Estudos para Seleção de Mestrado em Biologia Molecular

Heidi Muniz
Material de estudo para selecao de mestrado em Biologia

Molecular
Abril de 2015
Sumario
1
Estrutura da Cromatina
Regulac
ao da estrutura da cromatina
Replicac
ao e Reparo de DNA
Transcric
ao
11
Traduc
ao
19
Organelas e Membranas
21
Estrutura de protenas
26
Enovelamento de protenas
29
Enzimas
30
10 Crescimento Microbiano
32
11 Divis
ao celular bacteriana
38
12 Archaea
40
13 Biofilme
42
Captulo 1
Estrutura da Cromatina
Pegadinha : O genoma humano est
a distribudo em 23 pares de cromossomos, totalizando 46 cromossomos.
Porem, existem 24 tipos de cromossomos, pois 22 pares realmente, cada par e um de um tipo, mas para o 23o
par, um cromossomo e de um tipo (X) e o outro e de outro tipo (Y), logo 22 + 2 = 24 tipos de cromossomos.
Cromatina : complexo entre DNA e protenas, principalmente histonas. Estas protenas dobram e empacotam o DNA em uma estrutura mais compacta.
Cada cromossomo corresponde a uma u
nica molecula de DNA, associada a protenas, bastante compacta.
OBS: o cromossomo bacteriano, tambem tem DNA associado a protenas, no entanto, estas protenas s
ao
diferentes daquelas do cromossomo eucarioto.
Cromossomos hom
ologos: s
ao os membros de um par de cromossomos, sendo um cromossomo de origem
materna e e outro de origem paterna. O u
nico par de cromossomos nao homologos e o par de cromossomos
sexuais.
cromossomos mit
oticos: cromossomos na mitose, que estao altamente condensados. cromossomos interf
asicos: cromossomos na interfase, e cuja cromatina apresenta-se como finos cordoes, emaranhados e
alongados no n
ucleo.
H
a 3 sequencias que controlam a replicacao e divisao dos cromossomos:
Origens de replicac
ao: e nestas sequencias que se inicia a replicacao.
Centr
omeros: regi
oes onde as duas copias de um cromossomo duplicado se ligam, e no centromero que se
forma o cinetocoro (complexo proteico) necessario para que o fuso mitotico se prenda aos cromossomos
e realize a separac
ao das crom
atides irmas.
Tel
omeros: regi
ao da extremidade de uma molecula de DNA, possui varias copias de sequencias repetidas, e assegura a replicac
ao completa da molecula de DNA, alem disso a fita simples de repetic
oes
polimerizada pela telomerase projeta-se para dentro da dupla helice, evitando sua degradac
ao, e permitindo que a telomerase estenda numa proxima replicacao, o telomero.
Na cromatina existem dois tipos de protenas ligadas ao DNA:
Histonas : estas protenas possuem uma grande proporcao de aminoacidos carregados positivamente
(arginina e a lisina), que lhes permitem ligar-se mais facilmente ao DNA, negativamente carregado.
Protenas n
ao histonas: est
ao envolvidas com outras funcoes, como replicacao e expressao genica.
Nucleossomo: nvel mais b
asico de organizacao cromossomica ou ainda subunidade estrutural b
asica da
cromatina, que consiste de DNA enrolado em um n
ucleo de protenas histonas. Cada cerne nucleoss
omico e
formado por um complexo de oito protenas histonas: duas de cada : H2A, H2B, H3 e H4, enrolado por um
segmento de DNA.
Cada segmento de DNA ligando nucleossomos chama-se DNA de ligacao. Conformacao das histonas:
dobra de histona, com 3 alfa-helices e 2 alcas.
CAPITULO 1. ESTRUTURA DA CROMATINA
Existe uma outra histona, H1, se liga a um em cada 10 nucleossomos. A H1 e a mais pesada, dentre as
tambem
histonas citadas e tem a maior porcentagem de arginina-lisina. Ela nao faz parte do octamero. E
chamada de histona ligadora.
O DNA e as histonas interagem por interacoes nao covalentes:
Ligac
oes de hidrogenio
Interac
oes i
onicas
Interac
oes hidrof
obicas
Dobramentos: as histonas disp
oem-se no cerne nucleossomico, de modo que sua extremidade N-terminal
fique projetada para fora do cerne. Essas caudas N-terminal das histonas estao sujeitas a diferentes modificac
oes covalentes, que acabam por determinar a estrutura e funcao da cromatina. O DNA tambem sofre
dobramentos ao redor do cerne de histonas, forcando uma compressao da cavidade menor da helice. Algumas
sequencias ligam-se aos nucleossomos mais fortemente que outras.
O DNA enrolado em um nucleossomo e bastante dinamico, se desenrola e enrola rapidamente (cerca de 4
vezes por segundo) ao cerne nucleoss
omico; permitindo assim que outras protenas ligadoras de DNA acessem
o DNA que estava enrolado em um nucleossomo. Desse modo, a maioria do DNA em um nucleossomo isolado
est
a em princpio, disponvel para interagir com outras protenas.
Complexo de remodelamento da cromatina: complexo proteico que catalisa um afrouxamento adicional
das interac
oes entre DNA e histonas, sendo que este processo envolve como participante da reacao o ATP,
ou seja, o processo envolve a presenca de ATP.
H
a varios complexos de remodelagem: SWISNF, NURF, RSC.
Estes complexos podem gerar 3 tipos comuns de remodelagem
As histonas podem deslizar pelo DNA, alterando a posicao de uma sequencia de DNA ligada ao cerne
nucleoss
omico.
Alterac
ao do espacamento entre octameros de histonas, alterando assim as posicoes de sequencias
individuais em relac
ao `
a protena.
Um ou mais oct
ameros podem ser totalmente deslocados do DNA, originando lacunas desprovidas de
nucleossomo (ou lacunas de DNA livre).
A regulac
ao da transcric
ao bacteriana pode ser explicada com o modelo de equilbrio (DNA nao ligadoDNA
ligado a protena) dependente da concentracao de protenas. O stio de ligacao do DNA e ocupado quando
a concentrac
ao da protena ligadora de DNa e suficientemente alta. Quando o stio de ligacao e ocupado, o
estado de express
ao do DNA e afetado. Alteracoes nas concentracoes de ativadores e repressores, afetar
ao a
express
ao genica a qualquer momento.
ESte modelo de equilbrio dependente de concentracao nao e valido para eucariotos, devido à estrutura
da cromatina. Se um fator de transcricao estiver ligado ao DNa livre, as histonas nao conseguem se ligar ao
DNa para formar nucleossomo. O inverso e valido: se o DNa estiver enrolado num octamero de histonas, n
ao
e possvel um fator de transcric
ao se ligar ao DNA.
Cada um destes estados, o primeiro em que o gene e expresso, e o outro em que o gene nao e expresso,
e dito est
avel, pois o estado n
ao muda se for alterada a concentracao dos componentes livres. Ou seja, se o
DNa est
a ligado a fatores de transcric
ao e RNA polimerase, nao importa se houver aumento da concentrac
ao
de histonas, estas n
ao conseguir
ao se ligar ao DNa e o gene continuara no estado de expressao ativo. O
contr
ario vale para o estado em que o DNA esta como componente de nucleossomo.
Regi
oes do DNA na superfcie do nucleossomo sao acessveis à clivagem por determinadas nucleases. As
enzimas DNAase I e DNAase II clivam fita simples de DNA, e geram escadas de eletroforese cujo intervalo
entre fragmentos e de 10 pb. Nem todos os stios sao clivados com a mesma frequencia, alguns s
ao mais
eficientemente clivados que outros. Como os padroes de bandas de eletroforese dos fragmentos de DNA
clivado por DNAase I, DNAase II e radical hidroxil sao os mesmos, supoe-se que o que determina o padr
ao
e primariamente a organizac
ao o DNA, e com apenas alguma preferencia discreta por stios particulares
imposta pela enzima individual. Pode-se associar a ausencia de clivagem em stios do DNA associado no
nucleossomo a posic
oes do DNA inacessveis.
CAPITULO 1. ESTRUTURA DA CROMATINA
Na transcric
ao, a RNA pol inicia a sntese de RNA em um segmento de DNA nao impedido por nucleossomos. MAs para que a RNa pol prossiga a transcricao, os nucleossomos a sua frente devem ser deslocados. Isto
ocorre por meio da ac
ao de fatores de transcricao que recrutam complexos de remodelagem, os quais por meio
de um processo ativo, promovem o deslocamento dos nucleossomos para a regiao adjacente a de transcric
ao.
Os oct
ameros reorganizam-se na regi
ao deixada para tras da transcricao. A protena FACT (facilitadora da
transcric
ao da cromatina), atua como fator de elongacao de transcricao, pois altera a estrutura do oct
amero
e consequentemente e prov
avel que faca parte do complexo de remodelagem.
Explicando a chatice dos stios hipersensveis Um stio hipersensvel à clivagem por nucleases, e um
stio bastante suscetvel a clivagem. Geralmente os genes ativos possuem stios hipersensveis a clivagem, e
isto e essencial para sua transcric
ao. A sensibilidade aumentada a nucleases esta associada à exclus
ao de
nucleossomos. Logo, o DNA em stios hipersensveis nao esta organizado em nucleossomos, e assim, est
a
mais exposto a enzimas que outras regioes. Traduzindo, a importancia da presenca destes stios a montante
de promotores de genes ativos, e que estes stios permitem a ligacao de protenas necessarias a transcric
ao.
Existem ainda regi
oes que ficam protegidasquando sao flanqueadas por stios hipersensveis. Por protegidas
entenda-se que se ligam protenas n
ao-histonas. Nos stios hipersensveis tambem se ligam protenas, que
regulam e impedem a ligac
ao do oct
amero de histonas ao DNA do stio. Conclusao da historia: um domnio
que contem um gene transcrito pode ser definido por uma sensibilidade aumentada à degradacao por DNase
I.
Isoladores: stios que impedem a propagacao de um efeito (intensificador ou silenciador ) da transcric
ao.
Estes isoladores s
ao flanqueados por stios hipersensveis, ou seja, por DNA nao associado a histona. Um
isolador pode ter uma ou as duas propriedades:
Isolador situado entre um stio intensificador e um promotor; impede que o intensificador ative o
promotor.
Isolador situado entre heterocromatina e o promotor de um gene; protege o gene contra o efeito inativador que se dissemina a partir da heterocromatina.
LCR: regi
ao de controle de l
ocus corresponde a um grupo de genes hipersensveis, sao essenciais a express
ao
de cada gene em um domnio de v
arios genes consecutivos.
A estrutura de cromatina descrita ate agora nao e a estrutura que o DNA assume dentro de um n
ucleo.
Na verdade, o DNA encontra-se compactado sob a forma de uma fibra de 30 nm de diametro, em vez da
estrutura de colar de contas. Esta fibra de cromatina e resultante do empilhamento de nucleossomos. H
a
diferentes modelos moleculares para explicar esta fibra de 30 nm de cromatina. Um modelo e o de ziguezague, outro e o de solen
oide, etc. Apesar de ainda nao ser completamente satisfatorio o conhecimento atual
sobre os detalhes moleculares da fibra de 30 nm, sabe-se que dois importantes fatores que determinam o forte
empilhamento de nucleossomos s
ao: a cauda da H4 e a histona H1.
Captulo 2
Regulacao da estrutura da cromatina

H
a dois tipos gerais de estrutura de cromatina presentes no eucariotos: heterocromatina e eucromatina.
Heterocromatina: forma altamente condensada; ocorre em regioes de poucos genes, e estes normalmente
s
ao silenciados pela alto grau de compactacao. A heterocromatina deve ser vista como um conjunto de
diferentes tipos de estrutura de cromatina altamente compactada.
Eucromatina: forma menos condensada.
Efeitos posicionais: reposicionar um gene da eucromatina para uma regiao de heterocromatina tem como
resultado o silenciamento do gene.
Modificac
oes de histonas: acetilac
oes, mono, di e trimetilacao de lisinas fosfosrilacao de serinas
Grande parte destas modificac
oes ocorre nas cadeias laterais das caudas N-terminais das histonas, que se
projetam para fora do nucleossomo. No entanto, modificacoes nas cadeias laterais de aminoacidos do cerne
globular do nucleossomo tambem ocorrem.
Todas estas modificac
oes s
ao catalisadas por enzimas especficas, ex:
acetil-transferase de histonas: catalisa acetilacoes nas histonas complexo de desacetilases de histonas:
catalisa a retirada dos grupos acetilas adicionados metil-transferase de histonas: catalisam metilac
oes nas
histonas complexo de demetilases de histonas: catalisam a retirada dos grupos metila adicionados à histonas
Todas estas enzimas s
ao recrutadas por protenas de regulacao genica. A acetilacao de lisinas tende a
afrouxar a estrutura de cromatina visto que o grupo acetil remove a carga positiva da lisina, reduzindo a
afinidade das caudas aos nucleossomos adjacentes. Porem, o efeito mais drastico da modificacao de histonas e
que histonas modificadas atraem protenas especficas para um segmento de cromatina, e estas novas protenas
determinam como e quando os genes serao expressos. Portanto, a estrutura da cromatina determina a
express
ao de genes nela empacotados, que por sua vez determinam a estrutura e funcao de uma celula
eucari
otica.
Alem das modificac
oes covalentes, a presenca de variantes de histonas atuam para produzir um c
odigo de
histonas, que auxilia a determinar a funcao biologica.
A acetilac
ao e a metilac
ao s
ao mutuamente exclusivas, ou seja, uma lisina nao pode ser acetilada e
metilada ao mesmo tempo.
C
odigo de histonas: muitas modificacoes parecem ter um significado especfico para a celula, pois determinam como e quando o DNa empacotado nos nucleossomos sera acessado. Ex: um tipo de marca pode
indicar que o DNa foi replicado recentemente, outro tipo de marca pode indicar que o DNa esta danificado,
outro tipo pode indicar quando e como a expressao genica deve ocorrer. Parece que existem moleculas de um
complexo de leitura de c
odigo que identificam as modificacoes e sinalizam a acao a ser tomada. As marcas
nos nucleossomos s
ao constantemente removidas e adicionadas, sendo a velocidade dependente da localizac
ao
cromoss
omica.
Existem dois tipos de heterocromatina, a constitutiva e a facultativa. Predominantemente a heterocromatina ocorre nos centr
omero e nos tel
omeros.
Efeito posicional variegado: variacao na expressao de um gene devido à inativacao aleatoria deste gene
em uma populac
ao de celulas homogeneas. Este efeito e causado frequentemente por justaposicao entre a
regi
ao do gene e um bloco heterocromatina. Ressalta-se que quando o gene fica muito proximo ou sobreposto
a regi
ao de heterocromatina, este gene e silenciado.
DA ESTRUTURA DA CROMATINA
CAPITULO 2. REGULAC
AO
Complexo de leitura e escrita de c

odigo de histonas: as protenas de regulacao genica recrutam complexos
multisubunidades, que possuem protenas que promovem as modificacoes nas histonas (escrevem), seguidas
por protenas que reconhecem estas modificacoes (leitura). Assim, as enzimas de escritas e as protenas de
leitura trabalham em conjunto para marcar os nucleossomos, um a um. Muitos destes complexos de leitura
e escrita possuem tambem protenas de remodelagem de cromatina, que juntamente com ATP condensam
ou descondensam longos segmentos de cromatina à medida que as protenas de leitura se deslocam pelos
nucleossomos.
Fibras de cromatina:
10 nm: a fibra de 10 nm aparece no microscopio como colar de contas, isto e, uma sequencia de
nucleossomos, quando o DNA extrado e exposto a nuclease micrococcica.
30 nm: e a estrutura que de fato ocorre na celula, requer a presenca de H1. Para observ
a-la ao
na verdade um solen
microsc
opio e necess
ario expor o DNa a uma solucao de maior forca ionica. E
oide,
em que cada volta possui cerca de 6 nucleossomos dispostos num arranjo helicoidal e cada volta empilhase formando uma fibra com formato em S (solenoide).
Acetilac
ao est
a associada a dois eventos: replicacao (fase S) e ativacao da expressao genica.
Ap
os ser replicado, o DNA precisa novamente enovelar-se às histonas para formar nucleossomos, porem,
antes de serem incorporadas aos nucleossomos as histonas sao acetiladas na lisina da cauda N-terminal do
tetr
amero de H3 e H4. Especula-se que a acetilacao de histonas auxilie a controlar as interacoes protenaprotena `
a medida que as histonas s
ao incorporadas ao nucleossomo.
Quanto `
a express
ao genica, a acetilacao de histonas em regioes adjacentes a promotores esta associada
a ativac
`
ao da express
ao genica. Alem dos eventos de acetilacao de genes individuais, ha casos em que a
acetilac
ao ocorre em larga escala, como no caso do cromossomo X inativo em femeas de mamferos, cujas
histonas H4 s
ao subacetiladas. Enquanto o cromossomo X em machos de Drosophila e superativo, porque
existe acetilac
ao aumentada de H4. Este exemplo sugere que a acetilacao esta associada a ativac
ao da
express
ao genica, determinando uma estrutura de cromatina menos condensada. Ressalta-se que quando
a acetilac
ao est
a envolvida com a transcricao, a acetilacao ocorrem nas caudas de histonas que j
a est
ao
incorporadas `
a cromatina.
Como dito anteriormente, as modificacoes de histonas sao catalisadas por enzimas especficas. Ex: HAT:
histona acetil-transferase, HDAC: histona desacetilase. Ha dois tipos de HAT, grupo A e grupo B.
Grupo A: as HATs catalisam a acetilacao de histonas ja presentes na cromatina e estao envolvidas no
controle da transcric
ao.
Grupo B: as HATs catalisam a acetilacao de histonas recem-sintetizadas no citosol, e estao envolvidas
na montagem dos nucleossomos.
Efeitos da acetilac
ao: a acetilac
ao pode ser necessaria para afrouxar a estrutura da cromatina, e na
replicac
ao pode facilitar o processo de incorporacao de histonas a novos cernes. Na transcricao a acetilac
ao
pode provocar mudancas na estrutura da cromatina, como o deslocamento de histonas do DNa, ou ainda
pode criar stios de ligac
ao para protenas necessarias à transcricao.
Acetilases est
ao associadas a ativadores, uma prova disso e que algumas das proprias protenas j
a sabidamente envolvidas com a transcric
ao possuem domnios de acetilases.
As desacetilases revertem o efeito das acetilases, e estao associadas a repressores de transcric
ao. A
ausencia de acetilac
ao ocorre na heterocromatina, tanto na constitutiva(centromero e telomeros) quanto na
facultativa(regi
oes inativadas em uma celula, embora permanecam ativadas em outras). Tipicamente as
caudas N-terminal da H3 e H4 n
ao s
ao acetiladas na heterocromatina.
Captulo 3
Replicacao e Reparo de DNA

Replicacao
origem de replicac
ao: local onde ocorre a abertura inicial das fitas de DNa, para que estas possam ser
replicadas.Geralmente s
ao sequencias especificas.
Diferenca b
asica entre replicac
ao de procariotos e eucariotos: Procariotos possuem apenas uma origem
de replicac
ao, enquanto eucariotos podem possuir varias origens de replicacao.
Forquilha de replicac
ao: junc
ao em forma de Y que se forma a partir da origem de replicacao. A partir
da origem, formam-se duas forquilhas que seguem direcoes opastos, e à medida em que se delocam pelo DNa,
abrindo a fita dupla, s
ao replicadas ambas as fitas de DNa. Como as forquilhas formadas a partir de uma
origem deslocam-se uma em cada direcao, a replicacao de eucariotos e procariotos e dita bidirecional.
Acredita-se que forquilhas de replicacao deslocam-se mais lentamente em eucariotos devido à presenca de
estruturas de cromatina bastante compactas e enoveladas.
Principais protenas envolvidas na replicacao
DNA polimerase: catalisa a adic
ao de nucleotdeos à extremidade 3OH da nova fita nascente. Para isso,
a DNA polimerase utiliza a hidr
olise do nucleosdeo trifosfato que possui uma ligacao fosfoanidrido rica em
energia. A energia liberada da quebra desta ligacao e usada para polimerizar a fita nascente, estabelecendo
ligac
ao entre a extremidade 3OH de um nucleotdeo ja incorporado, com grupo 5fosfato do nucleotdeo a
ser incorporado.
Importantssimo: Por que a DNa polimerase so polimeriza na direcao 5para 3 ?
Porque se ela polimerizasse na direcao 3 para 5 , o 3 OH do nucleosdeo trifosfato a ser incorporado
atacaria a extremidade 5 trifosfato, a quebra resultante da ligacao fosfoanidrido da extremidade 5 libera
energia para a polimerizac
ao. No entanto, se a DNa polimerase verificar que o nucleotdeo anterior est
a
incorretamente pareado, ela o remove, e como consequencia, teramos uma extremidade 5monofosfato, e
portanto, o 3OH do pr
oximo nucleotdeo correto nao atacaria a extremidade 5monofosfato e tampouco esta
pode ser clivada para liberar energia para polimerizacao visto que ja foi clivado anteriormente seu trifosfato.
Sendo assim, ap
os a remoc
ao de um nucleotdeo incorreto, a fita de DNA nao poderia mais ser alongada. Por
isso, a DNA polimerase s
o polimeriza de 5 para 3 e verifica e remove de 3 para 5, caso contrario, ela n
ao
seria capaz de alongar a fita de DNA apos executar a edicao do mesmo.
Girase: enzima que usa ATP para abrir a fita dupla de DNA;
SSB(protena ligadora de DNA de fita simples): se ligam a uma fita simples de DNA, impedindo que esta
volte a parea com a fita complementar durante a replicacao.
grampo deslizante: protena que se liga ao DNA impedindo que a DNa polimerase se solte do DNa
topoisomerase: enzima que usa ATP para cortar DNA, permitir que ele gire, e depois restaura a ligac
ao
fosfodiester quebrada. Topoisomerase I quebra fita simples, a Topoisomerase II quebra fita dupla. Sua func
ao
e importante porque o deslocamento das forquilhas de replicacao causam giros na molecula de DNa, e isto
iria gerar um problema de emaranhamento do DNa, tendo como consequencia impedimentos à continuidade
da replicac
ao `
a frente da forquilha. Para evitar este emaranhamento, a topoisomerase rotaciona a molecula
de DNa logo `
a frente da forquilha.
7
E REPARO DE DNA
CAPITULO 3. REPLICAC
AO
primase: enzima que produz primers que servirao para iniciar a replicacao.
DNa polimerase I : retira primer de RNa ou fragmentos incorretos de DNA, e susbstitui por DNa, logo,
usando a atividade exonuclease 5 para 3; tambem tem atividade exonuclease 3 para 5. Atua no reparo.
DNa polimerase II: atividade de exonuclease de 3 para 5. Atua no reparo.
a mais
DNa polimerase III: polimeriza DNA de 5 para 3; atividade de exonuclease de 3 para 5. E
r
apida para polimerizar, e por isso atua na replicacao.
DNa ligase: liga fragmentos de DNa, como os de OKAzaki
obs: todas estas DNa polimerases, I, II e III sao bacterianas.
Replicase: DNa polimerase que participa da replicacao
nos eucariotos existem as polimerases alfa, delta e epsilon que sao necessarias para replicacao do DNA
nuclear. As outras DNA polimerases s
ao usadas no reparo.
DNA polimerase Beta est
a envolvida no reparo nuclear.
DNA polimerase gama : replicac
ao, reparo e recombinacao mitocondrial
DNA polimerase alfa: inicia a sntese de uma nova fita de DNA (tanto a contnua quanto a descontnua);
ao se ligar no complexo de iniciac
ao na origem, esta replicase sintetiza um primer, seguido de um pequeno
fragmento de DNA. Em seguida ela e substituda por outra polimerase para elongar a fita (este evento
chamamos de troca de polimerase).
DNA polimerase delta: elonga a fita contnua
DNA polimerase epsilon: elonga a fita descontnua, e faz outras funcoes
Problema da replicacao na extremidade telomerica
Na extremidade de um cromossomo linear, a DNa polimerase encontra uma dificuldade para costurar
para tr
asna fita retardada, pois para que ela polimerize e sempre necessario um primer para formar um
fragmento de Okazaki. No entanto, a primase aparentemente nao consegue se ligar à extremidade do DNA e
por isso n
ao sintetiza o primer. E mesmo que conseguisse, a DNa polimerase I que retira RNa e susbstitui por
DNa n
ao conseguiria faze-lo porque com a extremidade preenchidade por primer, nao haveria extremidade
3OH livre para que a DNA polimerase I se ligasse ao DNA.
Para contornar este problema, procariotos tem cromossomos circulares. Ja os eucariotos, os quais possuem
cromossomos lineares, resolvem a questao com a telomerase. ESta enzima produz DNa a partir de RNA,
portanto tem atividade de transcriptase reversa de 5 para 3. A regiao telomerica possui varias c
opias n
ao
codificantes ricas em G, porque a telomerase polimeriza estas copias na fita molde a partir de um molde interno
de RNA. A extremidade do tel
omero e alongada para permitir que a fita descontnua seja completamente
replicada, ent
ao geralmente a extremidade do DNa molde que permanece como fita simples adentra-se na
dupla helice formando uma alca, chamada de alca t, para proteger-se de degradacao. O envelhecimento est
a
associado com a diminuic
ao da atividade da telomerase e progressivo encurtamento dos telomeros.
Fases da replicacao
Iniciac
ao
Elongac
ao
Terminac
ao
Replicon: unidade de DNA em que ocorre um ato individual de replicacao. Possui um origem, de onde
partem as forquilhas de replicac
ao. E pode possuir uma terminacao, onde a replicacao e finalizada. Um
genoma eucarioto tem v
arios replicons, enquanto que procariotos possuem somente um replicon.
A enzima Dam metilase adiciona grupos metil a adenina da sequencia GATC (e na sua complementar)
de origens de replicac
ao. Isto implica uma maneira de regular a replicacao. A replicacao so se inicia em
uma origem que tiver as duas fitas da sequencia GATC metiladas, o que chamamos de DNA metilado, e caso
apenas uma das fitas esteja metilada no stio de metilacao GATC, isto significa que a replicacao ja se iniciou
naquela origem, ou seja, quando numa origem o DNA e hemimetilado, nao se inicia replicacao. Uma protena
identifica a fita n
ao metilada, caso exista uma lesao, uma endonuclease cliva a fita nao metilada desde o stio
GATC ate o local de les
ao e depois o segmento excisado e ressintetizado, e ligado no ponto de clivagem.
E REPARO DE DNA
AO
ORC: complexo de reconhecimento de origem; e um complexo proteico que reconhece a origem de re mais bem estudado em S. cerevisiae; as origens de replicacao deste fungo recebem o nome de
plicac
ao. E
ARS (sequencia de replicac
ao aut
onoma). Estas sequencias especiais sao reconhecidas pelo complexo ORC.
provavel que eucariotos tenham v
E
arias origens de replicacao, a fim de assegurar que o cromossomo inteiro
seja replicado em tempo h
abil caso algumas origens falhem. Protenas que formam o ORC: DNaA, DNaB,
DNaC, HU, Girase e SSB
Uma origem deve ter
Um stio para ligac
ao do ORC
Uma regi
ao rica em A-T logo mais facil de ser desenrolada
Um stio de ligac
ao a protenas que auxiliam a atrair o ORC
ORC + Cdc6 + Cdt1 + MCM = complexo pre-replicativo O complexo pre-replicativo e formado no fim
da mitose e incio de G1.
O ORC fica ligado a origem durante todo o ciclo celular. Ja o complexo pre-replicativo forma-se apenas
uma vez durante o ciclo, o que garante que o DNA seja replicado somente uma vez por ciclo celular.
A Cdc6 e a Cdt1 ligam-se ao ORC, e recrutam as protenas do complexo MCM, que funcionam posteriormente como helicase. Isto ocorre no fim da mitose e incio de G1, dando origem ao complexo pre-replicativo.
Obs: no final de G1, o complexo pre-replicativo e desmontado, logo, em S so fica o complexo de preiniciac
ao.
No fim de G1, a S-Cdk desencadeia a montagem de varios complexos proteicos na origem, formando assim
o complexo de iniciac
ao, que desenrola a helice e inicia a replicacao com polimerases e outras enzimas. Alem
disso, a S-Cdk desencadeia a desmontagem de alguns componentes do complexo pre-replicativo, assegurando
assim que n
ao ocorra replicac
ao mais de uma vez em um ciclo. Mais: o APC/C que degrada a geminina(que
inativa a Cdt1) est
a inativo no fim de G1, portanto, geminina se acumula e inibe Cdt1, de modo que esta
n
ao faca parte do complexo pre-replicativo.
E como o complexo pre-replicativo se forma novamente ? No final da mitose, o APC/C inativa as Cdks
e destroe a geminina, logo o que desencadeia a desmontagem do complexo esta inativo, e assim, o complexo
forma-se novamente na origem, pois seus componentes sao desfosforilados e a Cdt1 e ativada.
Somente as origens que est
ao ligadas a um complexo pre- replicativo terao a iniciacao da replicac
ao na
fase S
As forquilhas de replicac
ao p
aram e se desmontam quando encontram DNA com dano. So depois de
reparado o DNA, e que a replicac
ao reinicia, com a ajuda de um complexo proteico chamado primossomo
que recruta entre outras proteinas, a DnaB responsavel por desenrolar o DNA. No termino da replicac
ao as
forquilhas devem parar e ser desmontadas, para isso existem sequencias consenso chamadas de terminac
ao de
replicac
ao, sequencias ter (em E. coli), as quais se liga uma proteina chamada Tus que impede que a DnaB
prossiga a desenrolar a fita de DNA. A proteina Tus impede a prosseguimento de apenas uma das forquilhas,
portanto, diz-se que esta proteina age assimetricamente.
Reparo de DNA
Mutac
ao: alterac
ao permanente na sequencia de DNA.
Reparo de malpareamento de DNA:corrige erros que escaparam a atividade revisora da DNA polimerase durante `
a replicac
ao; este sistema de reparo baseia-se na excisao e reparo(ressintetizar) apenas da fita
recem-sintetizada com erro. Caso a fita molde fosse reparada, o erro inserido na fita recem-sintetizada seria
perpetuado em vez de corrigido. Para identificar qual das fitas e a recem-sintetizada, em eucariotos, as fitas
recem-sintetizadas(lder e a retardada) sao clivadas preferencialmente, e parece que tais quebras s
ao sinais
para direcionar o sistema de reparo `
a fita adequada.
A metilac
ao auxilia o sistema de reparo de mal-pareamento a identificar qual fita e a recem-sintetizada,
o que e u
til quando o sistema de reparo tem de agir logo depois da replicacao. Lembre-se que qualquer fita
(original ou nova) pode ser alterada, porem quando a alteracao ocorre durante a replicacao da nova fita, por
mal pareamento, obviamente e fita nova que recebeu um nucleotdeo incorretamente pareado, portanto, ela
e a fita que deve ser reparada neste caso. O DNA e metilado, e logo apos a replicacao, a fita nova ainda n
ao
E REPARO DE DNA
AO
10
foi metilada, somente a fita original esta metilada. Logo, o sistema de reparo identifica qual fita e a nova,
pela ausencia de metilac
ao.
Alterac
oes espont
aneas:
Depurinac
ao: hidr
olise da ligac
ao N-glicosil entre a base p
urica e o anel de acu
car.
Desaminac
ao: desaminac
ao da citosina produz uma uracila oxidacao(origina quebra de ligac
ao dupla, perda de hidrogenios); metilacao pela enzima S-adenosilmetionina; ataques hidrolticos alem da
depurinac
ao.
H
a 2 sistemas de reparo por excis
ao muito comuns:
Reparo por excisao de bases
DNA-glicosilases reconhecem bases alteradas(que sofreram oxidacao, desaminacao, metilacao, quebra de
ligac
ao dupla, quebra de anel, etc), por meio da mudanca de conformacao da base, a qual uma vez alterada,
projeta-se para fora da dupla helice. Cada glicosilase e especifica para um tipo de base. Uma vez reconhecida
a les
ao, a glicosilase remove a base.
A ausencia de base e reconhecida por uma enzima chamada AP endonuclease. Ressalta-se que a depurinac
ao tambem tem a mesma consequencia,uma desoxirribose sem base, e portanto, tambem e reconhecida
pela AP endonuclease. Esta enzima quebra a ligacao fosfodiester, removendo assim o acucar fosfato que
sobrou, e dessa maneira, pode vir uma DNA-polimerase e adicionar um novo nucleotdeo complementar ao
da fita original. A DNa-ligase liga os fragmentos de DNA.
Reparo por excisao de nucleotdeos
Este sistema busca por distorc
oes na dupla helice, em vez de procurar por uma alteracao especifica de u
ma
base. Entre as alterac
oes que causam tais distorcoes volumosas na helice, estao: reacao covalente de bases
do DNA com grandes hidrocarbonetos como o benzopireno;dmeros de pirimidinas (TT,TC,CC), resultantes
da exposic
ao `
a radiac
ao ultravioleta.
Os dmeros de pirimidinas s
ao formados por ligacoes covalentes entre estas bases; Um complexo multienzim
atico verifica a dupla helice, buscando distorcoes volumosas, caso encontre uma distorcao em um das
fitas, uma nuclease de excis
ao cliva a ligacao fosfodiester nas duas extremidades da distorcao, a DNA helicase
remove o oligonucleotdeo contendo a lesao, uma DNa polimerase e uma DNA-ligase restauram o segmento
ausente da fita clivada.
Captulo 4
Transcricao
H
a 2 principais diferencas qumicas entre o RNA e o DNA:
RNA tem ribonucleotdeos em vez de desoxirribonucleotdeos presentes no DNA.
RNA tem uracila em vez de timina presente no DNA.
Podemos mencionar duas diferencas estruturais:
O RNA ocorre nas celulas como uma fita simples, enquanto o DNA apresenta-se como fita dupla.
O RNA por ser fita simples, pode dobrar-si sobre si mesmo, e isto lhe confere formas e funcoes diversas,
diferente do DNA que sempre e helice dupla fita e que sempre armazena informacoes. O RNA pode
assumir func
ao cataltica, atuar na regulacao genica, assumir funcao estrutural, enfim, existem v
arias
func
oes importantes desempenhadas por diferentes tipos de RNA, alem do RNam.
Algumas convenc
oes:
Fita molde ou fita anti-senso: fita a partir da qual o RNA e sintetizado, e portanto, e complementar ao
RNAm.
fita codificadora ou fita senso: fita de sequencia identica à do RNAm, e portanto, complementar `
a fita
molde.
Nos bancos de dados, os genes s
ao representados pela fita codificadora escrita na direcao de 5 para 3.
Ponto de iniciac
ao: primeiro par de base transcrito pela RNA polimerase.
Promotor: regi
ao de DNA onde a RNA polimerase inicia a transcricao.
Regi
ao a montante do ponto de iniciacao: regiao que esta antes do ponto de iniciacao
Regi
ao a jusante do ponto de iniciacao: regiao que esta depois do ponto de iniciacao.
O ponto de iniciac
ao e simbolizado por +1, e a numeracao positiva aumenta na direcao a jusante.
A base anterior ao ponto de iniciacao e chamada -1, e a numeracao negativa aumenta na direc
ao `
a
montante.Obs: n
ao existe uma base numerada como 0.
As sequencias de genes s
ao escritas de tal modo que a esquerda seja a montante e a direita seja a
jusante.
11

CAPITULO 4. TRANSCRIC
AO
12
Devido a diferenca de organizac

ao genica entre eucariotos e procariotos, seus RNA normalmente diferem:
cada RNAm eucariotos e transcrito a partir de um u
nico gene, codificando uma u
nica protena; enquanto
que em bacterias um
operon e transcrito sob a forma de um u
nico RNAm, que consequentemente, contem
informac
ao referente a v
arias protenas diferentes.
Transcrito prim
ario: produto imediato da transcricao. O transcrito primario e muito instavel e por
isso, normalmente e degradado ou modificado. No caso dos procariotos, como estes nao possuem n
ucleo, o
DNA bacteriano permanece exposto no citoplasma, onde se localizam os ribossomos, entao a transcric
ao e a
traduc
ao s
ao simult
aneas, isto e, `
a medida que sao sintetizados os RNAm sao traduzidos pelos ribossomos.
E ap
os a traduc
ao os RNAm s
ao degradados. No caso dos eucariotos, os RNAm sao processados no n
ucleo,
e s
o s
ao transportados ao citoplasma quando maduros.
Podemos dividir os RNAs em quatro populacoes:
RNAm (RNA mensageiro)
RNAr (RNA ribossomal)
RNAt (RNA transportador)
pequenos RNAs (incluem os RNAs regulatorios, os RNAs envolvidos no splicing, e outros processos
celulares)
Como a RNA polimerase identifica qual das fitas e a molde ?
A RNA polimerase sintetiza RNA na direcao 5 para 3, e portanto, a fita molde deve ser 3 para 5.
Porem, como as denominac
oes de 5 para 3 podem ser invertidas (basta girar a molecula a 180o ), o que de
fato indica para a RNA polimerase qual fita deve ser transcrita (ou seja, qual fita e a molde), e a presenca
do promotor, pois o promotor contem uma sequencia que a RNA polimerase consegue identificar. Assim a
fita que tiver a sequencia de reconhecimento do promotor, e a fita molde, e logo, e nesta fita que a RNA
polimerase se ligar
a firmemente para iniciar a transcricao. Ressalta-se que este mecanismo de reconhecimento
ocorre em procariotos; em eucariotos, este processor envolve a participacao de outras protenas.
RNA polimerase
Esta enzima catalisa a formac
ao de ligacao fosfodiester entre ribonucleotdeos na direcao de 5 para 3.
Tanto em procariotos como em eucariotos as moleculas de RNA polimerase tendem a ser firmar fracamente
sobre o DNA quando colidem aleatoriamente. Em seguida, a molecula de polimerase desliza rapidamente sobre
o DNA, e se liga fortemente ao DNA quando encontra um promotor. Apos ter feito contato com promotor, a
RNA polimerase abre a dupla helice imediatamente à sua frente, e expoe os nucleotdeos de ambas as fitas ao
longo de uma curta extens
ao do DNA. A seguir, usando a fita molde, a RNA polimerase catalisa a uni
ao dos
dois primeiros ribonucleotdeos complementares à fita molde (iniciacao). Por meio deste sistema a enzima
prossegue (elongac
ao) ate que encontre um sinal de parada (terminacao). Durante a elongacao, `
a medida
que a RNA polimerase se desloca, desenrola o DNA à sua frente (ponto de desenrolamento) e enrola-o na
parte de tr
as (ponto de reenrolamento), e concomitantemente o duplex de DNa que se refaz desloca a cadeia
de RNA (antes parada com a de DNA), tornando o RNA uma fita simples.
OBS: express
ao genica n
ao e composta apenas por transcricao, mas sim por transcricao e traduc
ao.
Complexo fechado: Quando a RNA polimerase se liga ao DNA este permanece temporariamente como
fita dupla.
Complexo aberto: Quando a RNA polimerase catalisa a abertura da helice na regiao do promotor, que
inclui o ponto de iniciac
ao.
3 fases da transcricao
Iniciac
ao: Ap
os o reconhecimento do promotor, tem incio da sntese das primeiras ligacoes nucleotdicas
no RNA. A iniciac
ao e caracterizada pela ocorrencia de eventos abortivos, nos quais a enzima produz pequenos
transcritos, libera-os e recomeca a sntese de RNA. A iniciacao termina quando a enzima tem sucesso na
extens
ao da cadeia e deixa o promotor, seguindo para a regiao subsequente da transcricao.
Elongac
ao: envolve o movimento processivo da RNA polimerase para alem do promotor, por meio da
quebra das pontes de hidrogenio da dupla helice, exposicao da fita molde e adicao de novos ribonucleotdeos

AO
13
na cadeia crescente de RNA, concomitante ao deslocamento da bolha de transcricao a jusante. Os nucleotdeos

s
ao adicionados `
a extremidade 3 do RNA formando um hbrido de RNA-DNA dentro da bolha de transcric
ao.
A vis
ao de que a RNA polimerase sempre prossegue a um passo regular sobre o DNA tem sido questionada
recentemente, pois quando a extremidade 3 do RNA se desloca do centro ativo da RNA polimerase, esta
enzima volta o caminhoe remove alguns ribonucleotdeos antes de reiniciar a transcricaos.
Terminac
ao: envolve a presenca de sequencias que sinalizam para a enzima cessar a adicao de nucleotdeos
a cadeia de RNA. A terminac
`
ao e caracterizada pelo colapso da bolha de transcricao o que ocorre quando
e desfeito o hbrido de RNA-DNA, o DNA refaz a dupla helice, cessa a formacao de ligacoes fosfodiester
no RNA, e o complexo de transcric
ao se desfaz em suas partes componentes: DNA, RNA polimerase e o
transcrito prim
ario.
Terminador: sequencia de DNA que indica a terminacao. A transcricao do terminador forma um grampo
no RNA seguido de uma cauda poli-U, que interrompe a sntese de RNA.
Detalhe importante: regi
oes UTR (untranslated region) Antes do codon de iniciacao da traduc
ao existe
um segmento de RNA que n
ao ser
a traduzido, chamado de 5-UTR. Apos o codon de terminacao da traduc
ao
existe um segmento que inclui tambem o grampo de terminacao da transcricao e o poli-U, que n
ao ser
a
traduzido, chamado de 3UTR. A funcao destas regioes nas bacterias ainda nao e clara. Sabe-se por exemplo
que a regi
ao 5-UTR possui o RBS (stio de ligacao a ribossomos) sem o qual nao se produz protenas em
bacterias, afinal e neste stio que o ribossomos se ligam para realizarem o processo de traducao concomitante
ao de transcic
ao.
Detalhes da estrutura da RNA polimerase
A RNA polimerase bacteriana e composta por m
ultiplas subunidades. No caso dos procariotos, uma
mesma RNA polimerase e respons
avel pela sntese de diferentes RNAs (RNAm, RNAt e RNAr), j
a nos
eucariotos, existem diferentes RNA polimerases para diferentes tipos de RNA (pol I, II e III). As subunidades
e formam o centro cataltico da enzima. As sequencias das subunidades e da RNA polimerase s
ao
conservadas nos 3 domnios: Bacteria, Archaea e Eukarya. As diferencas entre RNA polimerases de eucariotos
e procariotos reside principalmente na superfcie da enzima, ja que seu centro cataltico e muito similar. A
holoenzima (enzima completa, com todas as subunidades) pode ser dividida em 2 componentes: a enzima
cerne e o fator (sigma).
Cerne e formada pelas seguintes subunidades: I, II, , e .
Fator : esta subunidade e essencial para o reconhecimento do promotor. O fator assegura que a RNA
polimerase inicie a transcric
ao em stios especficos e diminui a ligacao a stios inespecficos. O fator somente
permanece como parte da enzima ate que o RNA atinja um tamanho de cerca de 10 nucleotdeos, isto e, atua
apenas durante a iniciac
ao. A partir disso, esta subunidade dissocia-se da enzima cerne, a qual po sua vez
prossegue na elongac
ao. Outra maneira de explicar a acao do fator e a seguinte: este fator desestalibiliza
e se solta da enzima cerne quando a enzima se liga a um stio inespecfico, e estabiliza e permanece ligado
a enzima cerne quando a enzima se liga a um stio especfico. O fator e liberado assim que a holoenzima
`
produz um RNA de cerca de 10 pb pois parte do fator esta bloqueando o canal de sada da RNA polimerase,
ent
ao o fator se separa do restante da enzima de modo que a cadeia de RNA possa continuar a crescer e
ser liberada pelo canal de sada da enzima. Os fatores competem por copias limitadas da RNA polimerase
cerne, de modo que os fatores s podem regular a iniciacao e determinar os perfis de transcricao dos genes.
O domnio C-terminal (CTD) das subunidades I e II, interage diretamente com o promotor e portanto,
contribui para o reconhecimento do promotor.
Alem disso as subunidades e o fator sao as principais superfcies da RNA polimerase que interagem
com fatores reguladores da iniciac
ao da transcricao.
A RNA polimerase tem como cofatores 2 ons de M g 2+ , um dele fica ligado ao centro ativo e o outro
chega com o novo ribonucleotdeo a ser incorporado no RNA crescente.
O fator reconhece o promotor, porem qual seria a estrategia de busca para encontrar num genoma
inteiro, o promotor ?
O modelo atual para responder tal pergunta e que a enzima utiliza 3 mecanismos. Mas antes de coment
alos torna-se necess
ario justificar por que a RNA polimerase nao encontra o promotor simplesmente por difus
ao,
por meio de ligac
oes rand
omicas. Entenda-se que a taxa de difusao permite inferir a taxa de ligacao da RNA
polimerase a um stio. O limite superior da taxa de difusao para a ligacao a um stio de cerca de 75 pb e
menor que 10e8 Me-1 se-1. No entanto, a taxa de difusao para alguns promotores foi observada , in vitro,

AO
14
com valores iguais ou acima do limite superior mencionado, ou seja, a velocidade de ligacao a promotores e
muito r
apida.
Alem disso, considerando que por busca randomica, as RNA polimerases teriam um segmento de DNA alvo
muito maior (genoma inteiro), logo a velocidade de difusao seria correspondentemente aumentada, deixando
de ser limitante. Dessa maneira, associacao e dissociacao a stios randomicos, tornaria a busca pelo promotor
um processo um tanto lento, e comprovadamente como indicam as taxas in vitro, este processo e muito mais
r
apido para ocorrer apenas por difus
ao.
Pela justificativa acima, pode-se supor que a RNA polimerase livre liga-se ao DNA, permanecendo em
contato com este. Porem, esta enzima deve utilizar algum tipo de estrategia para se mover de um stio
de ligac
ao frouxa aleat
orio para o promotor. Atualmente, discute-se mecanismos utilizados pela enzima
para encontrar o promotor. J
a que uma vez ligada, a enzima permanece associada ao DNA, a enzima troca
rapidamente um sequencia por outra ate encontrar o promotor (troca direta). O deslocamento direto permite
a enzima criar um trajeto direcionado, movendo-se de um stio fraco para um stio mais forte.
3 mecanismos possveis:
Deslizamento direto
Troca intersegmento
Associac
ao e dissociac
ao intrasegmento
A iniciac
ao pode ser subdividida em 3 etapas:
Formac
ao de complexo fechado (a holoenzima RNA polimerase liga ao DNA em sua forma duplex).
Formac
ao de complexo aberto (a holoenzima promove a desnaturacao do DNA, e abertura de suas fitas;
o fator tambem contribui para este processo).
Formac
ao de complexo de 3 moleculas(RNA polimerase, DNA e RNA): depois de alguns eventos abortivos(RNA polimerse libera o RNA), a holoenzima finalmente consegue sintetizar um RNA que vai alem
do promotor.
Promotor: sua func
ao e ser reconhecido por protenas envolvidas na transcricao. O promotor de um
gene ou de um
operon possui sequencias consenso curtas e conservadas embora com variacoes em nvel de
indivduos que permitem que a RNA polimerase o reconheca.
Principais sequencias de reconhecimento de um promotor:
Elemento -10 de 6 pb (tambem conhecido como TATA box; sequencia consenso: TATAAT) elemento
-35 de 6 pb (sequencia consenso: TTGACA). Ha uma sequencia espacadora entre as duas sequencias
anteriores. As sequencias adjacentes ao elemento -10 e ao elemento -35 a montante e a jusante tambem
interagem com a RNA polimerase e contribuem para eficiencia do promotor.
Elemento -35 ....espacador.... elemento -10....+1. Os elemento -10 e -35 fazem contato sequenciaespecfico com o fator . O espacador nao tem relevancia de interacao com a RNA polimerase, no
entanto, como ele est
a entre os dois elementos que interagem com a RNA polimerase e considerando a
natureza da dupla helice de DNA, o espacador determina a distancia de separacao apropriada entre os
dois elementos e a orientac
ao geometrica dos dois stios um relacao ao outro.
Elemento UP: sequencia de cerca de 20 pb a montante do elemento -35 que interage com as CTDs
das subunidades da holoenzima RNA polimerase. Este elemento pode aumentar consideravelmente
a ordem de magnitude da expressao de um gene.
Mutacoes em promotores
As mutac
oes em promotores afetam o nvel de expressao sem alterar os produtos dos genes.
Mutac
oes down: diminuem ou cessam a transcricao de genes; podem aumentar a distancia entre os
elementos -10 e -35; podem diminuir a similaridades dos elementos -10 e -35 com as sequencias consenso.
Este tipo de mutac
ao quando ocorre no elemento -35, reduz o ndice de formacao de complexo fechado, pois

AO
15
dificulta a ligac
ao da RNA polimerase ao DNa. Quando ocorre no elemento -10, este tipo de mutac
ao reduz
o ndice de formac
ao do complexo fechado e a sua conversao no complexo aberto, pois dificulta a ligac
ao da
RNA polimerase ao DNA e a desnaturacao da dupla helice.
Mutacoes up: aumentam a transcricao de genes; podem fazer isso por exemplo, diminuindo a dist
ancia
entre os elementos -10 e -35 para 17 pb, ou tornando as sequencias destes elemento mais similares a sequencias
consenso. Este tipo
Detalhe importante: a eficiencia de um promotor nao necessariamente deve ser alta para as necessidades
da celula, pois muitos promotores evoluram suas sequencias bem diferentes da sequencia consenso porque
n
ao era
otimo para a celula produzir grandes quantidades dos produtos codificados por estes genes.
Dica para exerccios: Footprinting e uma tecnica que permite avaliar a habilidade de protenas reconhecerem e se ligarem ao DNA. Resumindo a tecnica, usa-se uma nuclease para clivar em varias fragmentos a
amostra de DNA dupla fita ligada a uma protena. Um das fitas e marcada com sonda em um extremidade.
Ent
ao ap
os fazer o footprinting, a eletroforese e usada para mostrar a escada de fragmentos obtidos com a
nuclease. O stio onde a protena estava ligada ao DNA fica protegido de clivagem e portanto, na escada do
resultado da eletroforese, o stio que n
ao contem nenhum fragmento detectado e o stio onde a protena se
liga ao DNA.
Obs importante a respeito da terminacao: A RNA polimerase transcreve a regiao terminadora seguida de
poli-U, ent
ao o terminador transcrito forma um grampo de terminacao que sinaliza para a RNA polimerase
que deve cessar a transcric
ao.
H
a 2 tipos de terminadores de transcricao:
Terminadores intrnsecos: n
ao requerem mais nada alem da presenca do proprio terminador rico em G-C
que codifica um grampo no RNA. Portanto, neste caso a terminacao depende do RNA transcrito. Outra
caracterstica de terminadores intrnsecos e uma sequencia de ate 7 uracilas (Poli-U) subsequente a regi
ao do
grampo.
Terminadores dependentes de Rho: sao definidos pela necessidade da prenseca do fator rho in vitro, e
an
alises de mutac
oes mostram que este fator esta envolvido com a terminacao in vivo. A protena Rho se
liga ao RNA a montante do sto de terminacao e anda por ele ate alcancar a RNA polimerase. A parada ou
atraso da RNA polimerase sobre o grampo de terminacao da tempo a Rho para alcancar a regiao onde h
a
o hbrido DNA-RNA, e quebrar as pontes de hidrogenio que o mantem, desfazendo o hbrido, interage com
a RNA polimerase para liberar o RNA, e por consequencia, desmonta o complexo de elongacao. A protena
Rho e uma helicase dependente de ATP
Antiterminac
ao: quando a terminac
ao e prevenida por fatores que interagem com o RNA ou com a RNA
polimerase.
Sendo assim, a terminac
ao assim como a iniciacao e a elongacao, pode ser regulada como um mecanismo
de controle da express
ao genica.
Outras similaridades entre terminacao e iniciacao:
Ambos os processos podem utilizar protenas adicionais(fator , fator rho, supressores e ativadores).
Ambos envolvem a quebra de pontes de hidrogenio(na iniciacao quebram-se as pontes do DNA, na
terminac
ao quebram-se as pontes entre RNA-DNA).
Ambos envolvem o reconhecimento de sinais ainda que de maneiras distintas.
O que de fato desmembra o complexo de elongacao ?
A interac
ao do grampo terminador com a RNA polimerase somada às forcas fracas das pontes de hidrogenio entre o hbrido RNA-DNA desestabilizam e desmontam o complexo de elongacao, o que resulta no
termino da transcric
ao.
Ainda sobre terminacao, outro aspecto importante sobre a terminacao dependente de rho e que o fator rho
n
ao consegue se ligar ao RNA ou se mover sobre ele quando os ribossomos estao traduzindo o RNA. Assim
a transcric
ao prossegue ate que os ribossomos tenham terminado a traducao. Porem, se ocorrerem mutac
oes
sem sentido (que substituam um c
odon codificador de aminoacido por um codon terminador da traduc
ao),
ent
ao os ribossomos s
ao liberados, a Rho pode se associar ao RNAm e à RNA polimerase e terminar a
transcric
ao prematuramente.
Polaridade: Quando uma mutac
ao sem sentido ocorre num gene que precede outros em um operon, os
genes subsequentes n
ao s
ao transcritos.

AO
16
Transcricao eucariotica
RNA-polimerases eucari
oticas:
RNApol I : transcreve genes de RNAs ribossomais e se concentra no nucleolo.
Lembre-se: nucleolo e a regi
ao do n
ucleo onde partes de diferentes cromossomos contendo genes ribossomais se agrupam, e onde os RNAs ribossomais sao associados a protenas para compor subunidades de
ribossomos.
RNapol II: transcreve os hnRNAs (RNA heterogeneo nuclear), isto e, todos os RNAs que apos o processamento formar
ao mRNAs.
RNApol III: transcreve genes de rRNAs, tRNAs e pequenos RNAs.
Existem tambem RNApols especiais presentes nas mitocondrias e nos cloroplastos.
As RNApol eucari
oticas possuem o centro cataltico, subunidades e homologas às procari
oticas,
porem, as demais subunidades diferem consideravelmente. Por exemplo, numa RNApol eucari
otica n
ao
existe uma subunidade hom
ologa ou correspondente ao fator procarioto, pois a funcao de reconhecimento
do promotor cabe a fatores basais de transcricao.
Antes de continuarmos, seria interessante deixar claro as principais diferencas entre a transcric
ao de
procariotos e de eucariotos:
Eucariotos possuem diferentes RNApol para diferentes tipos de RNAs, enquanto procariotos possuem
apenas um tipo de RNApol para todos os RNAs.
As RNApols de eucariotos e procariotos diferem na superfcie da enzima. Ex: RNApol eucari
otica n
ao
possui nenhuma subunidade similar ao fator dos procariotos.
O mecanismo de reconhecimento do promotor e outro ponto de diferenca: o fator e as caudas Cterminal das subunidades s
ao responsaveis pelo reconhecimento do promotor, isso significa que s
oa
pr
opria holoenzima da RNApol procariota ja e suficiente para reconhecer o promotor; em eucariotos
o papel de reconhecimento do promotor cabe a fatores transcricionais basais, ou seja, e necess
aria a
presenca de outras protenas que nao a RNapol.
Os transcritos tem propriedades diferentes: o mRNA procarioto esta apto para traducao à medida que
vai sendo sintetizado, afinal ele nao possui ntrons que precisam ser excisados e nao existe barreira
espacial entre transcric
ao e traducao. Ja o mRNA eucarioto precisa ser processado (capeamento,
poliadenilac
ao e splicing), exportado do n
ucleo para o citoplasma, onde finalmente podera ser traduzido
por ribossomos.
Fator transcricional ou fator basal de transcricao: qualquer protena que nao seja a RNApol.
Os fatores basais de transcric
ao atuam principalmente no reconhecimento do promotor. Cada fator basal
liga-se a um stio especfico, e o promotor e definido como o conjunto destes stios de ligacao que atuam em
cis.
Somente ap
os a ligac
ao de todos os fatores basais ao promotor, a RNA polimerase podera se ligar ao
DNA, juntando-se ao enorme complexo proteico que promove a transcricao.
Aparato basal de transcric
ao: complexo formado quando a RNA polimerase se junta ao complexo de
fatores basais ligados ao DNA.
Outro ponto a ser ressaltado e a cromatina. Esta deve possuir estrutura aberta para que ocorra a
transcric
ao, e alem disso, mesmo aberta, ainda e necessario remover o octamero de histonas para que a
RNApol possa se ligar ao DNA.
A RNApol se liga pr
oximo ao ponto de iniciacao, porem, sem estabelecer contato direto com a regi
ao
a montante do promotor. Cada promotor contem sequencias curtas conservadas que sao reconhecidas pela
classe apropriada de fatores basais.
Intensificador: stio identificado por sequencias que estimulam a iniciacao da transcricao, porem, que
se localiza a uma dist
ancia consider
avel do ponto de iniciacao, a montante ou a jusante. O intensificador
determina se o promotor e expresso, e caso seja expresso, se a expressao ocorrera em todas as celulas ou em
celulas de tecidos especficos. Os intensificadores geralmente sao alvos para regulacao tecido-especfica ou
temporal. As protenas ligadas aos intensificadores interagem com aquelas ligadas aos promotores.

AO
17
A transcric
ao eucari
otica est
a mais frequentemente sob a regulacao positiva: um fator transcricional
tecido-especficos ativa um promotor ou um grupo de promotores que possuem uma sequencia-alvo em comum.
A regulac
ao por meio de repress
ao negativa e menos comum.
Silenciador: stio regulat
orio que se liga mais a fatores transcricionais negativos que positivos.
Neste ponto, e relevante distinguir fatores basais, ativadores e repressores, e coativadores.
Os fatores transcricionais basais s
ao aqueles que fazem parte da maquinaria de transcricao, sem os quais
n
ao e possvel reconhecer o promotor, e portanto sao essenciais para determinar os stios que a RNApol deve
transcrever.
Ativadores e repressores s
ao fatores transcricionais que se ligam ao promotor, ao intensificador ou ao
silenciador, e podem aumentar (caso sejam ativadores) ou diminuir (caso sejam repressores) a eficiencia do
aparato basal de transcric
ao. Logo, estes fatores determinam a taxa de transcricao, e regulam a express
ao
temporal e espacialmente, isto e, podem ser produzidos em determinado momento ou ser tecido-especficos.
Os coativadores correspondem a fatores transcricionais que funcionam como intermediarios na interac
ao
entre os fatores basais e os ativadores. Como mencionado anteriormente, os intensificasores podem se localizar
a stios muito distantes do ponto de iniciacao, mas ainda assim os ativadores ligados a tais stios se comunicam
com os fatores basais por meio dos coativadores.
A terminac
ao da transcric
ao eucariotica nao tem a mesma importancia regulatoria que na transcric
ao
procari
otica. O evento que gera a extremidade 3do RNA nao e a terminacao em si, mas sim uma clivagem
que faz parte do processamento do RNAm.
V
arios promotores eucariotos possuem o TATA box, uma sequencia localizada a cerca de 25 pb a montante
do ponto de iniciac
ao. A sequencia cerne e TATAA, seguida por 3 pares A-T. No caso da RNApol II, esta
depende de uma classe de fatores basais para a iniciacao da transcricao de um promotor, chamados de TFiiX,
onde X e substitudo pela letra de identificacao de um fator individual. Vamos discutir um fator individual,
o TFiiD, que possui dois componentes: a TBP e as TAFs. A ligacao da TFiiD ao TATA box e a primeira
etapa na iniciac
ao.
A TBP e respons
avel por reconhecer o TATA box, dai seu nome ser uma referencia à protena de ligac
ao
ao TATA. As TAFs s
ao outras subunidades, que associadas a TBP, sao responsaveis por identificar todas as
classes de promotores. TBP e um fator universal, responsavel por identificar cada tipo de promotor (seja
aquele transcrito por RNApol I, II ou III), usando um mecanismo diferente para cada tipo.
Explicac
ao para o fato de que nucleossomos impedem a iniciacao da transcricao: os nucleossomos s
ao
formados preferencialmente pelo posicionamento de regioes ricas em A-T com sulco menor da dupla helice
voltado para interior, porem, a TBP liga-se na dupla helice exatamente no sulco menor. Se o sulco menor n
ao
estiver exposto na superfcie da helice, a TBP nao podera acessa-lo, e portanto, nao se formara o complexo
de iniciacao da transcric
ao. A TBP causa uma deformacao no DNA, de tal modo que a RNApol e os outros
fatores estabelecem uma associac
ao mais proxima com o DNA do que seria possvel com um DNA linear.
Iniciacao
Os fatores basais ligam-se ao promotor numa ordem definida, aumentando gradativamente a
area protegida, a fim de construir um complexo ao qual a RNApol se associa. Nem todos os fatores desempenham
apenas o papel de promover a ligac
ao da RNApol ao DNA. O fator TFiiH, por exemplo, possui m
ultiplas
func
oes: atividade de helicase, atividade de quinase capaz de fosforilar a DCT da RNApol II, e ainda est
a
envolvido no reparo de DNA danificado e na liberacao da RNApol do promotor, evento que parece exigir a
presenca de TFiiH a jusante do ponto de iniciacao.
A maior subunidade da RNApol II possui um domnio carboxi-terminal(DCT), composto por v
arias
repetic
oes de uma sequencia consenso de 7 aminoacidos. O DCT pode ser fosforilado, e esta envolvido na
iniciac
ao. No modelo atualmente proposta para a iniciacao eucariotica, a fosforilacao da cauda CTD da
RNApol II e necess
aria para que a enzima prossiga para alem do promotor, e portanto, passe para a fase
de elongac
ao. Neste est
agio, a maioria dos fatores transcricionais tambem e liberada do promotor. Para
separac
ao das fitas do DNA, s
ao necessarias a TFiiE e a TFiiH.
Assim como na iniciac
ao procariota, na iniciacao eucariota tambem ocorrem eventos abortivos em alguns
genes, isto e, a RNApol realiza terminacao apos produzir um transcrito curto, que logo e degradado. Alguns
genes exigem que a RNApol II seja adicionalmente no DCT, pela quinase P-TEFb. Mas a regulac
ao de tal
fosforilacao e porque alguns genes tem tal exigencia e outros nao, ainda permanece obscura.

AO
18
Outra func
ao bastante relevante do DCT e que este esta envolvido direta ou indiretamente com o processamento do RNAm. A enzima que promove a adicao de nucleotdeos 7-metil-guanosina, liga-se ao DCT
fosforilado, permitindo que o capeamento ocorra tao logo a extremidade 5 seja formada. As protenas SCAFs,
que se ligam `
as protenas de splicing, se ligam ao DCT tambem. E ainda alguns componentes do aparato
clivagem/poliadenilac
ao se ligam ao DCT. Alem disso, todos estes fatores citados estabelecem ligac
ao com a
RNApol II no momento da iniciac
ao, de modo que os aparatos de processamento do RNAm estao disponveis
desde que a RNApol inicia a transcric
ao.
N
ao vamos entrar em detalhes do fatores basais das RNapol I e III porque o foco aqui e a RNApol que
transcreve mRNAs.
Captulo 5
Traducao
A sntese proteica ocorre simultaneamente à transcricao em procariotos. Logo que seja produzido um curto
trecho de RNAm, a subunidade menor do ribossomo se liga ao stio RBS que fica um pouco antes do c
odon de
` subunidade menor associa-se o primeiro RNAt de metionina (em E. coli, formil-metionina), ent
iniciac
ao. A
ao
o complexo desloca-se sobre o RNAm mensageiro ate encontrar o codon AUG correspondente ao antic
odon
do RNAt na fase de leitura correta.
Das 3 fases de leitura possveis para um RNAm, geralmente apenas uma e aberta, e o RNAt nao e capaz
de identific
a-la, deixando tal tarefa para a subunidade menor do ribossomo. Esta por sua vez nao e capaz
de identificar o c
odon AUG, e dessa maneira, as propriedades de cada um (identificar fase de leitura aberta
e identificar c
odon de iniciac
ao) se complementam.
Na posic
ao exata para iniciar a traducao, a subunidade maior do ribossomo liga-se ao complexo subunidade
menor-RNAt. O ribossomo torna-se assim completo, e possuindo 3 cavidades: stio E, stio P e stio A.
stio E: stio de sada do RNAt vazio, sem aminoacido
stio P: stio onde fica o RNAt carregado com o aminoacido mais recentemente adicionado
stio A: stio onde ficar
a o RNAt carregado com o proximo aminoacido a ser adicionado
aminoacil-RNAt: amino
acido ligado ao seu respectivo RNAt (reacao catalisada por aminoacil-RNAt
sintetase
peptidil-RNAt: peptdeo ligado a um RNAt
A traduc
ao processa-se do seguinte modo: Voltando a situacao de incio da sntese, o RNAt iniciador (que
contem o primeiro amino
acido da proteina em sntese) ocupa desde o comeco o stio P. Quando a subunidade
menor + RNAt iniciador encontram o codon de iniciacao, a subunidade maior liga-se ao complexo, e ent
ao o
segundo RNAt carregado liga-se ao stio A, contendo anticodon correspondente ao codon do RNAm exposto
no stio A. A subunidade maior catalisa a formacao da ligacao peptdica entre a metionina e o segundo
amino
acido.
Uma vez formada a ligac
ao peptdica, o peptdio e transferido para do RNAt do stio P para o RNAt do
stio A. O ribossomo desloca-se ent
ao pelo proximo codon(estagio denominado translocacao); o movimento
do ribossomo transfere o RNAt desacilado do stio P para o stio E, e o peptidil-RNAt do stio A para o stio
P. Neste momento o c
odon do pr
oximo aminoacido a ser adiocinado esta posicionado no stio A, pronto para
a entrada de um novo amino
acido, quando o todo o processo se repetira.
3 est
agios do ribossomo
Antes da formac
ao da ligac
ao peptdica: o peptidil-RNAt ocupa o stio P, o aminoacil-RNAt ocupa o
stio A.
Formac
ao da ligac
ao peptdica: o polipeptdeo e transferido do peptidil-RNAt do stio P para o
aminoacil-RNAt do stio A.
19

CAPITULO 5. TRADUC
AO
20
Translocac
ao: o ribossomo move-se por um codon, posisiona o RNAt desacilado para o stio E de onde
deixa o ribossomo, e desloca o peptidil-RNAt do stio A para o stio P, deixando livre o stio A para
receber o pr
oximo aminoacil-RNAt.
Quem sabe o c
odigo genetico ?
As aminoacil-RNAt sintetases. Estas enzimas sao aminoacido especficas, portanto, existem 20 sintetases,
uma para cada amino
acido. Uma sintetase somente liga um aminoacido a um RNAt caso o RNAt possua o
antic
odon e braco aceptor adequados para aquele aminoacido. A reacao envolve a participacao do ATP como
reagente.
Detalhes sobre a estrutura de um RNAt
Um RNAt possui 4 segmentos pareados que sao longos o suficiente para assumir estrutura de dupla
helice: alca D, alca T, braco aceptor e alca anticodon. Alem disso, o RNAt dobra-se sobre si mesmo,
formando estrutura similar a letra L. As regioes de maior importancia para a traducao sao a alca antic
odon
e o braco aceptor, ambos possuem regi
oes nao pareadas: o anticodon esta na alca anticodon, e a outra regi
ao
fita simples, pertecente ao braco aceptor, fica na extremidade 3 da molecula e se liga ao aminoacido.
Detalhes da estrutura de um ribossomo
O ribossomo e formado por duas subunidades: uma maior e outra menor. Ambas sao compostas por protenas
e cadeias de RNAr. Um ribossomo eucarioto por exemplo, tem subunidade maior composta por cerca de 49
protenas + 3 moleculas de RNAr, e a subunidade menor composta por cerca de 33 protenas + 1 molecula
de RNAr. O ribossomo e uma ribozima (RNA ribossomico + protenas), cujo poder de catalise e respons
avel
pela formac
ao da ligac
ao peptdica.
Em eucariotos, a traduc
ao ocorre somente apos o processamento do RNAm e sua exportacao para o
citoplasma. Para o RNAm, o processamento consiste em capeamento, poliadenilacao e splicing.
O capeamento e a poliadenilac
ao s
ao relevante para a estabilidade do RNA, auxiliam na sua exportac
ao
do n
ucleo para o citoplasma, e na sua identificacao geral como RNAm, isto e, como um molecula que deve
ser traduzida.
Capeamento: consiste na adic
ao de um nucleotdeo atpico chamado 7-metil-guanosina na extremidade
5, que corresponde a um nucleotdeo guanina com grupo metil associado. Este processo ocorre quando o
RNAm atinge cerca de 25 nucleotdeos.
Poliadenilac
ao: consiste na adic
ao de centenas de nucleotdeos adenina na extremidade 3 do RNAm
(cauda poli-A). Primeiro uma nuclease cliva a extremidade 3 do RNAm, e entao uma segunda enzima
adiciona a cauda poli-A.
Atencao: outros tipos de RNA (ex: RNAr, RNAt, snRNA) recebem outro tipo de processamento.
Captulo 6
Organelas e Membranas
Retculo endoplasmatico
Retculo endoplasm
atico: e contnuo a membrana nuclear externa, e consiste de um sistema de sacos e tubos
de membrana interconectados; frequentemente o RE se estende pela maior parte da celula.
RE rugoso: porc
oes do retculo endoplasmatico cuja superfcie citosolica e coberta por ribossomos.
RE liso: porc
oes do RE cuja superfcie citosolica nao possue ribossomos.
H
a 2 tipos de protenas que v
ao para o RE:
Protenas transmembr
anicas: que vao sao parcialmente translocadas pela membrana do RE e cujo
destino e residir na membrana do RE, nas membranas de outras organelas ou na membrana plasm
atica.
Protenas hidrossol
uveis que s
ao completamente translocadas pela membrana do RE e liberadas no
l
umen do RE; estas ou ser
ao secretadas (para o meio extracelular) ou serao transportadas por vesculas
ate outras organelas.
Em ambos os casos, os RNAms destas protenas sao traduzidos por ribossomos do citosol. Logo no incio
da sequencia traduzida, existe uma sequencia-sinal de RE que direciona o ribossomo que esta sintetizando a
` medida que um RNAm e traduzido varios ribossomos se ligam a ele, formando um
protena para a RE. A
polirribossomo. A sequencia sinal de RE ligada à membrana do RE inicia o processo de translocac
ao da
protena para dentro do RE. Lembre-se que tantos as protenas transmembranicas quanto as hidrossol
uveis
possuem a sequencia-sinal de RE.
Assim, os ribossomos n
ao est
ao constantemente ligados ao RE, mas sao direcionados pela sequencia sinal
da protena que est
ao traduzindo, e s
o entao e que se ligam à membrana do RE. Nao existe diferenca estrutural
ou funcional entre os ribossomos que ligados à membrana do RE e os ribossomos livres no citosol. A u
nica
diferenca entre eles e a protena que estao sintetizando em um dado momento.
Mecanismo de ancoramento de protenas transmembranicas na membrana do RE
A protena possui a sequencia sinal que inicia translocacao proxima à extremidade C-terminal; para impedir que a protena seja totalmente translocada, um outra sequencia de aminoacidos hidrofobicos, chamada de
sequencia de finalizac
ao de transferencia, localizada mais adiante na protena liga-se no canal de translocac
ao
impedindo que a translocac
ao prossiga. Simultaneamente, a sequencia sinal aminoterminal e a sequencia
de finalizac
ao de transferencia s
ao liberadas do canal de translocacao na membrana lipdica. Finalmente a
sequencia sinal e clivada. Deste modo a protena transmembranicas do RE possui a extremidade N-terminal
voltada para o l
umen do RE, enquanto a extremidade C-terminal fica na face citosolica da membrana do RE.
Uma vez inserida, a protena transmembrana nao muda de orientacao.
Existem protenas cuja sequencia sinal nao e aminoterminal, mas sim um sequencia interna, que n
ao e
frequente em protenas cuja
clivada ap
os a translocac
ao, chamada de sequencia de incio de transferencia. E
cadeia polipeptidica passa varias vezes pela membrana lipidica do RE. Neste caso, ambas as extremidades,
amnica e carboxlica, ficam na face citosolica do RE.
O transporte vesicular consiste no brotamento de fusao de vesculas que carregam protenas e lipdeos
entre organelas que fazem parte do sistema de endomembranas da celula. As vesculas de transporte s
ao
21
CAPITULO 6. ORGANELAS E MEMBRANAS
22
formadas com uma capa, muito comumente composta de protena clatrina. Essa capa se desfaz depois que
a vescula se destaca da membrana. Suas funcoes sao dar forma de cesta à vescula e auxiliar indiretamente
na captac
ao das moleculas a serem transportadas. Resumindo a historia, existem receptores de carga que
reconhecem sinais de transporte das moleculas que devem ser transportadas. As adaptinas sao protenas que
ajudam a capturar moleculas especficas pelo aprisionamento de receptores de carga. Ao mesmo tempo as
adaptinas est
ao ligadas `
as moleculas de clatrina. o brotamento da vescula se inicia com a formacao de uma
fossa revestida de clatrina que captura moleculas especficas, e gradativamente forma um pescocoentre a
vesicula em formac
ao e a membrana de onde esta brotando. A protena ligadora de GTP, dinamina, liga-se
no pescoco e causa juntamente com outras protenas, a constricao do pescoco, destacando assim a vescula da
membrana. obs: vesculas revestidas de clatrina brotam no Ap. de Golgi, na membrana plasmatica, e na rota
secret
oria para fora da celula. No caso do RE, brotam vesculas revestidas com outra protena, COP (coat
protein). Lembre-se que as vesculas viajam pela celula ativamente (com gasto de energia) por protenas
motoras associadas ao citoesqueleto.
O mecanismo respons
avel pela especificidade das vesculas se fundirem as organelas correspondentes, ainda
n
ao e totalmente claro, porem, acredita-se que uma famlia de protenas, chamadas de SNAREs estejam
envolvidas. Aparentemente, para cada organela e cada tipo de vescula possui em sua superfcie um tipo
de SNARE. Ent
ao um certo tipo de vescula, possui uma v-SNARE que e complementar à t-SNARE da
membrana da organela alvo.
Modificac
oes covalentes das protenas no l
umen do RE
As pontes dissulfeto s
ao formadas por oxidacao da cadeia lateral de duas cistena, por uma enzima presente
no l
umen do RE. Outra modificac
ao de protenas realizada no RE, e a glicosilacao que corresponde a adic
ao
de oligossacardeos `
a proteina. Oligossacardeos podem ajudar a proteger a protena contra degradac
ao;
podem reter a protena no RE ate que ela seja adequadamente enovelada; podem ainda servir como sinal de
transporte para as vesculas de transporte. NA glicosilacao, e comum adicionar um oligossacardeo pronto
de 14 acu
cares, pois isto permite verificar se a cadeia de oligossacardeos tem a sequencia correta; caso haja
um erro na sequencia, a protena inteira sera descartada, e e mais barato contruir um oligossacardeo de 14
acu
cares novamente que um protena inteira.
Alem disso as enzimas tem dificuldade de acessar a estrutura arborea dos acu
cares, entao e mais f
acil
adicionar um oligossacardeo pronto, que tentar adicionar um a um os acu
cares na protena. O oligossacardeo
fica preso a um lipdeo chamado dolicol, associado a membrana do RE, e a sua transferencia para o grupo
amino de uma asparagina e catalisada pela enzima oligossacardeo-protena-transferase, que possui seu stio
ativo voltado para o l
umen do RE.
Aparelho de Golgi
Conjunto de sacos achatados definidos por membrana (vesculas) dispostos em pilha. Possui duas faces :
cis e trans. A face cis e onde protenas envoltas por vesculas provenientes do RE se fundem no Aparelho de
Golgi, ou seja, e a face de entrada das protenas na rede de Golgi. E a face trans e aquela onde as protenas
saem do Ap. de Golgi e s
ao transportadas para outras organelas ou para a membrana plasmatica.
Rota constitutiva de exocitose ou rota padrao Rota fixa de vesculas que brotam da rede trans de Golgi, e se
fusionam a membrana plasm
atica. Esta rota supre a membrana plasmatica de protenas e lipdeos (permitindo
a membrana plasm
atica crescer antes da celula se dividir), e encaminha protenas para a superfcie celular a
fim de serem liberadas no exterior. Sendo este u
ltimo processo chamado de secrecao. Algumas das protenas
liberadas aderem `
a superfcie celular, onde se tornam protenas perifericas da membrana plasmatica; outras
s
ao incorporadas `
a matriz extracelular; e outras se difundem no fluido extracelular para nutrir ou sinalizar
outras celulas. Esta rota n
ao exige uma sequencia sinal especfica (como a que leva protenas para o lisossomo
ou de volta para o RE).
Rota regulada de exocitose Opera apenas em celulas especializadas em secrecao. Celulas secret
orias
produzem horm
onios, muco ou enzimas digestivas, e estocam estes produtos em vesculas secretorias. Estas
vesculas se fundir
ao `
a membrana plasmatica e liberarao seu conte
udo no exterior celular somente se houver
a presenca de um sinal extracelular que estimule a fusao da vescula. Se nao houver sinal extracelular, as
vesculas secret
orias que brotam da rede trans de Golgi, se acumulam proximo à membrana plasm
atica. No
l
umen da rede trans, as condic
oes s
ao ionicas, isto e, pH acido e alta concentracao de Ca2+. As protenas
23
secret
orias tem s superfcie tal que sob condicoes ionicas, as protenas se agregam umas às outras. Ent
ao as
vesculas secret
orias conseguem transportar concentracoes de protenas muito mais altas que as das protenas
n
ao agregadas no Ap. Golgi.
Endocitose: pinocitose e fagocitose
Endocitose consiste na internalizac
ao celular de partculas. Assim como as rotas de exocitose, existem
rotas de endocitose. Estas u
ltimas s
ao tradicionalmente subdividas em pinocitose e fagocitose. A pinocitose
envolve a ingest
ao de fluidos e pequenas moleculas. A fagocitose envolve a ingestao de grandes partculas,
como microoganismos e fragmentos celulares, celulas mortas. Na endocitose o material a ser ingerido e
progressivamente encerrado por uma porcao da membrana plasmatica, que brota para dentro e depois destacase como uma vescula endoctica intracelular. Esta vescula se funde a um endossomo, que depois se funde a
um lisossomo, onde o material e degradado.
A fagocitose pode ter 3 prop
ositos:
Nutric
ao: a fagocitose de microoganismos por protozoarios e bastante comum.
Defesa contra infecc
oes: em animais, por exemplo celulas fagocitarias englobam microoganismos invasores e promovem sua digest
ao.
Limpeza de celulas mortas, defeituosas ou restos celulares. Este caso tambem ocorre por celulas fagocit
arias de animais.
A celula fagocit
aria forma projec
oes com a membrana plasmatica, os chamados pseudopodes, que engolfam
a bacteria, e se fusionam nas pontas para formar um fagossomo. Este se funde posteriormente com o lisossomo
que realiza a digest
ao da bacteria. Para capturar as bacterias algumas celulas fagocitarias exigem a ligac
ao
de anticorpos aos seus v
arios receptores de superfcie, e entao quando a bacteria e coberta por anticorpos se
liga aos receptores da celula fagocit
aria, inicia-se o processo de fagocitose.
Existem dois tipos de pinocitose: aquela indiscriminada, e aquela mediada por receptores. A primeira
consiste no englobamento de qualquer molecula que eventualmente estiver no fluido celular. Ja a segunda
fornece uma rota eficiente para captar moleculas especficas do fluido celular. Para o u
ltimo caso, pinocitose
mediada por receptor, um exemplo e a captacao de colesterol por celulas animais, que necessitam deste lipdeo
para produzir novas membranas.
O colesterol e muito insol
uvel, de modo que e transportado no sangue ligado à protena na forma de
partculas chamadas lipoprotenas de baixa densidade (LDL). O LDL se liga à receptores especficos , os
complexos LDL-receptores s
ao ingeridos por pinocitose, por meio do brotamento de uma vescula pinoctica
interna. Esta vescula se funde a um endossomo. Um endossomo e um compartimento associado a membrana
para o qual se dirigem vesculas pinocticas antes de serem fundidas aos lisossomos. Os receptores se destacam
do endossomo e retornam por meio de vesculas de transporte para a membrana plasmatica. E o LDL
e entregue aos lisossomos. No lisossomo, enzimas hidrolticas quebram o LDL, liberando o colesterol no
citoplasma para que este seja usado na producao de novas membranas. Outros exemplos de metab
olitos
essenciais transportados para a celula por pinocitose mediada por receptores sao a vitamina B12 e o ferro.
Vrus como o influenza e o HIV tambem usam a pinocitose mediada por receptores para invadir a celula.
Endossomos
Endossomos: s
ao compartimentos compostos por tubos de membrana conectados a vesculas. O endossomo prim
ario localiza-se pr
oximo `
a membrana plasmatica, e e o primeiro a receber a carga captada por
endocitose. Os endossomos prim
arios amadurecem à medida que suas vesculas se fundem, ou mesmo pela
sua pr
opria fus
ao a um endossomo secundario preexistente. Finalmente ja proximo do n
ucleo, chamamos
agora este compartimento de endossomo secundario. O endossomo tem como principal funcao servir como
uma estac
ao de distribuic
ao na rota endoctica, assim como a rede trans do Golgi serve como estac
ao de
distribuicao para a rota secret
oria. No interior do endossomo e mantido um ambiente acido por meio de
bombas de pr
otons dirigidas por ATP, que continuamente bombeiam protons do citoplasma para dentro do
endossomo. Tal ambiente
acido e essencial para que muitos receptores liberem sua carga ligada (que s
o se
mantem ligados em pH neutro ou alguma situacao similar), mas ha casos em que este complexo receptor-carga
se mantem intacto.
De acordo com o tipo de receptor este pode ter 3 destinos:
24
O receptor pode retornar `

a membrana plasmatica.
O receptor pode ir para o lisossomo e ser degradado.
O receptor pode prosseguir para outro espaco extracelular, transferindo suas moleculas-carga para
este novo espaco (processo chamado transcitose). Sobre a transcitose, pode-se dizer que ocorre em
celulas expostas simultaneamente a ambientes extracelulares diferentes. De um lado a superfcie celular
est
a exposta a m meio extracelular contendo a partcula a ser ligada ao receptor e transportada por
endocitose, e do outro lado a superfcie celular esta exposta a um outro ambiente celular para o qual
a partcula carga do receptor sera liberada apos destacar-se do endossomo dentro de uma vescula
de transporte. Exemplos de celulas que realizam endocitose : celulas epiteliais com a finalidade de
promover defesa imunol
ogica, distribuir nutrientes e produzir membrana plasmatica, celulas endoteliais,
e ainda celulas do sistema end
ocrino.
Lisossomos
Lisossomos s
ao sacos membranosos de enzimas hidrolticas, que conduzem a digestao intracelular de
partculas extracelulares, moleculas, organelas esgotadas ou ainda celulas de microrganismos como bacterias.
Todos os tipos de enzimas hidrolticas contidas nos lisossomos atuam otimamente no pH acido mantido no
interior do lisossomo(pH 5). Mesmo que estas hidrolases escapassem do lisossomo, nao ocorreriam danos ao
componentes celulares, pois no citosol e mantido um pH de cerca de 7.2, e estas enzimas so trabalham em
pH
acido.
Sobre a membrana de um lisossomos, temos 3 pontos a destacar:
Presenca de protenas de transporte de metabolitos: aminoacidos, nucleotdeos e acu
cares resultantes
da degradac
ao s
ao transportados para o citosol para que possam ser usados pela celula ou excretados.
Presenca de bombas de pr
otons, dirigidas por ATP, que bombeiam constantemente protons do citosol
para dentro do lisossom a fim de manter o pH acido.
As protenas da membrana do lisossomo possuem grande quantidade de acu
cares associados como uma
estrategia de protec
ao contra as proteases lisossomicas.
Alem das rotas j
a conhecidas (vesculas pinocticas-endossomos e fagossomos se fundirem ao lisossomo),
existe uma outra rota que degrada as proprias organelas da celula. O processo parece comecar quando
organelas s
ao cercadas por uma membrana dupla, autofagossomo que depois se funde ao lisossomo que
promove a degradac
ao da organela obsoleta. Este fenomeno chama-se autofagia.
Como o lisossomo n
ao se autodigere ?
Pelo menos parte da resposta e: as protenas altamente glicosiladas usam os acu
cares como um escudo
contra a enzimas digestivas afinal os v
arios acu
cares dificultam o acesso às ligacoes peptdicas das protenas.
Porem, dentro do lisossomo existem glicosilases, e portanto, eventualmente os proprios acu
cares protetores
ser
ao degradados. O que de fato parece ocorrer e um equilbrio entre a degradacao e a reparacao do lisossomo.
Contanto que o lisossomo se autodegrade numa velocidade que de tempo suficiente para que ele realize sua
func
ao ( digerir o conte
udo recebido), nao importa se eventualmente ele seja danificado. Ate porque mesmo
se as enzimas vazarem do lisossomo, serao inativas no pH neutro do citosol.
Resta ainda a d
uvida se existe uma estrategia dos lipdeos da membrana do lisossomo assim como existe
para as glicoprotenas, que os proteja ao menos parcialmente da degradacao.
Distribuicao de protenas
Depois de sintetizadas no citosol a maioria das protenas tem duas opcoes:
As protenas s
ao direcionadas para organelas, por meio de uma sequencia sinal, uma regi
ao de
amino
acidos da protena que indica qual e a organela de destino.
As protenas que n
ao tem sequencia sinal de distribuicao continuam no citosol.
H
a 3 mecanismos para importar protenas para organelas:
25
Protenas que precisam chegar ao n

ucleo, sao transportadas para dentro desta organela por meio de
poros nucleares, presentes nas membranas externa e interna do n
ucleo.
Para serem transportadas para dentro do RE, mitocondrias, cloroplastos e peroxissomos, as membranas
destas organelas (externa e interna) entram em contato uma com a outra em certos locais, e nestes
locais existem protenas translocadoras, que auxiliam a protena a se desdobrar, de modo que ela seja
desdobrada `
a medida que e transportada. Protenas chaperonas auxiliam a puxar as protenas pelas
membranas e restituir suas conformacoes funcionais. Finalmente a sequencia sinal e clivada. Bacterias
usam este tipo de mecanismo para transportar protenas para a membrana plasmatica.
Protenas que s
ao transportadas do RE para algum outro compartimento, o fazem por meio de vesculas
de transporte. Vesculas contendo uma carga de protenas brotam do RE, dirigem-se ate a organela
de destino, se fusionam `
a membrana da organela destino e liberam sua carga de protenas para dentro
desta organela.
Mitocondria
Mitoc
ondrias s
ao organelas que possuem seu proprio DNA, RNA e um sistema completo de transcric
ao
e traduc
ao, incluindo obviamente os ribossomos, o que as permite sintetizar algumas de suas protenas (a
outra parte e codificada por genes no n
ucleo). Dependendo do tipo celular, as mitocondrias podem ser
m
oveis, associando-se aos microt
ubulos do citoesqueleto para formar longas cadeias moveis de mitoc
ondrias,
ou podem ser fixas para direcionar ATP diretamente para um stio de alto consumo de ATP. Para o segundo
caso, pode-se citar celulas musculares cardacas e espermatozoides.
No que diz respeito `
a estrutura, uma mitocondria e formada por uma membrana externa, uma membrana
interna, um espaco entre estas duas membranas chamado de espaco intermembranas, e um espaco interno
chamado matriz. A composic
ao das membrana interna e externa difere consideravelmente. A membrana
externa e perme
avel a moleculas de ate 5000 Daltons, pois possui varias moleculas de porina ancoradas. As
porinas formam largos canais aquosos. Portanto, o espaco intermembranas tem constituicao muito similar `
a
do citosol.
A membrana interna e imperme
avel a ons e à maioria das protenas, exceto em alguns stios, como
por exemplo, ATP sintase que permite a entrada de protons. Logo, a matriz possui somente moleculas
tambem na membrana interna que se d
selecionadas que puderam atravessar a membrana interna. E
a a
sntese de ATP, pois nela est
ao ancorados os componentes da cadeia de transporte de eletrons, a ATP
sintase, e v
arias protenas que transportam o piruvato e acidos graxos para a matriz. Assim, a convers
ao de
piruvato a Acetil-Coa e o ciclo de Krebs ocorrem na matriz mitocondrial, enquanto a fosforilacao oxidativa
ocorre na membrana interna. Outro aspecto importante da membrana interna, e que esta forma varias dobras
(cristas) na matriz, aumentando enormemente a area de superfcie disponvel para sntese de ATP.
Ressalta-se ainda que a matriz possui DNA, ribossomos especiais, RNAt e varias enzimas necess
arias `
a
express
ao dos genes mitocondriais.
Captulo 7
Estrutura de protenas
Estrutura prim
aria: sequencia de aminoacidos de uma cadeia peptdica.
Estrutura secund
aria: enovelamento local da cadeia polipeptdica, sem incluir as cadeias laterais-grupamentos
R). Ex: alfa-helice, folha-beta
Estrutura terci
aria: enovelamento da cadeia polipeptdica como um todo, incluir tanto os atomos da
ligac
ao peptdica quanto os da cadeia lateral, ou seja, a conformacao tridimensional completa da cadeia.
Estrutura quarten
aria : arranjo espacial de todas as cadeias polipeptdicas. Lembre-se que uma protena
pode ter mais de uma cadeia polipeptdica.
Estrutura secund
aria
Os
atomos que participam da ligac
ao peptdica sao: C-alfa, C do grupo carboxilato, N do grupo amino
Na ligac
ao entre o C do grupo carboxilato e o N, por vezes se forma um ligacao dupla por resson
ancia do
par de eletrons da dupla ligac
ao entre o C do grupo carboxilato e o O (oxigenio).
Devido a este car
ater parcial de dupla ligacao, a ligacao C-N nao rotaciona. Devido à resson
ancia, a
ligac
ao C-N e mais curta que uma ligacao amida normal e mais longa que uma ligacao dupla normal, com
car
ater parcial de 40% de ligac
ao dupla. Outra consequencia da ressonancia e que os atomos envolvidos
na ligac
ao peptdica tendem a ficar no mesmo plano ja a ligacao peptdica e um tanto rgida. De forma
a minimizar tens
oes estericas, os resduos tendem a assumir conformacao trans mais do que a cis, porem
existem casos em que certos amino
acidos obrigam os residuos com quem estao ligados a ficar em configurac
ao
cis, exemplo disso, e a prolina que possui um anel que liga a cadeia alifatica do grupamento R com o grupo
amino, este anel imp
oe ainda mais restricoes à rotacao da ligacao peptdica, deixando a configuracao cis entre
ele (prolina) e os residuos ligados a ele.
No arcabouco peptdica (cadeia peptdica), pode ainda ocorrer rotacao das ligacoes C-alfa com C do
carboxilato, e na ligac
ao C-alfa com N. Na verdade e somente em torno do carbono alfa que realmente ocorre
rotac
ao. O
angulo de torc
ao(rotac
ao) da ligacao entre C-alfa e C da carboxila chama-se Angulo
psi(letra
grega), e o
angulo de torc
ao da ligac
ao C-N chama-se fi(letra grega). O fsico Ramachandran criou a teoria,
que foi posteriormente comprovada, de que somente com determinados valores dos angulos psi e fi destas
ligac
oes, e que e possvel ocorrer o enovelamento estavel das protenas. Estes angulos sao muito importantes
para determinar o enovelamento pois dependendo dos valores que possuem, podem impedir a formac
ao de
pontes de hidrogenio (ex: fi: 180 e psi: 0 ou quando fi:0 e psi: -180) ou pode ocorrer colisao entre as nuvens
eletr
onicas do N e do C (ex: fi: 0 e psi: 0 ou quando fi:-60 e psi:180).Veja a figura do penultimo slide
da primeira aula da ufrgs. A colis
ao entre nuvens eletronicas e o impedimento da formacao de pontes de
hidrogenio s
ao duas das restric
oes da ligacao peptdica.
Como existe resson
ancia na cadeia peptdica, os atomos da ligacao peptdica sao bastante polares, e
tendem a fazer pontes de hidrogenio, tambem chamadas de ligacoes de hidrogenio.
As pontes de hidrogenio s
ao estabelecidas entre o grupo amino (doador da ponte de hidrogenio) e o
oxigenio do grupo carboxilato (aceptor da ponte de hidrogenio).
Em condic
oes fisiol
ogicas, a cadeia polipeptdica se dobra para satisfazer as necessidades de pontes de
hidrogenio, e assume uma conformac
ao (estrutura secundaria) que minimize a tensao esterica.
Tens
ao esterica: repuls
ao entre nuvens eletronicas de atomos ou grupos de atomos.
A alfa-helice e a folha Beta s
ao dois tipos de estrutura secundaria comuns encontrados em protenas.
26
CAPITULO 7. ESTRUTURA DE PROTEINAS
27
alfa-helice: neste tipo de estrutura secundaria, o arcabouco peptdico gira como um helice para a direita;
um amino
acido estabelece um ponte de hidrogenio entre o seu oxigenio do grupo carboxila e o NH de outro
amino
acido a 4 resduos a frente. Ou seja, a cada 4 resduos existe um ponte de hidrogenio. Os atomos da
cadeia peptdica est
ao em contato por interacoes de van der Waals; as cadeias laterais projetam-se para fora
da helice.
folha beta: neste tipo de estrutura secundaria filamentos ou fitas formadas por cadeias peptdicas dispoemse lado a lado por meio de pontes de hidrogenio entre os filamentos. Cada aminoacido estabelece duas pontes
de hidrogenio, exceto os amino
acidos das fitas que ficam no incio e no fim da folha. As cadeias laterais
projetam-se para ambas as faces da folha.
Folha Beta paralela : aquela em que as fitas vizinhas dispoem-se no mesmo sentido (ou seja comecam
com a mesma extremidade: todas com N ou todas com C-terminal). Folha Beta antiparalela: aquela em
que as fitas vizinhas dispoem-se em sentidos opostos(uma fita comeca com N-terminal, a outra comeca com
C-terminal).
A alfa-helice e a folha beta s
ao estruturas secundarias regulares, pois os aminoacidos tem a mesma
conformac
ao. No entanto existem estruturas irregulares, isto e, nao ha um padrao de conformac
ao em
sucessivos amino
acidos, muito comuns em protenas: alcas. As alcas podem ser em forma volta em grampo
de cabelo, por exemplo, bem simples ligando duas fitas antiparalelas de uma folha beta. Mas podem tambem
ser mais longas, como aquelas que ligam fitas paralelas de uma folha beta.
Estrutura terci
aria Enovelamento geral do arcabouco peptdico que inclui a disposicao espacial de todas
as cadeias laterais. Uma maneira de investigar a estrutura terciaria e utilizar cristalografia com raios X.
Mioglobina: foi a primeira protena a ter sua estrutura determinada por cristalografia de raios X. E
diferente da maioria das protenas pois nao possui folhas beta, sendo constituda quase inteiramente por
helices alfa.
Qualquer protena possui uma superfcie hidrofila, em que os resduos de aminoacidos ficam expostos ao
solvente, e um cerne hidr
ofobo, onde os aminoacidos ficam sequestrados do solvente.
Domnio: unidade estrutural formada pelo enovelamento de um segmento peptdico, que possui um cerne
hidr
ofobo. Tipicamente, o interior hidrofobo possui estrutura secundaria regular em que os grupamentos
polares do arcabouco estabelecem pontes de hidrogenio entre si; ja na superfcie do domnio, sao frequentes
estruturas secund
arias irregulares, onde os grupamentos polares do arcabouco peptdico podem estabelecer
pontes de hidrogenio com moleculas da agua circundante.
Desse modo, cadeias laterais com maior grau de hidrofobia tendem a ficar no interior da protena. No
interior, as cadeias laterais se amontoam, sobrando pouco espaco vazio.
As cadeias laterais polares bem como oa grupamentos polares do arcabouco peptdico (amino e carboxila,
os quais s
ao capazes de fazer ponte de hidrogenio) ao estabelecerem pontes de hidrogenio na estrutura
secund
aria, perdem parte de sua polaridade ou seja esta polaridade e em parte neutralizada, e isto lhes
permite se aprofundar no meio interno apolar. Lembre-se que a polaridade e maior quando o atomo ainda
n
ao estabeleceu nenhuma ligac
ao que atenda suas necessidades eletrostaticas, uma vez que o faca, como por
exemplo, ao estabelecer pontes de hidrogenio, sua polaridade diminui pois suas necessidades elestrost
aticas
foram atendidas.
Conformac
ao: refere-se `
a um nvel de organizacao estrutural acima da sequencia de aminoacidos (estrutura prim
aria), ou seja, refere-se `
a estrutura tridimensional de uma molecula determinada pela somat
oria de
ligac
oes fracas n
ao covalentes. Configuracao: refere-se à estrutura tridimensional de uma molecula determinada por ligac
oes covalentes., como as configuracoes D e L dos aminoacidos.
conformac
ao nativa : e aquela em que a protena apresenta suas propriedades biologicas naturais
desnaturac
ao: alterac
ao da conformacao nativa, desenovelar a protena, que pode resultar em perda
possvel desnaturar uma
parcial ou total, reversvel ou irreversvel, da atividade biologica da protena. E
protena por alterac
ao do pH e da temperatura do meio, e tambem pela adicao de sais ou ureia que interfiram
com a estrutura da
agua solvente, atenuando o efeito hidrofobo
Forcas que estabilizam estrutura tridimensional das protenas
Forcas n
ao covalentes:
Ligacoes de hidrogenio quem faz: aminoacidos cujas cadeias laterais sao polares, e os grupos amino e
carboxila do arcabouco peptdico
Ligacoes i
onicas quem faz: amino
acidos carregados dependem do estado do ionizacao dos amino
acidos e
do pH do meio; s
ao menos frequentes que as pontes de hidrogenio
CAPITULO 7. ESTRUTURA DE PROTEINAS
28
Interac
oes hidrof
obicas quem faz: aminoacidos apolares sao a principal forca que governa a estrutura das
protenas O aumento de entropia causado pelo movimento das moleculas de agua que desfazem as esferas
de hidratac
ao ao redor dos radicais apolares devido a repulsao (pois as moleculas de agua sao polares),
impulsiona os radicais apolares a se aproximarem e afastaremse- das moleculas de agua. Assim, os radicais
apolares aprofundam-se no interior das protenas, e este efeito hidrofobo e termodinamicamente favor
avel.
Forcas de Van der Waals (forca eletrostatica entre dipolos temporarios criados devido a orbita err
atica
dos eletrons) quem faz: qualquer amino
acido ocorrem geralmente em regioes onde ha interacoes hidrof
obicas,
que aproximam os radicais apolares, facilitando a interacao entre dipolos.
Forcas covalentes: Pontes dissulfeto: sao formadas entre dois resduos de cistena; por ser covalentes, e
muito mais difcil de quebrar que as ligacoes de hidrogenio. Pontes dissulfeto so podem ser rompidas por
algum agente redutor, como mercapto-etanol. Ex: a insulina possui duas pontes dissulfeto entre as cadeias
A e B, alem disso, a cadeia B tem uma ponte dissulfeto intracadeia. Apesar de ser mais fraca que a ligac
ao
peptdica, a ponte dissulfeto n
ao se rompe quando a protena desnatura em meio acido ou por calor.
A ligac
ao peptdica e muito forte, sendo necessario HCl 6N a 100o C para rompe-la. Lembre-se que quando
a protena desnatura, ela perde sua conformacao nativa mas nao e rompida a ligacao peptdica por isso o
arcabouco peptdico permanece intacto.
Atencao: as pontes de hidrogenio n
ao sao a principal forca envolvida na estabilidade das protenas, pois
quem estabiliza a conformac
ao enovelada e em grande parte o efeito hidrofobo. As pontes de hidrogenio pode
ser vistas como um refinamento da estabilidade da conformacao nativa. Tanto e que, ao desnaturar uma
protena, s
ao desfeitas as pontes de hidrogenio.
Indice hidrop
atico ou escala de car
ater hidrofobo, e uma medida do quao hidrofobico e uma amino
acido.
Quanto mais negativo este ndice, mais polar e o aminoacido.
Perfil hidrop
atico de uma protena e a soma dos ndices hidropatico a cada 9 resduos de amino
acidos da
cadeia polipeptdica.Permite prever regioes hidrofobicas e hidroflicas de uma protena.
Ressalta-se que ligac
oes i
onicas e pontes dissulfeto contribuem pouco para a estabilidade da protena. No
caso das pontes dissulfeto, estas s
ao raras em protenas intracelulares, ja que o citoplasma e um ambiente
reduto. As pontes dissulfeto s
ao mais abundantes em protenas secretadas para o meio extracelular que e
normalmente oxidante, evitando que a protena desenovele sob as condicoes extracelulares. No caso da ligac
ao
i
onica, esta pouco contribui para o estabilidades, pois quando as cadeias laterais ficam fixas no par i
onico,
ocorre diminuic
ao da entropia.
Dedos de zinco s
ao interligac
oes entre um domnio proteico e ons zinco que ajudam a estabilizar domnios
muito pequenos.
Toda a informac
ao necess
aria para o enovelamento de uma protena esta contida em sua sequencia de
amino
acidos.
Chaperonas: protenas que auxiliam outras protenas a assumir sua conformacao nativa
Algumas protenas precisam ser processadasantes de se enovelarem; podem receber grupos glicdicos,
lipdicos, podem ser estabelecidas pontes dissulfeto; ou podem se ligar outros grupos organicos, como o grupo
heme que se liga no cerne hidr
ofobo da mioglobina.
ataque nucleoflico: quem ataca e um anion ataque eletroflico: quem ataca e um cation (atomo que tem
afinidade por eletrons)
Captulo 8
Enovelamento de protenas
As protenas globulares s
ao aproximadamente esfericas, geralmente sol
uveis e desempenham diversas
func
oes. Sua forma resulta do dobramento da ou das cadeias polipeptdicas. Ex: hemoglobina.
As protenas fibrosas tem forma alongada, geralmente sao insol
uveis e desempenham papel estrutural.
Sua forma resulta da disposic
ao das cadeias polipeptdicas em paralelo a um eixo, podendo produzir longas
fibras resistentes. Ex: alfa-queratina do cabelo, unhas; tropocolageno.
Protenas conjugadas: sua cadeia polipeptdica esta ligada covalentemente ou nao covalentemente a um
grupo org
anico n
ao proteico. Este grupo organico nao proteico chama-se grupo prostetico.
Conformac
ao nativa: Conformac
ao mais estavel para a protena no meio em que se encontra, e e nesta
Conformac
ao que a protena e capaz de exercer suas funcoes biologicas.
Desnaturar um protena significa fazer com que a protena perca sua Conformacao nativa, e por consequencia, perca suas func
oes biol
ogicas. Afinal uma protena desnaturada e uma cadeia polipeptdica distendida, devido `
a reduc
ao das pontes dissulfeto (caso as possusse) e da quebra das ligacoes nao covalentes
que determinavam as estruturas quartenaria(se tiver), terciaria e secundaria.
Para reduzir ou quebrar pontes dissulfeto podem ser usadas agentes redutores como ureia e 2-mercaptoetanol.
Experimento de Anfinsen
Anfisen usou ureia e 2-mercaptoetanol para quebrar as 4 pontes dissulfeto da ribonuclease A, e desnatur
ala. Com a adic
ao destes agentes ao meio, a protena perdeu sua atividade. Porem, uma vez retirados estes
agentes redutores por meio de di
alise (saco com furinhos muito pequenos, pelos quais so passam moleculas
pequenas como a ureia e o 2-mercaptoetanol), restando apenas as cadeias polipeptdicas distendidas, estas
voltaram a se reenovelar, assumindo novamente sua estrutura nativa e como resultado, voltando a exercer
sua atividade. Isto comprova que a cadeia polipeptdica reune toda a informacao necessaria para que um
protena atinja sua estrutura terci
aria, afinal no meio apos a dialise so restou protenas, e esta se reenovelaram
espontaneamente sem ajuda de nenhuma outra molecula, partindo apenas de sua sequencia de amino
acidos.
Learning some trick: a mioglobina, a globina alfa e a globina Beta (estas duas u
ltimas sao as cadeias
polipeptdicas da hemoglobina, duas de cada) possuem estruturas secundaria muito similares: todas possuem
7 segmentos de alfa-helice que delimitam um cerne hidrofobico onde se encontra um grupo heme. No entanto,
as sequencias de amino
acidos destas cadeias tem baixa similaridade.
Lembrando-se do experimento de Anfinsen, que comprovou toda a informacao necessario para o enovelamento de uma protena est
a em sua sequencia de aminoacidos, pareceria estranho o caso das globinas acima.
Explicac
ao: Os radicais (que diferenciam os aminoacidos entre si), nao participam da estabilidade da estrutura secund
aria. Apenas os
atomos os
atomos e grupos envolvidos na ligacao peptdica e que determinam a
estrutura secund
aria, isto e, apenas C-alfa, grupo carbonlico e e grupo amino. Assim, e possvel que ocorram
alterac
oes na estrutura prim
aria sem alterar a estrutura secundaria. No caso das globinas, estas sofreram
mutac
oes pontuais ao longo de sua evolucao sem no entanto alterar sua estrutura secundaria.
29
Captulo 9
Enzimas
S
ao catalisadores biol
ogicos. Catalisador: substancia que acelera uma reacao; participa da reac
ao e ao
final volta `
a sua conformac
ao inicial.
Substrato: reagente de uma reac
ao que e catalisada por uma enzima.
cat
alise: aumento da velocidade de uma reacao.
Exemplos de maneiras para acelerar a velocidade de uma reacao
Aumento da temperatura
Adic
ao de um catalisador
Uma enzima possui um centro ativo, regiao onde ocorre a catalise, pois e no centro ativo que o substrato
se liga a enzima. Os centros ativos de quase todas as enzimas localizam-se em fendas na superfcie da enzima.
Diferencas entre catalisadores n
ao biologicos e enzimas:
* As enzimas possuem um centro ativo. Os catalisadores nao biologicos nao possuem centro ativo. *
As enzimas possuem especificidade de reacao. Normalmente um catalisador nao biologico pode catalisar
diferentes reac
oes. * As enzimas s
ao reguladas pelos organismos, o que nao ocorre com os catalisadores n
ao
biol
ogicos.
Isoenzimas: m
ultiplas enzimas que catalisam a mesma reacao; obviamente elas possuem diferentes propriedades catalticas.
Para reagentes chegarem ao estado de transicao e em seguida se tornarem produtos, sao necess
arios
rearranjos dos padr
oes de ligac
oes covalentes dos reagentes, e do estado de transicao; estes rearranjos exigem
energia, ou seja, a energia necess
aria que os reagentes devem ter, e usado nos rearranjos. Um enzima diminui
a energia de ativac
ao de uma reac
ao, isto significa dizer que ela permite que moleculas de menor energia
cheguem ao estado de transic
ao. Existem varios mecanismos por meio dos quais uma enzima diminui a
energia de ativac
ao de uma reac
ao:
a enzima posiciona o substrato (reagente) na orientacao apropriada para a reacao;
a enzima permite uma proximidade ntima entre os grupamentos reativos, de modo a aumentar a frequencia
de colis
oes que podem levar `
a reac
ao.
a enzima estabelece interac
oes fracas com o substrato, e alem de orientar o substrato apropriadamente para
a reac
ao, a enzima faz alterac
oes na conformacao do substrato, enfraquecendo ligacoes crticas, e portanto,
facilitando a passagem do reagente para o estado de transicao, ou seja, facilitando a ocorrencia de rearranjos
necess
arios para chegar ao estado de transicao que exigiam uma energia muito mais alta. Dessa maneira a
enzima permite que moleculas de menor energia cheguem ao estado de transicao.
a enzima aproveita-se da energia diferencial de ligacao, que determina sua maior afinidade pelo estado
de transic
ao que pelo reagente no estado normal. A alta afinidade da enzima pelo estado de transic
ao,
torna-o energeticamente favor
avel,ou seja, estabiliza-o, diminuindo a energia desta estrutura intermedi
aria,
e portanto, diminuindo a energia de ativacao.
A variac
ao de energia livre de Gibbs e o equilbrio qumico nao sao alterados pela catalise enzim
atica.
Encaixe induzido: Muitas enzimas sofrem mudanca de conformacao durante a ligacao ao substrato, de
modo que elas encarcerem quse totalmente os subtratos.
Cinetica
Velocidade: taxa de aparecimento de produto por unidade de tempo
30
CAPITULO 9. ENZIMAS
31
Esquema de cinetica enzim

atica de Michaelis-Menten
E+S
ES
E
+
P
Quando concentrac
oes pequenas de substrato sao adicionadas a uma preparacao enzimatica, a velocidade
da reac
ao aumenta bruscamente. No entanto à medida que quantidades maiores de substrato sao adicionadas,
a velocidade da reac
ao tende a tornar-se constante e aproxima-se de um valor maximo. A reacao atinge ent
ao
sua velocidade m
axima quando a enzima esta saturada com substrato, o que significa dizer que ha muito mais
moleculas de substrato que de enzimas, de modo que nao ha moleculas de enzima suficientes para catalisar a
reac
ao de todas as moleculas de substrato. A velocidade maxima e constante e nao depende da concentrac
ao
do substrato, portanto, mesmo que seja adicinado mais substrato, a velocidade da reacao nao aumentar
a.
Informac
oes importantes para compreender textos que discutem regulacao de vias metabolicas
Km(constante de Michaelis): concentracao de substrato na qual a velocidade da reacao e metade da
velocidade m
axima. Esta constante Km indica a eficiencia de uma enzima, e tambem e usada como medida
da afinidade da enzima pelo substrato. Logo, quanto menor o valor de Km, mais eficiente e a enzima e maior
e a sua afinidade pelo substrato.
Estado estacion
ario: estado em que a concentracao do complexo enzima-substrato e constante.
a
Kcat(constante de cat
alise): indica o quao rapido um enzima converte o substrato em produto. E
constante de velocidade quando a enzima esta saturada com substrato.
Tipos de inibic
ao enzim
atica:
Inibidor irreversvel: modifica covalentemente alguma cadeia lateral de um resduo da enzima, inativandoa. Este Inibidor se liga a enzima como se fosse um substrato, mas e incapaz de sofrer a reacao completa, por
isso ele fica encalhado no centro ativo da enzima, e portanto, a impede de atuar sobre o verdadeiro substrato.
Inibidor reversvel: e qualquer inibidor que se liga de modo reversvel à enzima. Entre os tipo de inibic
oes
reversveis conhecidas, pode-se citar a inibicao competitiva. Um inibidor reversvel pode afetar a Km, a Kcat
da enzima ou ambas.
Inibic
ao competitiva: o inibidor e um composto que faz competicao direta com o subtrato, por ser parecido
no tamanho e nas propriedades qumicas gerais com o substrato. Eles competem pela ligacao ao centro ativo
da enzima. Ressalta-se que o inibidor nao tem a estrutura necessaria para sofrer a reacao. A ligac
ao do
inibidor e do substrato `
a enzima s
ao mutuamente excludentes.
Inibic
ao alosterica: enzimas oligomericas possuem m
ultiplos centros ativos de m
ultiplas subunidades. Este
tipo de enzima e sujeito `
a inibic
ao alosterica, em que a ligacao de um inibidor em um centro ativo diminui a
atividade cataltica dos outros centros ativos das outras subunidades.
Captulo 10
Crescimento Microbiano
Tempo de gerac
ao: tempo necess
ario para que uma celula se divida em duas novas celulas, originando
uma nova gerac
ao de celulas. Ou ainda tempo necessario para que uma geracao duplique seu n
umero de
celulas.
Crescimento microbiano: aumento do n
umero de celulas em um populacao.
Crescimento exponencial: e aquele em que o n
umero de celulas dobra a cada intervalo de tempo constante. Num gr
afico semilogartmico (n
umero de celulas plotado em escala logartmica, e tempo plotado em
escala aritmetica), nota-se que o crescimento e representado por uma reta, indicando que o crescimento e
exponencial.
possvel prever o tempo de gerac
E
ao por meio deste grafico, basta observar quantas horas sao necess
arias
para dobrar o n
umero de celulas (Figura 10.1).
N = N0 2 n
(10.1)
N = n
umero final de celulas
N0 = n
umero inicial de celulas
n = n
umero de gerac
oes
g = t/n
g = tempo de gerac
ao
t = tempo de durac
ao do crescimento exponencial, expresso em horas, dias, min.
inclinac
ao da reta de crescimento exponencial num grafico semilogartmico
k = 0,301/g
k tambem e chamado de ndice de crescimento especfico
ndice de divis
ao
v = 1/g
(10.2)
Corresponde ao contr
ario de g, ou seja, o n
umero de geracoes por unidade de tempo.
Batch culture: quando as bacterias crescem num sistema fechado, como um frasco, um tubo ou placa de
Petri.
O crescimento real de uma bacteria em um sistema fechado, e mais bem descrito por meio de outra curva,
que inclui diferentes fases, entre as quais esta a exponencial (Figura 10.2).
A primeira fase : fase lag Fase anterior ao comeco do crescimento exponencial; tempo necess
ario para
as celulas produzirem o que precisam para comecar a crescer; e uma fase onde nao ha aumento significativo
das celulas; esta fase ocorre quando o inoculo vem de cultura antiga (fase estacionaria) e precisam de tempo
para produzir componentes essenciais(ex.: coenzimas), ou quando as celulas sofreram danos (choque termico,
radiac
ao, agentes qumicos t
oxicos)e precisam de tempo para repara-los, ou ainda quando as celulas s
ao
tranferidas de um meio rico para um meio pobre, e precisam de tempo sintetizar varias enzimas. Neste
perodo ocorre aumento do tamanho celular, do peso seco e da quantidade de protenas. Nesta fase ocorre
adaptac
ao interna da celula ao novo meio de cultura.
32
CAPITULO 10. CRESCIMENTO MICROBIANO
33
Figura 10.1: Gr
afico de crescimento microbiano. Fonte: Brock Microbiology of Microorganisms, cap.2.
Segunda fase: fase exponencial ou fase log O n
umero de celulas dobra a cada intervalo de tempo regular.
a fase em que a celula est
E
a com as melhores condicoes, entao estudos sobre enzimas e outros componentes
celulares usam celulas que est
ao nesta fase. O ndice de crescimento exponencial e influenciado por condic
oes
ambientais (temperatura, composic
ao do meio de cultura), e por caractersticas geneticas do organismo.
Celulas de procariotos tendem a crescer mais rapidamente que de eucariotos, pois os primeiros possuem
uma relacao de
area de superfcie por volume maior que lhes da uma capacidade maior ou mais eficiente de
no final da fase log, que a populacao apresenta diferentes fen
absorver nutrientes e trocar excretas. E
otipos
marcantes, resultantes do quorum sensing.
Quorum sensing refere-se `
a comunicacao intra e interespecfica de bacterias que possuem vias metab
olicas
reguladas pela densidade populacional.
Terceira fase: fase estacion
aria Quando a fase exponencial cessa, a cultura de celulas entra na fase
estacion
aria. A fase exponencial cessa porque pode acontecer ou uma ou as duas situacoes: um nutriente
essencial e exaurido do meio produto excretado se acumula no meio e inibe o crescimento Na fase estacion
aria
n
ao ocorre nem aumento nem decrescimo no n
umero de celulas, sendo o ndice de crescimento igual a zero.
Embora as celulas n
ao crescam, seu metabolismo continua ativo. Algumas celulas podem ate passar por
divis
ao celular, porem, n
ao h
a aumento significativo no n
umero de celulas. O n
umero de celulas torna-se
aproximadamente constante pois o n
umero de celulas novas produzidas e compensado pelo n
umero de celulas
que morrem. Este fen
omeno em que divisao celular e morte se balanceiam e chamado de crescimento crptico.
Pode ocorrer esporulac
ao na fase estacionaria.
Quarta fase: fase de morte ou fase declnio Caso a incubacao prossiga mesmo depois que a cultura atingiu
a fase estacion
aria, as celulas ir
ao eventualmente morrer. Quando a populacao comeca a morrer, numa func
ao
exponencial, entra-se na fase declnio. O ndice de morte e menor que o ndice do crescimento exponencial,
apesar de ambas as fases serem func
ao exponencial.Pode ocorrer lise celular.
Lembre-se que este ciclo de crescimento, com a fase lag, log, estacionaria e declnio referem-se ao crescimento de uma populac
ao de celulas em sistema fechado, e nao à celulas individuais.
A seguir fatores que afetam o crescimento bacteriano:
Temperatura: e o principal fator que determina a taxa crescimento de um organismo.
Temperaturas cardinais:
Temperatura mnima: e aquela abaixo da qual nao e possvel ocorrer crescimento pois as membranas
congelariam a ponto de deixar extremamente lentos os processos de transporte inviabilizando a obtenc
ao
em tempo h
abil de nutrientes.
34
Figura 10.2: Fases de crescimento microbiano. Fonte: Brock Microbiology of Microorganisms, cap.2.
aquela em que todos ou quase todos
Temperatura
otima: mais proxima da maxima que da mnima. E
os componentes celulares est
ao em um ndice maximo de eficiencia, resultando taxa de crescimento
m
axima possvel para aquele micro-organismo.
Temperatura m
axima: temperatura acima da qual nao e possvel crescer pois as protenas sao desnaturadas, as membranas colapsam e ocorre lise termica, enfim componentes celulares sao irreversivelmente
danificados.
Classificac
ao dos microrganismos segundo a temperatura otima:
psicr
ofilos: temperatura
otima baixa (cerca de 15o C ou menos), temperatura maxima abaixo de 20o C
ou menos, temperatura mnima de 0o C ou menos. Habitats ideais para este tipo de organismo s
ao: lagos
com camada permanente de gelo; profundezas dos oceanos, geleiras, locais de grande altitude. Organismos
psicr
ofilos n
ao conseguem resistir ao aquecimento. Ex: Bacteria, Archaea e eucariotos como algas.
Psicrotolerantes: s
ao organismos que vivem numa temperatura otima entre 20o e 40o C, mas que conseguem
o
sobreviver a 0 C.
Adaptac
oes dos organimos psicr
ofilos
Apesar de ainda restarem muitas d
uvidas sobre as adaptacoes de microrganismos psicrofilos algumas
podem citadas:
As protenas possuem mais s-helice e menos folhas- que as protenas de organimos mesofilos,e alem
disso possuem menos interac
oes fracas, como pontes de hidrogenio e interacoes ionicas, e mais amino
acidos
polares e menos amino
acidos hidrof
obicos em sua estrutura primaria.
A membrana destes organimos mantem-se semifluidamesmo diante de baixas temperatura, pois sua membrana e predominantemente constituda de lipdeos de cadeias curtas e insaturados. Assim, sua membrana
consegue manter uma fluidez suficiente para que os processos de transporte e outras funcoes da membrana
sejam eficientes e viabilizem o crescimento do microrganismos. Explicacao para tal composicao: A fluidez
depende da composic
ao da membrana, pois a natureza dos lipdeos determina o grau de empacotamento das
caudas hidrocarbonadas. Quanto maior o grau de empacotamento menor sera a fluidez (e mais viscosa ser
a
a membrana). O comprimento das caudas hidrocarbonadas e o seu grau de insaturacao (n
umero de ligac
oes
duplas) afetam o grau de empacotamento na bicamada.Normalmente um lipdeo tem uma cauda saturada,
e a outra cauda insaturada, o que lhe da o aspecto de grampo. Cadeias mais curtas envolvem um n
umero
menor de interac
oes entre as caudas hidrocarbonadas, o que determina um ponto de fusao mais baixo,e maior
fluidez da membrana, pois oferecem menor area de superfcie para interacoes hidrofobicas e de Van der Waals.
E cada ligac
ao dupla em uma cauda hidrocarbonada cria uma pequena dobra rgida (as ligacoes duplas nos
35
lipdeos de membrana geralmente s

ao cis) que dificulta o empacotamento das caudas, aumentando assim a
fluidez.
Outra adaptac
ao s
ao as protenas de choque termico frio(cold-shock) e os crioprotetores. As protenas
cold shock auxiliam outras protenas a se manterem ativas sob baixas temperaturas e podem tambem se ligar
a RNAm especficos facilitando sua traducao. Crioprotetores incluem protenas anti-congelamento e solutos
especficos como glicerol e outros acu
cares que podem ser produzidos em grande quantidade a fim de evitar
a formac
ao de cristais de gelo que poderiam perfurar a membrana plasmatica.
Ponto importante: baixas temperaturas podem inibir o crescimento de microrganismos nao psicr
ofilos,
porem, tais temperaturas n
ao implicam necessariamente a morte. Um exemplo disso e a preservacao a longo
prazo de celulas por meio do congelamento. Mesmo em temperatura baixssimas como -80o C ou mais baixo
as celulas podem manter um metabolismo mnimo apesar de nao crescerem. O meio ao qual as celulas est
ao
expostas tambem afeta a resposta ao congelamento. No caso de culturas em criopreservacao, e adicionado ao
meio glicerol ou DMSO (dimetil sulf
oxido), crioprotetores que impedem a formacao de cristais de gelo.
Term
ofilos: organismos cuja temperatura otima de crescimento e acima de 45o , chegando ate 80o C. Foram
encontrados microrganismos de Bacteria, de Archaea e eucariotos(ex: fungos).
Pesquisas sobre term
ofilos permitiram formar 3 conclusoes:
Organismos procariotos s
ao capazes de crescer em temperaturas mais altas que eucariotos.
A maioria dos procariotos term
ofilos e composta por especies de Archaea
Organismos n
ao fototr
opicos conseguem viver sob temperaturas mais altas que organismos fototr
opicos.
Hiperterm
ofilos: organismos cuja temperatura otima de crescimento e acima de 80o C. Foram encontrados
microrganismos apenas de Bacteria e de Archaea.
Adaptac
oes dos term
ofilos e dos hipertermofilos
Protenas: As sequencias das protenas de termofilos e hipertermofilos tem similaridade consider
avel com
as protenas de mes
ofilos. Portanto, a sequencia de aminoacidos completa em si nao parece contribuir para
a estabilidade diante de altas temperatura das protenas de termofilos e hipertermofilos. No entanto, parece
ser mais significativa a substituic
ao de aminoacidos em alguns poucos stios que determina um enovelamento
alternativo, tal que este possibilite `
a protena ser termoestavel. Outras estrategias de estabilidade s
ao a
frequencia aumentada de interac
oes i
onicas entre aminoacidos basicos e acidos, e o interior altamente hidrof
obico da protena. Alem disso, certos hipertermofilos produzem solutos como diglicerol-fosfato e outros
em grande quantidade, os quais auxiliam as protenas a se manterem estaveis diante das altssimas temperaturas.
Membrana: A membrana dos term
ofilos e hipertermofilos e tambem termoestavel. No caso dos organismos
que possuem
acidos graxos como constituintes da membrana, basta usarmos as explicacoes da adaptac
ao dos
psicr
ofilos ao contr
ario. Ou seja, os termofilos e hipertermofilos possuem em sua membrana frequentemente
lipdeos saturados e de cadeia hidrocarbonada mais longa (assim a membrana tem um ponto de fusao maior, se
manter
a fluida sob altas temperatura e nao entrara em colapso). Porem, no caso das Archaeas hiperterm
ofilas,
estas utilizam algumas estrategias mais sutis: possuem outros compostos de longas cadeias no lugar dos
acidos
graxos para compor seus lipdeos. Ex: fitanil, bifitanil, crenarqueol, etc. E ainda algumas especies possuem
em vez de bicamada, uma monocada. Ex: uma monocamada de bifitanil. A monocamada por possuir um
lipdeo de cadeia muito maior, possui um ponto de fusao bem maior, e portanto, e muito mais resistente ao
aquecimento que a bicamada.
Curiosidada: a conhecida Taq polimerase, utilizada em qualquer PCR, foi isolada de Thermus aquaticus,
uma bacteria gram-negativa term
ofila.
Outros fatores ambientais que afetam o crescimento
pH: Todos os organismos possuem uma faixa de pH dentro da qual seu crescimento e possvel, bem como
o pH correspondente ao crescimento
otimo.
Acid
ofilos: organismos que crescem otimamente a um pH abaixo de 5.5 Muitos fungos e bacterias s
ao
acid
ofilos.
Alcaliflicos: organismos que crescem otimamente a um pH superior a 7.9
Tamp
oes: em culturas fechadas, e necessario trocar frequentemente o tampao para manter um meio
com pH relativamente constante, pois durante o crescimento o pH pode mudar como resultado das reac
oes
metab
olicas que consomem ou produzem substancias acidas ou basicas.
36
Neutr
ofilos: organismos que crescem otimamente a um pH entre 5.5 a 7.9
Press
ao osm
otica
Hal
ofilos: organismos crescem otimamente em ambientes com concentracoes altas de sais como NaCl e
KCl.
Hal
ofilos extremos: crescem otimamente em ambientes com concentracoes altssimas de sal.
Halotolerantes: organismos que conseguem viver em ambientes com certo aumento de solutos, porem, seu
crescimento
otimo se d
a na ausencia de soluto adicionado.
Osm
ofilos: organismos capazes de crescer em ambientes com altas concentracoes de acu
car como soluto.
Xer
ofilos: organismos que crescem em ambientes muito secos, com pouqussima disponibilidade de
agua.
Solutos compatveis: solutos usados para ajustar a pressao osmotica do citosol sem inibir as macromoleculas da celula: ex: KCl na archaea Halobacterium.
Tens
ao de Oxigenio
Aer
obios: Podem crescer em concentracoes altas de oxigenio (ex: ar com 21% de O2 ), e usam oxigenio
em seu metabolismo.
Aer
obios obrigat
orios: tem seu crescimento inibido ou podem morrer na ausencia de oxigenio.
Aer
obios facultativos: Com condic
oes adequadas de nutrientes, podem viver em ambientes com presenca
ou ausencia de oxigenio.
Microaer
ofilos: Aer
obios que usam oxigenio apenas quando sua concentracao e menor que a do ar, pois
possuem capacidade limitada de usar oxigenio ou porque contem moleculas sensveis a oxigenio.
Anaer
obios: Vivem em ambientes com ausencia de oxigenio
Anaer
obios obrigat
orios: tem seu crescimento inibido ou podem morrer na presenca de oxigenio.
Anaer
obios Aerotolerantes: podem tolerar oxigenio e crescer embora nao sejam capazes de usa-lo.
Derivados de oxigenio t
oxicos
O que de fato e t
oxico para anaer
obios estritos nao e o oxigenio molecular, mas sim os derivados de
oxigenio.
Oxigenio singlete (1 O2 ) e oxigenio triplete (3 O2 )
Chamamos de triplete o estado em que os eletrons ocupam orbitais individuais e neste caso existem 3
combinacoes possveis de spins:
+1/2 e -1/2 (um eletron para cima, outro para baixo)
+1/2 e +1/2 (dois eletrons para cima)
-1/2 e -1/2 (dois eletrons para baixo)
Chamamos de singlete o estado em que dois eletrons ocupam um mesmo orbital, e portanto s
o h
a uma
combinacao possvel de spin:
+1/2 e -1/2 (um eletron para cima, outro para baixo)
O oxigenio molecular triplete reage diretamente com radicais, isto e, moleculas que tem um atomo com
pelo menos um eletron desemparelhado. Em contrapartida, o oxigenio triplete nao reage com compostos com
eletrons emparelhados como os compostos organicos componentes da celula.
O oxigenio singlete por sua vez, tem um nvel de energia maior que o triplete, e mais instavel, reage
rapidamente com compostos com eletrons emparelhados e portanto pode conduzir oxidacoes espont
aneas
indesejadas de compostos org
anicos na celula. Esta especie reativa de oxigenio pode ser produzida por reac
oes
fotoqumicas ou bioqumicas, sendo no u
ltimo caso mediado pela acao de peroxidases. Alguns organismos
fototr
opicos possuem pigmentos coloridos chamados carotenoides que convertem o oxigenio singlete em formas
n
ao t
oxicas.
Alem do oxigenio singlete, outras formas reativas de oxigenio podem ser citadas:
super
oxido = O2
per
oxido de hidrogenio = H2 O2
hidroxila
Todos s
ao subprodutos da respirac
ao quando O2 e reduzido à agua, ou por reacoes catalisadas por redutores como flavoprotenas, quinonas, protenas com ferro ou enxofre. Portanto, mesmo que a celula n
ao
realiza fosforilac
ao oxidativa, e possvel que produza derivados de oxigenio toxicos. A hidroxila e a especie
mais reativa, seguida pelo super
oxido, e por u
ltimo o peroxido de hidrogenio.
Reduc
ao do oxigenio em 4 passos:
O2 + e O2
O2 + e + 2 H + H2 O2
37
H2 O2 + e + H+ H2 O + OH
OH + e + H+ H2 O
Nestas reac
oes, eletron e representado pela letra e. Enzimas que catalisam a conversao de super
oxido e
per
oxido a
agua e oxigenio Catalase: converte peroxido de hidrogenio à agua e oxigenio molecular
H2 O2 + H2 O2 2 H2 O + O2
Peroxidase: converte per
oxido de hidrogenio à agua
H2 O2 + NADH + H+ 2 H2 O + NAD+
Super
oxido desmutase: converte superoxido a peroxido e oxigenio molecular
O2 + O2 + 2 H+ H2 O2 + O2
Aer
obios estritos e facultativos: possuem superoxido desmutase e catalase, afinal seu metabolismo gera
frequentemente o super
oxido e o per
oxido de hidrogenio.
Anaer
obios estritos e aerotolerantes: nao possuem superoxido desmutase, porem alguns aerotolerantes
usam complexos de manganes para reduzir o superoxido. Como alternativa à superoxido desmutase, certos
anaer
obios obrigat
orios de Archaea usam a enzima superoxido redutase, que nao produz oxigenio, apenas
per
oxido de hidrogenio e usa como aceptor de eletrons a rubredoxina, uma protena contendo ferro-enxofre
com baixo potencial de reduc
ao. Quanto ao peroxido de hidrogenio formado, este e reduzido por enzimas
similares a peroxidase. A super
oxido redutase esta presente tambem em anaerobios de bacterias, metan
ogenos
de Archaea, e alguns microaer
ofilos. Portanto, organismos anaerobios apesar de nao possurem super
oxido
desmutase, s
ao capazes de consumir o superoxido com vias alternativas.
Captulo 11
Divisao celular bacteriana

Quando as celulas bacterianas crescem, estas realizam fissao binaria (crescimento vegetativo) ou algum
outro mecanismo de divis
ao celular. Algumas bacterias quando nao estao em crescimento e quando est
ao em
ambiente com escassez de nutrientes, realizam esporulacao, ou seja, formam endosporos, que sao estruturas
de dormencia que resistem `
a condic
oes ambientais desfavoraveis (exposicao ao calor, radiacao, desidratac
ao
e agentes desinfetantes). Lembre-se que endosporos nao sao estruturas reprodutivas, sao estruturas de resistencia. Quando o esporo estiver sob condicoes favoraveis novamente, o esporo germina e origina uma celula
vegetativa novamente. Processo de formacao da celula vegetativa a partir do esporo:
Ativac
ao: o esporo sofre aquecimento.
Germinac
ao: depois de aquecido e em um ambiente com disponibilidade de nutrientes, ocorre ruptura
ou reabsorc
ao da capa do esporo, consequente perda de resistencia e aumento do metabolismo.
Crescimento:o esporo sofre intumescimento, pois absorve agua do meio; metabolismo normal e retomado, a celula vegetativa emerge do endosporo quebrado, e continua a crescer como antes.
Etapas de formac
ao de endosporos:
Formac
ao de um septo em cada polo da celula, mas somente um deles formara o endosporo.
Invaginac
ao da membrana plasm
atica ao redor do DNA, formando um pre-esporo.
Engolfamento do pre-esporo pela membrana da celula mae formando um segundo envoltorio.
Deposic
ao de peptideoglicano entre as duas membranas, formando o cortex obs: este peptideoglicano
contem menos ligac
oes cruzadas que uma parede celular; ac
umulo de dipicolinato de calcio que se liga
a moleculas de
agua e portanto ajuda a desidratar o esporo e alem disso se intercala entre as bases do
DNA estabilizando e protegendo contra a desnaturacao por calor.
Deposic
ao da capa proteica(v
arias camadas) sobre o cortex.
Maturac
ao do endosporo, deposicao de exosporium, fina camada proteica sobre a capa proteica.
Liberac
ao do endosporo pela lise da celula-mae usando enzimas lticas.
Em microbiologia, crescimento significa aumento do n
umero de celulas e nao aumento das dimens
oes da
celula.
A fiss
ao bin
aria consiste no crescimento da celula, aumento de seus componentes, constricao e consequente
divis
ao em duas celulas filhas com quantidades equivalentes dos componentes celulares.
A fiss
ao e coordenada espacial e temporalmente. Existe um complexo proteico que se forma regiao mediana
da celula que determina o plano e o local de constricao na celula. Este complexo se chama divisoma. Algumas
das protenas mais importantes do divisoma sao as Fts. Uma Fts que existe tanto em archaeas quanto em
bacterias e a FtsZ, respons
avel por formar um anel de constricao similar ao de actina-miosina de muitos
38
CELULAR BACTERIANA
CAPITULO 11. DIVISAO
39
eucariotos. A FtsZ e uma GTPase que se polimera para formar o anel Z. ESte anel Z esta ligado à membrana
plasm
atica por meio da protena ZipA. A protena ZipA e a FtsA sao necessarias para recrutar as protenas
subsequentes do divisoma, e portanto, sao importantes para a maturacao do complexo. Antes do divisoma
se formar, a celula j
a se alongou e replicou e segregou o DNA duplicado. O septo orquestra a formac
ao de
nova membrana citoplasm
atica e de parede celular, sendo chamado este material de septo de divisao. Assim
em torno de cada nucle
oide forma-se membrana e parede celular.
Como o anel Z e formado no centro da celula e nao nos polos?
Existem as protenas Min, principalmente MinD, MinE e MinC. Cada uma delas de polimera formando
espirais ao longo da celula n
ao permitindo que o anel Z se forme onde ha os espirais. No entanto, estas
protenas Min concentram seus espirais nos polos da celula, de modo que o centro possui a menor concentrac
ao
media destas protenas. Portanto, e o centro da celula torna-se um stio mais permissivo para a formac
ao do
anel Z que outras regi
oes. Deste modo o anel Z sempre se forma na regiao mediana da celula com o auxlio
das protenas Min.
FtsI e necess
aria para sntese de peptideoglicano, mais especificamente para a transpeptidacao, e e uma
das protenas ligadoras de penicilina, esta protena tem sua atividade inibida pela penicilina.
A penicilina inibe outras protenas, entre as quais, algumas envolvidas na transpeptidacao como a FtsI
citada. Sem a transpeptidac
ao, e com a acao contnua das autolisinas, a parede celular e danificada de modo
que eventualmente a celula colapsa.
Durante a divis
ao celular, o anel Z comeca a se contrair pela remocao sucessiva de suas subunidades, que
migram para a regi
ao central das celulas filhas.
Antes do septo dividir a celula em duas, ocorre como mencionado anteriormente, deposicao de novo
material de membrana citoplasm
atica e parede celular. No caso da parede celular, e necessario fazer buracos
na parede celular por meio de autolisinas, que clivam a ligacao glicosdica B-1,4 entre o NAM e o NAG. Estes
buracos e que permitem a adic
ao de novo material da parede celular. Se houver excesso de autolisinas, a
parede celular colapsa e a elevada pressao osmotica leva à lise (autolise).
Os precursores de peptideoglicano (NAG,NAM e pentapeptdeo) sao carreados por um lipdeo chamado
bactoprenol (undecaprenol difosfato). ESte lipdeo torna os precursores hidrofobicos o suficiente para atravessar a membrana plasm
atica, e chegar ao periplasma. Depois de liberado o monomero de peptideoglicano,
o bactoprenol e reutilizado na membrana plasmatica. Enzimas glicosilases sao responsaveis por adicionar estes precursores ao peptideoglicano, catalisando a formacao da ligacao glicosdica B-1,4. Finalmente ocorrem
reac
oes de transpeptidac
ao, em que se forma uma ponte cruzada entre peptdeos ligados a NAM de cadeias
de glicano adjacentes. Nas Gram-negativas, as pontes cruzadas sao formadas entre o DAP(acido diaminopimelico) e D-alanina. H
a duas D-alaninas na ponta do pentapeptdeo, mas apenas uma delas permanece
ap
os a formac
ao da ponte cruzada. ESta reacao e exergonica, e faz sentido ela ser espontanea, pois seria
um problema precisar de ATP visto que a reacao ocorre fora da celula. A enzima FtsI e essencial para a
reac
ao de transpeptidac
ao na regi
ao do septo de divisao. Nos outros locais da celula onde peptideoglicano
est
a crescendo um outra enzima catalisa a transpeptidacao.
obs: o
acido teic
oico regula a atividade das autolisinas durante a divisao celular; alem disso facilita e
regula a entrada e sada de c
ations na celula; contribui para aderencia do microorganismo à superfcies; e o
principal antgeno de superfcie; e stio de recepcao para bacteriofagos.
Captulo 12
Archaea
Baseado em genes de RNA ribossomal 16S, as archaeas sofreram uma bifurcacao principal que deu origem
ao filo Euryarchaeota e ao filo Crenarchaeota. Esta hipotese tambem e suportada por dados genomicos.
Livrando-se de conceitos equivocados:
Archaea e ancestral de Bacteria. Afirmativa completamente errada, pois as archaeas possuem caractersticas u
nicas e peculiares, alem disso, as archaeas compartilham um ancestral comum mais pr
oximo
de Eucarya que de Bacteria. Esta u
ltima afirmacao e comprovada pela similaridade das maquinarias
proteicas envolvidas na replicac
ao, transcricao e traducao de eucariotos e archaeas. A similaridade n
ao
e apenas estrutural mas tambem abrange os mecanismos pelos quais ocorrem os eventos citados.
Archaea s
ao extrem
ofilas De fato existem archaeas extremofilas(que aguentam extremos de temperatura,
salinidade, press
ao e pH), porem, e possvel encontrar archaeas em todo tipo de ambiente, logo, as
archaeas s
ao organismos ubquos.
Diferencas gritantes entre Archaea e Bacteria:
Archaeas n
ao possuem peptideoglicano na parede celular.
Na membrana citoplasm
atica das archaeas em vez de ester, sao ligacoes eter que ligam acidos graxos
aos grupos glicer
ois. Alem disso archaeas podem ter bicamada, monocamada lipdica ou uma mistura
de ambas.
As RNA polimerases das archaeas sao estruturalmente mais complexas e similares às dos eucariotos.
Os cromossomos de archaeas s
ao circulares como os das bacterias, porem, o empacotamento e a replicac
ao
s
ao similares aos dos eucariotos. O superenovelamento de DNA nas bacterias e realizado por girases, enquanto
nos eucariotos o DNa se associa a histonas. As archaeas podem usar um ou ambos (girases e/ou histonas).
Crenarchaeota: muitas especies desse filo sao hipertermofilas (com crescimento otimo acima de 80o C).
No entanto, existem v
arias n
ao termoflicas que vivem em ambientes aquaticos e terrestres. Muitas hiperterm
ofilas s
ao quimioaut
otrofas (produzem energia pela oxidacao de compostos inorganicos). Estas quimioaut
otrofas s
ao os produtores prim
arias em ambientes de temperatura extrema.
Euryarchaeota: este filo possui muitas especies de halofilas (bacterias que vivem em ambientes com altas
concentrac
oes salinas) e metan
ogenos, bacterias cujo metabolismo produz gas metano. Existe um contraste
entre estes dois tipos de archaeas no que diz respeito a respiracao: halofilas extremas sao aerobias obrigat
orias
metan
ogenos s
ao anaer
obios obrigat
orios Assim como os Crenarchaeota, muitas especies de Euryarchaeota
habitam ambientes aqu
aticos (principalmente marinhos) e terrestres. Metabolismo de metanogenos: h
a duas
maneiras de produzir metano, ou por meio de respiracao anaerobica,usando dioxido de carbono como aceptor
de eletrons e H2 como doador de eletrons, ou por meio de reacoes catabolicas que degradem compostos
org
anicos, ex: acetato.
Aut
otrofos: organismo capaz de crescer tendo CO2 como u
nica fonte de carbono.
40
CAPITULO 12. ARCHAEA
41
Quimiolitotr
ofico: organismo que obtem energia a partir da oxidacao de compostos inorganicos.
Quimioorganotr
ofico: organismo que obtem energia a partir da oxidacao de compostos organicos.
Heter
otrofo: organismo que requer compostos organicos como fonte de carbono; e tambem quimioorganotr
ofico.
Nas archaeas podemos encontrar organismos quimiolitotrofico autotrofos e quimioorganotroficos.
As vias aut
otrofas encontradas em Archaea sao:
ciclo Acetil-CoA
reverso do ciclo do
acido ctrico
ciclo 3-hidroxipropionato/4-hidroxipropionato
ciclo de Calvin
Logo, muitas das vias metab
olicas da archaeas sao as mesmas usadas pelas bacterias.
Captulo 13
Biofilme
Biofilme: matriz polissacardica contendo celulas bacterianas, aderida a uma superfcie. Os biofilmes
podem ser formados por uma u
nica especie ou por varias especies, sendo encontrados em uma variedade de
superfcies bi
oticas e abi
oticas.
Uma definic
ao mais ecol
ogica de biofilme: associacao de microorganismos e de seus produtos extracelulares
que se encontram aderidos a um superfcie biotica ou abiotica.
Coagregac
ao: processo de ades
ao entre bacterias geneticamente distintas. Este processo e mediada por
um tipo de protena adesina presente em uma celula, e por um receptor sacardico complementar presente
na outra celula.
Coades
ao: ades
ao de celulas bacterianas (em suspensao) às celulas presentes no biofilme
Biofilmes geralmente se desenvolvem em substratos de um ambiente u
mido ou lquido, de onde os microorganismos retiram seus nutrientes.
Adsorc
ao: quando uma subst
ancia se acumula sobre um interface.
Fases de formac
ao de um biofilme multiespecie:
Os primeiros organismos que aderem sao ditos, colonizadores primarios. A colonizacao prim
aria e
mediada por interac
oes fisico-qumicas especficas ou nao com os componentes de um filme org
anico
que se encontra em ac
umulo sobre a superfcie. Ou seja, normalmente a superfcie a qual as celulas
bacterianas aderem possui protenas ou outros compostos organicos.
Se as condic
oes forem favor
aveis, os colonizadores primarios crescem (se multiplicam), sobre o substrato e formam microcol
onias, que sintetizam um matriz exopolissacardica devido ao ac
umulo de EPS
(subst
ancias polimericas extracelulares) em sua superfcie celular.
` medida que mudam as condic
A
oes ambientais dentro do biofilme, e o substrato e coberto por celulas
bacterianas, os colonizadores secundarios aderem às celulas dos colonizadores primarios que agora est
ao
na superfcie externa do biofilme. Nesta etapa ressalta-se que a coagregacao ocorre em duas vias: os
colonizadores secund
arios podem aderir diretamente aos colonizadores primarios, formando coagregados
no biofilme em desenvolvimento; ou os colonizadores secundarios podem formar coagregados com outras
bacterias geneticamente distintas que ainda nao aderiram ao biofilme, e entao o coagregado formado
adere aos colonizadores prim
arios. Desse modo, celulas individuais, coagregados e grupos de celulas de
uma mesma especie, podem coaderir às celulas do biofilme, e passar a fazer parte deste.
Assim, o biofilme comeca a se desenvolver em um comunidade multiespecie, ou ainda em um biofilme
maduro.
O biofilme e formada por uma matriz exopolissacardica, permeada por uma rede de canais de
agua, e
v
arias camadas de celulas bacterianas.
Func
oes/caractersticas da matriz polissacardica:
altamente hidratada (lembre-se que polissacardeos tem facilidade para hidratar), dando aspecto
E
viscoso ao biofilme.
42
CAPITULO 13. BIOFILME
43
Atua como barreira de difus

ao, cimento que mantem as celulas do biofilme unidas, peneira molecular,
adsorvente e comporta-se como gel ou material viscoelastico, o que lhe permite deslocar-se sobre o
substrato sob fluxo turbulento.
Sua estrutura e estabilizada pelo conte
udo de agua, ons Ca2+ , alinhamento de cadeias polissacardicas
e comportamento viscoel
astico.
O biofilme corresponde a uma entidade dinamica, devido a fluidez estrutural, e à fluidez biol
ogica das
celulas bacterianas que entram e saem de comunidade, promovendo diversificacao e dispersao quando na
comunidade clmax. Alem disso, ocorre constante remodelamento da estrutura do biofilme por predac
ao de
outros organismos (como protozo
arios) e por forcas hidrodinamicas. A diversidade de especies de um biofilme
lhe proporciona propriedades fsicas, qumicas e biologicas distintas, e deste modo, cada biofilme e u
nico.
Resistencia do biofilme a drogas: a matriz polissacardica parece nao desempenhar papel importante na
resistencia. Na verdade, a resistencia do biofilme a drogas e mais uma questao de resposta a interac
oes
ecol
ogicas: as celulas se ajudam a sobreviver. Por exemplo, se num biofilme existe uma especie que produz a
enzima B-lactamase, ent
ao ela proteger
a nao somente os indivduos de sua especie, como tambem os de outras
especies que n
ao expressam este gene de resistencia. Outro exemplo, seria que algumas bacterias resistem a
drogas pois no biofilme suas taxas metabolicas sao um tanto lentas.

Estudos para Seleção de Mestrado em Biologia Molecular

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Heidi Muniz

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