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INTRODUCCIN

En el captulo anterior estudiamos la composicin qumica, estructura y funciones de los principales tipos de paredes celulares
procariticas. En este captulo trataremos un aspecto dinmico del tema de las paredes: cmo se sintetiza el peptidoglucano de las
eubacterias, y cmo se produce el proceso general de crecimiento de la pared, incluyendo el evento particular de formacin del septo
transversal que marca el nacimiento de dos clulas hijas. Nos concentraremos en la biosntesis del peptidoglucano, debido a su
inters intrnseco y aplicado (sobre este proceso actan diversos antibiticos, algunos de gran importancia clnica).
Desde el punto de vista topolgico, todas las capas de las envueltas bacterianas (membranas, pared celular) son
superficies cerradas sobre s mismas, fsicamente continuas para mantener la integridad y viabilidad de la clula.
Pero por otro lado, deben de ser susceptibles de expandirse durante el crecimiento por incorporacin de nuevos
materiales. Adems, todos los constituyentes deben crecer coordinadamente e incorporarse en los lugares precisos.
Por ejemplo, en el caso de las bacterias Gram-negativas, distintos componentes deben de ir a parar a diferentes
localizaciones: periplasma, PG, membrana externa, e incluso medio exterior.
Durante cada ciclo celular, hay una fase en la que los materiales de las envueltas (y concretamente, de la pared celular
que nos ocupa ahora) deben de facilitar la divisin de la clula en una descendencia de dos clulas hijas.
Finalmente, queda el problema de la energa. Los procesos biosintticos requieren aporte de energa qumica, pero el
ATP y compuestos similares no pueden salir del protoplasto.
Precisamente en este captulo vamos a ver algunas de las estrategias bioqumicas y moleculares que las bacterias han evolucionado
para solventar estos puntos para el caso del peptidoglucano. Veremos que la estrategia implica varias fases:
Sntesis de precursores en el citoplasma
Ensamblaje parcial en membrana
Transporte a la cara externa externa de la membrana
Ensamblaje final en el exterior, mediante reacciones que no precisan energa

2 BIOSNTESIS DEL PEPTIDOGLUCANO DE MURENA


Consta de 4 etapas:
1. Sntesis de precursores solubles en el citoplasma.
2. Estos precursores son transferidos a un transportador lipdico situado en la membrana citoplsmica (un poliisoprenol fosfatado
llamado undecaprenil-fosfato), donde se forman las unidades disacardicas con el pentapptido.
3. Las unidades disacardicas se polimerizan en cadenas lineales fuera de la membrana, pero an unidas al undecaprenil-fosfato de la
membrana.
4. Unin del polmero lineal as formado al peptidoglucano preexistente en la pared celular, por entrecruzamiento de (al menos) parte
de sus pptidos respectivos.
A estas etapas hay que aadir una fase adicional de regeneracin del transportador lipdico, una vez que ha cumplido su misin, para
que pueda ser operativo en un nuevo ciclo de sntesis.
Veamos, pues, en ms detalle, cmo ocurre este interesante proceso:

Fase 1:. Los monosacridos que luego van a constituir la unidad disacardica repetitiva del esqueleto del peptidoglucano (NAM y
NAG) se activan al unirse a uridn difosfato (UDP). (En general, los monosacridos que han de incorporarse a polmeros de pared
celular bacteriana se activan mediante su unin con nuclesidos-fosfato.)

Por lo tanto, en esta fase se sintetizan por separado:


NAG-UDP
NAM-UDP
Luego se va produciendo la adicin secuencial y ordenada de los distintos aminocidos al NAM (en reacciones que requieren
energa e iones Mn++):
1. L-ala
2. D-glu
3. m-DAP (u otro diaminocido; p. ej. L-lys en Staphylococcus aureus)
4. D-ala-D-ala
Observar que no se produce un tetrapptido, sino un pentaptido. El ltimo paso de adicin de aminocidos es la unin del
dipptido D-alanil-D-alanina, que se ha sintetizado en dos fases:
una racemasa convierte la L-ala a D-ala;
creacin de enlace peptdico entre dos D-ala.
Fase 2: El UDP-NAM-pentapptido se transfiere ahora a un transportador de membrana, llamado undecaprenil-fosfato (que
abreviaremos como Lip-P), en una reaccin catalizada por una translocasa especfica.
El undecaprenil-fosfato es un poliisoprenoide de 55 tomos de C (C55, derivado de la repeticin 11 veces de la unidad
isoprenoide, con un fosfato terminal). Se le conoce tambin con el nombre de bactoprenol, pero hoy se sabe que no es exclusivo de
bacterias. El bactoprenol permite el transporte y ensamblaje de sustancias que, como los azcares, son hidroflicas, y no podran pasar
por s mismas la barrera hidrofbica de la membrana.

Una vez que el NAM-pentaptido est unido al undecaprenil (por medio de pirofosfato), una transferasa transfiere a ste la
NAG desde el UDP-NAG. Se genera pues el enlace (14) entre NAG y NAM. Por lo tanto, se obtiene: Lip-P-PNAM(pentapptido)-NAG.
En esta situacin es cuando se producen la modificaciones que ya estudiamos en la estructura bsica del PG. Por
ejemplo: en Staphylococcus aureus el grupo -COOH del D-glutmico en posicin (2) es amidado (pasa a --CO-NH2. Por
otro lado, se introducen los puentes peptdicos, que en el caso de esta bacteria consisten en una pentaglicina, que se une
al grupo amino terminal de la L-Lys en posicin (3).
Tanto la traslocasa como la transferasa est localizadas en el lado citoplsmico de la membrana, de modo que el
precursor Lip-P-P-NAM(pentapptido)-NAG, en este momento est colgando hacia el citoplasma, anclado a la lmina
interna de la membrana a travs de bactoprenol.
Fase 3: Polimerizacin de varias unidades disacardicas: Ahora el bactoprenol se da la vuelta en la membrana (una
especie de flip-flop desde la capa interna hasta la externa), de modo que logra que el precursor resultante de la fase 2
quede expuesto hacia el medio acuoso exterior a la membrana. Entonces tiene lugar la polimerizacin de varias unidades
disacardicas: ello se logra en una reaccin de transglucosidacin. Consiste en la unin de cada unidad disacardica
(con su pentapptido) unida a su respectivo Lip-P-P, con el extremo libre (reductor) de una cadena preexistente que a su
vez est unida a otra molcula de Lip-P-P.
En el proceso se libera uno de los Lip-P-P (o sea, el undecaprenil, pero en forma pirofosforilada). Sobre este Lip-P-P acta una
fosfatasa especfica, que elimina el fosfato terminal, regenerndose el undecaprenil-fosfato, que queda dispuesto para otro ciclo como
el descrito.
Fase 4: El polmero surgido de la fase anterior es una cadena lineal de PG sin entrecruzar, y unido an al transportador lipdico de
membrana. Ahora este polmero naciente (con sus pentapptidos) reacciona, por transpeptidacin, con un PG aceptor preexistente. En
esta reaccin se ven implicados el grupo C=O de la D-ala (4) del PG naciente y el grupo -NH2 libre del diaminocido (3) del PG
aceptor (o del ltimo aminocido del puente peptdico).
Esto es lo mismo que decir que el enlace peptdico entre D-ala (4) y D-ala (5) del PG naciente se ve sustituido por otro
enlace peptdico, entre dicha D-ala (4) y el diaminocido del PG naciente.

La energa para esta reaccin la suministra la hidrlisis concomitante del enlace peptdico entre las dos D-ala terminales. Es
decir, en cada reaccin de transpeptidacin se libera una D-ala, correspondiente a la que ocupaba la posicin (5).
Ya dijimos en el captulo anterior que no todos los tetrapptidos participan en entrecruzamientos. Las D-ala terminales (en 5)
de los pptidos no implicados en tales entrecruzamientos son eliminadas por una enzima llamada D-D-carboxipeptidasa. Esta enzima
explica no slo que en el PG maduro existan tetrapptidos (y no los pentapptidos originales), sino tambin la existencia de tripptidos.
Muchas bacterias controlan el grado de entrecruzamiento de su PG maduro. Incluso algunas pueden eliminar totalmente
muchos de los pptidos originalmente unidos al NAM, mediante enzimas conocidas genricamente con el nombre de autolisinas. As

por ejemplo, Micrococcus luteus -un coco Gram-positivo- merced a su actividad NAM-L-ala-amidasa, presenta un PG que no est
entrecruzado en un 50-70%.
Antibiticos que actan a nivel de la biosntesis de peptidoglucano:
Estos antibiticos tienen un efecto bactericida sobre bacterias en crecimiento. Ello se debe a que, al inhibir determinados pasos
del ciclo de sntesis y ensamblaje del PG, provocan la acumulacin de precursores de dicho PG, lo que a su vez desencadena la
activacin de las autolisinas de la bacteria, que degradan el PG y que finalmente provoca la lisis celular (en medios hipotnicos), por
entrada masiva de agua a la clula.
1. Fosfomicina: acta inhibiendo la formacin del 3-O-D-lactil-ter de la NAG (o sea, del NAM). Parece ser que la base molecular
estriba en la semejanza estructural entre el este antibitico y el PEP (es decir, la fosfomicina es anlogo estructural del PEP, lo que
lleva a la inactivacin de la enzima correspondiente a esta reaccin).
2. Cicloserina: Se comporta como anlogo estructural de la D-alanina, por lo que inhibe la actuacin de la racemasa que convierte la
L-ala a D-ala, as como de la reaccin de unin de dos D-ala.
3. Tunicamicina: inhibe la traslocasa que cede el NAM unido hasta entonces al UDP y lo pasa al bactoprenol (fase 2).
4. Vancomicina y ristocetina: inhiben la segunda transglucosidacin (fase 3), es decir, la unin de diversas unidades disacardicas.
5. Bacitracina: se une al undecaprenol-pirofosfato, bloqueando su desfosforilacin, e impidiendo por lo tanto, la regeneracin del
transportador de membrana.
6. Antibiticos -lactmicos (p. ej.: penicilinas, cefalosporinas): inhiben la reaccin de entrecruzamiento por transpeptidacin.
(Estudiaremos su mecanismo de accin en ms detalle en el captulo 20 sobre Quimioterpicos y Antibiticos).

3 CRECIMIENTO DE LA PARED CELULAR


Como ya dijimos al comienzo de este tema, aunque la pared celular es una estructura cerrada y sin solucin de continuidad,
debe permitir su expansin (crecimiento), y esto supone que se han de romper ciertos enlaces si se quiere que el nuevo material se
ensamble con el preexistente mediante nuevas uniones, es decir, debe existir una accin concertada de muren-hidrolasas y de murensintasas. Por otro lado, hay que tener en cuenta que en el crecimiento de la pared celular se producen dos tipos de procesos: la
expansin (aumento de tamao) de esa pared, y la formacin del tabique transversal en el centro de la clula.
El crecimiento y septacin del peptidoglucano estn basados en la actividad controlada y localizada en puntos determinados, de
una gama de autolisinas, especialmente las dotadas de actividad transglucosidasa y/o transpeptidasa. Debido a que estas enzimas son
los sitios de accin de las penicilinas (y otros antibiticos -lactmicos), se les conoce tambin con el nombre de PBP (de penicillinbinding proteins; vase la tabla 1).
TABLA 1
Propiedades de las PBPs de Escherichia coli
PBP

Actividad enzimtica
conocida
Transglucosilasa/transpeptidasa

Posibles funciones

PBP 1, 1B

N molculas/
clula
100 cada una

PBP 2

20

Transpeptidasa

Crecimiento de la forma bacilar

PBP 3

50

PBP 4

110

Transglucosidasa/transpeptidas
a
D-D-endopeptidasa/

Sntesis de PG durante la septacin


(tabique)
Hidrlisis de los entrecruzamientos
durante la elongacin

D-Dcarboxipeptidasa

Sntesis de PG durante la
elongacin celular

PBP 5

1800

D-D-carboxipeptidasa

Destruccin del pentapptido no


entrecruzado

3.1 CRECIMIENTO DE LA PARED EN UNA BACTERIA GRAM-NEGATIVA:


Escherichia coli
El crecimiento de la pared en E. coli se puede considerar dividido en dos fases:
1. Crecimiento en longitud (elongacin), mientras la clula crece en tamao.
2. Produccin del tabique transversal (septacin), que conduce a la formacin de dos clulas hijas.
Elongacin
Las PBPs 1 son las encargadas de la elongacin de las cadenas de PG naciente (por transglucosidacin de las
unidades disacardicas) y simultneamente, por transpeptidacin, logran el entrecruzamiento.
Las cadenas nacientes del PG se intercalan en la parte cilndrica del sculo de PG gracias a que las PBP4 y PBP5
cortan enlaces del PG preexistente. La PBP2 interviene aqu tambin para transpeptidacin. La cadena de PG se va
elongando unidireccionalmente alrededor de la circunferencia de la clula. Se calcula que existen unos 200 sitios de
insercin de nuevo material en cada clula, dispersos de forma ms o menos uniforme por toda la superficie de la
clula. La maquinaria biosinttica tarda 8 minutos en completar cada circunferencia de elongacin.
Formacin del tabique transversal
La divisin de la bacteria por fisin binaria simtrica se logra por medio de una invaginacin circular de las envueltas (membrana
citoplsmica y peptidoglucano) en mitad de la clula madre. En el inicio de este proceso tiene un papel esencial la protena FtsZ, y ms
tarde intervienen otras protenas Fts.
FtsZ es una protena imprescindible, presente tanto en eubacterias como en arqueas, que muestra parecido con las tubulinas
eucariticas. Al parecer, al igual que las tubulinas, la FtsZ se une a GTP, con lo que se promueve su polimerizacin. Bajo control del

ciclo celular, la FtsZ se ensambla poco antes de la divisin en el centro de la clula, formando un anillo citocintico en el lado
citoplsmico de la membrana celular. Existen indicios fuertes de que la formacin de este anillo de FtsZ sealiza el sitio por donde se
producir la divisin y se activar el crecimiento del peptidoglucano del tabique transversal. Una vez que FtsZ ocupa el lugar del
futuro septo, entran en accin otras protenas Fts, formando un complejo llamado divisoma.
En las fotografas a microscopio electrnico se ve cmo bajo la invaginacin de membrana que constituye la avanzadilla
del septo, se localizan las molculas de FtsZ.
La hiptesis seala que los polmeros de FtsZ se van contrayendo, de modo que tiran de las envueltas hacia el interior, provocando
la tpica invaginacin alrededor del centro del bacilo, y que simultneamente, la FtsZ provoca la activacin de la PBP3 (=FtsI), que es
una transglucosidasa/transpeptidasa especfica del tabique transversal.
A microscopio electrnico se observa que este tabique est formado por dos lminas de PG (densas a los electrones) separadas
entre s por otra transparente. El final de la divisin ocurre como consecuencia de la invaginacin de la membrana externa entre las dos
lminas de PG.
Cmo se ensambla la membrana externa con relacin al PG? Parece ser que esta membrana se ensambla en buena medida por
procesos espontneos guiados por interacciones entre el LPS y protenas, sirviendo el PG subyacente como andamio que facilita el
montaje de toda la estructura. Parece ser que las zonas de adhesin (junturas de Bayer) son importantes para la correcta colocacin de
LPS y protenas de la membrana externa.

3.2 CRECIMIENTO Y SEPTACIN EN UNA BACTERIA GRAM-POSITIVA:


Enterococcus faecalis
A diferencia de lo visto en E. coli, en el enterococo (Enterococcus faecalis) el crecimiento del PG no es difuso, sino zonal,
comenzando en el centro (zona ecuatorial) y avanzando hacia afuera.
Vase en la figura el experimento de marcado de pared celular con anticuerpos fluorescentes, con ulterior seguimiento del
marcaje al microscopio:

tras unos 15 minutos despus del marcado se observa que existe una banda ecuatorial oscura (no marcada, por lo
tanto est constituida por material nuevo recin insertado), mientras que los polos de las clulas siguen enteramente
marcados.
Tras 30 o 60 minutos observamos clulas enteramente sin marcar, intercaladas entre clulas con uno de sus polos
marcados.
El proceso se puede describir as:
1. En la clula adulta antes de la divisin aparece una banda ecuatorial donde la pared celular se hace ms gruesa.
2. Debajo de esta zona engrosada (hacia el interior del citoplasma) se va depositando nuevo material, lo que marca el inicio de la
formacin del tabique transversal. Enseguida aparece una muesca en la banda ecuatorial.
3. El tabique, con un grosor doble al de la pared celular de la superficie celular, sigue avanzando, hasta que...
4. ... se completa. Simultneamente a los pasos 3 y 4 la zona de nueva sntesis de P.C. superficial alcanza el ecuador de las cellas
hijas nacientes.
5. El tabique completo de doble grosor va siendo escindido en dos mitades desde el exterior hacia el centro, por accin de autolisinas.
De esta forma se le adjudica a cada clula hija la nueva pared correspondiente a uno de sus polos (el otro procede, intacto, de la
clula madre).
Vase igualmente la figura que muestra en ms detalle la formacin del tabique. La idea que se saca del proceso en esta bacteria es que
posee una sola zona de crecimiento de PG, con dos regiones de deposicin de nuevo material: la regin del tabique transversal
propiamente dicho, y la regin adyacente, ya en la superficie celular, responsable de la expansin de la pared perifrica, a ambos lados
del tabique.

4 PROTOPLASTOS Y ESFEROPLASTOS

Mediante procedimientos de laboratario se puede lograr eliminar total o parcialmente la pared celular bacteriana. Se denominan
protoplastos las clulas bacterianas a las que se ha desprovisto totalmente de pared celular, mientras que esferoplastos son aquellas
clulas bacterianas que poseen restos de pared.
Obtencin. Existen dos posibles mtodos alternativos:
1. Por destruccin del entramado del PG mediante enzimas lticas (lisozima, peptidasas). En el caso de bacterias Gram-negativas,
previamente hay que desorganizar la membrana externa para hacerla permeable a estas enzimas. Ello se logra usando el quelante
EDTA y/o sometiendo las clulas a bajas temperaturas.
2. Por inhibicin de la formacin de nuevo PG en las clulas en crecimiento, tratndolas p. ej., con penicilina. Si se parte de un
mutante auxotrofo para un componente del PG basta hacer crecer a la bacteria en un medio carente de dicho componente.
Estos mtodos permiten:
en el caso de Gram-positivas, la desorganizacin total de su pared, por lo que se obtienen protoplastos;
en el caso de las Gram-negativas, quedan restos de membrana externa y de peptidoglucano atrapados en ella, por lo
que se obtienen esferoplastos.
En ambos casos, protoplastos y esferoplastos pueden revertir a la forma normal eliminando el tratamiento (retirando la lisozima, o la
penicilina).

Los protoplastos son osmticamente sensibles:


En un medio hipotnico, estallan (lisis osmtica)
En un medio iso- o hipertnico se mantienen.

Protoplastos y esferoplastos son formas osmticamente sensibles debido precisamente a que al no existir o estar desorganizado
parcialmente el PG, ya no se pueden contrarrestar las fuerzas de presin osmtica existentes en los medios hipotnicos en que
normalmente se cultivan o suspenden las bacterias. Por lo tanto, si se quieren obtener suspensiones estables de estas formas, hay que
obtenerlas en medios o soluciones isotnicos o ligeramente hipertnicos, para evitar su lisis:
soluciones de NaCl 0,25-0,5 M;
sorbitol o sacarosa 0,1-0,5 M;
polietilnglicol (PEG) al 7,5%.

En estos medios los protoplastos y esferoplastos poseen formas esfricas, independientemente de la forma que tuviera la bacteria con
pared de que proceden.
Se emplean en varios aspectos de investigacin bsica:
mtodo suave para luego obtener extractos libres de clulas y fracciones subcelulares.
en algunas bacterias, mtodo para hacerlas permeables al ADN, en experimentos de transformacin gentica.
para realizar fusin entre protoplastos de diferentes cepas de la misma especie e incluso entre especies distintas. Se
trata de un mtodo de obtencin de recombinantes somticos usado para determinados estudios genticos en
bacterias que no tengan sistemas naturales de transferencia gentica.

5 FORMAS L
Son clulas bacterianas carentes total o casi totalmente de P.C., con formas pleomrficas, irregulares y globulares, que se
producen de forma espontnea en algunas especies bacterianas (p. ej., Streptobacillus moniliformis) cuando se cultivan en medios a
base de suero (que son hipertnicos).
Las colonias de las formas L naturales son muy caractersticas: en huevo frito, bifsicas.
Se pueden obtener de forma inducida formas L en diversas bacterias Gram-positivas y Gram-negativas, tratndolas con
penicilina en medios hipertnicos.
Las formas L inestables se generan por tratamientos breves, y pueden revertir con frecuencia a la forma normal con pared.
Poseen algo de PG, aunque ste se encuentra alterado respecto al PG de la clula normal.
Las formas L estables se producen por tratamientos ms prolongados, y no suelen revertir al tipo normal. La mayora carecen
totalmente de peptidoglucano.
As pues, en las formas L el peptidoglucano ha sido eliminado total o parcialmente, pero de manera que ya no puede servir de
aceptor de nuevo PG.

BIBLIOGRAFA
CAPTULOS DE LIBROS DE REFERENCIA
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