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Western Blotting por Patrcia Regina Manzine1

A tcnica de Western Blotting foi desenvolvida no laboratrio do Prof. George


Stark na Universidade de Stanford. O nome Western Blotting foi dado por W. Neal
Burnette e um trocadilho para o nome Southern Blotting, tcnica para deteco de
DNA desenvolvida anteriormente por Edwin Southern. Tambm h uma tcnica
chamada Northern Blotting que serve para a deteco de RNA.
Western Blotting um mtodo em biologia molecular/bioqumica para detectar
protenas em um homogenato (clulas trituradas) ou em um extrato de um tecido
biolgico. Essa tcnica utiliza eletroforese em gel para separar as protenas desnaturadas
por massa (comprimento do polipeptdeo). As protenas so transferidas do gel para
uma membrana (tipicamente de nitrocelulose ou de PVDF), onde sero utilizados como
sonda, anticorpos especficos protena a ser estudada (Figura 1).

Figura 1. Esquema de um exemplo da tcnica de Western Blotting.

Patrcia Regina Manzine realiza seu doutorado no LABEN atravs do Programa


Interinstitucional de Ps-Graduao em Cincias Fisiolgicas UFSCar UNESP e
bolsista CAPES.

Protocolo Western Blotting LABEN


Processamento do sangue e preparao das plaquetas

Tubos contendo soluo de citrato de sdio (3,8%) e glicose (136 mM) so


utilizados para coleta do sangue (8,5ml). Aps as coletas, os tubos so mantidos a
temperatura de 4C durante o perodo de armazenamento e transporte. Os tubos
contendo anticoagulante so, imediatamente aps a coleta, transportados at o
laboratrio, misturados por inverso e ento centrifugados a 1.200 rpm por 10 minutos,
obtendo-se assim o plasma rico em plaquetas (PRP), o qual congelado temperatura
de -80C at o momento do uso.
A partir do PRP, as plaquetas so coletadas por centrifugao a 2.400 rpm por
10 minutos, em seguida lavadas 2x em soluo de Tampo fosfato salino (PBS) a 3.000
rpm por 10 minutos. Em seguida as plaquetas so ressuspensas em 100 L de tampo de
lise (RIA Buffer) composto por NaCl 200mM, EDTA 10 mM, Na2HPO4 10 mM, NP40
0,5%, SDS 0,1% e inibidores de protease (Sigma Fast).
Posteriormente, realizada uma nova centrifugao das amostras para separao
dos sobrenadantes, os quais so utilizados para mensurao das concentraes proticas
utilizando o kit Bradford (BioRad). O contedo proteico das amostras (100 g)
separado atravs de eletroforese em gel de poliacrilamida 10% (SDS-PAGE - Sodium
dodecyl sulfate poliacrilamide gel electrophoresis) e transferido para membranas de
nitrocelulose.

SDS-PAGE e Western Blotting

Aps medida da concentrao proteica, o volume necessrio para obteno total


de 100 g de protena para cada amostra diludo em 10 L de tampo de amostra para
SDS-PAGE [Tris-HCl 0,125M pH 6,8, SDS 4% (w/v), glicerol 20% (v/v), mercaptoetanol 0,1M e azul de bromofenol 0,02% (w/v)]. Antes da aplicao no gel, as
amostras so fervidas a 100 C por 5 minutos no banho seco, desnaturando as protenas,
desenovelando-as completamente, a fim de facilitar a separao das mesmas durante a
corrida eletrofortica. Um volume de 10 L do marcador padro de massa molecular
Page-Ruler Prestained (Fermentas) utilizado em todas as corridas.

A corrida da eletroforese realizada durante 90 minutos a 120 V e em seguida as


protenas presentes no gel so transferidas para membranas de nitrocelulose (Sigma)
atravs do sistema de transferncia Mini Trans-Blot Cell (BioRad) em tampo Tris-HCl
(25 mM), glicina (92 mM), metanol (20%) e SDS (0,1%). A transferncia realizada a
350 mA (mili-Ampres) durante uma hora.
Para confirmar a eficincia da transferncia, o gel de poliacrilamida corado
com 0,25% de Comassie Blue R-250 (Sigma) dissolvido em 50% de isopropanol e 10%
de cido actico e a membrana de nitrocelulose corada com Ponceau 0,5% (m/v) em
cido actico 0,1% (v/v).
Para os prximos passos, o kit Amplified Opti-4CN Substrate (BioRad)
utilizado. Aps a transferncia protica para as membranas, estas so mantidas em
soluo de bloqueio (Blocker 3% - BioRad) por uma hora. As membranas so ento
incubadas em 10 mL do anticorpo primrio anti-ADAM10 (A-3) Mouse Monoclonal SC48400 (Santa Cruz Biotechnology) (1:100) por uma hora, seguido pela incubao em 10
mL do Anticorpo secundrio Goat Anti-Mouse IgG-HRP SC-2005 (Santa Cruz
Biotechnology) (1:2000) por uma hora. A diluio dos anticorpos realizada em
soluo de PBST1x/BSA 1% e a incubao em temperatura ambiente, com leve agitao
em plataforma agitadora.
Posteriormente, as membranas so incubadas no reagente BioRad Amplification
(BAR 1x) por 10 minutos e lavadas 4x em 20% DMSO/PBST por 5 minutos. Em
seguida, as membranas so incubadas em soluo de Streptavidin-HRP (1:1000 em
soluo PBST1x/BSA 1%) por 30 minutos e reveladas por deteco colorimtrica com
Opti-4CN Substrate Kit (BioRad). Em todas as lavagens das membranas, realizadas
entre as etapas do protocolo, utilizada a soluo PBST 1x (2x por 5 minutos cada).

Densitometria das bandas


Aps a revelao da membrana no experimento de Western Blotting, as bandas
marcadas pela reao com os anticorpos (anti-ADAM10) so quantificadas com auxlio
do software Quantity One (BioRad). Utiliza-se como parmetro para anlise o volume
ajustado das bandas, que significa o volume total, diminudo do background.