Instituto Politcnico Nacional

Escuela Nacional de Ciencias Biolgicas

Ingeniero Bioqumico
Depto. Mtodos de Anlisis

1. Nombre de la Materia: Curso prctico de Mtodos de Anlisis.

2. Nombre de la prctica: Separacin de una mezcla de azul de metileno y fluorescena usando
cromatografa por adsorcin.
3. Nombre del alumno: Torres Martnez Jordn Josu
4. Grupo: 4IM2
5. Seccin No. 2
6. Profesor: Rivas Faras Arturo
7. Fechas de realizacin: 21/Abril/2015 y 23/Abril/2015
8. Fecha de entrega: 30/Abril/2015
9. Situacin escolar: Inscrito

Separacin de una mezcla de azul de metileno y fluorescena usando cromatografa por adsorcin.
Objetivo extra: Observar el efecto de la concentracin de regulador de fosfatos pH=12 [HPO 4-2 ---- PO4-3
pH=12].
Resultados.
Tabla No.1 Valores de Absorbancia obtenidos para la separacin de Fluorescena y Azul de Metileno.

Observaciones de coloracin

Volumen de elucin (ml)

A493

A668

Transparente
Azul intenso
Azul
Azul tenue
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Amarillo fosforescente tenue
Amarillo fosforescente
Amarillo fosforescente
Amarillo fosforescente tenue
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente
Transparente

3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
33
36
39
42
45
48
51
54
57
60
63
66
69
72
75

0.010
0.112
0.090
0.004
0.012
0.001
0.003
0.006
0.001
0.009
0.003
0.001
0.003
0.060
0.235
1.303
0.976
0.201
0.069
0.046
0.033
0.025
0.020
0.017
0.015

0.011
1.757
1.515
0.080
0.031
0.080
0.045
0.009
0.050
0.015
0.004
0.001
0.003
0.003
0.003
0.002
0.005
0.002
0.005
0.012
0.015
0.003
0.002
0.004
0.028

Tabla No.2 Efecto de la concentracin de reguladores de fosfatos sobre la elucin de Fluorescena

Equipo

Volumen
de elucin

1
2
3
4

51
60
48
39

Concentracin
de regulador
de fosfatos
0.010 M
0.025 M
0.050 M
0.010 M

Grafico del perfil de elucin

Perfil de elucion
1.9
1.7
1.5
1.3
1.1
Abosrbancia (A)

0.9

A 493

A 668

0.7
0.5
0.3
0.1
-0.10

10

20

30

40

50

Vulumen de elucion mL

Calculo de volumen de elucin

Velucion=No . teubomax A3 mL

Velucion=163 mL=48

60

70

80

Discusiones
La cromatografa por columna se lleva con un soporte que es la parte que otorga estabilidad fsica al sistema
cromatografico, una fase mvil que servir para lograr la migracin de solutos o analitos, las fase estacionaria que
servir como un soporte fsico al analito, y el analito a separar.
Este tendr un principio fsico de adsorcin que es cuando uno de los componentes del analito se adhiere a la
superficie de la fase estacionaria y la otra se disuelve en la fase mvil. En nuestro caso la fase estacionaria es
Almina de Brockman hidratada lo que provoca una disociacin de sus iones. El analito es una mezcla de Azul de
metileno y fluorescena di-sdica, y las fases mviles son agua pH=5 y regulador de fosfatos pH=12. La primera
fase mvil es agua lo que disocia las molculas del analito como se ve en la imagen siguiente.
O
N
H3C
N

CH3 A z u l d e M e t i l e n o

CH3

[ A l2 ( O H ) 5 ] +
A lu m in a d e B r o c k m a n n

H3C

F lr u o r e s c e in a d is o d ic a

Lo que ocasiona una interaccin inica de atraccin Almina Brockmann-Fluorescena y de repulsin de Azul de
Metileno-Almina de Brockmann, aunque tambin existen otras fuerzas como Van Der Walls, Dipolo-Dipolo, Dipolo
inducido, las fuerzas electroestticas de atraccin y repulsin son las que mandan en este fenmeno de adsorcin.
Por lo que el azul de metileno es el primero en disolverse en el agua y migrar junto con el agua, obtenindolas en
las primeras fracciones de la elucin. El segundo disolvente es el regulador de fosfatos pH=12 lo que cambia la
carga netas de la Almina de Brockmann a negativa.

[ A l2 ( O H ) 5 ] A lu m in a d e B r o c k m a n n
Ocasionando que la fuerza atraccin que haba entre la Almina de Brockmann y la Fluorescena se cambia a una
fuerza de repulsin ocasionando que empieza la migracin de la fluorescena.
La grafica del perfil de elucin muestra que a una absorbancia existen dos mximos de la Absorbancia y esto es
debido a que el azul de metileno tambin absorbe a esas dos longitudes de onda pero eso no significa que la
fluorescena.
Para obtener el orden contrario de elucin primero Fluorescena en las primeras fracciones y despus azul de
metileno seria cambiar el orden de las fases mviles aunque el regulador de fosfatos sera muy tardado en eliminar
por completo, por lo que se tendra que utilizar una agua un poco ms acida para que se logre el cambio de carga
neta en la Almina de Brockman. Al utilizar diferentes concentraciones de reguladores de fosfatos pH=12 se
observa que el cambio de carga neta de la almina es ms rpida por lo que las fracciones de Fluorescena se
obtiene en menor volumen
Conclusin.
separacin de la Mezcla Azul de Metileno-Fluorescena disdica fue completa.
THE INDEX MERCK. Merck and Co., Inc. Whitehouse Station, NJ. 1996.

La
Bibliografa.