FACULTAD DE INGENIERIA AMBIENTAL

MICROBIOLOGIA I

EL MICROSCOPIO
1. OBJETIVOS:

Usar y manejar del microscopio.

Aprender la tcnica de observacin microscpica de microorganismos
en estado fresco.
Aprender las tcnicas de coloracin diferencial de gram.
Visualizar la morfologa, disposicin y agrupacin de los
microorganismos.
Visualizar diferentes tipos bacterianos (Gram+, Gram-) en funcin de la
distinta composicin de su pared bacteriana.

2. FUNDAMENTO TERICO:
En general, todas las bacterias en microbiologa presentan una morfologa y
un tamao muy variables, as como distintos sistemas de agrupacin. El
conocer este tipo de caractersticas propias de cada grupo bacteriano se
consigue por medio de diferentes mtodos de examen, ya sea por estudios en
fresco, en cuyo caso se observan las bacterias vivas o por tincin, que nos
permite una mayor visualizacin y contraste, pero se observan muertas.
En cualquier caso, sea cual fuera la tcnica a realizar, siempre se necesitar
para observar las bacterias la utilizacin del microscopio. Ahora bien, si lo que
se pretende investigar en la bacteria, adems de su morfologa, es su
movilidad, la tcnica a utilizar ser aquella que permita observar al germen in
vivo, es decir, en fresco ya que la mayor parte de las tinciones matan al
microorganismo, lo que imposibilita observar su movilidad.
La microbiologa se ha podido desarrollar a partir de la aparicin y progreso
del microscopio, gracias al cual se pueden visualizar las bacterias. Un
microscopio compuesto, emplea dos sistemas de lentes separadas,
consiguiendo con ello mayores aumentos.
Existen actualmente muchos tipos de microscopios compuestos, pero todos
ellos se basan en los mismos principios. As pues, todo microscopio
bsicamente constar de:

Un sistema ptico que aumenta la imagen.

Un sistema de visualizacin que amplifica adecuadamente dicha
imagen.

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PARTES DEL MICROSCOPIO:

PARTE

MECNICA:
Brazo y pie
tubo porta lente y cremallera
tornillo macro mtrico
tornillo micro mtrico
platina y pinzas
tornillo del condensador
soporte del espejo

PARTE PTICA:
Ocular
Objetivos 10X, 43X, 97X
Espejo con dos caras
Condensador con diafragma
TECNICA DE OBSERVACIN MICROSCPICA DE
MICROORGANISMOS EN ESTADO FRESCO:
Existen muchas especies bacterianas que presentan gran movilidad. Sin
embargo el similar ndice de refraccin entre el medio y stas hace que su
visualizacin al microscopio sea difcil. De ah que se recurra a su estudio
microscpico a travs da tinciones, aunque someter la muestra microbiana a
tincin supone tener que observarlos muertos y no poder conocer si adems
son o no mviles.
Por tanto, si se pretende conocer la movilidad y la disposicin bacteriana en
una muestra es necesario observar los grmenes in vivo. Para ello se deber
partir de cultivos jvenes, que son los que permiten visualizar mejor su
movilidad y realizar preparaciones en fresco.
Consiste en suspender el microorganismo objeto de estudio en agua destilada
o cualquier otro medio lquido transparente colocndolo en un portaobjetos a
fin de poder posteriormente, mediante microscopa, visualizar su morfologa,
disposicin y motilidad.
TECNICA DE COLORACIN DIFERENCIAL DE GRAM:

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Es el mtodo ms empleado en bacteriologa gracias al cual las bacterias se

pueden clasificar en dos grandes grupos (Gram+, Gram-). Este distinto
comportamiento en la tincin de Gram es debido a la distinta composicin de
la pared de las clulas bacterianas. De acuerdo con esto, la tincin de Gram
se va a basar en el empleo de un primer colorante bsico, generalmente
cristal violeta o violeta de genciana, teir de color azul a todas las bacterias.
Posteriormente, un mordiente, el lugol, aumentar la afinidad del primer
colorante a las clulas, es decir, lo fijar; finalmente, un agente decolorante
decolorar un tipo de bacterias que sern teidas con el colorante de
contraste o segundo colorante. Este distinto comportamiento frente a la
decoloracin es dependiente de la composicin de la pared bacteriana, hecho
que servir para clasificarlas como Gram + (aquellas que no han sido
decolorarlas y que por lo tanto quedan teidas con el cristal violeta de color
azul violaco) o como Gram (aquellas bacterias que han sido decoloradas y
son teidas con el colorante de contraste, la safranina; por lo tanto, su color
es rosa-rojo). Bacterilogo dans Christian Gram. 1884, se fundamenta en la
morfologa celular bacteriana.
DIFERENCIACIN DE GRAM POSITIVO Y GRAM NEGATIVO
La pared celular de las bacterias Gram
positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases
de cidos teicoicos: Anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la
membrana plasmtica, se encuentra el
cido lipoteicoico, y mas en la
superficie, elcido teicoico que est
anclado solamente en el peptidoglucano
(tambin conocido como murena).Por el
contrario, la capa de las Gram negativas
tiene
una
capa
delgada
de
peptidoglicano unida a una membrana
exterior por lipoprotenas. La membrana
exterior est hecha de protena,
fosfolpido y lipopolisacarido.
PARED CELULAR
Un microorganismo gran positivo debe presentar una pared celular sana. El
mismo microorganismo Si sufre dao de la pared por una u otra causa se
vuelve gram negativo. Esto indica la importancia de la pared para la retencin
o e escape del colorante.

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QU SUCEDE DURANTE LA TINCION GRAM?

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que
la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglicano
que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo
se escapa, perdindose la coloracin azul- violcea. Pero por lo contrario, las
Gram positivas, al poseer una pared celular mas resistente y con mayor
proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin solvente
orgnico, sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que
impide que pueda escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo
la coloracin azul-violcea.

3. PROCEDIMIENTO:
USO DEL MICROSCOPIO COMPUESTO:
RECONOCIMIENTO PREVIO:
1. Reconocer las partes importantes del microscopio.
2. Cerciorarse el nmero de aumentos marcado en el ocular. Comparar con
otros oculares de diferentes aumentos.
3. Observe los objetivos d su microscopio y los aumentos de cada uno de
ellos.
4. Calcular con las diferentes combinaciones de lentes, los aumentos que
puede obtener en su microscopio.
ENFOQUE:
5. Buscar el objetivo de menor aumento, 10x y pngalo en el tope del
revolver; el objetivo har su ruido caracterstico al estar en posicin
correcta.
6. Acomodar la cara del espejo, plana para luz natural y cncava para la luz
artificial; a fin de iluminar la totalidad del campo que se observa por el
ocular.
7. Preparar el objetivo que va observar (lmina)

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8. Poner la lmina sobre la abertura de la platina, y centrar el objeto que se

va a mirar.
9. Mirando por el costado bajar el objetivo utilizando el tornillo macro
mtrico hasta que est muy cerca de la lmina.
10.Mirar a travs del microscopio y levantar el objetivo usando siempre el
tornillo macro mtrico hasta ver la imagen.
11.Usar el tornillo micro mtrico para enfocar con ms nitidez.
12.Abrir o cerrar el diafragma para mejorar la calidad de la imagen.
PARA CAMBIAR DE AUMENTO:
13.Centrar cuidadosamente la parte que va a ser examinada.
14.Levantar el tubo porta lentes por medio del tornillo macro mtrico,
cambie el objetivo y siga con 10.
PARA OBSEVAR CON EL OBJETIVO DE INMERSIN:
15.Centrar la preparacin y levante el tubo porta lentes por medio del
tornillo macro mtrico y gire el revolver para colocar el objetivo de
inmersin (97X).
16.Colocar una gota de aceite de cedro sobre la preparacin.
17.Mirando por el costado hacer descender el objetivo con el tornillo macro
mtrico hasta que toque la gota de aceite.
18.Mirar por el ocular enfoque cuidadosamente utilizando el tornillo macro
mtrico, afinando con el micro mtrico.
19.Recordar que mirar a travs del microscopio requiere no solamente de las
manos, una en el tornillo micro mtrico y la otra en la platina para mover
la preparacin.
TECNICA DE OBSERVACIN MICROSCPICA DE MICROORGANISMOS EN
ESTADO FRESCO:
ENTRE PORTA OBJETO Y CUBREOBJETO:
1. Preparar un portaobjetos y cubreobjetos perfectamente limpios y
desengrasados.
2. En el portaobjetos se depositar una gota de agua estril.
3. Con el asa de siembra previamente esterilizada por flameado, se tomar
un poco de muestra del microorganismo y se realizar una suspensin de
sta en la gota.
4. Se intentar extender la muestra con el fin de homogeneizar la mezcla,
colocando con cuidado sobre la suspensin un cubreobjetos formando
inicialmente un ngulo de 45 evitando que se formen burbujas de aire al
caer el cubreobjetos sobre la suspensin.
5. Se sellarn con parafina los bordes del cubreobjetos para disminuir la
evaporacin y evitar corrientes en la preparacin.
6. Observar al microscopio.
SOBRE GOTA PENDIENTE EN PORTA EXCAVADO
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1. Utilizar un cubreobjetos adecuadamente limpio y

desengrasado en el que se colocar en el centro una
gota de la suspensin microbiana con un asa de siembra
inicialmente estril.
2. Colocar vaselina en los bordes del pocillo del portaobjetos
excavado.
3. Invertir el cubreobjetos sobre el portaobjetos
excavado perfectamente limpio, colocndolo encima
del rea cncava del portaobjetos.
4. La vaselina adherir el cubre al porta formando una
cmara que evitar su evaporacin,
as como corrientes de aire.
5. Invertir la preparacin.
6. Se observar al microscopio.
TECNICA DE COLORACIN DIFERENCIAL DE GRAM:
1. Usar lminas limpias y pasarlas varias veces cortando la
llama del mechero Bunsen. No tocar con los dedos la
superficie plana del portaobjeto.

2. Dejar enfriar la lmina y colocar sobre ella una gotita

de suero fisiolgico con el inoculador.
3. Con el inoculador estril, tocar ligeramente el cultivo
que ha de ser examinado y transferir un poquito de l
sobre la gotita de suero fisiolgico.
4. Esterilizar el inoculador y dejarlo enfriar.
5. Frotar el cultivo con el inoculador hasta extenderlo
sobre la parte central del portaobjeto, cuidando de
que se forme una pelcula muy delgada.
6. Dejar que la pelcula seque al aire.
7. Fijar la preparacin sobre el portaobjeto pasndolo por
la llama. Dejar enfriar.
8. Cubrir la pelcula con el colorante cristal violeta (Gram
#1) y dejar as cubierto por espacio de 20 segundos.
9. Lavar con agua durante 2 segundos.

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10.Tratar la lmina con la solucin Lugol (Gram # 2) durante un minuto.

11.

Decolorarla con alcohol acetona (Gram # 3) durante 15

a 20 segundos.
Lavar la lmina con agua, durante 2 segundos.

12.
13.

Contracolorear con Safranina (Gram # 4) y dejar que

se tia por espacio de 20 segundos.

14.Lavar la lmina con agua, durante 2 segundos.

15.Dejar secar y examinar al microscopio la preparacin.

4. RESULTADO Y OBSERVACIONES
OBSERVACIN MICROSCPICA DE MICROORGANISMOS EN ESTADO FRESCO:
Este mtodo es utilizado para poder identificar a los microorganismos, as
como para poder observar su morfologa.
1 MUESTRA: cebolla GRUPO 1
Verde (vacuolas)

rosada

2 MUESTRA: hilos
Amarrillo

rojo
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3 MUESTRA: algas (muestra del estanque de arquitectura) GRUPO 5

Verde (MOUGEOTIA)

marrones (DIATOMEAS)

DE COLORACIN DIFERENCIAL DE GRAM:

Se observa por campo bacterias de color azul violceo que corresponden a
las bacterias Gram + y/o bacterias de color rojo rosado que corresponden
a Gram -.
Un organismo Gram positivo retendr el color Cristal Violeta y aparecer
teido de azul o morado y un organismo Gram negativo tendr el color
rosado o rojo de la Safranina.

PRIMER COLORANTE

GRAM +
se tien

MORDIENTE

se fija la coloracin

DECOLORACIN

permanecen violetas

SEGUNDO COLORANTE

permanecen violetas

GRUPO COLOR
1
AMARILLO
CREMA

GRAM se tien
se fija la
coloracin
se decoloran
se tie de rosa
rojo

AMBIENTE

FORMA

AGRUPACION

BIBLIOTECA
BIBLIOTECA

COCOS
COCOS

ESTAFILOCOCOS
ESTAFILOCOCOS

EL MICROSCOPIO

Coloracin
gram
+
+

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BLANCO

BIBLIOTECA

BACILOS

DIPLOBACILOS

COLOR

AMBIENTE

FORMA

AGRUPACION

AMARILLO

PLACA 1 GRUPO 3

BACILOS

ESTREPTOBACILOS

Coloracin
gram
+

AMARILLO

PLACA 1 - GRUPO 3

BACILOS, COCOS

GRUP
O

COLOR

AMBIENTE

FORMA

AGRUPACION

BLANCO

PLACA NO ESTERIL

BACILOS

STREPTOBACILOS

Coloracin
gram
+

AMARILLO

PLACA NO ESTERIL

COCOS

ESTAFILOCOCOS

GRUP
O

COLOR

AMBIENTE

FORMA

AGRUPACION

CREMA

PLACA 2 GRUPO 1 D

BACILOS

Coloracin
gram
+

AMARILLO PLACA 2- GRUPO 1 D

LOBULAR

ESTAFILOCOCOS

FORMA

AGRUPACION

BACILOS

ESTREPTOBACILOS

Coloracin
gram
+

GRUPO

GRUP
O
5

COLOR

AMBIENTE

AMARILLO LAB. MICROBIOLOGIA

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5. CONCLUSIONES:

La coloracin de Gram es una coloracin diferencial, que nos permite

clasificar las bacterias no solo por su forma, sino tambin por la forma
como toman los colorantes del Gram.
Para no dar falsos Gram -, hay que considerar que si la decoloracin es
excesiva, puede incluso llegarse a decolorar las Gram +, y que debemos
utilizar siempre un cultivo joven.

6. RECOMENDACIONES:

El microscopio debe llevarse siempre agarrndolo con las dos manos una
de ellas en el brazo, y la otra con la palma hacia arriba sosteniendo la
base o pie.
Los tornillos (macro mtrico y micro mtrico) y el revolver deben moverse
siempre con cuidado y sin apresuramiento, para evitar que los lentes se
rompan o rayen.
No se debe usar la luz solar directa como fuente de iluminacin.
Nunca debe bajar el tubo pota lentes mientras se observa por l.
Para limpiar los lentes debe usarse papel lente, puesto que otro material
puede rayarlos.
Ningn lquido debe mojar pieza alguna del microscopio. Las lminas que
se colocan el la platina debern estar siempre secas.
Despus de usar el objetivo de inmersin limpiarlo con el papel lente
humedecido con xilol.
Comunicar al jefe de prcticas si se encuentra algn defecto en el
microscopio.
Que la cantidad de muestra sea representativa, no debiendo ser ni muy
abundante ni muy escasa.
Que la muestra sea recogida en condiciones de esterilidad.
Que est adecuadamente distribuida la muestra en el portaobjeto y que
dicha distribucin sea amplia y homognea.
Que la cantidad de agua o colorante, segn los casos, sea la adecuada y
nuca ni suficiente ni excesiva.
Si hubiera que fijarla por calor (esto no se realiza en las tinciones en
fresco), nunca deber calentarse demasiado.
Se har un seguimiento del mtodo o tcnica de manera adecuada (tipos
de colorantes apropiados, tiempos de aplicacin precisos, decolorantes en
perfecto estado, etc.).
Se trabajar con limpieza y orden, evitando cualquier tipo de
contaminacin.

7. BIBLIOGRAFIA:
EL MICROSCOPIO

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MICROBIOLOGIA I

Microbiologa, Raquel Granados Prez.

http://www.principia-malaga.com/portal/pdfs/microscopio.pdf
http://teleformacion.edu.aytolacoruna.es/FISICA/document/fisicaInteractiva
/OptGeometrica/Instrumentos/Microscopio/microscopio.htm
http://www.scribd.com/word/full/2078734?access_key=key75v194hj4m0ophghy1u
8. ANEXOS:
MORFOLOGA BACTERIANA:
La tincin de GRAM aporta dos ideas bsicas para la definicin taxonmica
de las bacterias: el color que adquieren tras la tincin y la forma que
presentan las clulas bacterianas.
Esta diversidad depende de que ala divisin de las clulas s d a lo largo de
uno, dos o tres ejes.
Formas bsicas en que se puede visualizar la morfologa bacteriana en una
tincin GRAM:

COCOS:
Micrococos, aparecen aislados y dispersos tras la divisin celular.
Diplococos, parecen por pares.
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Estreptococos, tienden a unirse formando cadenas.

Estafilococos, aparecen en grupos irregulares, a veces de gran tamao.

BACILOS:
Grandes variaciones morfolgicas: fusiformes, estreptobacilos, cocobacilos.

ESPIRALES:
Utilizamos el termino Pleomorfismo para referirnos a la adopcin de
diferentes formas en una misma especie.

EL MICROSCOPIO

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9. CUESTIONARIO
1. Dibuje el microscopio indicando la parte mecnica y la parte ptica.
PARTE

MECNICA:
Brazo y pie
tubo porta lente y cremallera
tornillo macro mtrico
tornillo micro mtrico
platina y pinzas
tornillo del condensador
soporte del espejo

PARTE PTICA:
Ocular
Objetivos 10X, 43X, 97X
Espejo con dos caras
Condensador con diafragma
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2.
se
con
de

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Calcular los
aumentos que
puede obtener
las diferentes
combinaciones
los lentes.
10x: 100
aumentos
43x: 430
aumentos
97x: 970
aumentos

3. Uso

del espejo
plano y
cncavo.

El espejo: necesario si la fuente de iluminacin no est construida

dentro del microscopio y ya alineada con el sistema ptico, como suele
ocurrir en los microscopios modernos. Suele tener dos caras: una
cncava y otra plana. Goza de movimientos en todas las direcciones.

EL MICROSCOPIO

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La cara cncava se emplea de preferencia con iluminacin

artificial.
La plana, para natural (luz solar).

Los modelos ms modernos no poseen espejos sino una lmpara que

cumple la misma funcin que el espejo.
4. Diferencia entre tornillo macromtrico y micromtrico.
PARTES DEL MICROSCOPIO
TORNILLO DE AJUSTE FINO
TORNILLO DE AJUSTE GRUESO

FUNCIONES
Con este se busca la imagen exacta
Con este se busca el enfoque inicial

El tornillo macromtrico: girando este tornillo, asciende o desciende

el tubo del microscopio, deslizndose en sentido vertical gracias a un
mecanismo de cremallera. Estos movimientos largos permiten el
enfoque rpido de la preparacin.

El tornillo micromtrico: mediante el ajuste fino con movimiento casi

imperceptible que produce al deslizar el tubo o la platina, se logra el
enfoque exacto y ntido de la preparacin. Lleva acoplado un tambor
graduado en divisiones de 0,001 mm., que se utiliza para precisar sus
movimientos y puede medir el espesor de los objetos.

5. Utilidad del diafragma o Iris.

PARTES DEL MICROSCOPIO
DIAFRAGMA DE IRIS

FUNCIONES
Regula la cantidad de luz que llega al
condensador.

Diafragma: el condensador est provisto de un diafragma-iris, que regula

su abertura para ajustarla a la del objetivo. Puede emplearse, de manera
irregular, para aumentar el contraste, lo que se hace cerrndolo ms de lo
que conviene si se quiere aprovechar la resolucin del sistema ptico.
6. Finalidad de usar el aceite de cedro.
El objetivo de inmersin est compuesto por un complicado sistema de
lentes. Para observar a travs de este objetivo es necesario colocar una
gota de aceite de cedro entre el objetivo y la preparacin, de manera que
la lente frontal entre en contacto con el aceite de cedro.

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