UNIVERSIDAD AUTNOMA DE GUERRERO

UNIDAD ACADMICA DE CIENCIAS QUMICO BIOLGICAS

MAESTRA EN CIENCIAS BIOMDICAS

MICROBIOLOGA MOLECULAR

REPORTE DE PRCTICA DE LABORATORIO

PRESENTAN
ELENA SALAZAR HERNNDEZ
OLIVER VILLALVA NJERA

CATEDRTICO:
M.C. ROMINA BELEN RADILLA VZQUEZ
Chilpancingo, Guerrero. Mayo de 2015

PRCTICA DE PRUEBAS DE SUSCEPTIBILIDAD ANTIMICROBIANA

1. INTRODUCCIN
El uso indiscriminado de antibiticos est llevando a que las bacterias
incrementen su posibilidad de adquirir o evolucionar sus mecanismos de
resistencia a stos, siendo un gran problema al ir en aumento por dificultar
el tratamiento y erradicacin de enfermedades infecciosas (Gonzlez, P.,
2002).
Varioss mtodos de laboratorio pueden ser usados para determinar in vitro
la susceptibilidad de bacterias ante agentes microbianos.

Un mtodo

recomendado por el Instituto de Estndares Clnicos y de Laboratorio (CLSI)

est basado en el mtodo originalmente descrito por Bauer et al., (mtodo
de Kirby-Bauer). Este es el mtodo de difusin en disco en que se han
desarrollado estndares para su interpretacin y est apoyado por datos
clnicos y de laboratorio. El principio del mtodo involucra el uso de una
cantidad constante de antimicrobianos en un reservorio (discos de papel)
aplicado sobre la superficie del agar en el cual se ha cultivado el
microorganismo en cuestin. Se formar as por difusin, un gradiente de
concentracin del antimicrobiano y la sensibilidad del microorganismo
estar indicada por el tamao de la zona de inhibicin del crecimiento
alrededor del reservorio. El dimetro obtenido depender no solo de la
sensibilidad del microorganismo y la carga del disco, sino tambin del
espesor de la capa del agar, su pH y composicin, de la capacidad de
difusin de la droga en ese medio, la temperatura, la velocidad de
duplicacin bacteriana, y el tamao y fase de crecimiento del inculo. El
medio de eleccin para la prueba es el agar Mueller-Hinton por las
siguientes razones:

Reproducibilidad aceptable lote a lote para ensayos de susceptibilidad.

Es bajo en inhibidores de sulfonamida, trimetoprim, y tetraciclina.
Crecimiento satisfactorio para la mayora de los patgenos no

fastidiosos.
Slo las formulaciones

del

medio

Mueller-Hinton

que

han

sido

controladas con la cepa de referencia de acuerdo al CLSI pueden ser

usados (Prat, n.d.).

Los macrlidos, junto con las lincosamidas y las estreptograminas B (MLSB)

son tres grupos de antimicrobianos de estructuras qumicas diferentes pero
con mecanismos de accin similares.
La resistencia a la eritromicina y lincosamidas es codificado por el gen erm
que induce la metilacin de la subunidad 23S ribosomal lo que conlleva a la
modificacin del sitio de unin de estos antibiticos. Estas cepas se han
dividido en dos clases fenotpicas mayores: a) Cepas con resistencia
constitutiva, las cuales pueden crecer en presencia de altas concentraciones
de antimicrobianos MLS sin requerir induccin previa (MLSc) y b) Cepas con
resistencia inducible, cuya resistencia a los antimicrobianos MLS pude ser
inducida por concentraciones subinhibitorias (0,01 a 0,1 ug/ml) de
eritromicina (MLSi).
La resistencia inducible para MLSB no se detecta usando los test de
susceptibilidad a antimicrobianos estndar. Para identificar in vitro las cepas
de Staphylococcus que poseen una resistencia inducible a la clindamicina,
existe un mtodo de laboratorio conocido como test de difusin de doble
disco (D test).
Los fenotipos que se observan mediante difusin con discos son: 1)
resistencia a la eritromicina y a la clindamicina; 2) resistencia a la
eritromicina y sensibilidad a la clindamicina pero con un achatamiento del
halo de la clindamicina en la proximidad de la eritromicina (Dtest positivo);
3) resistencia a la eritromicina y sensibilidad a la clindamicina sin
achatamiento del halo (D-test negativo). En el primer caso se trata de
resistencia constitutiva a la eritromicina y a la clindamicina (fenotipo
cMLSB), en el segundo de resistencia constitutiva de expresin inducible
(fenotipo iMLSB) y en el tercero de resistencia a la eritromicina mediada por
una bomba de expulsin activa (fenotipo MSB). Se puede identificar tambin
un cuarto fenotipo de resistencia a la clindamicina y sensibilidad a la
eritromicina debido a la accin de enzimas que inactivan las lincosamidas
(codificadas por los genes lnu) aunque es poco frecuente (Daza Prez, 1998;
Montoya et al., 2009).

Los antibiticos betalactmicos comparten un anillo -lactmico central

y su principal modo de accin es la inhibicin de sntesis de la pared

celular. Anillos adicionales a la estructura o grupos agregados al anillo lactmico determina si el agente es penicilina, cefem, carbapenem, o
monobactam.
La resistencia a

los betalactmicos, se puede producir por varios

mecanismos, pero el mecanismo ms importante en las enterobacterias es

la

produccin

de

Enterobacteriaceae

betalactamasas.
poseen

Muchos

betalactamasas

miembros

de

cromosmicas

la

familia

naturales,

probablemente derivadas de las propias protenas fijadoras de penicilina

(PBP, del ingls penicillinbinding protein), con las que tienen analoga
secuencial y estructural. Los genes que codifican estas enzimas se pueden
encontrar en el cromosoma o en elementos genticos mviles, y su
produccin puede ser constitutiva o inducible. Las betalactamasas de
espectro extendido (BLEE) se definen como enzimas capaces de hidrolizar
las penicilinas, todas las cefalosporinas (menos las cefamicinas) y las
monobactamas, pero no las carbapenemas. Se caracterizan por ser
inhibidas por el cido clavulnico, sulbactam y tazobactam.
Las pruebas para betalactamasas determinan si los agentes betalactmicos
de espectro limitado (ej. Penicilina y ampicilina) pueden ser utilizadas para
tratar unas pocas especies claves de bacterias. Una de las pruebas se basa
en la deteccin visual de los productos finales de la hidrolisis de
betalactmicos, demostrada con cambio de color. Esta prueba es realizada
con un disco de nitrocefina el cual utiliza un sustrato betalactmico
cromognico (una cefalosporina) que cambia de color cuando la amida de
su anillo es hidrolizada por accin de una betalactamasa

2. Material y mtodos
2.1 Prueba de difusin en disco
1. A partir de un cultivo fresco tomar de 4 a 5 colonias aisladas del
mismo tipo morfolgico y realizar una suspensin ajustada al 0.5 de
Mc Farland, agitar la suspensin para homogenizar.
2. Humedecer con la suspensin un hisopo estril, quitar el exceso de
caldo presionando y girando el hisopo sobre la pared interna del
tubo, por arriba del nivel de la suspensin.
3. Con el hisopo estriar en tres direcciones sobre la totalidad de la
superficie delagar, asegurando que el inculo sea distribuido

homogneamente, hacer el ltimo barrido del hisopo sobre el borde

de la caja.
4. Cuando el inculo ha secado (de 3 a 5 minutos) colocar los discos con
pinzas estriles, presionar ligeramente para asegurar el contacto con
la superficie. Deber prevenirse una sobreposicin de las zonas de
inhibicin con la distribucin adecuada de los discos y con un lmite
menor de 15 mm de los bordes de la placa.
5. Despus de 15 minutos de haber colocado los discos, invertir las
cajas de Petri e incubar a 37C durante 16 a 18 horas.
6. La medicin de los halos de inhibicin se hace con compases de
calibracin, vernier, regla o plantilla diseada para ese propsito, por
el fondo de la caja, sobre un fondo negro no reflejante y se ilumina
con luz reflejante.
Interpretacin de resultados: Las interpretaciones de las medidas de los
dimetros de las zonas de inhibicin son informadas y definidas como:

Susceptibles (S)
Implica que una infeccin debida a una cepa puede ser tratada
apropiadamente con dosis del antimicrobiano recomendado para ese
tipo de infeccin y microorganismo aislado.
Intermedia (I)
El trmino intermedio puede aplicarse clnicamente a sitios corporales
donde las drogas se concentran fisiolgicamente o cuando se pueden
utilizar una alta dosificacin de la droga.
Resistente (R)
Estas cepas no son inhibidas por las concentraciones sistmicas
habitualmente alcanzadas cuando se administran en dosis normales y
su eficacia clnica no ha resultado fiable en los estudios de
tratamiento.

A) Las cepas Gram (+) utilizadas para esta parte fueron:

Cepa control: ATCC 25925. Staphylococcus aureus.

Cepa problema: M-026. Staphylococcus coagulasa +

B) Las cepas Gram (-) utilizadas para esta parte fueron:

Cepa control: ATCC 25922. Escherichia coli.

Cepa problema M-031. Escherichia coli

2.2 Deteccin de -lactamasas

Prueba de nitrocefina
Colocar una gota de nitrocefina sobre un halo de inhibicin correspondiente
a un antibitico -lactmico, esperar 30 segundos para observar un cambio
de coloracin.
Interpretacin:
Positivo: Coloracin rojiza
Negativo: No hay cambio de coloracin
Prueba de doble disco combinado

1. A partir de un cultivo fresco hacer una suspensin ajustada al 0.5 de

Mc Farland (Se puede ajustar con el espectrofotmetro a una longitud
de onda de 625 nm con una densidad de 0.08-0.10 A.
2. Sumergir un hisopo estril dentro de la suspensin, rotar y presionar
firmemente contra la pared interna del tubo sobre el nivel del lquido
para eliminar el exceso de inoculo.
3. Posteriormente inocular la superficie de una placa de agar MuellerHinton por rayado con un hisopo, repitiendo de 3-4 veces con la
finalidad de una distribucin homognea del inculo. Por ultimo
deslizar el hisopo sobre los bordes de la placa.
4. Colocar discos con CAZ (30g) y CTX (30g) y discos de los mismos
antibiticos con cido clavulanico (10g).
5. Colocar los discos con una distancia mayor de 30 mm uno de cada
otro, presionando ligeramente para asegurar el contacto con la
superficie, despus de 15 minutos invertir las cajas de Petri e incubar
a 35C durante 16-18 horas.

Las cepas utilizadas para ambas partes fuern:

Cepa control: Klebsiella pneumoniae.

Cepa problema: M-031. Escherichia coli.

2.3 Prueba de Clindamicina

1. Hacer una suspensin al 0.5 Mc Farland, segn lo descrito en los
pasos anteriores. Utilizando las cepas correspondientes para esta
prueba.
2. Posteriormente colocar un disco de eritromicina (15 g) y un disco de
clindamicina (2 g), separados por una distancia de 15 mm.
3. Incubar por 24 horas a 35C.
Las cepas utilizadas para esta parte fueron:

Cepa control: 1031. Staphylococcus epidermidis.

Cepa problema: M-022. Staphylococcus coagulasa -

3. Resultados
3.1 Prueba de difusin en disco
A)

Para la valoracin del antibiograma se utiliz la cepa control ATCC 25925. En

la tabla 1 se indican los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos y la
interpretacin de los mismos de acuerdo al CLSI (Clinical and Laboratory
standards Institute).
Tabla 1. Medidas de los halos obtenidos de la prueba de sensibilidad e
interpretacin.
Antibitico

Halo de control

Penicilina
Ciprofloxacino
Eritromicina
Trimetroprimsulfametoxazol
Oxacilina

35
27
25
26

B)

(26-37
(22-30
(22-30
(24-32

mm)
mm)
mm)
mm)

12* (18-24 mm)

Halo
cepa
problema
40 mm
26 mm
26 mm
25 mm

Resultado

15 mm

Sensible

Sensible
Sensible
Sensible
Sensible

Para la valoracin del antibiograma se utiliz la cepa control ATCC 25922. En

la tabla 2 se indican los dimetros de los halos de inhibicin obtenidos y la
interpretacin de los mismos de acuerdo al CLSI (Clinical and Laboratory
standards Institute).
Tabla 2. Medidas de los halos obtenidos de la prueba de sensibilidad e
interpretacin.
Antibitico

Halo de control

TrimetoprimSulfametoxazol
Cefuroxima
Amoxicilinacido clavulanico
cido nalidxico
Ampicilina
3.2

Resultado

29 (23-29 mm)

Halo
cepa
problema
5 mm

21 (23-27 mm)
22 (18-24 mm)

21 mm
5 mm

Sensible
Resistente

21 (22-28 mm)
17 (16-22 mm)

11 mm
5 mm

Resistente
Resistente

Resistente

Deteccin de -lactamasas

Prueba de nitrocefina
Las cepas utilizadas para la prueba de deteccin de -lactamasas por el
mtodo la cefalosporinas cromognica (Nitrocefna) fueron: Una cepa de Klebsiella
pneumoniae como control positivo y una cepa problema que corresponda a
Escherichia coli. Los resultados obtenidos se mencionan en la tabla 3.
Tabla 3. Resultados de la prueba de nitrocefina.

Cepa
Klebsiella pneumoniae
M-031. Escherichia coli

Coloracin
Rojiza
Rojiza

Prueba de doble disco combinado

Resultado
Positivo
Positivo

Las cepas utilizadas para la deteccin de la produccin de - lactamasas de

amplio espectro (BLEEs) fueron las mismas que para la prueba de
nitrocefina, los resultados obtenidos para ambas pruebas pueden apreciarse
en las imgenes siguientes.

3
2

Izquierda correspondiente a la cepa control: Los discos de cefotaxima

y ceftazidima corresponden a los nmeros 1 y 2 respectivamente, los discos
de cefotaxima y ceftazidima ambos ms cido clavulanico corresponden a
los nmeros 3 y 4 respectivamente.
Derecha correspondiente a la cepa
cefotaxima y ceftazidima corresponden
respectivamente, los discos ce cefotaxima y
clavulanico corresponden a los nmeros 3 y 4

problema: Los discos de

a los nmeros 1 y 2
ceftazidima ambos ms cido
respectivamente.

Las flechas indican el resultado de la prueba de nitrocefina en este caso

positiva en ambos casos por el cambio de coloracin.

3.3

Prueba de Clindamicina

La cepa control utilizada para la prueba de clindamicina inducible fue la

1031, para contrastar contra la cepa problema (M-022). La prueba result

clindamicina sensible (no inducible por eritromicina) para la cepa M-022, al

no deformarse el halo de inhibicin, es decir, la forma caracterstica D.

4. Discusin

Difusin en disco. Para su realizacin, se utilizaron cinco diferentes

antibiticos que

se evaluaron dos cepas control

(ATCC

25925; de

Staphylococcus aureus y ATCC 25922; de Escherichia coli) cada una con sus
respectivos antibiticos. Sin embargo, en oxacilina para la primera cepa
control se determin que no entr dentro del rango establecido por el CLSI
para el dimetro del halo de inhibicin. Esto se debi a que los discos del
antibitico ya estaban expirados. A pesar de ello la cepa problema si fue
sensible a oxacilina (A). Pero esto remarca la importancia de respetar los
tiempos de viabilidad de los antibiticos para su uso, ya que stos suelen
perder su efectividad. Para la segunda cepa control los antibiticos
utilizados se difundieron correctamente en el agar

por los que no se

observ alteracin alguna asociada a la viabilidad de los antibiticos por su

tiempo y condicin de almacenamiento. La cepa problema resulto resistente
a la mayora de los antibiticos, no as a la Cefuroxima a la cual resulto
sensible. Los resultados de sensibilidad a los antibiticos son muy distintos a
pesar de que ambas cepas son del mismo gnero y especie esto podra
explicarse si a partir de que muestra fueron aisladas cada una (B).
La determinacin de susceptibilidad por el mtodo de difusin por agar es
una tcnica que nos permite saber la resistencia a un mayor nmero de
antibiticos en un solo paso, sin gastar mucho material y adems de que es
fcilmente reproducible, los puntos de corte ya estn establecidos por
consenso lo permite confiar en los resultados obtenidos. Pero presenta
algunas limitantes dado que a travs de esta tcnica no se puede predecir
el mecanismo de resistencia que confiere el fenotipo observado en las
placas, por lo que es necesario apoyarse de otro tipo de tcnicas para poder
interpretar de mejor manera el antibiograma.
Prueba de nitrocefina. Se sabe que existen diversos mecanismos de
resistencia para un solo grupo de antibticos, por lo que puede ser
importante determinar este mecanismo para determinar qu mecanismos
de resistencia posee la bacteria y evitar utilizar algn antibitico de manera

errnea. Por ejemplo, en las betalactamasas pueden ser tres mecanismos,

tales como modificacin del blanco de accin, produccin de enzimas
modificadoras o sistemas de eflujo. Para la deteccin de betalactamasas se
pueden utilizar discos impregnados con una cefalosporina cromognica
(nitrocefin)

que

al

hidrolizarse

en

presencia

de

la

betalactamasa

experimenta un cambio en su estructura, lo que resulta en un producto

coloreado (naranja-rojo). Una prueba de betalactamasa positiva indica,
asimismo, resistencia a todas las penicilinas (Ardanuy, C., n.d.).
La prueba de nitrocefina se aplic a la cepa M-027, presentando un cambio
de coloracin a la aplicacin del reactivo. Esto indica que es una bacteria
productora de betalactamasas, por lo que sta ser resistente a cualquier
antibitico de los betalactmicos.
Prueba de doble disco combinado. Esta prueba nos permite determinar
si algunas cepas son productoras de betalactamasas de amplio espectro
(BLEEs). Estas han sido recientemente descritas como enzimas que
aparecen por mutacin en los genes TEM-1, TEM-2, y SHV-1.
BLEEs pueden conferir resistencia a cefotaxime, ceftazidine, aztreonam,
penicilinas de espectro expandido a cepas aisladas en clnica de Klebsiella
pneumoniae, Klebsiella oxytoca, Escherichia coli, y unos pocos otros
gneros de la familia Enterobacteriaceae que usualmente son susceptibles
para betalactmicos de espectro extendido. Se han reportado cepas de
Klebsiella spp aisladas en clnica y E. coli con zonas de inhibicin pequeas
alrededor

de

cefpodoxime,

ceftazidime,

aztreonam,

cefotaxime,

ceftriaxone pueden ser sospechosas de producir BLEEs (Garca et al., 2010).

Para la cepa control (K. pneumoniae) se confirm que era productora de
betalactamasa por el mtodo de nitrocefina y observa una ligera resistencia
a cefotaxima y ceftazidima (1 y 2), se esperaba que no hubiera una halo de
inhibicin para ambos antibiticos en presencia de cido clavulanico dado
que este inhibe a las betalactamasas. Una posible explicacin es que por el
tiempo de almacenamiento los discos con antibiticos ya no eran viables
para su uso. Otra es que el fenotipo observado en la placa es por otro
mecanismo de resistencia diferente a la produccin de betalactamasas (p.ej.
alteracin en la permeabilidad de la membrana por sistemas de eflujo) este
mecanismo debe ser estudiado por otro tipo de tcnicas (p. ej. Moleculares).

La cepa problema resulto productora de BLEEs, y de acuerdo al fenotipo

observado cefotaxima y ceftazidima no seran recomendadas para el
tratamiento contra esta cepa. Se observa que el cido clavulanico no logra
inhibir la accin de las betalactamasas posiblemente esto confirma lo
anterior, que los disco con antibiticos ya no eran viables para su uso.
Prueba de Clindamicina. El CLSI recomienda el mtodo de difusin con
doble disco para la deteccin de la resistencia inducible a clindamicina en
Staphylococcus spp., debido a que la utilizacin de clindamicina en
pacientes con infeccin por estafilococos con este tipo de resistencia podra
conducir a un posible fracaso teraputico por la aparicin de resistencia a
clindamicina durante el tratamiento. La clindamicina es un antibitico de
eleccin para el tratamiento de las infecciones de piel y tejidos blandos por
estafilococos debido a su buena absorcin oral, excelente penetracin y a
que no necesita ajustarse la dosis en insuficiencia renal. Es una opcin
teraputica por va oral en pacientes ambulatorios as como para la
continuacin de una terapia intravenosa. As mismo, la clindamicina es el
tratamiento alternativo en pacientes alrgicos a penicilina (Merino-Daz et
al., 2007). En este caso la cepa M-022 se reporta como sensible a
clindamicina, ya que el halo de inhibicin observado no se deform, el
antibitico sigui actuando de manera homognea. A pesar de ser una
bacteria eritromicina resistente, esto no induci la resistencia para
claritromicina.

5. Conclusin
La determinacin de la susceptibilidad a antimicrobianos ha tomado gran
importancia debido a que las cifras de resistencia han ido en aumento a lo
largo de los aos, incluso han llegado encontrar que las bacterias han sido
capaces de adquirir mecanismos de resistencia que no eran propios de su
gnero. Es por ello que en caso de una enfermedad infecciosa, para
asegurar xito en su erradicacin se debe realizar dicho perfil de resistencia;
as como el seguimiento de la resistencia, ya que ste puede ser un fenotipo
que se transmite entre las bacterias por medio de plsmidos que le
confieran sta caracterstica.

6. Referencias

Ardanuy C, Cercenado E, Morosini M, Torres C. Deteccin

Fenotpica de Mecanismos
de Resistencia en grampositivos. Procedimientos en Microbiologa
Clnica. Recomendaciones de la Sociedad Espaola de Enfermedades
Infecciosas y Microbiologa Clnica. Madrid: disponible. en:
http://www.seimc.org/documentos/protocolos/microbiologia/cap39.

Bush K, Jacoby GA. Updated Functional Classification of Lactamases. Antimicrobl Agents Chemother 2010; 54:969-976.

Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance

Standards for Antimicrobial Susceptibiliy Testing; Twentieth
Informational Supplement. CLSI document M100-S20. Wayne, PA.
2010.

Daza Prez R.M. Resistencia bacteriana aantimicrobianos: su

importancia en la toma de decisiones en la prctica diaria.
Informacin Teraputica del Sistema Nacional de Salud. Vol. 22.N.o 31998

Seral, C. Garca, et al. Betalactamasas de espectro extendido en

enterobacterias distintas de Escherichia coli y Klebsiella. Enferm
Infecc Microbiol Clin. 2010;28(Supl 1):12-18