No sculo 17, o cientista Robert Hooke foi a primeira pessoa a usar a palavra clula para

identificar estruturas microscpicas em uma fatia de rolha:

" . . . Estes poros, ou clulas, no so muito profundos, mas constituem vrias pequenas caixas.

Robert Hooke

Imagem extrada do livro Micrographia.

Em 1665, Robert Hooke publicou um livro intitulado Micrographia, contendo desenhos de

praticamente tudo que podia se ver com a mais nova inveno, o microscpio.

Livro publicado pelo microscopista Ingls Robert Hooke, em 1665.

Microscpios:
produzem imagem ampliada de um espcime
(objeto)
separam detalhes de uma imagem

O microscpio ilustrado na figura um microscpio composto

simples utilizado pelo microscopista ingls Robert Hooke em
1660.

O microscpio simples era considerado o mais elevado estado de

perfeio em 1600.

Evoluo dos Microscpios

Microscopia: Microscopia de Luz (ptica)

Como estudamos as clulas em Biologia Celular?

Tipos de microscopia ptica

Microscopia ptica (microscopia de luz)

Microscpio de campo claro

Microscpio de campo escuro

Microscpio de contraste de fase
Microscpio de contraste de interferncia diferencial DIC (Nomarski)

Microscpio de fluorescncia
Microscpio confocal de varrredura a laser

Microscpio ptico

Elodea - Microscopia de luz

Colorao

Corantes podem ser usados para corar clulas e aumentar

contraste de maneira que elas possam ser mais facilmente

visualizadas e identificadas ao microscpio de campo claro.

Clulas do sangue (microscpio de campo claro)

Trichinella spiralis
encistado em msulo
esqueltico - colorao HE
(hematoxilina-eosina)

Esporos de mofo
(Lycopodium) corados com
safranina

(microscpio de campo claro)

(microscpio de campo claro)

Microscpio de campo claro

Microscpio de contraste de interferncia

diferencial DIC (Nomarski)

Microscpio de contraste de fase

Microscpio de campo escuro

Cell Biology interactive

Fig. 23.8 Megacaricito - Contraste de fase
Fig. 16.11 Clula muscular cardaca - Contraste de fase
Fig. 23.9 Cicatrizao de feridas - Contraste de fase
Fig. 24.4 Clula T citotxica - Contraste de fase
Fig. 16.2 Caa e fagocitose de bactrias por neutrfilos - Contraste de fase
Fig. 20.1 Clulas de cncer de mama - Contraste de fase
Fig. 16.2 - Quimiotaxia de neutrfilos vs. bactrias - Contraste de fase
Fig. 15.2 Quimiotaxia de neutrfilos - DIC
Fig. 19.2 Rolagem de linfcitos - Contraste de fase
Fig. 23.10 Homing de linfcitos - DIC
Fig. 21.5 Clulas precursoras de de neurnios do hipocampo do crebro de embrio
de roedor - Contraste de fase + DIC
Fig. 1.1 Dana do queratcito - DIC

Microscpio de fluorescncia

Sondas de fluorescncia

Cell Biology interactive

Fig. 17.7 Fuso mittico / diviso de clula animal Fluorescncia

Tcnica de imunofluorescncia indireta (uso de anticorpos como ferramentas de estudo)

Anticorpos podem ser

acoplados a sondas
fluorescentes

Microscopia de fluorescncia

Microscpio de
contraste de

Microscpio de
fluorescncia

interferncia diferencial
DIC (Nomarski)

Microscpio de
fluorescncia (tcnica
de deconvoluo da

imagem)

Microscpio confocal
de varrredura a laser

Cell Biology interactive

Fig. 13.5 Fagocitose Fluorescncia
Fig. 13.6 Exocitose Fluorescncia
Fig. 15.1 Sinalizao de clcio / Gap junction Fluorescncia
Fig. 17.4 Fuso mittico / diviso de clula animal DIC
Fig. 17.6 Fuso mittico / diviso de clulas de embrio de mosca Fluorescncia
Fig. 18.1 Apoptose / blebbing de membrana e fragmentao do ncleo - Contraste de
fase e fluorescncia

Microscpio ptico confocal de varredura a laser

Microscpio de
fluorescncia

Microscpio confocal
de varrredura a laser

Imagem Tridimensional

Microscopia Confocal de Varredura a Laser

(a) Sperm triple-labeled with FITC-Pisum sativum lectin (acrosome - green); TOTO-3 iodide for
DNA (blue) and Nile red for membrane lipid (red). (b) Complete loss of the acrosome following
spermicidal treatment. Staining as in the image above. (c) Cultured epithelial cells triple
stained for the nucleus (blue), microtubules (green), and actin (red). Images were acquired
with a 20X objective (c) and a 100X objective (d).

Microscopia Confocal de Varredura a Laser (reconstruo tridimensional de imagens confocais)

Microscopia de fluorescncia

Hibridizao in situ de
RNA (Tcnica FISH
Fluorescent in situ
hybridization)

Microscopia de fluorescncia

Nanopartculas
fluorescentes

(quantum dots)

Microscopia de fluorescncia

Tcnica de
deconvoluo de
imagem (material
marcado com sonda
fluorescente que se liga

a DNA)

Cell Biology interactive

Fig. 25.6 Sinapse imunolgica / apresentao de antgeno Fluorescncia e
processamento de imagem

Estrutura de GFP
(protena com
cromforo
autofluorescente ativo)

Gene de GFP acoplado

ao gene ativo em
neurnios de mosca
(Tcnica de DNA
recombinante)

Cell Biology interactive

Fig. 24.3 Listeria nvadindo clula hospedeira Contraste de fase e fluorescncia com
marcao de GFP
Fig. 16.5 Dinmica de microtbulos in vivo - Fluorescncia com marcao de GFP
Fig. 23.14 Clulas-tronco embrionrias Contraste de fase e fluorescncia com
marcao de GFP

Cell Biology interactive

Fig. 10.6
FRAP / marcao com GFP de protenas de membrana de retculo
endoplasmtico e de protenas ancoradas na membrana nuclear interna

Cell Biology interactive

Fig. 21.3 Ondas de Ca2+ aps fertilizao de ovos de ourio do mar - Fluorescncia

Cell Biology interactive

Fig. 9.1 Laser tweezer Esquema
Fig. 10.1 Laser tweezer / Fluidez de membrana
Fig. 23.2 Laser tweezer / estereoclios

Uso de radioistopos como marcadores de clulas

Microscopia ptica de campo claro (Tcnica de autoradiografia pelo uso de radioistopos)

Microscpio eletrnico de transmisso

Microscpio eletrnico de varredura

Microscpio eletrnico de transmisso

Microscopia Eletrnica
Microscopia Eletrnica de Transmisso

Processamento de material para observao ao microscpio

Moldeira para
emblocamento
de material
biolgico em
resina

Agentes qumicos fixadores para processamento de material biolgico para microscopia eletrnica

Agente qumico fixador:

- mata e preserva as
clulas
- fixa estruturas em sua
posio original
- permeabiliza membranas
das clulas para entrada
de novos agentes
qumicos usados no
processamento do
material biolgico

ULTRAMICROTOMIA

CORTES SERIADOS (ultrafinos 50 a 80 nanmetros de espessura)

Grade de suporte para recolher cortes ultrafinos para observao ao MET

Microscopia Eletrnica

Grades de suporte para recolher cortes ultrafinos

para observao ao MET

Hexagonal 75 mesh

Quadrada 200 mesh

CONTRASTAO POSITIVA
Objetivo:
impregnar o material biolgico com metais pesados (Exs.: chumbo - afinidade por
DNA; uranila - afinidade por membrana) para aumentar o contraste da imagem.
Normalmente, a contrastao positiva feita aplicando os agentes contrastantes de
metal pesado diretamente sobre cortes ultrafinos recolhidos em grades de suporte
para MET

Contrastao
Acetato de uranila e citrato de chumbo

Imagem de uma bactria por microscopia eletrnica de transmisso

(contrastao positiva de corte ultrafino)

Imagem de uma clula eucaritica por microscopia eletrnica de

transmisso (contrastao positiva de corte ultrafino)

Ncleo

Complexo de
Golgi

Mitocndria

Imagem de uma clula

de fungo por
microscopia eletrnica
de transmisso
(contrastao positiva de
corte ultrafino)

Cell Biology interactive

Figs. 4.4 / 4.5 Estrutura do ncleo Microscopia eletrnica de transmisso
Figs. 9.2 / 9.3 / 9.4 / 12.8 Clula do fgado Microscopia eletrnica de transmisso
Figs. 13.7 / 13.8 Clulas do pncreas - Microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 12.9 Clula secretora pancretica - Microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 16.12 Tecido cardaco - Microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 16.13 Clula muscular cardaca- Microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 19.3 Junes entre culas musculares - Microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 23.11 Epitlio da traquia - Microscopia eletrnica de transmisso
Figs. 23.12 / 23.13 Clulas endoteliais do fgado - Microscopia eletrnica de transmisso
Figs. 23.4 / 23.5 / 23.6 Epitlio do intestino - Microscopia eletrnica de transmisso
Fig. 17.8 Cromossomos mitticos - Microscopia eletrnica de transmisso

Reconstruo tridimensional em microscopia eletrnica de transmisso

a partir de cortes seriados

Mtodos imunocitoqumicos em microscopia eletrnica de transmisso (MET) com a utilizao de

anticorpos acoplados a partculas de ouro coloidal (imunomarcao com ouro coloidal )
MET

Mic
RA
GD
GA

Anticorpos podem ser acoplados a esferas de ouro coloidal

(nano partculas eltron densas que variam de 5 a 40
nanmetros de dimetro)

Imunomarcao de protenas por MET pelo uso anticorpos acoplados a esferas de ouro coloidal

Mtodo de preparao da rplica da

superfcie de um espcime (material
biolgico) por sombreamento com metal

Rplica sombreada com metal

da
superfcie de um arranjo de protenas
filamentosas em um msculo de inseto
(rplica feita de material congelado
rapidamente em hlio lquido e submetido a
profundo descongelamento) e observada
em MET.

CONTRASTAO NEGATIVA
- Consiste no envolvimento
de partculas por metais
pesados e de fina
granulao, fornecendo
imagens de fundo escuro e
objeto claro
- Ideal para anlise de
suspenso viral, bactrias
e pureza de fracionamento
celular

Agente qumico contrastante:

PTA-CIDO FOSFOTUNGSTICO

CONTRASTAO NEGATIVA em MET

Bacterifago

Vrus da batata;

Adenovrus
(estudo de
forma e de
estrutura de
superfcie)

Adenovrus

Vrus da influena

Ultraestrutura de macromolculas

- Macromolculas podem ser

observadas por microscopia
eletrnica de transmisso
atravs da tcnica de
contrastao negativa,
depositadas diretamente nas
grades.
- Sua visualizao depende
da preparao de grades
recobertas com uma fina
camada de carbono para
posterior adsoro das
molculas a serem
analisadas.

Adsoro das macromolculas superfcie das

grades revestidas por material colide,
contrastao negativa e observao ao
Microscpio Eletrnico de Transmisso

Anlise por MET - Contrastao negativa de protenas

Molculas de 2M (nativa, quimiotripsina, plasmina e metilamina. Contrastao por

acetato de uranila. Aumentos - 200.000-600.000x. Delain et al. 1989.

Anlise por MET - Contrastao negativa de filamentos de actina

MET

Contrastao
negativa

Contrastao positiva de cortes

ultrafinos

Bacterifago T4

Msculo estriado de gua-viva

Bactria endocitada por um macrfago

Microscpio eletrnico de varredura - MEV

PROCESSAMENTO DE MATERIAL BIOLGICO PARA

MICROSCOPIA ELETRNICA DE VARREDURA - MERV

Imagem de uma
bactria por
microscopia
eletrnica de
varredura (MEV)

Microscopia eletrnica
de varredura - MEV

Microscopia ptica DIC

Microscopia eletrnica
de transmisso - MET

Imagens
(micrografias)
de estereoclios
de clula do
ouvido interno

Microscopia Eletrnica de Varredura

Embrio de camundongo

Lorryia formosa

Diatomcea

Formiga de fogo

Pata de Centopia

Microscopia Eletrnica de Varredura

Bactria
Pednculo
Matriz extracelular

b
Testemunho 02 (arenito)

Bactrias aderidas ao arenito por estruturas semelhantes

a pednculos (a) e envolvidas por substncia amorfa possivelmente matriz extracelular (a e b, setas).

TCNICA PARA PROCESASMENTO DE RPLICAS DE

CRIOFRATURA PARA ANLISE AO MICROSCPIO
ELETRNICO

TCNICA PARA
PROCESASMENTO
DE RPLICAS DE
CRIOFRATURA
PARA ANLISE AO
MICROSCPIO
ELETRNICO

Cell Biology interactive

Fig. 12.7 Criofratura de fungo - Microscopia eletrnica de transmisso

CRIOFRATURA

CRIOFRATURA

CRIOFRATURA:
FACE P
(PROTOPLASMTICA
voltada para o
citoplasma/Protoplasma
aps a fratura)

CRIOFRATURA:
FACE E
(EXTRACELULAR
voltada para o meio
Extracelular aps a
fratura)

MET (tcnica
de
contrastao
positiva) corte ultrafino
marcado com
esferas de
ouro coloidal

TOMOGRAFIA EM
MICROSCOPIA
ELETRNICA

Cell Biology interactive

Fig. 12.1 - Tomograma a partir de imagens de microscpio eletrnico de alta voltagem Compartimentos celulares / reconstruo tridimensional
Fig. 13.9 Vescula sinptica Tomograma de imagens de microscopia eletrnica de
transmisso
Fig. 14.1 Mitocdria Tomograma de imagens de microscopia eletrnica de transmisso

RECONSTRUO DE PARTCULAS POR

TOMOGRAFIA EM MICROSCOPIA
ELETRNICADE MATERIAL CONGELADO