1

1Comparacin de mtodos de extraccin de RNA para la deteccin por RT-PCR del

2Potato yellow vein virus (PYVV) en diferentes rganos de Solanum tuberosum Grupo
3Phureja
4Comparison of RNA isolation methods for Potato yellow vein virus (PYVV) detection
5by RT-PCR in different organs of Solanum tuberosum Group Phureja
6Ttulo corto: comparacin de mtodos de extraccin de RNA
7Hernndez Guzmn Anngie Katherine* , Guzmn-Barney Mara Mnica**
8* M.Sc. Bioqumica. Biloga. Instituto de Biotecnologa Universidad Nacional de
9Colombia, Sede Bogot, Colombia.
10** Ph.D. Virologa, M.Sc. Microbiologa. Biloga. Coordinadora del Laboratorio de Virus
11Vegetales del Instituto de Biotecnologa de la Universidad Nacional de Colombia, Sede
12Bogot, Colombia. mmguzmanb@unal.edu.co
13Resumen
14Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contiene genoma tripartita de
15ssRNA(+), se limita al floema y causa prdidas en la produccin. Es un virus re-emergente
16y cuarentenario en Europa y Estados Unidos. La deteccin se ha basado en RT-PCR, NASH
17y RT-PCR en tiempo real (RT-qPCR) en muestras de foliolo y tubrculo. Se desconoce
18como es la distribucin del virus en plantas infectadas lo que hace necesario establecer un
19mtodo de extraccin de RNA, que sea eficiente en la obtencin de material a partir de
20diferentes rganos. El objetivo de este trabajo fue comparar tres mtodos de extraccin de
21RNA: uno basado en Tioisocianato de guanidina (Trizol (Invitrogen)), uno que utiliza
22bromuro de hexadecil trimetil amonio (CTAB) y el mtodo fenol/cloroformo seguido por
23purificacin con columnas de Sephadex; para detectar el virus por RT-PCR en: foliolo,
24peciolo, pednculo floral, ptalos, tallo areo y subterrneo, antera y brotes de tubrculo; de
25plantas infectadas. Los mtodos de extraccin fueron evaluados en trminos de la
26integridad (relacin de la intensidad de las bandas de las subunidades ribosomales
2728S/18S), calidad (relacin de las lecturas espectrofomtricas 260/280nm) y rendimiento de
28los extractos. PYVV se detect por RT-PCR en todos los rganos analizados por los tres
29mtodos de extraccin. No se presentaron diferencias estadsticamente significativas entre
30los tres mtodos de extraccin; sin embargo, Trizol (Invitrogen) present mayor
31rendimiento, calidad e integridad; adems, permiti la deteccin del virus por RT-PCR en
32todos los rganos evaluados.
33Palabras claves: crinivirus, PYVV, extraccin, Trizol, CTAB, Sephadex.

34Abstract
35Potato yellow vein virus (PYVV, Crinivirus/Closteroviridae), contains a tripartite genome
36with ssRNA(+), is phloem limited and can affect yield reduction. PYVV is a re-emergent
37virus and is a quarantine pathogen in Europe and United States. The detection has been
38based in RT-PCR, NASH and real time RT-PCR (RT-qPCR) in leaflets and tuber shoots
39samples. It is not known how is the distribution of PYVV within infected plants, for that is
40necessary to establish an efficient RNA isolation method for obtaining material from
41different organs. The objective of the present work was to evaluate three RNA isolation
42methods:
a
Trizol
(Invitrogen)
based
method,
a
method
using
43hexadecyltrimethylammonium bromide (CTAB) and the phenol chloroform method
44followed by Sephadex columns purification; for virus detection using RT-PCR in: leaflets,
45petiole, peduncle, petals, stem, aerial and subterranean roots, anther and shoot tuber; of
46infected plants. The isolation methods were tested in terms of integrity (ratio of band
47intensity of 28S and 18S ribosomal subunits), quality (absorbance 260/280 ratio) and total
48yield. PYVV was detected by RT-PCR in all organs analyzed by the three isolation
49methods. There were no significant differences found among the three isolation methods,
50although, Trizol (Invitrogen) presented high yield, quality and integrity, furthermore
51Trizol (Invitrogen) allowed the virus detection using RT-PCR in all analyzed organs.
52
53Key words: Crinivirus, PYVD, Trizol, CTAB, Sephadex.
54Recibido: octubre 10 de 2012
55Aprobado: junio 15 de 2013
56Introduccin
57Potato yellow vein virus(PYVV) es un virus re-emergente, limitado al floema, miembro de
58la familia Closteroviridae, del gnero Crinivirus (Salazar et al., 2000; Martelli et al.,
592011); sus partculas son filamentosas (Salazar et al., 2000) y su genoma es tripartita
60ssRNA(+) (Livieratos et al., 2004). Potato yellow vein disease (PYVD) fue observada por
61primera vez por Alba (1950) en Antioquia (Colombia) y debido al incremento en las
62poblaciones del vector (Trialeurodes vaporariorum, Westwood; Buritic, 1971) y al
63transporte de tubrculos-semilla, el virus se ha dispersado en Colombia y pases vecinos
64(Venezuela, Per y Ecuador) (Salazar et al., 2000). Los sntomas de PYVD son un
65amarillamiento intervenal que comienza en el pice y se va extendiendo al resto de la
66lmina foliar adems reduce la produccin (Salazar et al., 2000; Guzmn et al., 2011). Por
67esta razn, es considerado un patgeno cuarentenario por agencias fitosanitarias como
68OEPP-EPPO (European and Mediterranean Plant Protection Organization) y USDA 69APHIS (United States Department of Agriculture - Animal and Plant Health Inspection
70Service) (OEPP/EPPO, 1979; USDA APHIS, 2000).
71En la actualidad no existen mtodos serolgicos para la deteccin de este virus, debido a
72que no hay un anticuerpo comercial anti-PYVV, en este momento el laboratorio de virus

73vegetales del IBUN, trabaja en la obtencin de un anticuerpo para la deteccin de este

74virus. PYVV se ha detectado cualitativamente a partir de muestras de foliolo, por medio de
75tcnicas moleculares como NASH (Salazar et al., 2000), RT-PCR (Offei et al., 2004;
76Guzmn et al., 2006; 2010; Wei et al., 2009) y cuantitativamente por qRT-PCR (Lpez et
77al., 2006);
78Para que las tcnicas basadas en amplificacin de genes sean exitosas y se disminuya al
79mximo la posibilidad de detectar falsos negativos, es necesario contar con extractos de
80RNA de buena calidad y cantidad, en particular cuando se van a utilizar tcnicas
81cuantitativas. Hay que tener en cuenta que algunos rganos de plantas de papa presentan
82una alta oxidacin, tienen paredes celulares, pigmentos, polisacridos, polifenoles y otros
83metabolitos secundarios que coprecipitan con el RNA afectando el rendimiento y calidad de
84los mismos (Claros y Canovas, 1998; Kim y Hamada, 2005).
85La seleccin de un mtodo de extraccin de RNA en diferentes rganos, posibilita la
86deteccin del PYVV tanto a nivel cualitativo; como a nivel cuantitativo; permitiendo
87analizar algunos aspectos de la biologa de PYVV como su distribucin y dispersin en
88diferentes rganos de plantas, as como la contribucin de diferentes rganos en la
89transmisin de este virus; como por ejemplo la transmisin sexual la cual no se ha podido
90demostrar para este virus, la deteccin de PYVV en rganos reproductores como antera
91podran ayudar a dilucidar algunas caractersticas relacionadas con este tipo de transmisin.
92Adicionalmente, esta informacin resulta til en programas de fitomejoramiento, de
93certificacin de semillas e indexacin de material vegetal.
94Para la extraccin de RNA a partir de muestras de plantas infectadas se puede utilizar
95diferentes mtodos, dentro de los que se encuentran kits comerciales (ej. Qiagen, MoBio,
96Sigma, Promega, entre otros) que son rpidos pero costosos cuando se requiere hacer el
97diagnstico en un alto nmero de muestras; otros mtodos podran ser ms econmicos y
98eficientes para diagnosticar virus, como por ejemplo el mtodo comercial basado en
99Tioisocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen) (Chomczynski, 1993);el mtodo basado en
100CTAB (Chang et al., 1993; Lpez et al., 2006), y el mtodo fenol/cloroformo
101(Schneiderbauer et al., 1991), razn por la cual fueron seleccionados en este estudio.
102PYVV se limita al floema, pero no se ha reportado su deteccin en diferentes rganos de
103plantas infectadas. El objetivo de este trabajo fue evaluar tres mtodos de extraccin, para
104obtener RNA a partir de diferentes rganos (tallo, foliolo, peciolo, raz, pednculo floral,
105ptalos y anteras) de plantas de S. tuberosum Grupo Phureja infectadas con PYVV; con el
106propsito de determinar cul mtodo es el ms apropiado para la deteccin del virus por
107RT-PCR, a partir de diferentes rganos de plantas infectadas. En el trabajo se compararon
108tres mtodos de extraccin: uno que utiliza CTAB (Lpez et al., 2006), uno basado en
109Tioisocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen) (Chomczynski, 1993), y el mtodo de
110fenol/cloroformo seguido de una purificacin con columnas de Sephadex G-50 (Guzmn et
111al., 2006); en trminos de integridad, rendimiento, calidad y amplificacin del gen CP112PYVV.
113

114Materiales y Mtodos
115Material vegetal y aislados virales
116Se recolectaron tres plantas completas de papa criolla que expresaban sntomas para
117PYVD, en el municipio de Chipaque (Cundinamarca), con una edad aproximada de dos
118meses. Estas fueron sembradas en matera, utilizando como sustrato una mezcla de
119tierra:cascarilla de arroz (3:1) y se mantuvieron durante dos meses a temperatura ambiente
120en el Instituto de Biotecnologa (IBUN). Se regaron con agua dos veces por semana y se
121fertilizaron con 15:15:15 (Nitrgeno: Fsforo: Potasio), el da de la siembra en matera y un
122mes despus. Se hizo control para hongos aplicando una vez a la semana Benlate 0.1% y
123para el control de mosca blanca, dos aplicaciones semanales de Karate 1.5cc/L.
124De cada planta se tomaron muestras de tallo subterrneo y areo, brotes de tubrculo,
125foliolo, ptalo, antera y pednculo floral de S. tuberosum Grupo Phureja. Se evaluaron 84
126muestras por cada mtodo de extraccin (10 por cada rganos, excepto para antera, slo se
127analizaron cuatro muestras debido a que la abundancia es baja dentro de las plantas).
128Mtodos de extraccin de RNA
129Las muestras recolectadas fueron pulverizadas con nitrgeno lquido y posteriormente se
130hizo extraccin de RNA utilizando los tres mtodos de extraccin que han sido reportados
131en estudios de PYVV: uno que utiliza CTAB (Lpez et al., 2006), uno basado en
132Tioisocianato de guanidina (Trizol, Invitrogen) (Chomczynski, 1993), y el mtodo de
133fenol/cloroformo seguido de una purificacin con columnas de Sephadex G-50 (Guzmn et
134al., 2006) (En la tabla 1 se muestran algunas caractersticas de los tres mtodos de
135extraccin). Para Trizol (Invitrogen) el procesamiento se hizo teniendo en cuenta las
136instrucciones del fabricante; en el mtodo basado en CTAB de acuerdo al protocolo
137propuesto por Lpez et al., (2006); y en el mtodo fenol/clorofomo seguido por
138purificacin con columnas de SephadexG-50 considerando el protocolo sugerido por
139Guzmn et al., (2006).Todos los extractos de RNA fueron resuspendidos en 30l de agua
140tratada con DEPC y almacenados a -20C hasta su procesamiento.
141Tabla 1. Caractersticas de los tres mtodos de extraccin.

Referencia
Cantidad de
material vegetal
procesado
Rompimiento de
las clulas

Trizol
(Invitrogen)
Chomczynski (1993)

Lpez et al., (1993)

Fenol:cloroformo
Sephadex
Guzmn et al., (2006)

100mg

150mg

100mg

Sarkosyl
Tioisocianato de Guanidina

CTAB
Cloroformo:Isoamilalcohol

SDS

142
143Tabla 1. Continuacin

CTAB

Denaturacin
de protenas e
inhibicin de
RNasas
Eliminacin de
carbohidratos
Eliminacin de
Polifenoles
Precipitacin de
RNA

Trizol
(Invitrogen)
Sarkosyl
Cloroformo
Fenol
Tioisocianato de Guanidina
Fenol
Cloroformo

CTAB
Cloroformo: isoamil-alcohol
EDTA

Fenol
Cloroformo
EDTA

Cloroformo

Fenol
Cloroformo

Cloroformo

Cloroformo: isoamil-alcohol
PVP-40
Na2SO3

Fenol
Cloroformo

LiCl

Purificacin con
columnas de
Sephadex

Isopropanol

CTAB

Material
RNA total
RNA total
extrado
Tiempo
1h 30min
2h
Precio*
$5.500
$3.000
144*Valor aproximado por reaccin en pesos colombianos

Fenol:cloroformo
Sephadex

RNA de doble cadena

45min
$4.000

145Evaluacin de los tres mtodos de extraccin

146Los extractos de RNA fueron evaluados en trminos del rendimiento (ng de RNA /mg de
147material), relacin de absorbancias 260/280nm (calidad), relacin de la intensidad de las
148bandas de las subunidades ribosomales 28S/18S (integridad) y deteccin de PYVV por RT149PCR.
150El rendimiento se estim a partir de la concentracin de los extractos de RNA, que se
151determin por fluorimetra con el kit Quant-iTTM RiboGreen Assay (Invitrogen), teniendo
152en cuenta las instrucciones del fabricante.
153La calidad fue una medida indirecta de la presencia de contaminantes proteicos que se
154estableci por espectrofotometra; se diluy 10l del extracto de RNA con 990l de agua
155tratada con DEPC y utilizando una celda de cuarzo de 1ml se hicieron lecturas a 260 y
156280nm en un espectrofotmetro SmartSpec TM Plus (BIO-RAD), se calcul la relacin
157260nm/280nm, la cual debe tener un valor superior a 1.8, asumiendo que cuando el valor es
158igual a 2 el extracto es puro (Sambrook et al., 1989; Staub et al., 1995).
159La integridad se determin a partir de geles denaturantes de agarosa 1% con formaldehido,
160posteriormente se estim la intensidad de las bandas correspondientes a las subunidades
16128S y 18S utilizando el software ImageJ 1.37 (Rasband, 1997). Finalmente se calcul el
162radio de las intensidades 28S/18S. Se considera que un RNA que se encuentra casi intacto
163debe presentar una relacin 28S/18S igual o superior a dos (Conde et al., 2012).
164RT-PCR

165Los extractos obtenidos por las tres metodologas de extraccin fueron evaluados por RT166PCR utilizando una pareja de primers para la deteccin del gen CP-PYVV (Primer forward
167F2: 5 AAG CTT CTA CTC AAT AGA TCC TGC TA 3, Primer reverse 3: 5 CTC GAG
168GAT CCT CAT GGA AAT CCG AT 3) (Rodrguez et al., 2009). La sntesis de cDNA se
169llev a cabo en un volumen final de 10l adicionando una mezcla de 1X buffer de reaccin
170(Epicentre), 1mM de dNTPs (Bioline), 10mM de DTT (Epicentre), 0.4M de primer
171reverse 3, 1.6U de RNAseinhibitor (Fermentas), 8U de MMLV HP (Epicentre) y 100ng de
172RNA. Se incub durante una hora a 42C seguida de una denaturacin a 70C por 10min.
173Las reacciones de amplificacin contenan 1.6l de cDNA, 1X de buffer NH4 (Bioline),
1742.5mM de MgCl2 (Bioline), 0.4M de dNTPs (Bioline), 0.4M de cada primer (F2 y 3) y
1751U de Biolasa (Bioline) en un volumen final de 10l. El programa de amplificacin
176consisti de una denaturacin inicial a 94C durante 3min, 35 ciclos de denaturacin a 94C
177durante 1min, alineamiento a 55C durante 1min y extensin a 72C durante 1min, y una
178extensin final a 72C durante 10min. En las reacciones se incluyeron los controles
179descritos en la tabla 2.
180Tabla 2. Muestras control incluidas en las reacciones de amplificacin.

Control
Positivo
Negativo

Muestra
Planta de S. tuberosum Grupo Phureja sintomtica para PYVD que haba
resultado positiva por RT-PCR para el gen CP-PYVV
Planta de S. tuberosum Grupo Phureja Clon 1 obtenida a partir de cultivo de
meristemos in vitro (libre de virus)
Planta de Citrofortunella madurensis, Lour; infectada con el virus Citrus
tristeza virus (CTV).

181Los productos de PCR fueron visualizados en geles de agarosa 1% preparados en TAE 1X

182(0.04M Tris-Acetato, 0.001M EDTA) y teidos con SYBRSafe (Invitrogen), corridos a
18370V constantes durante una hora y visualizados en digitalizador Gel Doc (BIO-RAD).
184Anlisis Estadsticos
185Los anlisis estadsticos se realizaron utilizando el Software R (R Development Core Team,
1862008). Se calcul la desviacin estndar, coeficiente de variacin (CV%) inter-ensayo
187(porcentaje de la desviacin estndar en comparacin con el promedio) y el promedio del
188rendimiento, la integridad y calidad por cada mtodo de extraccin y por cada rgano . La
189distribucin de todos los datos fue evaluada utilizando el test de normalidad Shapiro Wilk.
190Debido a que no presentaron una distribucin normal las comparaciones entre los rganos
191por mtodo de extraccin y entre mtodos de extraccin por rgano se determinaron
192mediante la aplicacin de una prueba Mann-Whitney acompaada de la correccin de
193Bonferroni a nivel de significancia (p<0.05) para controlar la tasa de error (Yuan et al.,
1942006). Adicionalmente, se realiz un anlisis de componentes principales para evaluar las
195relaciones entre los parmetros cuantitativos.
196Resultados y Discusin

197Rendimiento de la extraccin de RNA, radio de la absorbancia 260/280nm y radio de la

198intensidad de las subunidades ribosomales 28S/18S.
199El rendimiento de RNA obtenido con Trizol (Invitrogen) fue casi el doble y
200significativamente mayor (414.25 24 ngRNA/mg de material) que el de los otros dos

201mtodos de extraccin (Sephadex: 283.17 14.43 y CTAB: 248.99 16) (p<0.05)

202entre los que no se present diferencias significativas (tabla 3). Al evaluar el rendimiento
203por rgano, el mayor promedio se present en los extractos obtenidos por Trizol
204(Invitrogen) para todos los rganos (tabla 4), y aunque en todos los casos el rendimiento no
205fue significativamente mayor (solamente en antera, foliolo y peciolo; p<0.05), la tendencia
206mostr que con Trizol (Invitrogen), haba una mayor probabilidad de obtener un
207rendimiento ms alto que el alcanzado con los otros dos mtodos de extraccin. Antera y
208pednculo floral fueron los rganos en los que se present el mayor rendimiento de
209extraccin, cuyos valores fueron superiores a 500ng RNA/mg de tejido vegetal, mientras
210que la mayora de los rganos presentaron un rendimiento menor (tabla 4).
211De acuerdo a la relacin de las lecturas espectrofomtricas a 260nm y 280nm, en los
212extractos obtenidos por Trizol (Invitrogen) el rango estuvo entre 1.65 y 2.05, lo que indica
213que por este mtodo de extraccin la contaminacin con protenas fue baja, mientras que
214con los otros dos mtodos de extraccin (que presentaron rangos similares) el rango fue
215ms amplio mostrando que en algunos extractos hubo contaminacin con protenas (tabla
2163). Al evaluar la calidad por rgano no se present diferencias estadsticamente
217significativas entre los tres mtodos de extraccin, a pesar de esto por Trizol (Invitrogen)
218se obtuvo el mayor promedio de la relacin 260/280nm en la mayora de los rganos (tabla
2194), lo que indica que hay una mayor tendencia a obtener mejor calidad (relacin 260/280nm
220cercana a dos) cuando se utiliza este mtodo, sugiriendo que este resultara ms eficiente en
221la eliminacin de protenas que los otros dos mtodos.
222Tabla 3. Resumen de resultados en los parmetros evaluados

Trizol
Promedio del rendimiento
(ng RNA/mg material vegetal)
Rango de la calidad
(260/280nm)
Rango de la integridad
(28S/18S)
Muestras amplificadas por RT-PCR

414.25

CTAB
248.99

Sephadex
283.17 14.4

24

16

1.65 2.05

1.34 1.93

1.39 1.98

1 1.98

1.17 2.13

0.87 1.97

75/84

71/84

72/84

223Con respecto a la integridad, se observ que en la mayora de las muestras, en los geles
224agarosa denaturantes se visualizaron dos bandas claras, que representan las subunidades
225ribosomales 18S y 28S. La integridad fue similar en los tres mtodos de extraccin (tabla

2263), con un rango entre uno y dos, indicando que en algunos extractos se present
227degradacin de RNA, mientras que en otros se conserv la integridad.
228En la tabla 4 se observan los valores de la relacin de las intensidad de las bandas 28S/18S
229en cada rgano por mtodo de extraccin, en ningn rgano se present diferencias
230significativas entre los tres mtodos (p>0.05), sugiriendo que la integridad no es afectada
231por el mtodo de extraccin. Adicionalmente, se pudo observar que raz presento la menor
232integridad con respecto al resto de los rganos, esto puede deberse a que raz es muy difcil
233de macerar, y la maceracin es crtica para conservar la integridad del RNA, si este proceso
234no se realiza adecuadamente se puede producir la liberacin de nucleasas que conducen a la
235degradacin de los cidos nucleicos.
236Tabla 4. Resultados de RT-PCR, rendimiento, calidad e integridad obtenidos en los
237extractos obtenidos a partir de diferentes rganos utilizando los tres mtodos de extraccin
238de RNA
Rendimiento
Calidad
Integridad
RTError
rgano Extraccin
Error
Error
PCR Promedio estnda %CV Promedio
%CV Promedio
estndar
estndar
r
CTAB
4/4
583,84
25,32
8,67
1,69
0,031
3,64
1,56
0,13
Antera
Sephadex
4/4
638,78
24,24
7,59
1,78
0,029
3,25
1,63
0,07
Trizol
4/4
956,71
74,25
15,52
1,83
0,018
2,00
1,66
0,04
CTAB
9/10
109,72
11,30
32,57
1,62
0,045
8,84
1,37
0,03
Foliolo
Sephadex
8/10
253,56
11,70
14,59
1,67
0,030
5,71
1,59
0,05
Trizol
9/10
414,54
23,88
18,22
1,89
0,031
5,16
1,74
0,03
CTAB
7/10
50,12
7,09
44,74
1,80
0,029
5,13
1,41
0,05
Sephadex
8/10
100,88
9,84
30,83
1,78
0,021
3,67
1,67
0,03
Peciolo
10/1
Trizol
0
216,27
8,64
12,63
1,89
0,029
4,83
1,75
0,04
10/1
CTAB
0
607,86
47,56
24,74
1,73
0,029
5,37
2,02
0,03
Pednculo
Sephadex
9/10
613,16
31,14
16,06
1,65
0,046
8,76
1,77
0,10
floral
10/1
Trizol
0
876,29
33,86
12,22
1,86
0,025
4,24
1,69
0,03
CTAB
7/10
238,53
13,21
17,51
1,77
0,022
3,95
1,38
0,05
Sephadex
8/10
240,34
9,63
12,67
1,80
0,035
6,12
1,41
0,04
Ptalo
10/1
Trizol
0
301,47
15,98
16,77
1,82
0,030
5,20
1,52
0,06
10/1
CTAB
0
98,18
9,11
29,34
1,71
0,031
5,83
1,54
0,04
Tallo
Sephadex
9/10
148,11
7,23
15,44
1,59
0,047
9,25
1,43
0,06
Trizol
8/10
224,04
11,94
16,85
1,92
0,023
3,81
1,82
0,03
CTAB
9/12
275,17
17,63
22,19
1,72
0,021
4,24
1,44
0,03
Brote de
Sephadex
7/10
202,62
13,03
20,33
1,72
0,037
6,71
1,63
0,06
Tubrculo
Trizol
8/10
327,54
21,77
21,02
1,85
0,020
3,45
1,82
0,03
CTAB
8/10
143,56
10,83
23,85
1,75
0,021
3,82
1,54
0,04
Raz
Sephadex
9/10
164,54
8,52
16,37
1,81
0,039
6,77
1,52
0,07
Primaria
Trizol
9/10
165,02
13,95
26,73
1,81
0,011
2,00
1,55
0,05
Raz
CTAB
8/10
133,96
7,07
16,69
1,72
0,021
3,89
NA
NA
Secundari Sephadex
8/10
186,51
14,50
24,58
1,70
0,020
3,79
1,00
0,05

%CV
8,67
7,59
15,52
32,57
14,59
18,22
44,74
30,83
12,63
24,74
16,06
12,22
17,51
12,67
16,77
29,34
15,44
16,85
22,19
20,33
21,02
23,85
16,37
26,73
NA
24,58

Trizol

7/10

246,39

11,70

15,01

1,80

0,033

5,77

0,85

0,04

239El promedio del rendimiento se estim en ng de RNA/mg de material vegetal procesado.

240Para poder seleccionar el mejor mtodo de extraccin teniendo en cuenta las variables
241analizadas, se hizo un anlisis de componentes principales (ACP), eligiendo el mtodo que
242presentara mayor calidad e integridad, parmetros que tienen gran influencia sobre la
243amplificacin por RT-PCR. En la figura 1 se muestran los resultados de este anlisis, en
244donde en la figura 1A se encuentra el circulo de correlaciones entre las tres variables,
245integridad y rendimiento se encuentran correlacionadas; mientras que calidad (260/280nm)
246es independiente de estos dos parmetros. Este anlisis mostr que al relacionar la
247integridad, la calidad y el rendimiento no se encontr diferencias estadsticamente
248significativas entre los tres mtodos de extraccin, lo que ya se haba observado al analizar
249cada uno de los parmetros independientemente (figura 1B), a pesar de esto los resultados
250sugieren que con Trizol (invitrogen) los extractos presentan mejor calidad, rendimiento e
251integridad, los otros dos mtodos de extraccin fueron prcticamente idnticos en trminos
252de los tres parmetros analizados debido a que los datos se sobrelaparon.
253Al evaluar los grupos formados en el ACP segn rgano (figura 1C) se encontr que se
254formaron tres grupos: uno formado por foliolo, peciolo, ptalos, tallo, tallo subterrneo y
255brotes de tubrculo; pednculo floral y antera que fueron los rganos que presentaron
256mayor rendimiento e integridad; y raz secundaria que fue el rgano que present los
257menores valores en los tres parmetros evaluados (en particular en integridad). Estos
258resultados sugieren antera y pednculo floral podran ser tiles a la hora de seleccionar
259rganos de plantas de papa para procesos de extraccin de RNA porque en estos dos
260rganos se presentaron los mayores valores de rendimiento, integridad y calidad.

15,01

10

10

261
262Figura 1. Grficos del ACP. A. Crculo de correlaciones entre rendimiento, integridad y
263calidad. B. Agrupacin de los resultados del ACP segn mtodo de extraccin. C.
264Agrupacin de los resultados del ACP segn rgano. D. Agrupacin de los resultados del
265ACP segn resultado de RT-PCR.
266RT-PCR del gen CP de PYVV
267Para una sntesis de cDNA viral adecuada y el subsecuente uso para amplificacin de
268genes, es necesario partir de una extraccin de RNA, que permita obtener un material de
269alta cantidad y cantidad. Para evaluar los extractos obtenidos por los tres mtodos de
270extraccin de RNA en los rganos analizados se amplific el gen completo de la protena
271mayor de la cpside de PYVV. Se obtuvo amplificados del tamao esperado (769pb) en
272todos los rganos evaluados por los tres mtodos de extraccin (tabla 3 y figura 2), aunque
273en algunos rganos el porcentaje de deteccin no fue del 100% (tabla 4).

11

11

274
275Figura 2. Gel de agarosa 1% de los productos de RT-PCR del gen de la protena mayor de
276la cpside con extractos de todos los rganos evaluados extrados con las tres metodologas
277de extraccin (Tamao esperado 759pb). Para los tres geles M corresponde al marcador de
278peso molecular GeneRuler 100pb (Fermentas), carril 1: antera, carril 2: foliolo, carril 3:
279peciolo, carril 4: pednculo floral, carril 5: ptalo, carril 6: brote de tubrculo, carril 7: tallo,
280carril 8: tallo subterrneo, carril 9: raz secundaria, carriles 10 y 11: controles positivos,
281carril 12: muestra de S. tuberosum Grupo Phureja obtenida a partir de cultivo de
282meristemos y carril 13: muestra de C. madurensis, Lour infectada con CTV.
283
284Por Sephadex se pudo amplificar el gen de la protena mayor de la cpside de PYVV en el
28583.3% de las muestras analizadas, por CTAB en el 85.7% y por Trizol (Invitrogen) en el
28689.3%. En algunos rganos (foliolo, brote de tubrculo, tallo subterrneo y raz secundaria)
287no se logr detectar el virus en todas las muestras evaluadas por los tres mtodos de
288extraccin, aunque hay que tener en cuenta que se logr detectar entre el 70% y el 90% de
289las muestras evaluadas, en antera se logr la deteccin en todas las muestras obtenidas por
290los tres mtodos de extraccin, en pednculo floral se logr detectar el virus en casi todas
291las muestras (29/30) (tabla 4).
292Estos dos rganos fueron los que presentaron el mayor rendimiento, pero no se puede
293relacionar la deteccin del virus por RT-PCR con el rendimiento de la extraccin de RNA,
294debido a que el agrupamiento del ACP por resultado de RT-PCR indic que no hubo
295diferencias significativas en trminos de los tres parmetros evaluados entre muestras RT296PCR positivas y negativas (figura 1D).
297Raz present un bajo porcentaje de deteccin de PYVV por RT-PCR que en los dems
298rganos (tabla 4), adems fue el rgano en el que se present menor rendimiento, calidad e
299integridad (tabla 4 y figura 1C), esto podra ser debido a la acumulacin diferencial de
300algunas sustancias en este rgano que afectan los procesos de extraccin. Por ejemplo los
301polisacridos, presentan un mayor contenido en la zona radical de plantas de papa (St302Pierre et al., 1996), es posible que en los tres mtodos utilizados no se haya eliminado
303completamente estas sustancias lo cual interfiri con los extractos obtenidos a partir de este
304tejido.
305Otra de las sustancias que hace que raz sea menos adecuada para la deteccin del virus es
306que se acumula la polifenol oxidasa (PPO) que es la enzima relacionada con el
307pardeamiento enzimtico, la cual se distribuye principalmente en tejidos en desarrollo como

12

12

308por ejemplo flores y en la zona radical (Thygesen et al., 1995). Se esperara que en estos
309rganos se vea afectada la extraccin de RNA, lo cual se evidenci en las muestras de la
310zona radical en donde se obtuvieron los menores valores de los tres parmetros evaluados
311(tabla 4 y figura 1C) y el menor porcentaje de deteccin de PYVV por RT-PCR, pero no se
312relacion con flor (pednculo, antera y ptalos), a pesar de que hay una alta acumulacin de
313esta enzima en este rgano, en los extractos obtenidos los valores de los tres parmetros
314fueron aceptables, adems por RT-PCR se logr la deteccin del virus (figura 2)
315(confirmando que los extractos obtenidos eran adecuados en procesos de sntesis de cDNA
316y amplificacin), lo que sugiere que los procesos de extraccin permitieron la eliminacin
317de estas sustancias en los extractos obtenidos a partir de rganos florales, es posible que el
318procesamiento del material vegetal sea ms fcil en muestras de rganos florales que en la
319zona radical de la planta en donde en el proceso de maceracin se da oxidacin del material
320(probablemente por la actividad de la enzima PPO).
321Diferencias entre los tres mtodos de extraccin
322Algunas diferencias entre los mtodos de extraccin podran afectar el rendimiento,
323integridad y calidad. El detergente utilizado para el rompimiento de las clulas y la
324denaturacin de protenas fue diferente en los tres mtodos: en Sephadex se utiliz el
325detergente aninico SDS; con el mtodo basado en CTAB se emple la accin conjunta del
326detergente catinico CTAB y del cloroformo:isoamilalcohol, algunos autores han reportado
327el uso de ms de un detergente para potenciar las actividades llevadas a cabo por estas
328sustancias (Niu et al., 2008); y en Trizol (Invitrogen) adems de la utilizacin del
329detergente aninico Sarkosyl, esta funcin es complementada con la actividad del agente
330caotrpico tioisocianato de guanidina, que tambin es utilizado por su actividad de
331inhibicin de RNasas, aspecto crtico en los protocolos de extraccin porque afecta el
332rendimiento, la calidad y la integridad; el tioisocianato de guanidina es muy eficiente para
333cumplir con esta funcin, debido a que puede actuar sobre cualquier RNasa, lo que no
334ocurre con EDTA, sustancia utilizada para cumplir con esta funcin en los otros dos
335mtodos de extraccin, este es un agente quelante y slo acta sobre las nucleasas que
336tienen como cofactor Mg2+(Sambrook et al., 1989) (tabla 1); adems hay que tener en
337cuenta que Trizol (Invitrogen) tiene otros agentes denaturantes fuertes (no revelados) (Liu
338et al., 1998) haciendo que este mtodo sea ms eficiente que los otros dos en trminos del
339rompimiento de las clulas y denaturacin de protenas.
340El rendimiento tambin puede ser afectado por la precipitacin, la cual fue diferente entre
341los tres mtodos, en particular en Sephadex, en donde no se hace una precipitacin como
342tal, en este mtodo los extractos son purificados a travs de columnas de Sephadex G-50,
343recuperando molculas de alto peso molecular (RNA), en la resina quedan atrapadas
344molculas pequeas como polifenoles y sales (contaminantes entre 1.5 Y 30KDa)
345(Amershan Biosciences, 2002). En los otros dos mtodos de extraccin si se hace una
346precipitacin, pero la sustancia utilizada en cada mtodo fue diferente; en Trizol
347(Invitrogen) se utiliza isopropanol, que es eficiente para la precipitacin de RNA, pero si no
348se usa a la temperatura y el tiempo adecuado, se puede ocasionar la precipitacin de otras
349sustancias como protenas y carbohidratos, por lo tanto la fase inicial (fase de extraccin)

13

13

350debe ser realizada con el objetivo de separar estas sustancias, para que no se sedimenten en
351la fase de precipitacin; en el mtodo basado en CTAB se utiliza LiCl el cual permite hacer
352una precipitacin diferencial del RNA, su gran utilidad se ha atribuido a que este no es
353eficiente para precipitar sustancias como DNA, protenas y carbohidratos, permitiendo una
354precipitacin eficiente del RNA (Barlow et al., 1993). A pesar de esto, Chan et al., (2004) y
355Rubio y Zapata (2011) han reportado que en algunas ocasiones, las altas concentraciones de
356LiCl pueden contribuir con un incremento en las cantidad de impurezas (polifenoles y
357carbohidratos), afectando la concentracin y calidad del RNA (Chan et al., 2004) (tabla 1).
358A pesar de que con Trizol (Invitrogen) se obtuvo el mayor promedio del rendimiento, hay
359que prestar atencin al tipo de molculas que se recupera en la extraccin; en Trizol
360(Invitrogen) y CTAB se obtiene RNA total, mientras que por Sephadex el material
361recuperado es RNA de doble cadena, estas estructuras son tpicas de los virus, a pesar de
362que los extractos obtenidos por este mtodo no presentaron un rendimiento tan alto, estos
363extractos estaran enriquecidos en RNAs de origen viral (tabla 1).
364Otro parmetro a tener en cuenta es el tiempo requerido para el procesamiento, este
365contribuye en el mantenimiento de la integridad de los extractos. Entre los tres extractos,
366Sephadex fue el que present menor tiempo de procesamiento, a pesar de esto este
367parmetro no afect la integridad, debido a que los valores de integridad fueron similares
368entre los tres mtodos de extraccin.
369Con respecto a los costos, los mtodos utilizados en este trabajo resultan ms econmicos
370que algunos kits comerciales. CTAB fue el ms econmico y sera una excelente opcin
371cuando se necesita hacer la evaluacin de un alto nmero de muestras, este fue seguido de
372Sephadex y el de mayor valor fue Trizol (Invitrogen) (tabla 1).
373Conclusin
374En trminos de rendimiento, calidad e integridad no se presentaron diferencias
375estadsticamente significativas entre los tres mtodos de extraccin y los tres permitieron la
376deteccin del virus en todos los rganos evaluados, sin embargo, los resultados sugirieron
377que los extractos obtenidos por Trizol (Invitrogen) tenan una mayor probabilidad de
378presentar mayor rendimiento y una menor contaminacin con protenas, adems es un
379mtodo rpido que permiti la amplificacin de CP-PYVV a partir de cualquier rgano;
380estos atributos lo hacen un buen mtodo de extraccin para la deteccin de PYVV por RT381PCR en diferentes rganos de plantas infectadas.
382Los resultados obtenidos en este trabajo son tiles para monitorear la presencia,
383acumulacin, y dispersin del virus en diferentes rganos, lo que puede ser de gran utilidad
384para el apoyo de los programas de fitomejoramiento, de certificacin de semillas e
385indexado de material vegetal.

14

14

386Agradecimientos
387Esta investigacin se realiz gracias al apoyo econmico y tcnico del Ministerio de
388Agricultura y Desarrollo Rural de Colombia y a Colciencias (201010016538).
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