr-tratamento cido do material lignocelulsico, visando solubilizao
da hemicelulose, gera-se uma mistura de glicdeos na qual a xilose majoritria,
alcanando os dois teros dos acares redutores (DELGENES et al., 1998).
-Arabinofuranose
Grupo Acetil
OH
H
H
OH
O
CH3
H
H
O
OH
H
OH
O
OH
H
OH
O
O
H
O
O OH
CH3
H
O
H
OH
OH
Xilobiose
OH
H
O
H
OH
O
OH
H
O
H
O
H
O
H
O
H
OH
H
OH
H
OH
H
OH
OH
OH
OH
OH
H
H
OH
H
O OH
O
CH3
Grupo Acetil
cido Glucurnico
H
CH3
H
OH
OH
cido Glucurnico
---
35
PLATAFORMA BIOQUMICA
Hidrlise (qumica/enzimtica)
Fermentao
Converso da lignina
intermedirios
glicdicos ou
derivados de lignina
PRODUTOS
BIOMASSAS
Cultivos energticos
Resduos agrcolas/agroindustriais
PLATAFORMA TERMOQUMICA
Pirlise (bio-leo)
Gaseificao (BTL; GTL)
combustveis
substncias qumicas
energia
Intermedirios
gasosos ou lquidos
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
36
de
parte
do
bagao
queimado
por
outros
materiais
como
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
37
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
38
da
celulose
futuros
processos
de
hidrlise
sem
afetar,
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
39
---
40
lcool
coniferilico
lcool
3,5-dimetoxi-4-hidroxinamlico
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
41
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
42
(E.C.3.2.1.74),
tambm
conhecidas
como
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
43
redutores. Essas enzimas geralmente sofrem inibio pelo seu produto de hidrlise, a
celobiose (AWAFO et al., 1996). A estrutura das celobiohidrolases apresenta uma regio
na forma de gancho, cuja funo se ligar fibra celulsica, facilitando o seu acesso ao
stio cataltico. Adicionalmente, reportado que as celobiohidrolases (CBH I) possuem dez
substios ativos no domnio cataltico, cuja funo se ligar fisicamente celulose e iniciar
as reaes qumicas que hidrolisam as cadeias a celobiose.
O terceiro e ltimo grande grupo das enzimas do complexo celuloltico engloba as
enzimas
-glucosidsicas,
ou
-glicosdeo
glucohidrolases
(E.C.3.2.1.21).
As
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
44
SLIDOS
(CELULIGNINA)
PR-TRATAMENTO
HIDRLISE
HEMICELULOSE
PRODUO DE
ENZIMAS
PSP
ACARES
SOLVEIS
FERMENTAO
C5
Succinato
cido
Succnico
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
45
PR-TRATAMENTO
HIDRLISE
HEMICELULOSE
SLIDOS
(CELULIGNINA)
PRODUO DE
ENZIMAS
PSP
Succinato
cido
Succnico
De acordo com esta concepo, a corrente lquida rica em pentoses, obtida aps o
pr-tratamento permanece no reator, ao qual so adicionadas as celulases e,
posteriormente, inoculado com uma linhagem recombinante (capaz de fermentar pentoses
e hexoses).
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
46
flavefaciens,
Actinobacillus
succinogenes,
Bacterides
amylophilus,
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
47
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
48
piruvato, malato e acetato, sinalizando para uma possvel deficincia no potencial redox
desta linhagem.
Tcnicas de modificao gentica tm sido empregadas de forma recorrente para a
transformao de vrias linhagens, com a formao de vetores entre espcies prximas,
como Actinobacillus, Haemophilus, e Pasteurella visando elevar os valores de eficincia do
processo (BROGAN et al., 1996; FREY, 1992).
Raros estudos envolvendo o uso de fungos na produo de cido succnico foram
descritos, at a presente data. No entando, Fusarium spp., Aspergillus spp., e Penicillium
simplicissimum so fungos filamentosos conhecidos por produzirem cido succnico sob
condies aerbicas e anaerbicas (MAGNUSON et al., 2004).
Estudos envolvendo Saccharomyces cerevisiae vm apresentando um avano no
processo de produo de cido succnico, com o objetivo de minimizar os custos de
purificao e acidificao, etapas posteriores fermentao. No entanto, esta linhagem
no acumula succinato naturalmente, necessitando de alteraes genticas sobre seu
metabolismo, para utilizao de diversas fontes de substratos (OTERO, 2009).
CAMARASA & GRIVET (2003) investigaram o uso do vinho de arroz na produo
de cido succnico, em fermentao sob condies anaerbicas, por Saccharomyces
cerevisiae aps modificaes genticas, elevando os valores de rendimento em produto.
Um efeito combinado entre fungo e bactria (Rhizophus sp. Enterococcus faecalis)
atravs de um processo desenvolvido em duas etapas, apresentou um alto valor de
produtividade e rendimento (2.2 g/l/h e 0.95 g/g), durante estudos descritos por MOON et
al. (2003). Na primeira etapa, o fungo produz fumarato, que transferido para um segundo
reator, onde E. faecalis sintetiza o cido succnico.
Os substratos que podem ser utilizados para produo de cido succnico por esses
microrganismos so variados. A principal fonte de carbono geralmente a glicose, no
entanto, outros acares como celobiose, frutose, lactose, maltose, manitol, manose,
sacarose, D-xilose e salicina podem ser utilizadas por alguns microrganismos especficos,
como a A. succinogenes (GARRITY et al., 2004; GUETTLER, et al., 1999), permitindo a
fermentao de muitas fontes de carbono baratas, como melao de cana, soro e
hidrolisado de trigo (DU et al, 2008; WAN et al., 2008 e LIU et al., 2008).
J A.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
49
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
50
Figura 2.15. Via bioqumica para sntese de succinato, por E. coli, em presena de glicose
como fonte de carbono (VEMURI et al., 2002)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
51
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
52
(LINTOMEN,
---
53
Figura 2.17. Transporte de diferentes espcies atravs de uma membrana (HABERT et al.,
1997).
Mtodos
Escalabilidade Robustez
Rendimento
(separao)
Custo
Ultrafiltrao
Precipitao
Eletrodilise
+/
Extrao lquido-lquido
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
54
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
55
Preparo do meio
Esterilizao
Inculo
Objetivo Geral
Separao
Purificao
Fermentao
Cristalizao
Produto
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
56
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
57
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
58
modelos simplificados suficiente para o design do sistema. Contudo, em outros pode ser
vantajoso o uso de modelos mais sofisticados (LUNELLI & MACIEL, 2007)..
Dependendo do uso, da aplicao e da complexidade da situao fsica, os modelos
que representam o crescimento celular podem variar bastante. Esta variao engloba os
modelos bem simples e os mais sofisticados. A Figura 2.21 mostra alguns parmetros,
fenmenos e interaes que influenciam o comportamento cintico da populao de
clulas.
Meio
Multicomponentes
Populao microbiana
Nutrientes
Componentes mltiplos
Substrato
Reaes em soluo
Reaes mtiplas
pH, T, ...variveis
Controle interno
Propriedades reolgicas
Calor
Fases multiplas
Adaptabilidade
Probabilidade
Interaes
Heterogeneidade espacial
Mecnicas
Degenerecncia
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
59
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
60
ela
independente
do
tempo,
isto
em
crescimento
balanceado
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
61
(Equao 2.2)
onde,
no
devem
ser
utilizados
quando
composio
celular
mudar
significativamente no processo, afetando assim a cintica. Para estes casos devem ser
utilizados modelos estruturados disponveis em literatura especializada.
BAILEY & OLIS (1986) descreveram alguns estudos de casos onde o modelo de
Monod sofreu algumas modificaes, devido necessidade de se ampliar ou incluir
modificaes nos termos cinticos, para levar em conta o metabolismo endgeno,
manuteno celular, ou sugerir taxas especficas de crescimento que levam em conta
diferentes dependncias da cintica de crescimento, como os modelos de Tessier, Moser e
Contois. As duas primeiras equaes resultam equaes algbricas com solues mais
complicadas que a forma de Monod.
A equao de Contois, por exemplo, contm uma constante aparente proporcional
concentrao de biomassa X. Outros modelos para a taxa especfica de crescimento foram
propostos de acordo com casos particulares que forneceram bom ajuste a dados
experimentais. Segundo o modelo proposto por Andrews, a taxa especfica de crescimento
pode ser inibida pelos constituintes do meio tal como substrato e produto.
Existem tambm os modelos de formao de produto. A formao de produto pode
ser classificada em diferentes grupos (ASENJO & MERCHUK, 1994):
a. Produto principal resultado direto do metabolismo energtico.
b. Produto principal resultado indireto do metabolismo energtico.
c. Produto principal um metablico secundrio.
d. Produto principal uma protena intra ou extracelular.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
62
Modelo cintico
MOISER
CONTOIS
SINCLAIR; KRISTIANSEN
Crescimento com um nico substrato limitante e inibidor
ANDREWS
WU
DUNNET
MEGEE
TSAO; HANSON
PIRT
ZENG; DECKWER
Onde:
X: taxa especfica de crescimento.
d: taxa especfica de morte celular.
s: taxa especfica de consumo de substrato (pode ser representado por qs)
S, S1, S2 e S3: concentraes de substratos limitantes.
S*:concentrao de S para manter X.
X:concentrao celular.
Yx/s:fator de converso de substrato em clulas.
ms:coeficiente de manuteno energtica.Os demais so parmetros cinticos.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
63
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
64
Referncia
Modelo cintico
AIBA; SHODA
AIBA
GHOSE; TYAGI
LEVENSPEIL
LEE
TOSETTO
Onde:
X: taxa especfica de crescimento.
p: taxa especfica de produo (tambm pode ser representado por qp).
S: concentrao de substrato limitante.
P: concentrao de produto.
Os demais so parmetros cinticos.
Fonte: Adaptado de SCHMIDELL et al. (2001)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
65
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
66
h
yn.1 = yn + (kn.1 +2kn.2 +2kn.3 +kn.4 )
6
yn.1 = hf (tn , yn )
1
1
yn.2 = hf (tn + h, yn + + hkn.1)
2
2
1
1
yn.3 = hf (tn + h, yn + + hkn.2 )
2
2
(Equao 2.6)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
67
Na Tabela 2.13 foi elaborada uma avaliao para a produo de cido succnico,
mediante uma ampla reviso da literatura, at a presente data. Foram selecionados para a
anlise os seguintes aspectos: as linhagens mais recorrentes (A.succinogenes, A.
succiniciproducens, M.succiniciproducens, E.coli, C.glutamicum e Bacteroides fragalis), as
estratgias de fermentao (aerao, operao do processo, componentes do meio e fonte
de CO2), alm dos valores de rendimento, taxa de formao de produto, concentrao final
de produto, produtividade volumtrica e subprodutos formados (BEAUPREZ et al., 2010).
Entre os trabalhos pesquisados, h um total de 11 patentes, que foram depositadas entre
1992 e 2005. Cabe ressaltar que os resultados encontrados para a linhagem A.
succinogenes CIP 106512 foram os mais proeminentes do presente trabalho.
Nota-se que a maioria dos grupos conduziram o processo em batelada, com
resultados relativamente satisfatrios, embora os maiores valores de produtividades e
taxas de formao de produto tenham sido obtidos com os ensaios conduzidos em
batelada alimentada e processo contnuo. Todos as operaes descritas foram conduzidas
em pH neutro e apresentaram formao de outros metablitos, alm do cido succnico,
comportamento tpico de heterofermentao. A maioria dos estudos utilizou para o preparo
do meio de cultivo as seguintes matrias-primas: milhocina, hidrolisado da madeira,
hidrolisado de resduos do milho, soro e melao. Quase a tolalidade dos ensaios foram
conduzidos com glicose como fonte de carbono. No entanto, ISAR et al. (2006)
depositaram uma patente onde foi utilizada a sacarose como fonte de carbono, com E.coli
W3110 e o processo foi conduzido com batelada em duas fases (aerbica e anaerbica),
resultando em um elevado rendimento, de 1.2 g/g, uma concentrao final de cido
succnico de 24 g/L e uma produtividade volumtrica de 0,81g/L.h.
Uma produtividade volumtrica elevada, igual a 10.4 g/L.h, e uma concentrao
igual 83 g/L de cido succnico, foram obtidos durante um processo contnuo com A.
succiniciproducens, a partir de um sistema de integrao com membranas para o reciclo de
clulas, a uma taxa de diluio igual a 0,98 h1 (MEYNIAL & DOROTNY, 2008)
Em um processo conduzido com batelada alimentada e reciclo de clulas, por C.
glutamicum (OKINO et al., 2008), uma concentrao de 146 g/L de cido succnico foi
obtida. Cabe ressaltar que os autores fizeram uso de engenharia metablica para atingir os
objetivos almejados. Utilizando a bactria A succinogenes CGMCC1593, ZHENG et al.
(2009) conseguiram um rendimento de 80% em cido succnico, a partir do hidrolisado da
palha, aps destoxificao para reduo da concentrao de inibidores do crescimento
celular, alm de conduzirem o processo em batelada alimentada.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
68
Tabela 2.13. Valores encontrados e calculados para rendimento (Yp/s), produtividade volumtrica (Qp) e taxa especfica de formao de
produto (qp), a partir dos dados obtidos pela literatura, para diferentes linhagens e estratgias de fermentao.
Linhagens
Estratgia de fermentao
A. succinogenes
CIP106512
an; B; Xi, E.L, CO2, NaHCO3
CIP106512
an; B; Hbc, E.L, CO2, NaHCO3
CIP106512
an; B; Glc, E.L, CO2, NaHCO3
CIP106512
an; B; Bc(SSF), E.L, CO2, NaHCO3
FZ6
an; B; Mic, E.L, Na2CO3
130Z
an; B; Mic, E.L, Na2CO3
FZ53
an; B; Glc, Mic, E.L, MgCO3
130Z
an; B; Glc, Mic, E.L, Ac, MgCO3
an; Bs; Glc, Mic, E.L, Ac,
130Z*
130Z
an; B; Glc, Def, NaHCO3
130Z
an; B; Glc, Def, NaHCO3
130Z
an; B; Glc, E.L, CO2, NaHCO3
CGMCC1593
an; B; HM, E.L, CO2, Na2CO3
an; BA; HM, E.L, CO2, Na2CO3
CGMCC1593*
an; BA; Glc, E.L CO2, Na2CO3
CGMCC1593*
130Z
an; B; Sor, E.L, CO2
130Z
an; B; HTr, CO2, MgCO3
CGMCC1593
an; B; HMil, CO2, MgCO3
an; BA; HMil, CO2, MgCO3
CGMCC1593*
A. succiniciproducens
ATCC 29305a
an; B; Glc, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, P, E.L, CO2, Na2CO3
an; C2e; Glc, Mic , CO2, Na2CO3
ATCC 53488*
FA-10
an; B; Glc, Mi, CO2, Na2CO3
Yp/s
(g/g)
qAS
(g/g . h)d
Qp
(g/L.h)
P
(g/L)c
0.66
0.53
0.52
0.45
0.94
0.79
0.82
0.87
0.86
0.46
0.5
0.62
0.79
0.94
0.75
0.57
0.81
0.81
0.82
0.34
0.31
0.27
0.25
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.47
0.19
0.3
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
1.88
1.50
1.77
1.42
1.01
1.56
1.36
0.18
0.88
0.28
0.3
1.35
0.97
1.15
1.3
0.58
1.19
0.95
1.21
42.5
40.3
41.6
38.4
63.7
2939
105.8
17.4
33.9
4.2
4.1
33.8
46.4
55.2
60.2
50
64.2
45.5
53.2
Fo,Ac
Fo,Ac
Fo,Ac
Fo,Ac
Fo, Pi, Pr, Ac
Fo, Pi, Ac
Fo, Pi, Pr, Ac
Fo, Pi, Ac
Fo, Pi, Ac
Fo, Ac, Et
Fo, Ac, Et
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Fo, Ac
Este trabalho
Este trabalho
Este trabalho
Este trabalho
GLASSNER et al., 1996
GLASSHER et al., 1998
GUETLER et al., 1996
URBANCE et al., 2003
URBANCE et al., 2004
MCKINLAY et al., 2005
MCKINLAY et al., 2007
CORONA et al., 2008
LIU et al., 2008
LIU et al., 2008
LIU& ZHENG,2008
WAN et al., 2009
DU et al., 2008
ZHENG et al., 2009
ZHENG et al., 2009
15.9
43.5
33.2
39.1
34.1
0.79
0.91
0.88
0.85
0.66
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.79
1.93
0.87
2.03
0.77
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
Subprodutosb
Referncias
69
Linhagens
Estratgia de fermentao
FA-10
an; B; Glc, E.L, P, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, E.L, P, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Glc, E.L, P, CO2/H2,
ATCC 53488
an; B; Sor, Mic, CO2, Na2CO3
an; BA; Sor, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488*
an; C; Sor, Mic, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
ATCC 53488
an; B; Glc/Gl, P, E.L, CO2,
ATCC 53488
an; B; HM, Mic, CO2, Na2CO3
an; Cm; Glc, P, E.L, CO2,
ATCC 53488*
an; Cm; Glc, P, E.L, CO2,
ATCC 53488*
ATCC 53488
an; B; Gal, P, E.L, CO2, Na2CO3
ATCC 53488
an; B; Gal/Glc, P, E.L, CO2,
M. succiniciproducens
MBEL55E
an; B; Glc, P, E.L, CO2
MBEL55E
an; B; HM, Mic, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, Mic, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, Mic, E.L, CO2
MBEL55E
an; B; HM, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, E.L, CO2
MBEL55E
an; C; HM, E.L, CO2
an; BA; Glc, E.L, CO2
LPK7*
MBEL55E
an; B; Glc, E.L, CO2, NaHCO3
LPK7
an; C; Glc (9 g/l), E.L, CO2
LPK7
an; C; Glc (9 g/l), EL, CO2
LPK7
an; C; Glc (18 g/l), EL, CO2
LPK7
an; C; Glc (18 g/l), EL, CO2
LPK7
an; B; Glc, Def, CO2
E. coli
JCL1208pPC201
an; B; Glc, E.L, T, MgCO3
Yp/s
(g/g)
qAS
(g/g . h)d
Qp
(g/L.h)
P
(g/L)c
Referncias
0.7
0.99
0.86
0.84
0.91
0.64
0.97
0.88
0.88
0.71
0.87
0.87
N.D.
1.5
0.45
N.D.
N.D.
N.D.
0.29
0.37
1.1
0.51
1.32
3
0.78
1.2
1.8
N.D.
0.96
3
1.35
0.74
10.4
3.3
1.46
0.97
31.6
32.2
34.4
34.3
34.7
19.8
29.6
23.8
83
14.3
15.3
14.7
Fo, Ac
Fo, Ac
Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
Ac
0.70
0.72
0.69
0.60
0.56
0.60
0.55
0.76
0.59
0.71
0.29
0.28
0.10
0.54
0.54
0.37
0.45
1.77
0.58
1.80
6.38
0.72
0.52
0.64
0.78
0.53
0.52
0.53
1.87
1.22
1.00
3.90
1.17
1.40
3.19
1.80
1.75
1.29
1.56
1.07
1.05
1.67
14
13.5
12
5
11.7
9.5
8
52.4
10.5
12.9
5.2
10.7
3.5
10.1
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Fo, La, Ac
Pi, Ma, Ac, La
Fo, La, Ac
Pi, Ac, La
Pi, Ac, La
PI, Ac, La
PI, Ac, La
Fo, La, Ac
0.29
N.D.
0.59
10.7
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
Subprodutosb
----
70
Linhagens
NZN111pMEE1
MG1655/pUC18
AFP111
JCL1242-pyc
NZN111pTrcML*
AFP400
AFP111-pyc
NZN111pTrcML
SS373
NZN111pTrcMLFu
HL27615k
HL27659k-pepc*
HL51276k-pepc
HL27659k*
SBS550MG*
E. coli
W3110GFA*
SBS110MG-pyc
TUQ19/pQZ6
TUQ2/pQZ6/pQZ5
W3110
SBS550 pHL314*
AFP184
AFP184
AFP184
NZN111*
W3110
KJ060
KJ073
Estratgia de fermentao
Yp/s
(g/g)
qAS
(g/g . h)d
Qp
(g/L.h)
P
(g/L)c
Subprodutosb
Referncias
0.64
0.42
0.54
0.15
0.47
0.61
1.10
1.10
0.73
0.35
0.45
0.62
0.71
0.59
1.06
N.D.
0.48
N.D.
0.17
N.D.
N.D.
0.13
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.09
0.05
0.20
0.21
0.32
0.43
0.52
0.14
0.08
0.61
1.30
0.13
0.32
0.06
0.16
0.72
0.14
0.70
0.42
12.8
4.2
51
1.5
9.4
6.1
99.2
10
11
7
5
58.3
8.3
7
40
Ac, Et
Fo, La
Ac
Fo, Ac, Et, La
Ma, Ac, Fo, La,
Fo, Ac, Et, La
Ac, Et
Ma, Ac, Et
PI
Ac, Et
PI, Ac
PI, Ac
PI, Ac
PI, Ac
Fo, Ac
0.2
0.9
0.8
0.8
1.2
1.1
0.8
0.7
0.5
0.7
0.52
0.9
0.8
N.D.
N.D.
N.D.
1.2
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
N.D.
0.2
N.D.
N.D.
N.D.
0.03
0.65
0.79
0.59
0.81
0.42
1.27
1.01
0.78
0.70
0.87
0.90
0.82
2.1
16
13
12
24
40
38
30
23
28
26
87
79
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
71
Linhagens
Estratgia de fermentao
Yp/s
(g/g)
qAS
(g/g . h)d
Qp
(g/L.h)
P
(g/L)c
Subprodutosb
Referncias
KJ060
an; B; Glc, def, NaHCO3, CO2
1.1
N.D.
0.61
73
Ma, Ac, La, PI
JANTAMA & HAUPT, 2008
KJ122
an; B; Glc, def, NaHCO3, CO2
0.9
0.4
0.88
83
Ma, Ac, PI
JANTAMA & ZHANG, 2008
C. glutamicum*
ae; BArc; Glc, EL, Cas, NaHCO3 0.19 0.13
R*
3.8
23
Ac, La
OKINO et al., 2005
R ldhA-pCRA717* ae; BArc; Glc, EL, Cas, NaHCO3 0.92 0.06
3.17
146
Ac, Ma, La, PI
OKINO et al., 2008
Bacteroides fragalis
MTCC1045
an; B; Glc, EL, P, Na2CO3, CO2
0.62 N.D.
0.42
12.5 N.D.
ISAR & AGARWAL, 2006
MTCC1045
an; B; Glc, EL, P, Na2CO3, CO2
0.57 N.D.
0.83
20
N.D.
ISAR & AGARWAL, 2007
Estratgia de fermentao: an: anaerbico, ae: aerbico, d: duas fases; ae: microaerbico; B: batelada, Bs: batelada sequencial
(repetida); BA: batelada alimentada, BArc: batelada alimentada com reciclo de clulas, C: cultivo contnuo, C2e: sistema contnuo em dois
estgios (2 taxas de diluio diferentes), Cm: cultivo contnuo integrado com sitema de membranas para reciclo de clulas.
Meio de cultivo: Xi: xilose, Glc: glicose, Gl: glicerol, Sac: sacarose, Fru: frutose Gal: galactose, So: sorbitol, P: peptona, T: triptona, E.L:
extrato de levedura, Cas: casaminocidos, Mic: milhocina, Sor: soro, HM: Hidrolisado de madeira pr-tratado, Me: melao de cana, HTr:
Hidrolisado do trigo, HMil: Hidrolisado de resduos de milho (corn stover), Bc: bagao de cana-de-aucar, Hbc: Hidrolisado do bagao de
cana-de-aucar; Ac: acetato, Def: meio definido.
Smbolos: Qp: produtividade volumtrica, qAS: taxa especfica de formao de cido succnico, Yp/s: rendimento em produto por substrato
consumido, N.D: Nenhum dado foi mencionado
Subprodutos: Fo: cido frmico, La: cido ltico, Ac: cido actico, PI: piruvato, Ma: malato, Pr: propionato, Et: etanol.
ndices: a: ATCC 29305 foi depositado novamente, como ATCC 53488, em 1992. b: Em muitos casos, no houve a formao de todos os
subprodutos. c: Alguns casos apresentaram valores baixos na concentrao de cido succnico, devido ao uso de pequenas concentraes
iniciais de fonte de carbono ou adotaram uma estratgia de fermentao pouco eficiente. d: Muitos estudos no apresentaram dados
suficientes para que fossem realizados todos os clculos referentes s taxas especficas de formao de produto.
* Processos que utilizaram estratgias diferentes da conduo em Batelada simples.
Dados em vermelho representam as referncias de trabalhos que foram depositados como patente.
Fonte: Adaptado de BEAUPREZ et al. (2010)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
72
2007),
---
73
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
74
CAPTULO 3
JUSTIFICATIVAS E OBJETIVOS
3.1. Justificativa
A dependncia por petrleo permanece como o fator mais importante que afeta a
distribuio mundial de riqueza, os conflitos globais e a qualidade do meio ambiente.
Existem diversas possibilidades para substituir processos qumicos convencionais por
processos biotecnolgicos baseados em fontes renovveis, dentro do contexto de
biorrefinaria. Porm, isso se torna vivel somente quando a matria-prima barata, como
o caso do bagao de cana-de-acar no Brasil. Adicionalmente, necessrio o
desenvolvimento de processos que trabalham de forma adequada para fazer o melhor
uso possvel de matria-prima, com procedimentos que evitam o mximo possvel
agresso ao meio ambiente, onde a utilizao de fontes alternativas feita de forma
equilibrada entre a cadeia alimentar e a obteno de produtos qumicos (HATTI et al.,
2007).
Paralelamente, questes de segurana, poltica e sade esto se tornando cada vez
mais importantes, fazendo-se necessria a reavaliao de muitos processos qumicos. As
autoridades reguladoras tm dado maior ateno aos problemas de carter ambiental, seja
por presso da opinio pblica mundial ou por segmentos da sociedade civil organizada. O
processamento de hidrocarbonetos ocorre, via de regras, em solventes orgnicos. Muitas
rotas so baseadas em catalisadores que requerem altas temperaturas e presses para
sua atividade. Em geral, reagentes, subprodutos ou intermedirios so nocivos sade
humana ou ao meio-ambiente. Alm disto, o consumo de energia e a emisso de efluentes
(lquidos, gasosos e resduos slidos) so significativos (DECHEMA, 2004).
Por outro lado, os bioprocessos ocorrem geralmente em meio aquoso e produzem
efluentes com um grau de toxidez muito inferior em relao aqueles oriundos do
processamento do petrleo. Alm disto, os produtos do processamento de biomassa so
normalmente biodegradveis e no-txicos (LYND et al., 1999; WILLKE & VORLOPO,
2004). incontestvel que, particularmente na rea de produo bsica e na qumica fina,
o uso de processos biotecnolgicos significativo, uma vez que:
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
75
Usam
fontes
renovveis
como
matria-prima,
contribuindo
para
Possui alta reatividade, devido a sua quiralidade natural, pela presena de dois
grupamentos carboxila;
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
76
Estudar a fermentabilidade a partir do hidrolisado hemicelulsico de bagao de canade-acar, obtido em condies otimizadas por Betancur (2005), para produo de
cido succnico;
Estudar uma estratgia para propagao celular em meio contendo hidrolisado com
alto teor de xilose (aclimatao celular);
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
77
CAPTULO 4
MATERIAIS E MTODOS
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
78
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
79
Componente
Peptona de casena
Peptona de soja
Cloreto de sdio
Fosfato dipotsico
Glicose
gar-gar
Fonte: (FREY, 1992).
Concentrao (g/L)
20.0
2.0
1.0
12.0
1.5
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
80
4.3.2. Inculo
Para atingir o crescimento celular, o meio para o preparo de inculo possui mesma
composio descrita na Tabela 4.2, com exceo da fonte de carbono, que anteriormente
fora realizada apenas com glicose. Cabe ressaltar, nesta etapa, que todos os experimentos
foram realizados paralelamente para glicose e xilose como fontes de carbono, mantendose os mesmos valores de concentrao inicial para os outros componentes presentes no
meio.
Frascos Erlenmeyer de 500 mL, contendo 200 mL de meio (previamente
esterilizado), foram inoculados com o volume total de pr-inculo (20mL), para a obteno
do cultivo de inculo. As condies de cultivo, em incubadora refrigerada orbital, foram s
mesmas citadas anteriormente. Adicionalmente, foi realizado um cultivo em meio sinttico
para a obteno de inculo, contendo hidrolisado diludo, visando avaliar o comportamento
celular diante de inibidores presentes no hidrolisado hemicelulsico (BETANCUR, 2005),
que foi esterilizado separadamente, a 0,5 atm durante 10 min.
A Figura 4.1 apresenta um esquema representativo dos ensaios, conduzidos
inicialmente em frascos agitados. Foram realizados quantificao de clulas e posterior
clculo do volume a ser centrifugado, obtendo-se a quantidade de clulas requeridas para
alcanar as concentraes desejadas, de acordo com os planejamentos experimentais
para cada fermentao desenvolvida. A concentrao celular foi determinada pela medida
de densidade ptica a 600 nm (SPECTRUMLAB 22 PC), utilizando-se uma curva de
calibrao para absorvncia.
Resumidamente, as estratgias adotadas para os ensaios em frascos agitados,
correspondem s seguintes etapas:
a) Todos os ensaios tiveram incio com o cultivo de meio de ativao, em frascos cnicos
de 100 mL contendo 20 mL de meio (Tabela 4.2), sob agitao de 150 rpm e 37C.
Cabe ressaltar que no foram realizadas etapas de pr-inculo a partir de xilose,
usando-se portanto apenas a glicose para esta finalidade;
ou
de
presena
redundante,
caracterizando
uma
complexidade
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
81
Frascos 100 mL
Meio de ativao:
20 mL
a) Padronizao de tempo
Frascos 500 mL
Meio de Crescimento:
200 mL
b) Padronizao de tempo
Frascos 500 mL
Meio de Fermentao:
200 mL
c.1 ) Planejamentos
........experimentais
com Xilose
10 % (v/v)
Volume
total
Cmara
assptica
c.2) Planejamentos
........experimentais
com Glicose
Pr-inculo
10 % (v/v)
a) Pr-Inculo
b) Preparo de Inculo
c) Fermentao
Figura 4.1. Esquema representativo das estratgias para a padronizao do tempo de preparo
de pr-inculo (a), inculo (b) e fermentao (c), dos experimentos iniciais, em frascos
agitados. Todos os ensaios foram realizados para xilose e glicose, como fonte de carbono, sob
as mesmas condies.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
82
Concentrao
20 g
5g
1,16 g
0,31
1,0 g
0,2 g
10 mg
200 mg
200 mg
500 mg
500 mg
500 mg
500 mg
500 mg
500 mg
1 mg
80 g
1,5 3,5 g
100 135 g
Concentrao
(g/L)
Variaes*
2.0
1.0
12.0
1.5
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
83
Glicose
Xilose
10 %
1.Ativao
10 % (v/v)
Fermentao
(meio com
hidrolisado)
Figura 4.2. Metodologia para Propagao Celular. (a) crescimento em uma nica etapa em
meio sinttico; (b) crescimento em uma nica etapa em meio contendo 25% de hidrolisado e,
(c) crescimento em duas etapas em meios contendo 25% e 50% de hidrolisado,
respectivamente.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
84
no
meio
de
fermentao
contendo
hidrolisado,
com
uma
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
-
---
85
3-Cmara assptica
4 - Incubadora
2-Autoclave 121C
1-Preparo de meios
37C
24 h
Filtrao a vcuo
37C
5 - Preparo de inculo
12 h
150 rpm
CO2
Shaker
Frascos
500 mL
amostras
200 mL
meio
Sobrenadante
8 Centrifugao
12000 rpm/15 min
Figura 4.3. Esquema ilustrativo geral para crescimento celular e produo de cido succnico, em frascos agitados. 1-preparo de meio, 2- esterilizao de meios
e vidrarias, 3- ativao de clulas e repiques peridicos, 4- condies de cultivo, 5- preparo de inculo, 6- inoculao em meio de fermentao, 7. a) Shaker e
condies de cultivo, com ou sem presena de CO2, 7.b) filtrao a vcuo de clulas para obteno de curva padro, correlacionando peso seco de clulas com
absorvncia, 8- separao de biomassa e sobrenadante, 9 a) quantificao de biomassa, 9.b) quantificao de produtos e aucares em HPLC.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
86
2- Manmetro
5-Distribuidor de gs
4- Membrana
Milipore 0.45 m
3-Rotmetro
CO2
0,05 vvm
1-Cilindro
6-Shaker
CO2
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
87
bom desempenho em todos os ensaios posteriores, uma vez que tal exigncia nutricional deve
ser atendida de acordo com o que reportado pela literatura.
Glicose e Xilose*
(g/L)
C
(g/L)
E.L
(g/L)
N
(g/L)
C:N
1
4,0
1,6
5
0,650
2,6:1
2
8,0
3,2
5
0,650
5,2:1
3
10,0
4,0
5
0,650
6,5:1
4
15,0
6,0
5
0,650
9,7:1
5
20,0
8,0
5
0,650
13:1
6
25,0
10,0
5
0,650
16,2:1
7
30,0
12,0
5
0,650
19,4:1
8
35,0
14,0
5
0,650
22,7:1
9
45,0
18,0
5
0,650
29,1:1
10
55,0
22,0
5
0,650
35,1:1
*Os valores encontram-se ligeiramente diferente daqueles usados por Gonzales et al.
(2008), devido a impreciso durante etapa de pesagem na quantidade de aucares, o que
no inviabiliza estudos de comparao entre os resultados.
Segundo Gonzales et al. (2008), o estudo da influncia da razo C:N pode ser
baseado na composio qumica do meio de cultivo. Nesta etapa foram feitos dez meios com
diferentes razes C:N, variando de 2.6 a 35.1, para cada carboidrato estudado (glicose,
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
88
----
89
Nveis
Inferior Superior
0.0
10.0
0.0
2.0
0.0
5.0
0.0
10.0
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
90
Tabela 4.7. Parmetros e nveis usados no Planejamento Composto Central Rotacional e para
otimizao produo de cido succnico.
Nveis
Axial
Inferior
CP
Superior
Axial
2.5
1.0
0.0
1.5
5.0
2.0
1.0
5.0
7.0
3.0
3.0
10.0
10.0
4.0
5.0
15.0
12.5
5.0
7.0
20.0
Parmetros
(g/L)
K2HPO4
MgSO4
xtrato de levedura
NaHCO3
-1
5
20,0
32
6
100
Nveis
0
+1
8
11
30,0
40,0
37
42
7
8
200
300
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
91
Superfcie de Resposta (MSR), atravs do Software Statistic 5.0 (Statsoft Inc. 2335, Easth 13th
Street Tusla, OK, 74104, USA), segundo BOX & HUNTER (1978).
4.7. Fermentao em biorreator instrumentado a partir de meio sinttico
Para a realizao das fermentaes sob condies controladas foi utilizado um
biorreator do modelo Biostat (B. Braun Biotech International - Alemanha), agitado
mecanicamente (Figura 4.5), empregando um vaso reacional de 2L, contendo 600 mL de meio
de
fermentao.
Os
experimentos
conduzidos
em
batelada
foram
controlados
foi
conduzido, sob as mesmas condies, para avaliar a influncia do suprimento externo de CO2,
atravs de uma distribuio constante de fluxo a 0,05 vvm. A operao em batelada foi
conduzida com as variveis significativamente mais favorveis produo de cido succnico,
de acordo com os experimentos em frascos agitados. O meio de fermentao (Tabela 4.9), foi
preparado com 22, 52 e 80 g/L de xilose, simulando os valores de concentrao utilizadas
conduo dos experimentos de fermentao em meio contendo hidrolisado. Para o incio do
processo foram inoculadas aproximadamente 3,0 g/L de clulas concentradas, aps
centrifugao (6000 rpm/ 10 min) e separao do sobrenadante.
Figura 4.5. Biorreator BIOFLO III (New .Brunswick) utilizado na produo de cido succnico
Concentrao
(g/L)
5.0
3.0
NaHCO3
10.0
K2HPO4
1.5
* As concentraes de xilose para cada ensaio foram: 22,0; 52.0 e 80,0 g/L.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
92
Figura 4.6. Etapas do pr-tratamento cido: Bagao in natura (a), Exposio do bagao ao cido
(b,c), Distribuio em frascos (d), Tratamento trmico em autoclave (e), Distribuio em prensa
hidrulica (f), Prensagem para separao do bagao acidificado (celulignina) (g) da frao
hemicelulsica (h).
----
93
Figura 4.7. Etapas do tratamento alcalino: Celulignina sendo pesada (a,b); Tratamento alcalino
com NaOH diludo (c); Tratamento trmico em autoclave (d); Celulignina obtida/licor alcalino (e);
Separao em prensa hidrulica(f), Sequncia de lavagens at clarificao da gua utilizada para
remoo da lignina (h).
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
94
Figura 4.8. Aspecto da celulignina aps a deslignificao (a); aps a adio de enzimas e meio (b)
e aspecto aps a pr-hidrlise enzimtica em frascos agitados (c).
Figura 4.9. Celulignina aps deslignificao (a), aps a pr-hidrlise em frascos (b) e aps a prhidrlise enzimtica em biorreator (c).
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
95
operados com variao da concentrao (1,0; 2,0; 3,0 e 4,0 g/L), para avaliao da
concentrao final de cido succnico e, posterior validao em biorreator.
4.9.3. Processo SSF em biorreator
Os ensaios de fermentao foram realizados em biorreator (BIOFLO III, New
Brunswick), com volume nominal de 1,5 L. O processo foi operado com um volume de meio
para fermentao de 600 mL, sob as mesmas condies anteriores, aps inoculao de
aproximadamente 3,0 g/L de clulas.
Adicionalmente, foi realizada uma fermentao em meio sinttico visando padronizar
uma referncia de comparao com o processo SSF. Neste caso o meio de fermentao foi
preparado simulando a composio em glicose obtida aps a pr-hidrlise enzimtica, de
aproximadamente 81 g/L. A composio de meio utilizado, a exemplo da fermentao a partir
do hidrolisado, foi previamente otimizado por planejamento experimental DCCR para glicose
como fonte de carbono, resultando na mesma composio anterior: K2HPO4, 5.0 g/L; MgSO4,
2.0 g/L, extrato de levedura, 3.0 g/L e NaHCO3; 10 g/L. Cabe ressaltar que todos os
experimentos atravs do processo SSF foram conduzidos com fluxo contnuo de suprimento
externo de CO2 meio de fermentao, a 0,05 vvm.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
96
resoluo das equaes diferenciais ordinrias do modelo foi usado, a exemplo dos modelos
encontrados na literatura, o mtodo de Runge-Kutta de 4a ordem (LUNELLI & MACIEL, 2007).
m S
( S + K S + ( S 2 / K I ))
(Equao 4.1)
Onde,
m : taxa de crescimento especfico mximo (h-1),
S : concentrao de substrato (g/L),
KS : constante de saturao do substrato (g/L),
KI : constante de inibio do substrato (g/L)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
97
Dessa forma, para valores de P< PCRIT, a equao anterior pode ser representada da
seguinte maneira:
m S
P
1
2
( S + K S + ( S / K I )) PCRIT
(Equao 4.2)
= Kd ,
(Equao 4.3)
Onde,
m : taxa de crescimento especfico mximo (h-1),
S : concentrao de substrato (g/L),
P : soma das concentraes dos produtos (g/L),
PCRIT : soma das concentraes crticas dos produtos na qual o crescimento celular cessa
totalmente (g/L),
Kd : taxa especfica de morte (h-1), e
X : concentrao de biomassa (g/L).
A bactria A. succinogenes produz o cido succnico como produto principal na
fermentao e, simultaneamente, formam-se os cidos actico, frmico e ltico como
subprodutos (GUETLER et al., 1999). Considerando a soma dos produtos formados e valores
de P > PCRIT, de acordo com a equao anterior, o perfil cintico o crescimento pode ser
representado atravs das seguinte expresso:
m S
P
rX =
2
P X
S
K
S
K
(
+
+
(
/
))
S
I
CRIT
(Equao 4.4)
rX = K d X
(Equao 4.5)
rP = P rX + P X
(Equao 4.6)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
98
rS =
1
1
1
1
1
rX +
rAS +
rAA +
rAF +
rAL + mS X
YX
YAS
YAA
YAF
YAL
(Equao 4.7)
Sendo, rS a taxa de consumo de substrato (glicose), dado em g/L.h; YX, YSA, YAA,
j=1
j=1
(Eq. 4.8)
j=1
4.11. Amostragem
Em todos os experimentos foram retiradas alquotas de 2 mL, em mdia, a cada trs
horas, com auxlio de pipetas estreis do mesmo volume. As amostras eram centrifugadas a
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
99
12000 rpm durante 10 minutos, sendo o sobrenadante destinado para dosagens de acares
e produtos, aps de filtrao em membrana de celulose com uma porosidade de 0,22 m.
O sedimentado foi lavado e completado at 2 mL com gua destilada e homogeneizado
em agitador tipo vortex, para promover a ressuspenso das clulas antes da quantificao.
Todos os procedimentos de amostragem foram conduzidos com rigor assptico, em cabine de
fluxo laminar. A Figura 4.10 apresenta um diagrama de blocos com a metodologia utilizada
para o processamento das amostras.
Amostra
Sobrenadante
Filtrao em
membrana de 0,22 m
Centrifugao
12000 rpm/15
Sedimento
Lavagem
c/ gua destilada
Diluio
Diluio
Dosagem de acares e
produtos em HPLC
----
100
X=(0,331*Abs)*fd
(Equao 4.9)
Onde,
X = concentrao celular em peso seco (g/L) a 600 nm;
Abs = absorvncia em 600 nm;
fd = fator de diluio empregado na soluo.
As concentraes de cido succnico, cido actico, cido ltico e cido frmico (Figura
4.11), foram determinadas por CLAE em cromatgrafo Waters (Sistema de bombeamento
modelo 510, injetor Rheodyne), acoplado a uma coluna C18 (250mm x 4,6 mm, 9 m; StrodsII
Peek), com ndice de deteco no UV, 210 nm, prpria para quantificao de cidos
orgnicos. As condies operacionais utilizadas para as anlises encontram-se na Tabela
4.11..
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
101
Conc . da amostra =
diluio
(Equao 4.10)
4.12.3. Medida do pH
O pH do meio livre de clulas foi determinado utilizando o potencimetro da Marca
Digimed, modelo MS-21, na temperatura de 25C.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
102
Clculo de eficincia :
(Equao 4.11)
Onde, Yp/s (Terico) para glicose = 1,12 g.g-1,
Yp/s (Terico) para xilose = 1,34 g.g-1
(MMGl) Massa molecular da glicose = 180 g
(MMXl) Massa molecular da xilose = 150 g
(MMAS) Massa molecular do cido succnico = 118,09 g
4.13.2. Taxa instantnea especfica de crescimento microbiano
Durante o intervalo de tempo (dt), o aumento de nmeros de microrganismos (dx), na
fase exponencial, onde as clulas absorvem os nutrientes, sintetizando seus constituintes,
crescendo e se duplicando, pode ser representado por:
1 dX
dX
= X = .
dt
X dt
= d.
[ ]
LnX 1
T
dt
(Equao 4.12)
qp =
1 dP
.
X dt
qs =
1 dS
.
X dt
(Equao 4.13)
tg = Ln 2 / m
td = 0,693/
(Equao 4.14)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
103
Y P / S = (P S ) = (P Po
) (S o
S)
(Equao 4.15)
Sendo:
P:
Po:
S:
So:
YX
/ S
= (X S ) = ( X X o
) (S o
S)
(Equao 4.16)
Sendo:
X:
Xo:
S:
So:
(P
Po
(Equao 4.17)
Sendo:
P:
Po:
tf:
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
104
CAPTULO 5
RESULTADOS E DISCUSSO
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
105
Figura 5.1. Nmero de patentes (Patent) e Trabalhos publicados (Article), sobre a produo
de cido succnico, at o ano de 2010. Fonte: ScienceFinder (2011)
Em 2003, foi depositada a primeira patente abordando o tema aproveitamento de
materiais lignocelulsicos, com os resultados obtidos por LEE et al. (2003). Em 2006, os
estudos envolvendo o uso de microrganismo geneticamente modificado (E.coli), para
produo de cido succnico, foram patenteados por BENNET et al. (2006). Em 2009 podem
ser encontrados os trabalhos patenteados por LAURENTE & BENNET (2009), que
apresentaram um review, abordando os diversos processos j estudados para a produo de
cido succnico; os resutados obtidos por LEE et al. (2009), onde foram realizadas
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
106
Figura 5.2. Peridicos com maior nmero de publicaes (a) e os temas mais estudados (b),
at o ano de 2010. Fonte: ScienceFinder (2011)
Entre outras informaes, como nome de autores e regies (pases, universidades)
com maior quantidade de publicaes (artigos, patentes e teses), o software tambm
apresenta os temas mais recorrentes acerca desta temtica, onde a rea de processos
fermentativos e o uso de Actinobacillus succinogenes encontram-se entre os mais discutidos
na literatura.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
107
a)
b)
Figura 5.3. Observao microscpica das linhagens com aumento de 1000 vezes. a)
Actinobacillus succinogenes CIP 106512; b) Actinobacillus succinogenes 130Z (DATTA, 1992)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
108
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
25
10
20
15
10
Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)
Glicose (g/L)
109
0
0
10
15
20
Tempo (h)
Glicose
c. Succnico
Biomassa
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
110
25
Xilose (g/L)
4
15
3
10
2
5
Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)
20
0
0
10
15
20
Tempo (h)
Xilose
c. Succnico
Biomassa
Figura 5.5. Cintica de crescimento do inculo (A. succinogenes CIP 106512) em meio sinttico,
para xilose (20 g/L)
25
Glicose (g/L)
4
15
3
10
2
5
Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)
20
0
0
10
15
20
Tempo (h)
Glicose
c. Succnico
Biomassa
Figura 5.6. Cintica de crescimento do inculo (A. succinogenes CIP 106512) em meio sinttico,
para glicose (20 g/L)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
111
hemicelulsica,
oriunda
do
pr-tratamento
de
biomassa
residual
de
composio
lignoeclulsica.
Figura 5.7. Cintica de crescimento do inculo (A. succinogenes CIP 106512) contendo
hidrolisado diludo
Para o crescimento celular, tambm foi observado um tempo maior para atingir a
estabilizao, de aproximadamente 18 horas. Aps esse perodo as concentraes de cido
succnico e biomassa foram de 5,3 g/L e 1,0 g/L, respectivamente.
Na Tabela 5.1 esto sumarizados os resultados mais relevantes obtidos com o
processo do crescimento celular (inculo), analisados no final da fase exponencial de
crescimento, para cada ensaio, durante o processo de fermentao proposto por um perodo
de 24 horas de processo.
Tabela 5.1. Parmetros relevantes nos processos de propagao de clulas de A.
succinogenes CIP 106512 (cultivo de inculo) obtidos com um tempo total de fermentao de
24 horas.
Processo
S0
(g/g)
T
(h)
X
(g/L)
x
(h1)
td
(h)
*QP
(g/L.h)
YP/S
(g/g)
YX/S
(g/g)
AS
(g/L)
Cultivo de Ativao
em Meio Sinttico
(Glicose)
21,5
24
0,82
0,186
3,72
0,346
0,454
0,0396
4,16
Inculo em Meio
Sinttico (Glicose)
21,0
24
0,98
0,273
2,53
0,415
0,240
0,0476
4,98
Inculo em Meio
Sinttico (Xilose)
20,9
24
1,2
0,305
2,13
0,433
0,261
0,0462
5,20
Inculo em
Hidrolisado Diludo
22,0
24
0,9
0,278
2,49
0,378
0,252
0,0379
5,30
*O tempo utilizado como base de clculo para obteno do valor de produtividade refere-se ao
tempo de esgotamento total da fonte de carbono, necessrio para obteno do valor mximo de
concentrao final de cido succnico (AS) e crescimento celular, em cada perfil descrito.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
112
Na Figura 5.8 apresentado o perfil cintico para fermentao em meio sinttico, que
foi utilizado como referncia para as fermentaes realizadas em presena do hidrolisado, ou
seja, com concentrao inicial de xilose de aproximadamente 52 g/L. O esgotamento da fonte
de carbono ocorreu aps 22 horas, com uma concentrao final de cido succnico igual a
15,5 g/L, com concentrao celular de aproximadamente 2,8 g/L.
60
25
20
40
15
30
10
20
5
10
0
Biomassa (g/L)
c. Succnico (g/L)
Xilose (g/L)
50
0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
Xilose
Biomassa
c. succnico
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
113
60
20
50
Xilose (g/L)
B io m a ssa (g/L)
3
2
40
30
20
10
10
20 30
Tempo (h)
40
50
15
10
5
0
10
20
30
40
Tempo (h)
50
10
20 30 40
Tempo (h)
50
Figura 5.9. Perfil de crescimento celular (a), de consumo de xilose (b) e de formao de produto
(c), em fermentaes de hidrolisado hemicelulsico utilizando clulas previamente cultivadas em
diferentes estratgias de propagao: aclimatao celular em duas etapas, com 25 e 50% de
hidrolisado (); uma etapa, 25% de hidrolisado () e no aclimatadas ()
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
114
*tf
(h)
P
(g/L)
X
(g/L)
51,0
48
10,0
2,3
50,5
36
12,0
49,8
28
Em Meio Sinttico
51,4
26
Fermentao
**YP/S
(g/g)
**YX/S
(g/g)
QP
(g/L.h)
0,195
0,014
0,20
2,7
0,259
0,024
0,33
16,0
3,4
0,330
0,033
0,61
15,0
2,8
0,284
0,020
0,67
----
115
xilose
1,4
glicose
Biomassa (g/L)
1,2
1
0,8
0,6
0,4
0,2
0
2,5
5 7,5
15 17,5 19,4
20 22,5
30 32,5
35
2,6 5,2
7,4 10
9,7 12,5
13 16,2
22,7 25
25 27,5
27 29,1
32 35,1
Relao C:N
----
116
Valores ligeiramente maiores do que estes foram encontrados por Gonzales et al.
(2008), porm semelhantes. Os autores encontram at 1,6 g/L de biomassa ao realizar os
ensaios com xilose. Pode-se notar que uma reduzida quantidade de nitrognio nos ensaios
com elevadas razes C:N no limitou o crescimento bacteriano, sinalizando para uma maior
influncia por parte da fonte de carbono em relao a fonte de nitrognio (MADIHAH et al.,
2001). HEERDE & RADLER (1978) investigaram a produo de cido succnico, sob
condies anaerbicas, atravs de Saccharomyces cerevisiae, e verificaram que as fontes de
nitrognio tiveram maior influncia sobre a converso de glicose em cido succnico.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
117
N.E
Glicose
e
Xilose
(g/L)
Biomassa (g/L)
C:N
1
4,0
2,6:1
2
8,0
5,2:1
3
10,0
6,5:1
4
15,0
9,7:1
5
20,0
13:1
6
25,0
16,2:1
7
30,0
19,4:1
8
35,0
22,7:1
9
45,0
29,1:1
10
55,0
35,1:1
N.E: Nmero de ensaios
Xilose
0,5
1,17
1,16
1,3
1,2
1,22
1,24
1,3
1,15
1,2
Glicose
0,3
0,72
1,16
1,14
1,3
1,15
1,29
1,25
1,2
1,18
cido succnico
(g/L)
Xilose
1,7
3,2
5,3
5
6,5
6
5,7
6,1
5,3
7,5
Glicose
1
2,6
4,8
5
5,7
5,5
5,2
5,8
4,9
4,4
Pode-se verificar ainda que, na maioria dos ensaios, houve um sinergismo entre o
crescimento celular e a produo do cido succnico. Estes resultados mostram que os limites
tolerveis de C:N para o mximo crescimento celular apresentam uma ampla faixa,
possibilitando o uso de diferentes razes C:N (WU et al., 2004), confirmando a adequao da
linhagem face utilizao diversas fontes de carbono, como xilose e glicose.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
118
Adicionalmente, as Figuras 5.13 e 5.14, mostram os efeitos das diferentes relaes C:N
na produo cido succnico, para xilose e glicose, respectivamente.
8
xilose
glicose
c. succnico (g/L)
6
5
4
3
2
1
0
2,6 5,2
7,4 10
9,7 12,5
13 16,2
17,5 20
19,422,5
22,725
25 27,5
27 29,1
32 35,1
2,5
5 7,5
15 17,5
30 32,5
35
Relao C:N
Figura 5.13. Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a concentrao final de cido succnico
8
xilose
c. succnico (g/L)
glicose
6
5
4
3
2
1
0
2,6
2,5
5,2
5
6,2
6,5
9,7
10
13
12,5 16,2
15
19,4
20
22,7
25
29,1
30
35,1
35
Relao C:N
Figura 5.14. Efeitos de diferentes fontes de carbono sobre a concentrao final de cido succnico
Foi possvel concluir que o crescimento celular e a produo de cido succnico foram
reduzidos em presena de glicose, com concentrao acima de aproximadamente 40 g/L. Os
resultados obtidos esto de acordo com as afirmaes reportadas na literatura, a respeito da
habilidade da bactria A. succinogenes para a produo de cido succnico a partir de uma
variedade de substratos, como celobiose, frutose, galactose, lactose, maltose, manitol,
manose, sorbitol, glicose, xilose e sacarose, em condies adequadas de processo
(GUETLER et al., 1998).
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
119
1
2
3
4
5
6
7
8
9 (PC)
10 (PC)
11 (PC)
K2HPO4
(g/L)
MgSO4
(g/L)
0.0
10.0
0.0
10.0
0.0
10.0
0.0
10.0
5.0
5.0
5.0
0.0
0.0
2.0
2.0
0.0
0.0
2.0
2.0
1.0
1.0
1.0
C
Extrato de
Levedura
(g/L)
0.0
0.0
0.0
0.0
5.0
5.0
5.0
5.0
2.5
2.5
2.5
Resposta
D
NaHCO3
(g/L)
0.0
10.0
10.0
0.0
10.0
0.0
0.0
10.0
5.0
5.0
5.0
cido succnico
(g/L)
5.53
4.74
8.36
5.96
7.66
4.96
6.08
9.02
7.16
7.58
7.23
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
120
Tabela 5.5. Matriz experimental do PFF 24-1 e concentrao final de cido succnico, para
glicose como fonte de carbono
Parmetros e nveis reais
Ensaios
1
2
3
4
5
6
7
8
9 (PC)
10 (PC)
11 (PC)
K2HPO4
(g/L)
MgSO4
(g/L)
0.00
10.00
0.00
10.00
0.00
10.00
0.00
10.00
5.00
5.00
5.0
0.00
0.00
2.00
2.00
0.00
0.00
2.00
2.00
1.00
1.00
1.0
C
Extrato de
Levedura
(g/L)
0.00
0.00
0.00
0.00
5.00
5.00
5.00
5.00
2.50
2.50
2.5
Resposta
D
cido succnico
(g/L)
NaHCO3
(g/L)
0.00
10.00
10.00
0.00
10.00
0.00
0.00
10.00
5.00
5.00
5.0
4.06
3.21
6.83
4.43
6.13
3.43
4.55
7.49
6,15
6.38
6,12
A anlise estatstica dos modelos foi realizada usando ANOVA. Os valores obtidos
mostram que a concentrao de cido succnico variou de 4.74 a 9.02 g/L e 3,21 a 7,49 g/L
para os ensaios conduzidos a partir de xilose e glicose, respectivamente.
Para as duas fontes de carbono, os resultados apresentaram comportamento
semelhante. As maiores concentraes de cido succnico tiveram como caracterstica a
presena de NaHCO3 no meio de fermentao. No caso do experimento 2, onde tambm foi
utilizada NaHCO3, a baixa concentrao de cido succnico pode ser explicada pela ausncia
tanto de extrato de levedura como de MgSO4.
Nas fermentaes em que foi utilizado extrato de levedura, a concentrao de cido
succnico esteve acima de 7,0 e 6,0 g/L (experimentos 3, 5, 8, 9 e 10) para xilose e glicose,
respectivamente; exceto para os ensaios de nmero 6. Nesses experimentos, apesar de ter
sido utilizado o maior nvel de extrato de levedura, a ausncia de MgSO4 e NaHCO3 pode ter
levado baixa concentrao de cido succnico obtida, sinalizando para a importncia de
interao entre estes componentes do meio.
Concentraes acima de 5,96 e 4,43 g/L (xilose e glicose) de cido succnico foram
obtidas sempre que a soluo de MgSO4 foi adicionada ao meio de fermentao, com
exceo do experimento 5. No entanto, para este ensaio, o extrato de levedura e NaHCO3
estiveram presentes em nveis superiores. Os maiores valores de concentrao final de cido
succnico (9,02 e 7,49 g/L para xilose e glicose, respectivamente) foram obtidos coma adio
de todos os nutrientes nas dosagens estimadas em nvel superior (ensaio 8): K2HPO4, 10.0
g/L; MgSO4 2.0 g/L; extrato de levedura 5.0 g/L e NaHCO3 10.0 g/L.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
121
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
122
Tabela 5.6. Anlise de varincia (ANOVA) da concentrao de cido succinico, no PFF 241
para xilose como fonte de carbono
Efeito
Modelo
SM
DF
QM
F valor
p>F
18.0797875
1.80797875
29.85843805
.. < 0.0001
1.9110125
1.9110125
19.49093364
0.1159
3.0876125
3.0876125
47.64834105
0.0916
2.9701125
1.9701125
41.40297068
0.0982
7.7815125
7.7815125
120.0850694
0.0579
AB
0.8385125
0.8385125
12.94000772
0.1726
AC
2.4090125
2.4090125
31.17611883
0.0922
AD
0.0820125
0.0820125
1.265625
0.4626
Curvature
1.3140625
1.3140625
30.27874228
0.0952
Lack of Fit
45.641850
4.564185
27.43712
0.1204
Pure Error
1.5634
0.0648
Cor Total
19.04526
19
Tabela 5.7. Anlise de varincia (ANOVA) da concentrao de cido succinico, no PFF 241
para glicose como fonte de carbono
Efeito
SM
DF
QM
F valor
p>F
Model
21,6841796
2,16841796
39,48785425
<0.0001
2,4875931
2,4875931
29,49093364
0.1035
4,0578431
4,0578431
47,64834105
0.0816
2,8549831
2,8549831
42,45687068
0.0956
9,1205431
9,1205431
131,0845264
0.0542
AB
0,9452131
0,9452131
12,94000772
0.1978
AC
3,5589231
3,5589231
39,58611883
0,0987
AD
0,0975231
0,0975231
1,265625
0.5246
Curvature
1.3140625
1.3140625
40,1568944
0.0862
Lack of Fit
50,489560
5,048956
29.45268
0.1845
Pure Error
1.35764
0.0881
Cor Total
20,145878
19
----
123
Figura 5.15. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, de acordo com a soma
quadrtica (Sum of Squares), do PFF 24-1 para xilose (a) e glicose (b), respectivamente,
considerando o intervalo de confiana de 90% (p<0,1). A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de
Levedura, D: NaHCO3.
----
124
Figura 5.16. Diagrama de Pareto para o efeito estimado das variveis sob a concentrao final de
cido succnico, pelo PFF 24-1, considerando o intervalo de confiana de 90% (p<0,1). A: K2HPO4,
B:MgSO4, C: Extrato de levedura, D: NaHCO3.
----
125
----
126
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
127
Tabela 5.8. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos de K2HPO4, MgSO4, extrato
de levedura e NaHCO3 na concentrao final de cido succnico, para xilose como fonte de
carbono
Parmetros e nveis reais
A
B
C
D
Ensaios
Extrato de
K2HPO4 MgSO4
NaHCO3
levedura
(g/L)
(g/L)
(g/L)
(g/L)
1
5.0
4.0
3.0
5.0
2
5.0
2.0
3.0
10.0
3
10.0
3.0
5.0
15.0
4
10.0
3.0
1.0
15.0
5
7.5
2.0
0.0
10.0
6
7.5
4.0
3.0
1.5
7
5.0
4.0
1.0
5.0
8
7.5
2.0
3.0
10.0
9
10.0
2.0
1.0
15.0
10
10.0
1.0
5.0
15.0
11
10.0
4.0
5.0
5.0
12
10.0
3.0
1.0
5.0
13
12.5
4.0
3.0
10.0
14
10.0
4.0
3.0
20.0
15
5.0
2.0
5.0
15.0
16
7.5
2.0
3.0
10.0
17
7.5
3.0
3.0
10.0
18
5.0
4.0
1.0
15.0
19
5.0
3.0
5.0
5.0
20
7.5
3.0
5.0
5.0
21
5.0
4.0
1.0
5.0
22
10.0
3.0
1.0
5.0
23
2.5
2.0
3.0
10.0
24
5.0
2.0
1.0
15.0
25
5.0
3.0
5.0
15.0
26
7.5
3.0
7.0
10.0
27
7.5
2.0
3.0
10.0
28 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
29 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
30 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
Total: 27 ensaios com 3 repeties do ponto central - PC
Resposta
cido Succnico
(g/L)
11.55
12.85
11.12
11.42
6.04
10.45
10.26
9.42
9.10
8.45
12.15
12.10
12.27
12.45
7.85
7.12
12.20
12.41
11.02
10.78
7.56
10.23
8.86
6.54
7.45
11.24
9.25
10.15
11.23
11.12
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
128
Tabela 5.9. Matriz experimental do DCCR investigando os efeitos de K2HPO4, MgSO4, extrato
de levedura e NaHCO3 na concentrao final de cido succnico, para glicose como fonte de
carbono
Parmetros e nveis reais
A
B
C
D
Ensaios
Extrato de
K2HPO4 MgSO4
NaHCO3
levedura
(g/L)
(g/L)
(g/L)
(g/L)
1
5.0
4.0
3.0
5.0
2
5.0
2.0
3.0
10.0
3
10.0
3.0
5.0
15.0
4
10.0
3.0
1.0
15.0
5
7.5
2.0
0.0
10.0
6
7.5
4.0
3.0
1.5
7
5.0
4.0
1.0
5.0
8
7.5
2.0
3.0
10.0
9
10.0
2.0
1.0
15.0
10
10.0
1.0
5.0
15.0
11
10.0
4.0
5.0
5.0
12
10.0
3.0
1.0
5.0
13
12.5
4.0
3.0
10.0
14
10.0
4.0
3.0
20.0
15
5.0
2.0
5.0
15.0
16
7.5
2.0
3.0
10.0
17
7.5
3.0
3.0
10.0
18
5.0
4.0
1.0
15.0
19
5.0
3.0
5.0
5.0
20
7.5
3.0
5.0
5.0
21
5.0
4.0
1.0
5.0
22
10.0
3.0
1.0
5.0
23
2.5
2.0
3.0
10.0
24
5.0
2.0
1.0
15.0
25
5.0
3.0
5.0
15.0
26
7.5
3.0
7.0
10.0
27
7.5
2.0
3.0
10.0
28 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
29 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
30 (CP)
7.5
3.0
3.0
10.0
Total: 8 ensaios com 3 repeties do ponto central - PC
Resposta
cido Succnico
(g/L)
9,55
10,86
9,02
9,31
5,07
8,42
8,23
7,31
7,01
6,44
10,05
10,00
10,10
10,41
5,94
5,13
10,14
10,40
9,04
8,67
5,75
8,25
6,78
5,47
5,87
9,14
7,62
8,15
8,22
8,10
Corroborando com os resultados obtidos pelo PFF 241, as Tabelas 5.10 e 5.11
mostram que o modelo mais adequado para o ajuste dos fatores, foi Modelo Quadrtico
Reduzido, baseado nos altos valores de R 2, indicando 99 % de viabilidade da resposta, para
ambos os experimentos.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
129
Efeito
SM
Model
149.903075 14
14.9903075
34.81492204
<0.0001
0.88166667 1
0.881666667
0.624275956
0.4418
22.0800164 1
22.0800164
45.63405313
0.0013
8.40166657 1
8.40166657
35.948913221
0.0276
87.1645267 1
88. 1645267
62.42759559
< 0.0001
AB
7.1824
7.1824
5.085595039
0.0395
AC
0.126025
0.126025
10.089233698
0.7693
AD
1.177225
1.177225
20.833550014
0.3757
BC
4.3264
4.3264
33.06336578
0.1000
BD
4.2849
4.2849
8.033981146
0.1020
CD
0.912025
0.912025
0.645771583
0.4342
21.1845416715
1.412302778
3.918699167
35.80263114
0.0486
Residual
DF
QM
F valor
p>F
0.39951
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
130
SM
DF
QM
F valor
p>F
Model
151.17895 14
15,117895
40,17589563
<0.0001
1,04529163 1
1,045289163
0,421589630
0.47859
25,1459564 1
25.14589564
48,24526333
0.00089
9,25487667 1
9,254879667
41.94785966
0.01969
92,154263 1
92,1548263
67,1254896
< 0.0001
AB
8,5479625
8,5479625
6,457812568
0.02147
AC
0,3457894
0,3457894
11,145878962
0.84563
AD
2,2458963
2,2458963
22,0457896
0.47867
BC
6,154889
6,154889
40,147891
0.1000
BD
5,12789
5,12789
39,145789
0.1020
CD
1,120589
1,120589
0,8495662
0,5124
Residual
19,452789 15
1.2145868
Lack of Fit
34,125789
3,4125789
31,4587896
0.0315
Pure Error
4,124566
0.247851
[c. Succnico] = +10.42 +2.48 * A +0.45 * B+0.24 * C+0.67 * D+0.72 * A * B+0.78 * A * +1,04 * A *
D-0.27 * B * C+0.63 * B * D+0.25 * C * D+0.42 * A^2-0.47 * B^2-0.39 * C^2+0.18* D^2
(2)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
131
a)
b)
Figura 5.18. Histograma de influncia das variveis e suas interaes, de acordo com a soma
quadrtica (Sum of Squares), para o DCCR com xilose (a) e glicose (b), respectivamente,
considerando o intervalo de confiana de 90% (p<0,1). A: K2HPO4, B:MgSO4, C: Extrato de
Levedura, D: NaHCO3.
----
132
a)
b)
c)
d)
Figura 5.19. Superfcie de resposta dos efeitos combinados entre os parmetros sobre a
concentrao final de cido succnico, pelo DCCR para xilose, como fonte de carbono. Interao
entre os parmetros AB (a); AC (b); AD (c); BD (d). A:K2HPO4, B: MgSO4, C: extrato de levedura,
D NaHCO3.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
133
a)
b)
c)
d)
Figura 5.20. Superfcie de resposta para os efeitos combinados dos parmetros sobre a
concentrao final de cido succnico, pelo DCCR para glicose como fonte de carbono. Interao
entre os parmetros AB (a); AC (b); AD (c); BD (d). A:K2HPO4, B: MgSO4, C: extrato de levedura,
D NaHCO3.
Mantendo MgSO4 em seu nvel inferior (2.0 g/L) e extrato de levedura no ponto central
(3.0 g/L), o ponto de mximo na concentrao final de cido sucnico pode ser obtido quando
NaHCO3 encontra-se em seu nvel superior (10.0 g/L). Todavia, quando a fermentao ocorre em
presena de nveis elevados de K2HPO4, a concentrao final de cido succnico afetada. Como
todos os nutrientes so necessrios e essenciais para o metabolismo, em concentraes
adequadas, os resultados mostraram a faixa ideal para cada varivel, principalmente do extrato de
levedura (fonte de nitrognio), NaHCO3 (ons sdio e fonte de CO2) e MgSO4 (fonte de magnsio e
enxofre), de forma semelhante ao encontrado por SONG & LEE (2007). LIU et al. (2008)
demonstraram que no houve inibio significativa do crescimento celular ou na produo de
cido succnico por ons de magnsio, em meio contendo K2HPO4 por A. succinogenes
CGMCC1593. Dessa forma, anlise de varincia mostrou que o modelo quadrtico reduzido
escolhido, foi adequado para o ajuste dos dados experimentais, tornando possvel a validao de
resultados em biorreator, segundo condies otimizadas.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
134
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
135
Tabela 5.12. Matriz experimental do planejamento fatorial fracionado PFF 25-1 e resultados
correspondentes para a concentrao final de cido succnico, para glicose como fonte de
carbono, em 24 e 48 horas de fermentao
Ensaios
Glicose
(g/L)
E.L
(g/L)
Temperatura
(C)
pH
Agitao
(rpm)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17 (PC)
18 (PC)
19 (PC)
40
40
40
40
40
40
40
40
20
20
20
20
20
20
20
20
30
30
30
11
11
11
11
5
5
5
5
11
11
11
11
5
5
5
5
8
8
8
42
42
32
32
42
42
32
32
42
42
32
32
42
42
32
32
37
37
37
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
7
7
7
300
100
100
300
100
300
300
100
100
300
300
100
300
100
100
300
200
200
200
c. succnico
(g/L)
24 h
48 h
14,18 13,61
4,72
4,93
8,79
11,34
4,58
4,48
11,30 10,68
4,18
4,16
8,26
12,66
4,47
4,77
10,98 10,60
2,91
3,08
8,08
8,75
4,31
4,74
11,27 11,83
4,58
5,65
8,6
8,72
2,8
2,75
9,65
9,63
8,10
8,44
9,45
10,23
Ensaios
Xilose
(g/L)
E.L
(g/L)
Temperatura
(C)
pH
Agitao
(rpm)
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17 (PC)
18 (PC)
19 (PC)
40
40
40
40
40
40
20
20
20
40
40
20
20
20
20
20
30
30
30
11
5
5
11
11
11
11
11
11
5
5
11
5
5
5
5
8
8
8
32
42
42
42
42
32
42
32
32
32
32
42
32
32
42
42
37
37
37
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
6
8
8
6
8
6
7
7
7
300
100
300
300
100
100
300
300
100
300
100
100
100
300
300
100
200
200
200
c. succnico
(g/L)
24 h
48 h
6,11
5,94
9,98
9,51
5,71
5,62
15,01 15,12
5,25
5,93
10,32 11,00
5,44
5,54
8,51
9,24
6,84
6,2
8,79
9,66
5,00
5,96
12,89 12,16
10,13
9,52
4,33
4,18
10,08 10,06
6,11
10,65
11,08
11,73
10,52
10,23
9,6
9,44
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
136
Com 20 g/L de concentrao inicial de glicose foram obtidos aproximadamente 11,0 g/L
de cido succnico (Tabela 5.12), valor similar ao encontrado por CORONA et al. (2007), de
10,5 g/L, durante 32 horas de fermentao, a 37C, pH 7.0 e 200 rpm.
ISAR et al. (2006), estudando a produo de cido de succinico por E. coli, sob
condies anaerbicas, a partir do Delineamento Composto Central de Faces-centradas
(DCCCF) na avaliao das condies de cultivo, encontraram uma concentrao final de cido
succnico de, aproximadamente, 14 g/L, sob agitao de 250 rpm, em 48 horas, com uma
composio de meio de cultivo que incluia MgCO3 ao invs de NaHCO3.
Foi possvel verificar que as maiores concentraes de cido succnico, acima de 8,08
g/L e 8,51 g/L para glicose e xilose, respectivamente, tiveram como caracterstica o ajuste de
pH para 7,0 ou 8,0 no meio de fermentao. VAN DER WERF et al. (1997) relataram que o
crescimento celular afetado de forma negativa em valores de pH inferiores a 6,0, resultando
em maiores gastos de energia durante as atividades metablicas do microrganismo.
As Tabelas 5.14 e 5.15 apresentam os efeitos das cinco variveis estudadas e seus
respectivos erros, obtidos a partir de anlise estatstica, na concentrao final de cido
succnico, em 24 horas de fermentao para glicose e xilose, respectivamente. Uma
alternativa interessante para simplificar o modelo, realizada com amplo aval da literatura,
consiste em excluir os parmetros com pequena ou nenhuma influncia sobre o resultado do
ajuste final. Com isso teremos um modelo com nmero reduzido de dados, portanto mais
simples, , tambm utilizado por Gonzales & Ubeda (2008), ao qual denominamos Modelo
Reparametrizado Reduzido da tabela ANOVA (RODRIGUES, 2010).
Tabela 5.14. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sob a
concentrao de cido succnico, em 24 horas de processo a partir de glicose.
Parmetros
MDIA
Glicose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
a
p < 0,1
Efeito
7,01
0,22
0,20
3,15
7,25
-0,48
Erro
t(2)
Padro
0,51
14,1
1,57
0,15
1,57
0,06
1,57
2,65
1,57
6,02
1,57
-0,46
p-valor
<0,0001
0,96
0,962
0,0485
<0,0001
0,6015
Pela tabela ANOVA, o ajuste mais adequado com os dados experimentais foi obtido,
novamente, modelo quadrtico reduzido, com valores de R2 iguais a 0.992 e 0,995, erro
padro de 0,51 e 0,58, para glicose e xilose, respectivamente.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
137
Tabela 5.15. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sob a
concentrao de cido succnico, em 24 horas de processo a partir de xilose.
Parmetros
MDIA
Xilose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
a
p < 0.1
Efeito
7,56
0,31
0,29
3,45
7,41
-0,65
Erro
t(2)
Padro
0,58
14,55
2,06
0,19
2,03
0,21
2,06
3,42
2,04
6,57
2,09
-0,63
p-valor
<0,0001
0,97
0,99
0,0416
<0,0001
0,6485
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
138
Tabela 5.16. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sobre a
concentrao de cido succnico como resposta (48h) para glicose
Parmetros
Efeito
MDIA
Glicose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
7,62
-1,42
-1,56
1,30
7,10
-0,90
Erro
t(2)
Padro
0,50
19,48
1,05
-1,06
1,05
-1,42
1,05
1,15
1,05
7,75
1,05
-0,84
p-valor
<0,0001
0,3897
0,2001
0,3112
<0,0001
0,4998
p < 0.1
Tabela 5.17. Efeitos estimados do planejamento fatorial fracionrio PFF 25-1 sobre a
concentrao de cido succnico como resposta (48h) para xilose.
Parmetros
MDIA
Xilose
Extrato de Levedura
Temperaturaa
pHa
Agitao
a
p < 0.1
Efeito
8,52
-1,19
-1,21
1,42
7,22
-0,94
Erro
Padro
0,55
1,12
1,12
1,12
1,12
1,12
t(2)
p-valor
20,12
-1,64
-1,23
1,42
8,06
-0,95
<0,0001
0,3004
0,1102
0,2986
<0,0001
0,5102
Os resultados foram semelhantes aos encontrados por Gonzales & Ubeda (2008) e
mostraram que a produo de cido succnico, no tempo de 48horas, teve influncia positiva
e significativa (p<0.1) apenas do pH inicial, promovendo um aumento na concentrao de
cido succnico de 7,10 e 7,22 g/L para os processos com glicose e xilose, respectivamente.
Assim como ocorrido em 24 horas de fermentao, o extrato de levedura no foi significativo,
alm de gerar efeitos negativos sobre a produo de cido succnico, iguais a -1,56 e -1,21
g/L para glicose e xilose, respectivamente.
O efeito quantitativo estimado que cada uma das variveis possui sobre a concentrao
final de cido succnico, em 24 horas de processo, pode ser visto no diagrama de Pareto
(Figura 5.21), que estabelece do mesmo modo que a tabela ANOVA, quais destes efeitos
encontram-se dentro do grau de confiana estabelecido para a anlise (90%).
Para 24 horas, a ordem dos efeitos, sobre a produo de cido succnico iniciada
pelo pH, seguida da temperatura, fonte de carbono e extrato de levedura, que apresentou
pouca influncia sobre a varivel de resposta. Mesmo que a influncia do extrato de levedura
no seja estatisticamente significativa, de acordo com valores de p, o efeito foi negativo,
indicando uma reduo da concentrao de extrato de levedura (nvel inferior).
.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
139
a)
b)
5-1
----
140
sugere o uso de extrato de levedura em concentraes inferiores, uma vez que os outros
parmetros exercem maiores efeitos sob a concentrao final de cido succnico. Para 48
horas de fermentao, a ordem de efeitos estimados foi semelhante ao caso anterior,
conforme mostra a Figura 5.22, onde o pH foi a varivel de efeito majoritrio, seguido da
temperatura que no foi significativa a p<0,1 mas seu efeito foi positivo, para glicose e xilose,
respectivamente, indicando a conduo do processo em nveis superiores de pH.
a)
b)
5-1
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
141
b)
b)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
142
Resultados
similares
este
foram
observados
durante
estudos
com
M.
----
143
a)
25
10
20
15
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose (g/L)
Xilose
Biomassa
c. Succnico
c. actico
c. frmico
c. ltico
0
0
10
15
20
Tempo (h)
b)
25
10
20
15
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose (g/L)
Xilose
Biomassa
c. Succnico
c. actico
c. frmico
0
0
10
15
20
Tempo (h)
Figura 5.25. Fermentao em meio sinttico, com 22,0 g/L de xilose, sob condies controladas
(37C, pH 7.0, 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b ) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.
----
144
----
145
a)
25
20
Xilose (g/L)
15
15
10
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose
20
Biomassa
c. Succnico
c. actico
c. frmico
c. ltico
0
0
10
15
20
Tempo (h)
b)
20
25
Xilose (g/L)
15
15
10
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose
20
Biomassa
c. Succnico
c. actico
0
0
10
15
20
Tempo (h)
----
146
concentrao inicial de xilose igual a aproximadamente 22 g/L, obtido em meio contendo 25%
de hidrolisado hemicelulsico, suplementado com os mesmos nutrientes essnciais, cuja
composio foi definida aps os estudos de otimizao. Da mesma forma, os ensaios foram
monitorados sob as mesmas condies anteriores. Observando o perfil cintico obtido com os
ensaios, nota-se em ambos os casos, o aparecimento de glicose e arabinose, em pequenas
concentraes, iguais a aproximadamente 1,1 e 3,0 g/L, respectivamente.
a)
14
25
Xilose
20
10
15
10
Biomassa e c. Succnico
e Subprodutos (g/L)
12
Glicose
Arabinose
c. succnico
Biomassa
c. actico
2
c. frmico
0
0
0
10
15
c. ltico
20
Tempo (h)
b)
14
25
12
Xilose
10
15
10
Biomassa e c. succnico
e Subprodutos(g/L)
20
Glicose
Arabinose
Biomassa
c. succnico
4
c. actico
5
2
0
0
10
15
20
Tempo (h)
Figura 5.27. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com concentrao inicial de xilose igual
a 22,0 g/L, sob condies controladas (37C, pH 7.0 , 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b) de
suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.
----
147
hidrximetilfurfural (HMF) 0,55 g/L e furfural 0,09 g/L. CHEN et al. (2010) encontraram
concentraes de inibidores muito prximas: 0,6 g/L HMF; 0.3 g/l de furfural, 1.0 g/L de cido
frmico e 3,4 g/L de cido actico em hidrolisado da fibra de milho com concentrao de
acares redutores totais, igual a 70,0 g/L, durante os estudos para produo de cido
succnico, por A. succinogenes.
Nota-se que, nas primeiras horas de processo, ocorre o esgotamento total de glicose a
uma taxa de consumo igual a 0,36 g/L.h, concomitantemente a uma menor taxa de consumo
de xilose, iguais a aproximadamente 0,20 g/L.h, em ambos os ensaios. Em seguida, a taxa de
consumo de xilose aumentou, gradualmente, para cada ensaio com valores finais a 0,87 e
0,96 g/L.h, num perodo de aproximadamente 24 e 22 horas, em ausncia e presena do
suprimento externo de CO2, respectivamente. A concentrao de arabinose manteve-se
praticamente constante durante todo o processo.
Com relao produo de cido succnico, os valores obtidos para a produtividade
volumtrica, concentrao final e rendimento em produto, apresentaram um aumento de 0,27
para 0,45 g/L.h; de 8,5 para 11,7 g/L e de 0,28 para 0,39 g/g de acordo com as figuras 5.32a e
5.32b, respectivamente. A concentrao de cido actico reduziu de 6,5 para 5,6 g/L do
primeiro para o segundo ensaio, respectivamente. As concentraes finais de cido frmico,
ltico e etanol no primeiro ensaio, foram de 2,4; 0,9 e 0,19 g/L. No houve a formao de
cido ltico e etanol em presena do suprimento externo de CO2.
A Figura 5.28 apresenta os perfis cinticos de fermentao, anteriores aos estudos de
otimizao do processo, para concentrao inicial de xilose igual a 52,0 g/L, em 32 horas de
fermentao, com uma concentrao inicial de clulas de aproximadamente 3,0 g/L.
Novamente, o tempo para o esgotamento total de xilose foi maior no primeiro ensaio
(Figura 5.28a), prximo de 28 horas de fermentao, com formao simultnea dos cidos
actico (5,2 g/L), frmico (3,3 g/L) e ltico (1,0 g/L). Quando o crescimento celular atinge a
fase estacionria, em aproximadamente 24 horas, possvel perceber a continuidade na
formao de acido actico, enquanto as concentraes do cido frmico e cido ltico ficam
constantes.
Para o segundo ensaio (Figura 5.28b) nota-se uma reduo no tempo de esgotamento
de xilose para aproximadamente 24 horas, com crescimento celular contnuo at o final do
processo, alm de uma reduo na concentrao final de cido actico (2,4 g/L).
Os valores encontrados para a concentrao final de cido succnico, rendimento em
produto e de eficincia em relao ao rendimento mximo terico, apresentaram um aumento
de 15,5 para 20,1 g/L, 0,26 para 0,40 g/g e de 19,4 para 29,9%, em ausncia e presena de
suprimento externo de CO2, respectivamente.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
148
60
25
Xilose
50
20
40
Xilose (g/L)
15
30
10
20
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
a)
Biomassa
c. succnico
c. actico
c. frmico
10
c. ltico
0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
b)
60
25
20
Xilose (g/L)
40
15
30
10
20
5
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose
50
c. succnico
Biomassa
c. actico
0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
Figura 5.28. Fermentao em meio sinttico, com 52,0 g/L de xilose, sob condies controladas
(37C, pH 7.0, 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b ) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
149
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
c. succnico
Biomassa
c. actico
c. frmico
c. ltico
etanol
0
0
b)
Xilose
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose (g/L)
a)
10
15
20
25
30
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose (g/L)
Tempo (h)
Xilose
c. succnico
Biomassa
c. actico
c. frmico
0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
----
150
em
duas
etapas
utilizando
hidrolisado,
com
uma
concentrao
de
aproximadamente 3,0 g/L. Os ensaios foram conduzidos por 32 horas, com uma concentrao
inicial de xilose igual a aproximadamente 52 g/L, obtido em meio contendo 50% de hidrolisado
hemicelulsico, suplementado com os nutrientes de composio definida aps os estudos de
otimizao.
Foram observadas concentraes iniciais de glicose e arabinose, em torno de
aproximadamente 2,5 e 8,0 g/L, existentes no hidrolisado. A presena de hexoses como
manose, galactose e glicose, e/ou de pentoses, pode promover uma diminuio na utilizao
da xilose, por preferncia metablica por esses glicdeos. Apesar disso, o consumo de xilose
restabelecido quando esgotados esses glicdeos fermentveis (DU et al., 1994). O consumo
total da glicose ocorreu nas primeiras 3 horas de processo, tempo em que a taxa de formao
de produto aumentada. Aps consumo da glicose, a xilose foi degradada em
aproximadamente 28 horas de processo, como mostra a Figura 5.30a. No foi constatado
nenhum consumo de arabinose com o decorrer do processo.
A concentrao final de cido succnico foi de 18,0 g/L, com uma concentrao final de
clulas igual a 4,4 g/L e valores de rendimento em produto e produtividade volumtrica iguais
a 0,30 g/g e 0,69 g/L.h. Com relao formao de subprodutos, foram encontrados 8,7 g/L
de cido actico, que manteve um aumento at o final do processo, 3,8 g/L para o cido
frmico, que se manteve constante aps 20 horas, 1,2 g/L de cido ltico, cujo aumento foi
detecado quando o crescimento celular entrou atingiu fase de crescimento estacionrio e,
concentrao de etanol prxima de zero.
Para o segundo ensaio, em aproximadamente 24 horas de fermentao, os valores de
concentrao final de cido succnico, concentrao final de clulas, rendimento em produto
(Yp/s) e produtividade volumtrica foram de 23,0 g/L, 4,9 g/L, 0,42 g/g e 1,05 g/L.h,
respectivamente. Estes resultados foram inferiores aos obtidos, no procedimento anterior
(Figura 5.29), possivelmente devido presena de inibidores presentes no hidrolisado. Para
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
151
este caso (presena de suprimento externo de CO2) a concentrao final de cido actico foi
reduzida para 6,6 g/L, sem a formao de cido ltico e etanol.
a)
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Biomassa e c. Succnico
e Subprodutos (g/L)
Xilose
Glicose
Arabinose
c. succnico
Biomassa
c. actico
c. frmico
0
0
0
10
15
20
25
c. ltico
30
Tempo (h)
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Xilose
Biomassa e c. succnico
e Subprodutos(g/L)
b)
Glicose
Arabinose
Biomassa
c. succnico
c. actico
0
0
10
15
20
25
30
Tempo (h)
Figura 5.30. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com concentrao inicial de xilose igual
a 52,0 g/L, sob condies controladas (37C, pH 7.0 , 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b) de
suprimento externo de CO2, a 0,05 vvm.
Resultados semelhantes a
fermentao a partir do soro de queijo, com uma concentrao inicial de lactose igual a 50 g/L,
com suprimento de CO2 a 0,05vvm e concentrao inicial de clulas de 4 g/L, em pH 6.8,
usando a linhagem Actinobacillus succinogenes 130 Z. Porm, as concentraes de
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
152
subprodutos encontradas pelo autor foram maiores, em torno de 8 g/L de cido actico, 5 g/L
de cido frmico, 2,5 g/L de cido ltico e 0,5 g/L de etanol.
A Figura 5.31 apresenta os perfis cinticos de fermentao, em meio de composio de
nutrientes anterior aos estudos de otimizao, para concentrao inicial de xilose igual a 80,0
g/L, em 48 horas de fermentao, com uma concentrao inicial de clulas de
aproximadamente 3,0 g/L.
90
40
80
35
70
30
Xilose (g/L)
60
25
50
20
40
15
30
10
20
Xilose
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
a)
c. succnico
c. actico
c. frmico
etanol
c. ltico
10
Biomassa
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
b)
40
80
35
70
30
60
25
Xilose (g/L)
50
20
40
15
30
10
20
10
0
Xilose
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
90
Biomassa
c. succnico
c. actico
c. frmico
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
Figura 5.31. Fermentao em meio sinttico, com 80,0 g/L de xilose, sob condies controladas
(37C, pH 7.0, 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b ) de suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.
----
153
concentrao final de cido succnico igual a 33,5 g/L e uma produtividade volumtrica em
cido succnico igual a 1,16 g/L.h. Como ocorrido anteriormente, aps um determinado
perodo (22 horas), a concentrao de cido actico continuou aumentando at atingir 10,4
g/L, enquanto os cidos frmico e ltico atingiram 5,8 e 1,85 g/L, respectivamente. O etanol
apresentou uma concentrao baixa de 0,65 g/L.
Para o ensaio seguinte, em presena do suprimento externo de CO2, o tempo de
esgotamento de xilose foi de aproximadamente 28 horas e as concentraes finais de cido
actico e cido frmico foram reduzidas para 3,6 e 0,70 g/L, respectivamente; sem a formao
dos outros subprodutos.
Ao final do processo, foi encontrada uma concentrao final de clulas de
aproximadamente 4,9 g/L, uma concentrao final de cido succnico de 37,6 g/L e uma
produtividade igual de 1,44 g/L.h. Foi possvel observar ainda que, o crescimento celular
alcanado foi menor que os valores obtidos em concentraes iniciais de substrato menores,
denotando inibio do crescimento para concentraes elevadas de substrato.
Segundo
ZHENG et al. (2009), concentraes acima de 80 g/L de xilose, obtida do hidrolisado da palha,
promovem inibio no crescimento celular da bactria A. succinogenes CGMCC1593.
A Figura 5.32 apresenta os perfis cinticos de fermentao, obtidos com os ensaios
aps os estudos de otimizao, com a mesma concentrao inicial de xilose de 80 g/L, sob as
mesmas condies de pH, agitao e temperatura anteriores.
Uma reduo no perodo necessrio para a fermentao, de aproximadamente 4 horas,
em relao ao perfil cintico do ensaio anterior (Figura 5.31) foi observado, enfatizando assim,
a importncia dos estudos realizados para otimizao do processo.
Pela anlise da Figura 5.32, os valores das de concentraes finais de cido actico e
cido frmico foram reduzidos, de 12,1 para 4,3 g/L e de 6,9 para 0,9 g/L, respectivamente.
Em aproximadamente 18 horas de fermentao, a concentrao de cido actico continuou
aumentando, com estabilizao celular em 4,6 g/L. Os valores de concentrao final de cido
succnico, rendimento em produto e produtividade volumtrica apresentaram um aumento, de
38,4 para 42,5 g/L, 0,49 para 0,66 g/g e de 1,40 para 1,80 g/L.h, em 28 e 24 horas de tempo
de fermentao, respectivamente.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
154
a)
90
45
80
40
70
35
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
Xilose (g/L)
Xilose
Biomassa
c. succnico
c. frmico
etanol
c. ltico
c. actico
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
90
45
80
40
70
35
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Xilose
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
Xilose (g/L)
b)
Biomassa
c. succnico
c. actico
c. frmico
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
155
50
80
45
Xilose
40
Glicose
70
35
60
30
50
25
40
20
Arabinose
Biomassa
c. succnico
c. actico
30
20
10
15
c. frmico
10
c. ltico
etanol
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
b)
90
50
80
45
40
70
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
90
35
60
30
50
25
40
20
Xilose
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
a)
Glicose
Arabinose
Biomassa
c. succnico
30
15
20
c. actico
10
c. frmico
10
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
Figura 5.33. Fermentao do hidrolisado hemicelulsico, com concentrao inicial de xilose igual
a 80,0 g/L, sob condies controladas (37C, pH 7.0 , 150 rpm). Ausncia (a) e presena (b) de
suprimento externo de CO2, a 0.05 vvm.
Cabe ressaltar, que o processo se inicia com uma concentrao de cido actico em
torno de 5,0 g/L, presente no hidrolisado hemicelulsico. Verifica-se elevadas taxas de
consumo de glicose, iguais a 1,26 e 1,33 g/L.h, concomitantemente a taxa de consumo de
xilose mais reduzida, iguais a 0,66 e 0,50 g/L.h, na ausncia e presena de suprimento
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
156
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
157
Tabela 5.18. Variveis de resposta obtidos a partir dos processos de fermentao, a partir de
meio sinttico e da frao hemicelulsica do bagao de cana-de-aucar.
Valores mximos
Condies
Processo
de
fermentao
So
(g/L)
tf
(h)
x
(g/L)
P
(g/L)
*QP
(g/L.h)
YP/S
(g/g)
Ef
(%)
x
(g/L)
Ausncia de CO2
Meio
Inicial
Meio
(condies
timas)
P
(g/L)
*QP
(g/L.h)
YP/S
(g/g)
Ef
(%)
Presena de CO2
22.0
24
3,0
6,04
0,25
0,23
17,1
3,5
9,2
0,41
0,36
26,9
52.0
32
4,5
15,5
0,65
0,26
19,4
5,2
20,1
1,00
0,40
29,9
80,0
48
4,4
33,5
1,16
0,42
31,3
4,9
37,6
1,44
0,46
34,3
22.0
24
3,6
10,04
0,47
0,37
27,6
4,15
14,2
0,66
0,57
42,5
52.0
32
5,2
20,5
0,90
0,40
29,9
6,1
25,4
1,21
0,62
46,3
80,0
48
4,6
38,4
1,40
0,49
36,6
5,0
42,5
1,80
0,66
49,3
22.0
24
2,9
8,50
0,27
0,28 20,9
3,2
11,7
0,45
0,39
29,6
52.0
32
4,4
18,0
0,69
0,30 22,4
4,9
23,0
1,05
0,42
31,3
80,0
48
4,1
35,9
1,21
0,45 33,6
4,5
40,3
1,50
0,53
39,6
S0: concentrao inicial de xilose, x: concentrao final de clulas; P: concentrao final de cido
succnico; Qp: produtividade;Yp/s: rendimento em produto; Ef: eficincia em relao ao mximo
terico (Yp/s terico = 1,34g cido succnico/g xilose consumido)
*Varivel de resposta analisada para definir a viabilidade do processo
Hidrolisado
Para os ensaios com 80 g/L de concentrao inicial de xilose inicial, foram obtidos os
melhores resultados para a concentrao final de cido succnico, que aumentou de 33,5 para
42,5 g/L. Para a produtividade, rendimento em produto e eficincia, houve um aumento de
1,16 para 1,80 g/L.h, de 0,42 para 0,66 g/g e de 31,3 para aproximadamente 49,3%, ou seja,
uma diferena total em torno de 22,5%, inferior as diferenas obtidas com os ensaios em
concentraes de 20 e 52 g/L, que aumentaram em torno de 25-27%, na ausncia e presena
de CO2.
No que concerne aos valores de concentrao celular, os acrscimos foram de 3,0 para
4,15; 4,5 para 6,1 e 4,4 para 5,0 g/L, para os ensaios com as concentraes iniciais de 22; 52
e 80 g/L, respectivamente. Tambm foi possvel verificar maiores perodos de fermentao, de
acordo com a concentrao inicial de xilose, influenciando nos valores finais de produtividade
volumtrica.
Os experimentos realizados com o hidrolisado hemicelulsico apresentaram uma
reduo nas concentraes finais de produto em relao aos resultados obtidos em meio
sinttico, alcanando valores iguais a 11,7; 23,0 e 40,3 g/L, para 22, 52 e 80 g/L de xilose,
respectivamente. Estudos anteriores mostraram que o crescimento celular pode ser reduzido
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
158
pelos inibidores, como furfural, hydrximetilfurfural (HMF) e cido actico, bem como
compostos aromticos oriundos da lignina cida (BETANCUR & PEREIRA, 2010; SAHA,
2003; PALMQVIST & HAHN-HGERDAL, 1999).
No foram realizados estudos sobre a influncia desses inibidores celulares no
crescimento celular e na produo de cido succnico, vislumbrando-se a possibilidade de
trabalhos futuros acerca desse aspecto, segundo metodologias para monitoramento dessas
substncias txicas e possvel remoo, sem acarretar perdas de substrato. Porm, com o
presente trabalho ficou demonstrado possibilidade de desenvolver um eficiente processo de
fermentao a partir da frao hemicelulsica, sem a implementao de etapas de
destoxificao, utilizando apenas aclimatao celular, em etapas suscessivas. Ainda de
acordo com a Tabela 5.18, mesmo havendo uma queda no valor dos resultados a partir do
hidrolisado hemicelulsico, eles se mantiveram superiores aos valores encontrados nos
ensaios realizados antes dos estudos de otimizao para a hierarquizao da influncia dos
componentes presentes no meio de fermentao.
Toda bactria produtora de cido succnico, durante a fermentao, forma uma mistura
de cidos (Tabela 5.19), produzindo quantidades variadas de produto de interesse e de outros
produtos, incluindo cido actico, cido ltico, cido frmico (ZEIKUS et al., 1999).
De acordo com a anlise dos resultados obtidos, a concentrao de subprodutos pode
ser relacionada, principalmente, a trs fatores: a otimizao dos componentes do meio de
cultivo; a utilizao de suprimento externo de CO2 e a concentrao inicial de substrato
(xilose).
A concentrao de subprodutos foi reduzida em presena de suprimento externo de
CO2, ao passo que acrscimos foram alcanados com a concentrao de cido succnico.
Durante a produo de cido succnico, o fosfoenolpiruvato (PEP), um dos intermedirios
centrais durante fermentao de mistura de cidos, convertido por duas enzimas, presentes
no metabolismo de A. succinogenes, chamada PEP carboxiquinase e piruvato quinase (KIM et
al., 2004). PEP carboxiquinase a enzima responsvel por fixar o CO2 covertendo a PEP em
oxaloacetato, induzindo o fluxo para formao de cido succnico (LEE et al., 1999). Na
ausncia de CO2 (Figura 2.16), a piruvato quinase converte PEP a piruvato, que convertido
em subprodutos da fermentao, como o etanol e os cidos actico, frmico e ltico (VAN
DER WERF et al., 1997).
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
159
Condies
(g/L)
Processo de
fermentao
So
(g/L)
Tempo
(h)
AS
AA
AF
AL
Et
AS
Ausncia de CO2
Meio
Inicial
Meio
sinttico
(condies
timas)
Hidrolisado
AA
AF
AL
Et
Presena de CO2
22.0
24
6,04
2,2
1,3
0,67
0,14
9,2
1,2
0,15
---
---
52.0
32
15,5
5,2
3,3
1,0
0,36
20,1
2,4
0,25
---
---
80,0
48
33,5
10,4
5,8
1,85
0,65
37,6
3,6
0,70
---
---
22.0
24
10,0
4,74
1,44
1,1
0,23
14,2
2,0
0,2
---
---
52.0
24
20,5
7,35
4,5
1,4
0,5
25,4
3,1
0,4
---
---
80.0
48
38,4
12,1
6,9
2,2
0,8
42,5
4,3
0,9
---
---
22.0
24
8,50
6,5
2,4
0,90
0,19
11,7
5,6
0,5
--.
--.
52.0
32
18,0
8,7
5,5
1,2
0,41
23,0
6,6
0,64
---
---
80.0
48
35,9
11,0
5,9
1,96
0,7
40,3
7,8
0,75
---
---
AS: cido succnico, AA: cido actico, AF: cido frmico, AL:cido ltico, Et: etanol
----
160
pela incorporao dos nutrientes essenciais em concentraes adequadas, como por exemplo
componentes como MgCO3 ou NaHCO3, que contribuem para a melhoria na produo de
cido succnico, aliviando uma possvel deficincia mineral (em derivados do trigo, por
exemplo); promovendo a liberao de CO2, ao reagir com os cidos orgnicos produzidos
durante a fermentao (DU et al., 2008).
Para o consumo de substrato, verificou-se que em termos de produtividade e
rendimentos, houve um aumento significativo em 80 g/L, porm grandes diferenas no foram
encontradas ao variar a concentrao de xilose entre 20 e 52 g/L. Para as fermentaes
conduzidas em presena de hidrolisado, o fator crucial foi concentrao inicial de cido
actico (4,0-6,0 g/L, para 20-80 g/L, respectivamente), j presente no hidrolisado, contribuindo
para inibir o crescimento celular e reduzir a formao de cido succnico, embora a
concentrao de subprodutos no tenha apresentado uma diferena significativa dos ensaios
anteriores.
Portanto, alternativas podem reavaliadas a respeito da etapa de pr-tratamento do
bagao de cana-de-aucar, visando uma reduo mais efetiva na concentrao de inibidores.
DAVID & CRISTIAN, (2008) alcanaram este objetivo, mediante adsoro com carvo ativado,
em estudos para produo de cido succnico a partir do hidrolisado da madeira. A tcnica foi
desenvolvida e otimizada previamente por CARVALHEIRO et al. (2005), durante o prtratamento de de gros de cervejaria, para produo de de xilitol a partir de Debaryomyces
hansenii CCMI1941.
Pode-se concluir que os cidos actico e frmico foram os subprodutos principais. LIU
et al. (2008) reportaram que acetato e formato de sdio exercem inibiao mediante
interferncias na membrana transporta de fosfato. O transporte de fosfato pela membrana
celular um processo de transporte ativo, que requer consumo de ATP. A primeira etapa da
gliclise envolve, ento, a produo da substncia glicose-6-fosfato, onde as interferncias
resultam em uma maior exigncia de ATP para manuteno. Essas interferncias podem
acontecer de acordo com a concentrao de subprodutos. Estudos mostram que cerca 2,5 g/L
de cido frmico, pode reduzir at 80% da densidade clular. O cido frmico tem uma
solubilidade similar ao actico, portanto, o mesmo mecanismo de inibio pode ocorrer em
valores baixos de concentrao de cido actico (MAIORELLA et al.,1983).
5.9. Avaliao da produo de cido succnico pelo processo SSF (Simultaneous
Saccharification and Fermentation) em biorreator
O processo SSF vem sendo bastante utilizado, como uma alternativa para obteno de
diversos produtos a partir de fontes renovveis, como etanol (WINGREN et al., 2003;
OHGRENAL et al., 2007 e SANTOS & PEREIRA, 2009), cido lctico (ROMAN et al., 2008;
JOHN et al., 2009) e hidrognio (LI & Chen, 2007). Porm, nenhum estudo foi realizado para o
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
161
c. frmico
c. actico
c. succnico
40
35
30
25
20
15
10
5
0
1.0
2.0
3.0
4.0
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
162
a)
90
45
80
40
70
35
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
Glicose
C elobiose
c. succnico
c. frmico
c. actico
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
b)
90
45
80
40
70
35
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
Glicose
C elobiose
c. succnico
c. frmico
c. actico
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
163
90
45
80
40
70
35
60
30
50
25
40
20
30
15
20
10
10
Glicose
Biomassa, c. succnico
e Subprodutos(g/L)
c. succnico
c. frmico
c. actico
0
0
10
15
20
25
30
35
40
45
Tempo (h)
Figura 5.36. Perfil cintico do processo de fermentao, com uma concentrao inicial de glicose
igual a 81,0 g/L, em biorreator, com concentrao inicial de clulas igual de 3,0 g/L, com
suprimento externo de CO2, a 0,05 vvm.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
164
----
165
cido ltico e etanol no foram identificados durante todo o processo. Os resultados obtidos a
partir de meio sinttico foram prximos aos valores encontrados por URBANCE et al. (2003),
que obtiveram 35,0 g/L de cido succnico, com concentrao inicial de glicose igual a 65 g/L,
durante fermentao em batelada e uma produtividade inferior, de 0,52 g/L.h.
Valores mximos
Ensaios
S0
(g/L)
Tempo
(h)
tf
(h)
P
AA
AF
x0
(g/L) (g/L) (g/L)
(g/L)
*QP
(g/L.h)
75,0
48
36
1,0
28,6
3,1
1,60
0,81
Frascos Ensaio 2
Agitados
75,0
48
32
2,0
30,4
3,3
1,64
0,98
Ensaio 3
75,0
48
30
3,0
35,1
3,8
1,74
1,21
Ensaio 4
75,0
48
30
4,0
35,7
3,87
1,75
1,23
81,0
48
28
3,0
38,4
4,0
1,81
1,42
4,4
1,88
1,77
Biorreator
81,0
48
24
3,0
41,6
S0: concentrao inicial de xilose, tf: tempo de esgotamento de glicose e mxima concentrao do
produto formado; x0: concentrao inicial de clulas; P: concentrao final de cido succnico; Qp:
produtividade; AA: cido actico, AF: cido frmico
*Varivel de resposta analisada para os estudos da viabilidade do processo
CHEN et al. (2010) alcanaram uma concentrao final de cido succnico, cido
actico, cido frmico e etanol em concentraes iguais a 14 g/L, 7,8 g/L, 1.7 g/L e 5.0 g/L,
durante estudos de fermentao a partir do sake (bebida alcolica japonesa), por A.
succinogenes 130Z, com um rendimento de 0,55 g/g. Os mesmos autores encontraram uma
concentrao de 48 g/L de cido succnico, a partir de estudos de otimizao da hidrlise
enzimtica do sake, durante 51 horas de processo, com concentrao inicial de glicose igual a
63,6 g/L. Porm, a quantidade de nutrientes presentes no sake contribuiu para incrementar o
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
166
seguida,
durante
as
primeiras
fermentaes,
foram
utilizados
recursos
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
167
Tabela 5.21. Resultados finais para a produo de cido succnico, durante as etapas de
ensaios iniciais, planejamentos experimentais seqenciais e validao das condies
otimizadas, em meio sinttico com concentrao de substrato de 20 g/L.
Resultados finais
Condies
Etapas
S0
Glicose
Xilose
(g/L)
Tempo
(h)
P
(g/L)
Yp/s
(g/g)
Ef
(%)
P
(g/L)
Yp/s
(g/g)
Ef
(%)
M.C
20,0
24
4,98
0,24
21,4
5,20
0,26
23,2
F1
20,0
24
5,70
0,27
24,1
6,50
0,28
25,0
P1
20,0
24
7,49
0,34
30,4
9,02
0,36
32,1
P2
20,0
24
10,86
0,49
43,8
12,85
0,51
45,5
P3
20,0
24
10,98
0,50
44,7
12,89
0,52
46,4
F2
20,0
24
12,5
0,55
49,2
14,2
0,57
50,1
Ensaios
iniciais
Otimizao
Validao
MC:Meio de crescimento para inculo; F1: Fermentao para estudo da relao C:N sob crescimento
celular e produo de cido succnico; P1: Planejamento Fatorial Fracionado PFF4-1, P2: Delineamento
Composto Central Rotacional (DCCR); P3:Planejamento Fatorial Fracionado PFF5-1, F2: Validao em
meio sinttico.
*Dados calculados a partir do rendimento terico para cada substrato (Yp/s terico = 1,12g cido
succnico/g glicose consumido; 1,34g cido succnico/g xilose consumido)
O efeito das condies de cultivo do processo, como pH, temperatura e agitao foram
avaliados no planejamento P3, confirmando os melhores valores para conduo de trabalho,
usados no decorrer dos ensaios anteriores, iguais a 37C, 150 rpm e pH 7.0. Os resultados
foram prximos aos obtidos com P2, como era de se esperar. A fermentao (F2) para a
validao das condies otimizadas, resultaram em uma concentrao final de cido succnico
igual 12,5 e 14,2 g/L para glicose e xilose, respectivamente.
Atravs de uma viso geral dos experimentos, foi constatado um aumento na produo
de cido succnico de 19,4 para 42,5% e de 21,4 para 49,2%
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
168
Resultados muito prximos a estes, foram encontrados por LEE et al. (2000) durante
estudos, em condies anaerbicas, com A. succiniciproducens, onde os autores verificaram a
capacidade da bactria de se desenvolver em meio com composio mnima (20 g/L de
glicose), quando suplementado com milhocina (10-15 g/L), como fonte de nitrognio,
resultando em 12,8 g/L de cido succnico.
16
Glicose
14
Xilose
12
10
8
6
4
2
0
MC
F1
P1
P2
P3
F2
Experimentos
Figura 5.38. Evoluo da produo de cido succnico, em meio sinttico com 20 g/L de substrato.
MC:Meio de crescimento para inculo; F1: Fermentao para estudo da relao C:N sob
crescimento celular e produo de cido succnico; P1: Planejamento fatorial fracionado PFF4-1;
P2: Planejamento Composto Central Rotacional (DCCR); P3:Planejamento fatorial fracionado
PFF5-1; F2: Validao em meio sinttico
Resultados muito prximos a estes, foram encontrados por LEE et al. (2000), durante
estudos, em condies anaerbicas, com A. succiniciproducens, onde os autores verificaram a
capacidade da bactria de se desenvolver em meio com composio mnima (20 g/L de
glicose), quando suplementado com milhocina (10-15 g/L), como fonte de nitrognio,
resultando em 12,8 g/L de cido succnico.
----
169
Fermentao
(Condies otimizadas)
Condies
S0
(g/L)
Valores mximos
Tempo
(h)
P
(g/L)
Qp
(g/L.h)
80,0
48
42,5
1,80
Hidrolisado
80,0
48
40,3
1,50
81,0
48
41,6
1,77
SSF
81,0
48
38,4
1,42
Porm, um dos fatores determinantes para a eleio desta bactria, foi pautado,
fundamentalmente em sua tolerncia a elevadas concentraes de substrato. LIN et al. (2008)
estudaram o efeito inibio pelo substrato e pelo produto, sobre o crescimento de
Actinobacillus succinogenes ATCC 55618, em fermentao usando glicose como principal
fonte de carbono e verificaram que o crescimento celular foi completamente inibido com
concentrao de glicose acima de 140 g/L. Cabe ressaltar, que os autores se depararam com
um decrscimo bastante significativo do rendimento e da produtividade, alm de um
prolongamento da fase lag na maioria dos experimentos acima de 70 g/L, ao contrrio do perfil
obtido no presente trabalho. Atravs de estudos cinticos, constataram que as concentraes
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
170
crticas de acetato, etanol, formato, lactato e succinato foram 46, 42, 16, 74 e 104 g/L,
respectivamente. Fenmeno semelhante foi descrito por Guettler et al. (1996) e Liu et al.
(2008), sugerindo que a linhagem em questo poderia tolerar at 160 g/L de glicose inicial,
mas, tambm alcanaram rendimentos e valores de produtividade bastante reduzidos.
Dessa forma, estudos envolvendo a avaliao do comportamento podem facilitar a
compreenso desses fenmenos acerca do metabolismo da bactria Actinobacillus
succinogenes CIP 106512. Uma investigao sistemtica dos efeitos de inibio pelo
substrato e pelo produto , ento, um fator crucial para o desenvolvimento de uma estratgia
de controle efetiva para melhorar a produo de cido succnico.
----
171
AA
0,555
FA
0,590
LA
0
SA
1,436
AA
0,110
FA
0,093
LA
0,186
SA
0,315
YAA
0,887
YFA
1,359
YLA
0,886
YSA
1,162
Kd (h1)
0,009
KS (g/L)
0,996
Ki (g/L)
78,40
mx (h1)
0,883
YX (g g1)
0,678
PCRIT (g L1)
16,29
igual a aproximadamente 20,0 g/L, o valor encontrado para a taxa de crescimento especfico
mximo (mx) alcanado pode ser prximo de 0,883 h1.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
172
onde
ocorre
um
acmulo
de
metablitos
que
acabam
interferindo
Figura 5.39. Avaliao dos efeitos da concentrao inicial de glicose sobre a taxa especfica de
crescimento de A. succinogenes CIP 106512. Dados simulados (-) e experimentais ()
A taxa especfica mxima de crescimento determinada pelo modelo foi mais alta que
valores j reportados na literatura (0.39-0.41 h1) (MCLINKAY et al., 2008) e (0,5 h1 (LIN et
al., 2008). CORONA-GONZALS et al. (2008) encontraram valores para a taxa de
crescimento celular que foi reduzida de 0,41 para 0,09 com o aumento da concentrao inicial
de glicose de 10 para 100 g/L, por A. succinogenes ZT-130, ao estudarem a cintica pelo
modelo proposto por JERUSALIMSKY (1967) para descrever o perfil cintico microbiano e,
Song et al. (2008) encontraram um valor igual a 1,3245 h1, mas a linhagem utilizada foi
diferente daquela usada no presente trabalho.
Baseando-se no valor encontrado de m, pode-se concluir que a bactria A.
succinogenes CIP 106512 apresenta um desempenho promissor para a produo de cido
succnico, por fermentao. Esta diferena pode ter sido ocasionada pela composio de
nutrientes do meio, de influncia previamente hierarquizada com os estudos de planejamento.
Com relao aos efeitos de inibio dos cidos orgnicos no crescimento celular, tem sido
reportado na literatura, que existe uma dependncia entre esses efeitos com o pH do meio de
cultura, com a constante de dissociao dos cidos (pKa) e com a concentrao molar dos
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
173
cidos (NARENDRANATH & THOMAS, 2001; VASSEUR et al., 1999). Assim, o termo de
produto nas equaes (4.2 - 4.4) pode ser assumido como sendo a soma das quantidades
individuais de cada cido presente no meio de fermentao, para simplificar o modelo (SONG
et al., 2008). A Figuras 5.40 e 5.41 mostram os perfis de crescimento da bactra A
succinogenes,
Figura 5.40. Perfil cintico de consumo de substrato (), produo de cido succnico () e
crescimento celular (o) em fermentao por batelada simples, por A succinogenes, com
diferentes concentraes inicias de glicose (a) 10 g L1, (b) 20 g L1, (c) 30 g L1, (d) 40 g L1,
(e) 50 g L1e (f) 70 g L1. Dados simulados (linhas) e experimentais (smbolos circulares)
.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
174
Figura 5.41. Perfil cintico da formao dos cidos actico (), frmico () e ltico () durante a
fermentao, por A succinogenes, a partir de diferentes concentraes iniciais de glicose. (a)
10 g L1, (b) 20 g L1, (c) 30 g L1, (d) 40 g L1, (e) 50 g L1e (f) 70 g L1. Dados simulados (linhas) e
experimentais (smbolos).
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
175
Portanto, Isto significa que a produo de cido de succnico por A. succinogenes CIP
106512 segue o modelo proposto por Luedeking-Piret, indicando que a taxa de formao de
produto est relacionada tanto com a taxa de crescimento celular (rX), como tambm com a
concentrao de biomassa (X) (LUEDEKING-PIRET, 1959).
5.12.2. Avaliao e classificao do perfil cintico de formao de produto(s)
De acordo com os grficos os valores preditos pelo modelo apresentaram um ajuste
adequado aos dados experimentais, diminuindo a distncia entre eles. O coeficiente no
associado, para formao de cido succnico (SA = 0.315 h-1), foi determinado quando no foi
identificado nenhum crescimento celular, ou seja, para valores de P PCRIT. J o coeficiente
de crescimento associado foi obtido para valores de P < PCRIT. Os coeficientes para formao
dos subprodutos foram obtidos de maneira semelhante identificao do cido succnico,
atravs da equao 4.6. Estes valores foram muito prximos aos encontrados por SONG et
al.(2008), mostrando que a linhagem M. succiniciproducens possui comportamente
semelhante a bactria A. succinogenes.
Como ocorrido com o perfil para cido succnico, o perfil cintico para formao do
cido actico e cido frmico foi classificado como associado ao crescimento celular, de
acordo com a Figura 5.41. Entretanto, percebe-se que o cido ltico comeou a ser produzido
quando a taxa de crescimento celular foi reduzida, em um perfil tipicamente no associado ao
crescimento. Comportamento diferente deste observado com outros microrganismos, como
Escherichia coli, Lactobacillus, Lactococcus, e Saccharomyces, onde o cido ltico
apresentado como um produto de formao associada ao crescimento, (AKERBERG et al.,
1998; HA et al., 2003; YOUSSEF et al., 2005 e SHULER et al., 1992).
5.12.3. Avaliao e classificao do perfil cintico de consumo de substrato
No ajuste entre os dados simulados e experimentais, para o consumo de glicose, foram
observadas pequenas discrepncias na fase de crescimento estacionrio, que ficaram
ligeiramente maiores, com o aumento das concentraes iniciais de glicose, como mostrado
nas Figuras 5.40 (d-f). Para simplificar o modelo, no foi incorporada a produo de CO2,
pelas clulas, que acontece atravs de reaes de descarboxilao, o que pode ter causado
esta ligeira discrepncia entre os dados analisados. Parte desse carbono tambm liberada
durante a lise celular. Adicionalmente, mudanas na morfologia celular durante a fase de
crescimento estacionrio (DATTA et al., 1992), podem ter resultado esta variao.
Uma
----
176
parmetros
que
determinam
viabilidade
econmica
de
um
processo
----
177
succinogenes CIP 106512 para a produo de cido succnico, a partir de diferentes fontes de
carbono, em meio de composio mnima. Alm disso, o modelo proposto pode ser til para o
desenvolvimento e o aperfeioamento dos processos para a produo de cido succnico a
partir de fontes renovveis.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
178
CAPTULO 6
CONCLUSES
6.1. Concluses
A bactria Actinobacillus succinogenes mostrou-se um microrganismo agente do
processo de produo de cido succnico bastante promissor. Sua habilidade de
consumir os acares que aparecem em maior proporo nos hidrolisados de materiais
lignocelulsicos, aliada a elevada capacidade de produo desse cido orgnico
ficaram
evidenciadas,
gerando
oportunidades
para
futuros
interessantes
desenvolvimentos tecnolgicos;
Nos experimentos iniciais, o tempo de preparo do inculo ficou padronizado entre 12 a
15 horas de cultivo, atravs de monitoramento do perfil cintico. Aps este perodo, a
fermentao ficou caracterizada pelas fases de desacelerao e estacionria do
crescimento celular, para ambas as fontes de carbono utilizadas;
A incluso de duas etapas de aclimatao, durante o processo de propagao celular,
permitiu a reduo do tempo de fermentao em hidrolisado hemicelulsico, com efeito
positivo sobre o valor da produtividade volumtrica, alm de aumentar a produo final
de cido succnico, com uma concentrao muito prxima ao valor obtido em meio
sinttico (diferena de apenas 10 %), o que denota a robustez da bactria face a
utilizao de um hidrolisado contendo agentes txicos .
Os melhores resultados da razo C:N sobre o crescimento celular esto entre 13,0 e
22,7:1. Estes valores representam uma concentrao de nitrognio de 0,65 g/L no meio
de cultivo. A linhagem se desenvolveu adequadamente em concentraes elevadas de
xilose. Porm, para os ensaios com glicose, houve um decrscimo no crescimento
celular, indicando inibio acima de 36,0-40,0 g/L;
Com a aplicao da tcnica de planejamento experimental seqencial foi constatada
uma maior importncia estatstica da interao entre os componentes NaHCO3 e
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
179
MgSO4, com valores de p-level abaixo do estabelecido para a anlise (0,1). O KH2PO4
mostrou um efeito negativo sobre a concentrao final de cido succnico, no entanto
apresentou a menor significncia estatstica entre as variveis analisadas.
O pH mostrou-se uma varivel de elevada importncia estatstica, em ambos os
tempos de fermentao (24 e 48 horas), com aumento do seu valor do nvel inferior
(pH=6.0) para o superior (pH=8.0), conforme j evidenciado por outros autores. A
temperatura tambm apresentou efeito significativo, em 24 horas de fermentao;
As concentraes de glicose e xilose apresentaram um efeito positivo, em 24 horas de
fermentao, porm negativo para 48 horas de fermentao, mas no significativo. A
anlise de varincia (ANOVA) mostrou que o modelo mais adequado para o ajuste dos
dados experimentais foi o modelo quadrtico reduzido, possibilitando a validao das
condies otimizadas, em biorreator;
A produo de cido succnico a partir da frao hemicelulsica do bagao de cana-deacar, resultou em uma concentrao final de produto igual a 40,3 g/L, com 80,0 g/L de
concentrao inicial de xilose, sob agitao de 150 rpm a 37C. Nos ensaios com 80 g/L
enzimtica
25
FPU/g,
concentrao
inicial
de
clulas
de
g/L
----
180
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
181
6.2. Sugestes
Como o desenvolvimento do modelo simples descreveu satisfatoriamente os
comportamentos cinticos do processo, ele poder ser usado para aperfeioar a
produo de cido succnico. Por exemplo, a concentrao tima de substrato (glicose)
pode ser selecionada para alimentar um processo de fermentao contnuo ou em
batelada alimentada. Esta forma de conduo permitiria estender a fase exponencial de
crescimento e controlar os nveis de substrato, evitando assim, os efeitos repressores
sobre o metabolismo da bactria;
Outras concepes podem ser incorporadas ao presente trabalho, como a estratgia
de operao denominada SSCF (Simultaneous Saccharification and Cofermentation SSCF), no qual a co-fermentao se refere fermentao de ambos os acares,
pentoses e hexoses, em uma mesma etapa. Nesta configurao o hidrolisado
hemicelulsico e a celulose no so separados aps a etapa de pr-tratamento,
permitindo que os acares da hemicelulose sejam convertidos a cido succnico
juntamente com a sacarificao e fermentao da celulose;
Verificar a habilidade da bactria Actinobacillus succinogenes face utilizao de
outros aucares como lactose, galactose e maltose, incluindo o uso de reestimao de
resultados, como rendimento e produtiviade, mediante a utilizao de meios de cultivo
mais complexos do que o meio utilizado no decorrer do presente trabalho;
Utilizar a metodologia de Plackett-Burman para a determinao dos parmetros
cinticos do modelo gerado com o presente trabalho e, verificar a influncia destes
sobre os perfis das variveis de estado;
Estudar uma etapa de incluso de membranas de eletrodilise bipolares aps
micro/ultrafiltrao em membranas de fibra oca (hollow fiber), para separao da forma
aninica (succinato) e purificao, seguida de cristalizao;
Caracterizar as membranas com relao aos dados de resistncia, fouling (queda de
fluxo do permeado/retido), temperatura, pH e presso transmembrana durante o
processo de separao.
Realizar balanos de massa e finaceiro visando a o escalonamento do processo,
desenvolvido com o presente trabalho, a partir de estudos de viabilidade industrial.
___________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________________-----------------------------____________________------------------__________________________________________________________________________
----
182
CAPTULO 7
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