los anticuerpos, sin competencia ni obstaculizacin estrica, para

formar luego un complejo soluble en sndwich. La interaccin se

ilustra mediante la siguiente ecuacin:

Enz

Ac (p) + AgPSA + btn Ac m.

Ka

Enz
Ac (p) - AgPSA - btn Ac m
K-a
Ac m = Anticuerpo marcado con biotina (cantidad en exceso)
AgPSA =Antgeno nativo (cantidad variable)
Enz
Ac (p) = Anticuerpo marcado de enzima (cantidad excesiva)
Enz
Ac (p) - AgPSA - btn Ac m. = Complejo antgeno -anticuerpos
Ka =Tasa constante de asociacin.
K-a =Tasa constante de disociacin.
Simultneamente el complejo es depositado en el pozo a travs de la
reaccin de alta afinidad de la estreptavidina y del anticuerpo
marcado con biotina. Esta interaccin se ilustra de la siguiente
manera:

8.
9.
10.
11.

Aspiradora al vaco (opcional) para los pasos de lavado

Cronometro
Recipiente para almacenamiento del bfer de lavado.
Agua destilada o des ionizada o destilada.

5.0 PRECAUCIONES
Para uso Diagnstico in Vitro
No para uso externo o interno en humanos o animales

9.0 PROCEDIMIENTO DEL ENSAYO

Antes de seguir adelante con el ensayo, permitir que todos los
reactivos, referencias y controles de suero alcancen la temperatura
ambiente (20-27C).
**La prueba puede ser procesada por personal experto o por un
profesional entrenado**

btn

Enz

Ac (p) - AgPSA - btn Ac m + estreptavidinacw = complejo inmovilizado

Estreptavidina CW = estreptavidina inmovilizado en el pozo complejo

inmovilizado= complejo unido a la superficie slida.

Sistema de Prueba Antgeno Prosttico

Especfico (tPSA)
Cdigo de producto: 2175-300

Despus de lograr el equilibrio, la fraccin unida al anticuerpo es

separada del antgeno no enlazado mediante decantacin o
aspiracin. La actividad enzimtica, determinada por reaccin con un
sustrato que genera luz, en la fraccin anticuerpo enlace ser
directamente proporcional a la concentracin de antgeno nativo. Al
utilizar diversos sueros referencia de valores conocidos de antgeno,
se podr generar una curva dosis-respuesta a partir de la cual se
establecer la concentracin un valor desconocido.

1.0

4.0 REACTIVOS

INTRODUCCIN

Uso: Determinacin cuantitativa de la concentracin del

antgeno prosttico especfico total (tPSA) en suero
humano, mediante inmuno ensayo de quimioluminiscencia
de microplacas.

Materiales suministrados
A. Antgeno prosttico especfico (PSA) 1ml/vial- Iconos A-F
Seis (6) viales de antgeno PSA de referencia en niveles de 0
(A), 5 (B), 10 (C), 25 (D) 50 (E) y 100(F) ng/ml. Almacenar de 28C. Se agrego un preservante

2.0 RESUMEN Y EXPLICACION DEL ENSAYO

El antgeno prosttico especfico total (tPSA) es una proteasa serina
con actividad similar a la de la quimo-tripsina (1,2). La protena es una
glicoprotena de cadena sencilla y de peso molecular de 28.4 kDa
(3). El antgeno PSA deriva su nombre de la observacin que indica
que se trata de un antgeno normal de la prstata pero que no se
encuentra en ningn otro tejido normal o maligno.
El PSA se encuentra en cncer prosttico, benigno, maligno y
metasttico. Debido a que el cncer de prstata es la segunda forma
mas prevalente de malignidad en el hombre, se ha establecido que
detectar niveles elevados de PSA es una funcin importante para el
diagnostico temprano. Se ha determinado que los niveles PSA en
suero son mas tiles que la fosfatasa cida prosttica (PAP) para el
diagnostico y manejo de pacientes debido a la incrementada
sensibilidad y especificidad (4).
De acuerdo con este mtodo, el calibrador PSA, la muestra o control
del paciente se adiciona en primer trmino a un pozo revestido con
estreptadivina. Los anticuerpos monoclonales marcado con biotina y
anticuerpos marcados con enzimas (dirigidos contra eptopes
diferentes de PSA) se adicionan y mezclan los reactivos. La reaccin
entre los diversos anticuerpos PSA y el PSA nativo forma un complejo
en sndwich que se enlaza con la estreptadivina que recubre el pozo.
Luego de terminar el periodo requerido de incubacin, el conjugado
enlazado al anticuerpo enzima-PSA se separa del conjugado enzima
PSA sin enlazar mediante aspiracin o decantacin. La actividad de
la enzima presente en la superficie del pozo se cuantifica mediante
reaccin con un sustrato adecuado para producir luz (luminiscencia).
La utilizacin de diversos sueros de referencia con niveles conocidos
de antgeno prosttico especfico (PSA) permite la construccin de
una curva de respuesta de dosis para la actividad y concentracin. A
partir de la comparacin con la curva dosis-respuesta, se puede
correlacionar la actividad de una muestra desconocida con la
concentracin del PSA.
3.0 PRINCIPIO
Ensayo inmunoenzimomtrico:
Los reactivos esenciales que se requieren para lograr un ensayo
inmuno enzimomtrico incluyen anticuerpos de alta afinidad y
especificidad (enzimticos e inmovilizados), con reconocimiento de
diferentes eptopes, en exceso y un antgeno nativo. De acuerdo con
este procedimiento, la inmovilizacin tiene lugar durante el ensayo en
la superficie del pozo de micro placas a travs de la interaccin de la
estreptadivina que recubre el pozo y el anticuerpo anti PSA
monoclonal marcado con biotina agregado en forma exgena.
Al momento de mezclar el anticuerpo monoclonal marcado con
biotina, el anticuerpo marcado-enzima y un suero que contiene el
antgeno nativo, producirn una reaccin entre el antgeno nativo y

B.

C.

D.

Todos los productos que contienen suero humano han sido hallados
no reactivos para antgeno de superficie de hepatitis B, VIH 1 y 2 y
anticuerpos HCV segn pruebas exigidas por la A. Ninguna prueba
puede asegurar completamente la ausencia de agentes infecciosos,
Todos los productos de suero humano deben manipularse como
potencialmente peligrosos y con
capacidad
de transmitir
enfermedades. Las buenas practicas de laboratorio para el manejo de
productos sanguneos pueden ser encontrados en el Centro de
Control de Enfermedades/ Instituto Nacional de Salud, Bioseguridad
en Laboratorios Microbiolgicos y Biomdicos, 2da Edicin, 1988,
HHS Publicacin N (CDC) 88-8395.
La eliminacin adecuada de los componentes del kit debe ser
acorde con los requerimientos estatutarios y de regulacin.

6.0 RECOLECCIN Y PREPARACIN DE LAS MUESTRAS

Se deben emplear las precauciones en la recoleccin de muestras
por puncin venosa para las muestras de suero o sangre. La sangre
se recolecta por puncin venosa en un tubo pleno tapa roja sin
aditivos. Permitir que la sangre coagule. Centrifugar la muestra para
separar el suero de las clulas
Las muestras pueden ser refrigeradas de 2-8C por un perodo
mximo de 5 das. Si la muestra no puede ser ensayada dentro de
este tiempo, la muestra puede ser almacenada a temperatura de 20C por hasta 30 das. Evitar la congelacin y descongelacin
repetitiva. Cuando ensayamos en duplicado, se requiere 0.050ml de
las muestras.

El material es calibrado contra el IS#96/670 de la OMS (Instituto

Nacional de Controles y Estndares Biolgicos).

7.0 CONTROL DE CALIDAD

Reactivo trazador PSA 13 ml/vial icono E

Un (1) vial contiene anticuerpo marcado con enzima, IgG de
monoclonal de ratn marcado con biotina en bfer, tincin y
conservantes. Almacenar de 2-8 C.

Cada laboratorio debe analizar controles externos a niveles en los

rangos de bajo, medio y alto para monitorear el desempeo de los
ensayos. Estos controles deben ser tratados como desconocidos y
los valores determinados en cada procedimiento de prueba realizada.
Se mantendrn grficos de control de calidad para hacerle un
seguimiento al desempeo de los reactivos suministrados. Se
debern utilizar mtodos estadsticos pertinentes para evaluar las
tendencias. Los laboratorios en particular debern establecer lmites
aceptables de desempeo de los ensayos. Adicionalmente, la
intensidad mxima de luz deber ser consistente con lo registrado
anteriormente. Una desviacin significativa a partir de los datos
establecidos de desempeo puede indicar que hay cambios no
perceptibles en condiciones experimentales o degradacin de los
reactivos del kit. Los reactivos frescos sern usados para determinar
la razn para las variaciones.

Pozos de reaccin luminosa 96 pozos Icono

Una micro placa blanca de 96 pozos recubierta con
estreptavidina y empacada en bolsa de aluminio con un agente
secante. Almacenar de 2-8 C.
Solucin de Lavado concentrado -20 ml - Icono
Un (1) vial contiene un surfactante en bffer salino. Un
preservante ha sido adicionado. Almacenar de 2-30C. (Ver
seccin de preparacin de reactivos)

E.

Reactivo de seal A- 7ml/ vial Icono CA

Un (1) frasco que contiene luminol en bffer. Almacenar a 2-8
C. (Ver seccin de preparacin de reactivos)

F.

Reactivo de seal B 7 ml/vial- Icono CB

Un (1) frasco que contiene peroxido de hidrogeno (H 2O2.) en
bfer. Almacenar de 2-8C. (Ver seccin de preparacin de
reactivos).

G. Instrucciones del Producto

Nota 1: No utilizar los reactivos despus de la fecha de vencimiento
Nota 2: Evitar la exposicin prolongada al calor y la luz. Los reactivos
abiertos son estables por 60 das cuando son almacenados de
2-8C. La estabilidad del kit y los componentes son identificados
en la etiqueta.
Nota 3: Los reactivos anteriores son suficientes para un solo ensayo
de micro placas de 96 pozos.
4.1 MATERIALES REQUERIDOS (No proporcionados)
1.
Pipeta(s) de 25l y 100 l con una precisin superior a 1.5%.
2.
Dispensador(es) para mediciones repetitivas de 0.100 ml y
0.350ml con una precisin superior al 1.5%.
3.

Lavador de microplacas o botella de lavado (opcional)

4.
5.
6.
7.

Luminmetro de micro placas

Recipiente para mezcla de reactivos (Ver abajo)
Papel absorbente para secar los pozos de microplacas
Envoltura plstica o cubiertas de microplacas para los pasos de
incubacin

1.

Formatee los pozos de micro placas para cada suero de

referencia, control y muestra del paciente para ser analizada por
duplicado. Ubicar las tiras de micropozos no empleadas en la
bolsa de aluminio, sellar y almacenar a 2-8C.

2.

Pipetee 0.025 ml (25l) de suero referencia apropiada, control o

muestra dentro del pozo asignado.

3.

Adicione 0.100ml (100l) del reactivo trazador PSA a todos los

pozos. Es muy importante dispensar todos los reactivos cerca
de la base del pozo recubierta.

4.

Agite la microplaca suavemente durante 20-30 segundos

mezclar y luego cubrir.

5.

Incube durante 30 minutos a temperatura ambiente.

6.

Elimine el contenido de la microplaca por decantacin o

aspiracin. Si decanta, golpee y seque la placa con papel
absorbente.

7.

Adicione 350l de bfer de lavado (Ver

Seccin sobre
Preparacin de Reactivos), decante, (golpee y seque) o aspire.
Repetir el procedimiento cuatro (4) veces mas para un total de
cinco (5) lavados. Se puede utilizar un lavador de placas
automtico o manual. Seguir las instrucciones del
fabricante para el uso adecuado. Si se utiliza una botella de
lavado, llenar cada pozo oprimiendo el recipiente (evitando
la formacin de burbujas) para dispensar el lavado. Decante
el lavado y repetir el procedimiento cuatro (4) veces ms.

8.

Adicione 0.100 ml (100l) de la solucin de trabajo reactivo de

seal a todos los pozos (Ver Seccin sobre Preparacin de los
Reactivos). Adicionar siempre los reactivos en el mismo
orden para minimizar las diferencias en tiempo de reaccin
entre los pozos.

9.

Incube a temperatura ambiente en la oscuridad durante cinco

(5) minutos.

10.

Tome lectura de las unidades relativas de luz, en cada pozo

para 0.2-1.0 segundos / pozo, utilizando un luminmetro de
microplacas. Los resultados se deben leer dentro de los 30
minutos siguientes a la adicin de la solucin de sustrato.

10.0 RESULTADOS
Se utiliza una curva de respuesta de dosis para evaluar la
concentracin del tPSA en muestras desconocidos.
1.

Registrar los RLUs obtenidos de la impresin del lector de micro

placas segn se seala en el Ejemplo 1.

2.

Graficar los RLU para cada referencia de suero en duplicado

vs. la concentracin correspondiente de tPSA en ng/ml sobre
un papel de grficos lineal. (No promediar los duplicados de los
sueros de referencia antes del graficado).

3.

Trazar la curva de ajuste a travs de los puntos trazados.

4.

Determinar la concentracin de tPSA para muestras

desconocidas, ubicando los RLUs promedios de las muestras
desconocidas en el eje vertical del grafico, luego encontrar el
punto de interseccin en la curva y tomar la lectura de la
concentracin (pg/ml) a partir del eje horizontal del grafico
(entendindose que los duplicados de la muestra desconocida
pueden promediarse segn se indica). En el siguiente ejemplo,
el RLU promedio (17210) de las muestras desconocidas
intercepta la curva de calibracin en (12.3 ng/ml) de la
concentracin tPSA (ver figura 1).

8.0 PREPARACION DEL REACTIVO

1.

2.

Tampn de lavado
Diluir el contenido del lavado concentrado en 1000ml de agua
destilada o desionizada en un recipiente adecuado de
almacenamiento. Almacenar el bfer diluido a temperatura
ambiente de 20-27C.
Solucin de trabajo reactivo de seal
Almacenar de 2-8 C.
Determinar la cantidad de reactivos necesarios y prepararlos
mezclando porciones iguales de reactivos de seal A y B en un
recipiente limpio. Por ejemplo, agregar 1 ml de A y 1ml de B por
cada dos (2) tiras de 8 pozos (se logra un ligero exceso de la
solucin). Eliminar la porcin no utilizada dentro de las 36
horas siguientes al mezclado. Si el plan es utilizar
completamente los reactivos, dentro del lmite antes
especificado, verter el contenido del reactivo de seal B dentro
del reactivo de seal A y marcar segn corresponda.

Nota: No use reactivos que estn contaminadas o que tengan

crecimiento bacteriano.

Nota 1: El software de reduccin de datos por computador diseado

para ensayos de quimioluminiscencia tambin se puede utilizar para
reduccin de datos. Si tal software es utilizado, la variacin del
software debe ser comprobada

Valor

(ng/ml)

Media

RLU (B)

RLU (A)

Pozo

Numero

Muestra
I.D.

A1

12.1 Desempeo del anlisis

520

Cal A

530
B1

541

C1

8466

D1

8317

E1

16404

Cal B

Cal C
F1

16100

G1

36760

H1

37106

A2

59233

Cal D

Cal E
B2

60680

C2

97360

D2

102640

E2

8627

Cal F

Ctrl 1
F2

9228

G2

62962

H2

82197

Ctrl 2

16252

10

36933

25

2.

El pipeteo de las muestras no se extender ms de 10 minutos

para evitar derivar el anlisis.

3.

No se deben emplear muestras altamente lipmicas,

hemolizadas o contaminadas.

4.

Si ms de 1 placa es usada, se recomienda repetir la curva de

respuesta a la dosis.

5.

La adicin del reactivo de seal inicia una reaccin cintica por

lo tanto el reactivo de seal debe ser adicionado en la misma
frecuencia para eliminar cualquier derivacin de tiempo durante
la reaccin.

6.

La falla al remover solucin adherida en los pasos de aspiracin

o decantacin puede resultar en replicacin baja y resultados
incorrectos.

7.

Usar los componentes del mismo grupo no mezclar los reactivos

de diferentes conjuntos.

8.

Es esencial un pipeteo preciso y exacto as como seguir el

tiempo exacto y la temperatura requerida. Cualquier desviacin
de las instrucciones de uso puede arrojar resultados inexactos.

50
9.

100000

100

8928

7.6

87579
A3

Es importante que el tiempo de reaccin en cada pozo sea

mantenido en forma constante para obtener resultados
reproducibles.

8391

59957

1.

Se deben seguir las buenas prcticas de laboratorio todos los

estndares nacionales aplicables, regulaciones y leyes de
manera estricta para asegurar el cumplimiento y uso adecuado
del dispositivo.

10.

Es importante calibrar todos los equipos, por ejemplo: pipetas,

lectores, lavadores y/o instrumentos automatizados con este
reactivo y realizar un mantenimiento preventivo rutinario

11.

El anlisis de riesgo como la requiere la directiva IVD

98/79/EC de la marca CE- para estos y otros dispositivos
elaborados por Monobind, pueden ser solicitados va e-mail:
Monobind@monobind.com

86.4

17450

Paciente

17210
B3

12.3

16970

* Los datos presentados en el ejemplo 1, figura 1 son para ilustracin

nicamente, y no deben ser utilizados en lugar de una curva de
respuesta de dosis, preparada con cada uno de los ensayos.
Adicionalmente, los RLU de los calibradores se han normalizado a un
valor de 100.000 RLU para el calibrador F (la mayor produccin de
luz). Esta conversin minimiza las diferencias causadas por la
eficiencia de los diversos instrumentos que pueden ser utilizados para
medir la produccin de luz.

Las mediciones e interpretacin de resultados deben ser

realizadas por personal entrenado.

2.

Los resultados de laboratorio por si solos son nicamente un

aspecto para determinar el cuidado del paciente y no deben ser
la nica base para una terapia, particularmente si los resultados
estn en conflicto con otros determinantes.

3.

Para resultados de pruebas vlidas, los controles adecuados y

otros parmetros deben estar dentro de los rangos listados y
requerimientos del ensayo.

4.

Si los kits de prueba estn alterados, ya sea por mezcla de

partes de diferente kits, lo cual puede producir resultados de
prueba falsos o si los resultados son interpretados
incorrectamente, Monobind no tendr responsabilidad.

5.

Si se utiliza el sistema de reduccin de datos controlados por

Computador para interpretar los resultados del ensayo, es
necesario que los valores de prediccin para los calibradores se
ubiquen dentro del 10% de las concentraciones asignadas.

6.

Valores PSA en ngml

6.
11.0 PARMETROS DE CONTROL DE CALIDAD
Para que los resultados del ensayo puedan ser considerados como
vlidos debern satisfacerse los siguientes criterios:
1.

La curva dosis - respuesta deber encontrarse dentro de los

parmetros establecidos.

2.

4 de 6 pools de control de calidad debern estar ubicados

dentro de los rangos establecidos.

PSA es elevado en hiperplasia prosttica benigna (BPH).

Clnicamente un valor elevado de PSA por si solo no es un
valor diagnostico como prueba especifica de cncer y debe
solo utilizarse conjuntamente con otras manifestaciones clnicas
(observaciones) y procedimientos diagnsticos tales como
biopsia de prosttica y DRE (Examen rectal digital). Las
determinaciones de PSA libre pueden ser tiles con respecto
del diagnostico diferencial de BPH y condiciones de cncer de
prstata (5).
Debido a variaciones en la calibracin utilizada en los kits de
prueba PSA/fPSA y las diferencias en el reconocimiento
epitpico de los distintos anticuerpos, se sugiere siempre que
la muestra del paciente se analice aplicando pruebas PSA/fPSA
realizadas por el fabricante mismo. (Monobind Inc. Ofrece una
prueba de PSA libre por quimioluminiscencia que debe ser
utilizada cuando sea necesario).

13.0 RANGOS ESPERADOS DE VALORES

Se espera que los hombres saludables tengan valores por debajo de
4ng/ml (4).

12.0 ANALISIS DE RIESGOS

TABLA I
Valores Esperados para el PSA AccuLiteTM CLIA
El MSDS y Forma de Anlisis de Riesgo para este producto
Est disponible en la solicitud de Monoblind Inc.

Hombres sanos

14.0 CARACTERSTICAS DE DESEMPEO

14.1 Precisin
La precisin del intra e inter ensayo de la prueba MonoBind PSA
Acculite CLIA se determino mediante anlisis en tres niveles distintos
de sueros de control. El nmero, valor medio, desviacin estndar y
el coeficiente de variacin para cada uno de estos sueros de control
se presentan en las Tablas 2 y Tabla 3.
TABLA 2
Precisin al interior de los Ensayos (Valores en ng/ml)
Muestra
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3

N
20
20
20

X
0.55
3.84
25.21

0.03
0.22
0.86

N
10
10
10

X
0.51
3.92
25.01

0.06
0.32
1.07

Tamao

C.V.
11.8%
8.1%
4.3%

< 4ng/ml

14.2 Sensibilidad
La sensibilidad del mtodo PSA AccuLite CLIA se define como el
valor nico mas pequeo que pueda diferenciarse en 2 D S. a partir
de una media de 10 replicas de calibrador 0. Este mtodo tiene una
sensibilidad de 0.25ng/ml.
14.3 Exactitud
El procedimiento Monobind PSA AccuLite CLIA se comparo con un
mtodo de inmunoensayo enzimtico de referencia (ELISA). Se
estudiaron igualmente muestras biolgicas de concentraciones bajas,
normales y elevadas. El nmero total de estas muestras fue de 180.
Se calcularon los valores para la ecuacin de regresin de mnimos
cuadrados y el coeficiente de correlacin para este mtodo, en
comparacin con el mtodo de referencia. Los datos obtenidos se
pueden observar en la tabla 4.
Mtodo

Este Mtodo
Referencia

Media (X)

6.18
6.45

15.0 REFERENCIAS

TABLA 4
Anlisis de regresin coeficiente
Mnimos cuadrados correlacin
y=-0.0748+0.986 (x)

Date: 110411

DCO: 0583

Cat #: 2175-300

TABLA 3
Precisin inter - Ensayo (Valores en ng/ml)
Muestra
Nivel 1
Nivel 2
Nivel 3

Revisin: 3

C.V.
5.5%
5.7%
3.4%

* Segn mediciones hechas en 10 experimentos por duplicado.

12.2 Interpretacin
1.

Figura 1

Es importante tener en cuenta que el establecimiento de un rango de

valores que puede encontrarse utilizando un mtodo dado para una
poblacin de personas normales depender de toda una serie de
factores entre los cuales estn los siguientes: especificidad del
mtodo, poblacin estudiada y precisin del mtodo que maneje el
analista. Por estas razones, cada laboratorio deber basarse en el
rango de valores esperados establecidos por el fabricante
nicamente; hasta cuando los analistas puedan determinar un rango
dentro del laboratorio utilizando el mtodo con una poblacin propia
del rea en la cual se encuentre ubicado el laboratorio.

0.991

A)
B)
Reactivo

EJEMPLO 1

96(A)

192(B)

1ml set
1(13ml)

1ml set
2(13ml)

C)

1 placa

2 placa

D)

1(20ml)

1(20ml)

E)

1(7ml)

2(7ml)

F)

1(7ml)

2(7ml)