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O documento descreve um experimento sobre respiração celular em leveduras, incluindo o isolamento de mitocôndrias e testes com indicadores de oxido-redução. O resumo explica que as mitocôndrias foram isoladas através de lavagem, maceração e centrifugação das células de levedura, e que os indicadores revelaram onde na cadeia de transporte de elétrons a transferência de elétrons foi inibida.
O documento descreve um experimento sobre respiração celular em leveduras, incluindo o isolamento de mitocôndrias e testes com indicadores de oxido-redução. O resumo explica que as mitocôndrias foram isoladas através de lavagem, maceração e centrifugação das células de levedura, e que os indicadores revelaram onde na cadeia de transporte de elétrons a transferência de elétrons foi inibida.
O documento descreve um experimento sobre respiração celular em leveduras, incluindo o isolamento de mitocôndrias e testes com indicadores de oxido-redução. O resumo explica que as mitocôndrias foram isoladas através de lavagem, maceração e centrifugação das células de levedura, e que os indicadores revelaram onde na cadeia de transporte de elétrons a transferência de elétrons foi inibida.
Respirao Celular em Leveduras: Transporte de Eltrons Data de realizao: 14/05/2015 Data de entrega: 21/05/2015
Docente:
Denise Bevilaqua
Alunos:
Gabriel Martins de Alvarenga
Samir Prioto Tayar Weslei Bruno Botero
1) Explique cada etapa do procedimento para isolamento das mitocndrias de
leveduras. R: O procedimento iniciado com a suspenso das clulas de levedura em gua gelada (para evitar degradaes), seguida de uma homogeneizao no vrtex e centrifugao por 15 minutos a 4000 rpm, esta etapa tem objetivo de lavar as clulas de levedura, pois como so produzidas industrialmente, podem ter muitas impurezas.Aps repetir o processo de lavagem, a levedura foi suspendida em soluo de sorbitol, para preservar o equilbrio osmtico. Aps a obteno da suspenso de levedura limpa, ela foi colocada em almofariz com areia para macerao em benho de gelo. Esta etapa tem como objetivo quebrar a parede celular da levedura e liberar as mitocndrias que estavam na clula para a soluo. O almofariz foi limpo com sorbitol para se aproveitar todos os resduos da macerao. Aps obter os resduos da macerao, a soluo foi centrifugada a 4000 rpm por 5 minutos a 4C, nesta etapa os detritos celulares e a areia foram sedimentados e separados da soluo contendo as mitocndrias (que no sedimentaram, pois a centrifugao no tinha fora G suficiente para isso). A temperatura de 4C importante para se evitar a degradao da mitocndria pelo oxignio e por enzimas. O sobrenadante obtido na centrifugao foi submetido a outro processo de centrifugao, mas desta vez a 28.000xg por 30 minutos a 4C, esta etapa consegue sedimentar as mitocndrias que estavam presentes na soluo pois a fora g muito grande. Aps a centrifugao o sobrenadante foi descartado e o sedimentado que continha as mitocndrias foi ressuspendido em banho de gelo para evitar degradao.
2) Explique os resultados sobre o efeito dos indicadores de oxido-reduo
(Procedimento 3), comparando a colorao observada em cada tubo.
R: A explicao para os resultados do efeito dos indicadores de xido-reduo
pode ser feita baseada na anlise da seguinte figura que relaciona todos os componentes presentes na transferncia de eltrons da cadeia respiratria da levedura:
Observa-se que ao adicionar o indicador MTT (Metil tetrazlio) na presena de
mitocndrias, ouve a reduo do mesmo indicado pela mudana de colorao de amarelo (forma oxidada) para uma tonalidade verde escura muito intensa (forma reduzida). Essa observao experimental, juntamente com a informao de que o potencial de reduo deste indicador de -0,12V, permite-nos fazer a afirmao de que o mesmo inibe a transferncia dos eltrons do FMN para o centro de ferro-enxofre, visto que o potencial de reduo para que este processo ocorra superior ao potencial necessrio para a reduo MTT. J
quando
analisamos
efeito
da
adio
do
indicador
DCPI
(Diclorofenolindofenol), observa-se que a soluo tambm sofre uma mudana de
colorao quando comparada com seu branco, pois este ltimo apresenta colorao azul (forma oxidada), enquanto o tubo contendo mitocndrias mostra-se com ausncia de colorao (forma reduzida). Assim como no caso do indicador MTT, o que ocorre que um pouco mais adiante no processo de transferncia de eltrons da cadeia respiratria da levedura, o indicador de DCPI inibe a etapa na qual o eltron passa de um centro ferro-enxofre para o citocromo c1, visto que o potencial de reduo deste indicador, +0,22V, inferior ao potencial de reduo necessrio para a reduo do citocromo c1, que de +0,23V. Por fim, observa-se que para os tubos contendo o indicador ferricianto, uma mudana de colorao ocorre, visto que a forma oxidada do mesmo indicada na figura 1 pela colorao levemente amarelada, seguida da comparao com um tubo de ensaio
onde encontram-se as mitocndrias, evidenciando a mudana de colorao que vai do
amarelo (forma oxidada) para incolor (forma reduzida). Novamente, pode-se atribuir esta mudana de colorao devido a inibio da transferncia de eltrons na sequncia representada na figura 1 da cadeia respiratria da levedura. O indicador de ferrocianina, por possuir um potencial de reduo inferior (+0,38V) ao potencial de reduo do citocromo c2 (+0,55), inibe tal processo fazendo com que todos os eltrons passem a reduzi-lo.
3) Pelos resultados obtidos no procedimento 4, explique o ponto de ao da
azida e do malonato na fosforilao oxidativa.
R: Primeiramente vamos avaliar a inibio que as azidas provocam na cadeia
respiratria de eltrons. As azidas causam inibio no grupamento prosttico dos citocromos c e b presentes no complexo citocromo-oxidase (Complexo IV) da cadeia de transporte de eltrons. Desse modo, aps a utilizao de azida nos trs primeiros tubos, a transferncia de eltrons da ubiquinona para o citocromo c deve ser inibida. Essa transferncia ocorre em uma etapa posterior reduo dos indicadores, de modo que o ferricianeto, DCPI e MMT apresentao a colorao reduzida.
O malonato pode inibir especificamente a enzima succinato-desidrogenase de
modo competitivo, pelo fato de esse composto se mostrar estruturalmente parecido com o substrato e tambm conseguir se ligar ao stio ativo dessa enzima. A succinato-desidrogenase uma enzima presente na membrana mitocrondrial interna e participa do ciclo do cido ctrico convertendo uma molcula de succinato em fumarato, resultando na reduo do transportador de eltrons FADH2. Essa enzima mostra-se importante tambm na cadeia transportadora de eltrons, devido ao fato de que promove a passagem de eltrons para uma molcula de FAD presente dentro do complexo II, de modo que esse eltron posteriormente doado a uma ubiquinona.
Como temos uma ao competitiva, espera-se uma menor quantidade de
succinato produzido nessa etapa e consequentemente a passagem de eltrons com uma velocidade mais lenta. Desse modo, os indicadores utilizados para a verificao do efeito do malonato devero apresentar coloraes intermedirias, indicando uma reduo em pequena quantidade. Devido a ao do malonato, espera-se uma menor quantidade de succinato sendo oxidada no complexo II da cadeia transportadora de eltron, o que deve resultar em colorao intermedirias para os trs indicadores utilizados.
Desse modo, devido a ao do malonato observou-se uma pequena
oxidao do ferricianeto, apresentando colorao ainda levemente amarelada. Para o DCPI e o MMT, observaram-se coloraes intermedirias entre a forma reduzida e oxidada.
4) Observando a figura presente no roteiro, explique a diferena entre os
desacopladores e inibidores na respirao celular (O2 consumido e a ATP sintetizado)
R: Inibidores so espcies que bloqueiam uma determinada reao ou enzima da
cadeia de transporte de eltrons e da fosforilao oxidativa. Desse modo, aps a adio de um inibidor no meio, temos que a sntese de ATP e a produo de O 2 param ao mesmo tempo. Desacopladores so substncias que eliminam a relao entre a produo de O 2 e a sntese de ATP, permitindo cada um desses produtos se formarem independentemente. No caso do grfico apresentado no roteiro, verifica-se que aps a adio de uma espcie inibidora (oligomicina) a produo de ATP cessada. Isso ocorre pelo fato de que esse inibidor mostra-se especfico para a ATP-Sintase. Devido a relao entre os dois sistemas, a quantidade de oxignio tambm se mantm constante.
Aps a adio de uma espcie descopladora, entretanto, a produo de oxignio
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