Electroforesis Capilar (CE).

Bases de Electroforesis Capilar.

Qu es la Electroforesis?
Es el movimiento de una
molcula cargada debido a
un campo elctrico externo,
es decir, si se coloca una
muestra inica y le es
aplicado un potencial, sta
tender a dirigirse hacia el
polo opuesto a su propia
carga.

Movimiento de una molcula cargada

debido a un campo elctrico externo.

qE = fv
Fuerza de
aceleracin

Fuerza de
friccin

v=
q = carga del ion
E = campo elctrico
f = coeficiente de friccin
v = velocidad del ion

q
E E
f

La movilidad electrofortica es la
constante de proporcionalidad entre la
velocidad del in y la fuerza del
campo elctrico.
5

Separacin dentro de tubos capilares.

N
N
N
N

Un poco de Historia
Es una tcnica relativamente
nueva, el primer instrumento
comercial apareci en los aos
80s.
La EC experiment desde su
aparicin un crecimiento muy
importante, situndose rpidamente
para el anlisis de una gran
variedad de muestras, compitiendo
en la mayora de ellas con las
tcnicas de mayor tradicin
analtica como HPLC y CG.

Principales Caractersticas de
CE.
Se desarrolla en un capilar de slice fundida
(i.d. 25-150 m).

Opera en medio acuoso (aunque actualmente se

est desarrollando en solventes orgnicos
polares [NACE]).
8

Principales Caractersticas de
CE.
Se requieren volmenes muy pequeos de
muestra (1-50 nL inyectados).
A travs del capilar son aplicados altos voltajes
(10 a 30 kV) y campos elctricos (100 a 1000 V
cm-1)

Principales Caractersticas de
CE.
La alta resistencia del capilar limita la
generacin de corriente y el calentamiento
interno.
Presenta alta eficiencia (N>105 a 106) y tiempos
de anlisis cortos.
Tiene numerosas modalidades y un amplio
rango de aplicacin.
10

Principales Caractersticas de
CE.
El desarrollo del mtodo es muy simple.
Instrumentacin automatizada.
La deteccin se puede llevar a cabo de 2
formas:
On-capillary.
Decoupled detection cell.
11

Instrumentacin.

13

Principio de CE.

14

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin Hidrodinmica.
15

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin Electrocintica.
16

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin por Vaco.

17

Mtodos de Inyeccin de Muestra.

Inyeccin por Sifoneo.

18

Cmo detecto las especies?

19

Flujo
Electroosmtico
(EOF)

20

10

Superficie de Slice
cargada negativamente.

fundida
21

Los cationes hidratados se acumulan

cerca de la superficie.
22

11

El flujo va en direccin hacia el ctodo

cuando se aplica el campo elctrico.
23

EOF
EOF

24

12

Flujo electroosmtico

Flujo parablico

Caractersticas:

CE

GC, HPLC

Menor ancho de banda

Mayor ancho de banda

25

Caractersticas:

La velocidad del EOF es mayor a

la movilidad de cualquier especie,
independientemente de su carga.
26

13

Separacin por Electroforesis Capilar

N
N
N
N

27

Seal

Electroferograma

Tiempo de migracin (min)

28

14

Modos de Operacin de EC.

Modo de Operacin

Bases de la Separacin.

Electroforesis Capilar de Solucin

Libre/relacin
Zona (CZE)
masa carga.
(FS/ capilares fundidos)
Cromatografa
Micelar Hidrofbicas/ interacciones
inicas
con
Electrocintica (MEKC)
micelas/retardacin.
Electroforesis Capilar en Tamao y Carga
Gel (CEG)

30

15

Modo de Operacin

Bases de la Separacin.

Electroforesis de Enfoque Punto Isoelctrico.

Isoelctrico (IEF)
Isotacoforesis (ITP)

Movimientos Frontera

Electrocromatografa
Capilar (CEC)

Interaccin
con
slidas/retardacin.

fases

31

Electroforesis Capilar de Zona

s
m
a
EC
m
r
e
F o le d
p
m
i
s

M
dif igra
ere ci
nci n p
ad
o
ec r
arg
a.

32

16

Mecanismo de Separacin por

Electroforesis Capilar de Zona

Desarrollada en capilares de slice descubiertos y

permanentemente o dinmicamente en capilares
cubiertos.
33

Cromatografa Micelar Electrocintica.

CE + Crom. = MECK
Caracterstica: separa especies neutras
s
vo
cti C
a
so CM
en
e t e su
d
d
n
ici rriba
d
A or a
p

N
N

N
N
N
N

34

CMC=concentracin micelar crtica

17

Electroforesis Capilar en Gel

Basada en la
Electroforesis en Gel
convencional.

Separacin
basada en el
tamao.

Capilar relleno con

polmero, acta como
tamiz molecular.

Algunas protenas y ADN

tienen masa/carga similares
deben separarse por CGE.
35

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.

Generacin
de un gradiente
de pH

36

18

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.

Generacin
de un gradiente
de pH

pH
37

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.

Generacin
de un gradiente
de pH

pH
38

19

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.

Generacin
de un gradiente
de pH

pH
39

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.

Generacin
de un gradiente
de pH

pH
40

20

Electroforesis de Enfoque Isoelctrico

Separacin
basada en el
Punto Isoelctrico.

Generacin
de un gradiente
de pH

41

Instrumentacin.

21

Electrolitos
Fuente de poder

Reservorios
Muestras

Capilar

Sistema de deteccin

43

Detector

Control
PC

150 mV

Capilar

O FF
ON

ON
OFF

Muestra
Electrolito

Electrolito

Fuente
de poder
44

22

Capilares
Composicin (Slice).
Dimetro interno (25-75 m).
Longitud (30-75 cm).
Modificados.
Control temperatura.

45

Detectores
UV-VIS

Fluorescencia

Diseo especial

Fcil adaptacin

Deteccin Universal

Alta sensibilidad

Amplio intervalo

Derivatizacin

DAD

46

23

Detectores
Espectrometra Masas
Problema de interfase (electro-spray)
Caracterizacin absoluta
Verstil

47

Aplicaciones.

24

Separaciones quirales

Biociencia

Medioambiente

Alimentos

Industria
49

Separaciones Quirales.
Gran importancia en Farmacia y Alimentos
Tradicionalmente se realizan por HPLC y GC
D,L aminocidos
Frmacos
Ismeros

50

25

Biociencia

Gran cantidad de aplicaciones.

Pptidos y protenas (caracterizacin, secuenciacin, pI,

etc.)

cidos nucleicos y pruebas de pureza

Drogas, frmacos y metabolitos (tabletas, inyectables,

etc.)

Forense (LSD, morfina, cocana, plvora, etc.)

51

Medioambiente

Variedad de anlisis medioambientales:

Aguas (ros, lagos, lluvia, potable, residuales, etc.)

Suelos (cultivos, lixiviados, suelos varios)

Ejemplos de aplicaciones: cidos orgnicos, colorantes,

sustancias

hmicas,

pesticidas,

iones

inorgnicos,

aminas, tensoactivos, cidos aromticos, etc.

52

26

Alimentos

Muestras analizadas:
Aguas
Frutas
Bebidas refrescantes
Bebidas alcohlicas
Leche y productos lcteos
Pescados y mariscos
Carnes
Hortalizas y vegetales
Cereales
Y ms...

53

Alimentos

Sustancias estudiadas:
Iones inorgnicos (sodio, potasio, calcio, magnesio,
cloruros, fosfatos, citratos, etc.).
cidos orgnicos (maleato, citrato, acetato, lactato,
ascrbico, etc.)
Otros compuestos Orgnicos (cafena, histaminas,
pesticidas, azcares, edulcorantes artificiales, etc.)
Protenas (Suero
protenicos, etc.)

de

leche,

queso,

preparados
54

27

Industria

Diversas reas de aplicacin: materia prima, control

de calidad, aguas residuales, etc.

Caracterizacin de polmeros
Compuestos sintticos
Contaminantes
Se incluyen las aplicaciones anteriores
55

50.0

OTC
45.0
pKa 3

R1

40.0

CH3

R2

N(CH3)2

R3
H

DT

OH pKa 1

NH2

35.0
OH

Abs (mU.A.)

OH
pKa 4

30.0

OH

pKa 2

25.0

(Orina dopada)

20.0
15.0

(Estndar)

10.0

(Orina)

5.0

Nombre comn

R1

R2

R3

Tetraciclina

-H

-OH

-H

Oxitetraciclina

-H

-OH

-H

Doxitetraciclina

-Cl

-H

-OH

0.0
6.0

6.5

7.0

7.5

8.0

8.5

9.0

9.5

10.0

10.5

Tiempo (min)

56

28