OBTENCION DE CLULAS MONONUCLEARES A PARTIR DE

SANGRE PERIFRICA

En el anlisis del sistema inmune es necesario evaluar las clulas que se desarrollan y activan en
forma especfica o inespecfica, en cada tipo de respuesta. De all el inters por separar las clulas y
evaluarlas en forma diferenciada.
En muchos de los experimentos in vivo e in vitro que llevan a cabo los inmunlogos son precisas
poblaciones linfocitarias puras. Las principales fuentes de linfocitos de animales de
experimentacin son el timo, el bazo y los ganglios linfticos perifricos. En los estudios llevados a
cabo en seres humanos la fuente de linfocitos ms cmoda es la sangre perifrica, pero tambin se
pueden obtener clulas del bazo, las amgdalas o los ganglios linfticos mediante procedimientos
quirrgicos. Hay que tener en cuenta que las poblaciones celulares obtenidas a partir de cada una de
estas zonas es diferente de las dems en lo que respecta a la madurez de los linfocitos y a la
proporcin relativa de los diversos tipos de clulas que contiene. La inmunologa dispone de varios
mtodos para la separacin rpida de poblaciones linfocitarias, dentro de ellas contamos con la
separacin en gradientes de densidad, la formacin de rosetas, la separacin celular por medio de
partculas magnticas, Identificacin de linfocitos por Inmunofluorescencia y la identificacin por
Citometra de flujo. Nosotros en la prctica realizaremos la tcnica de separacin por gradientes de
densidad, la cual se basa en que los linfocitos son menos densos que los eritrocitos y los
granulocitos, y se utiliza para separar conjuntamente todos los linfocitos sanguneos.

Materiales:

Microscopio ptico
Gradillas para Tubos
Cmara de Neubauer
Lminas Portaobjeto

Tubos de vidrio (13x100 12x75)

Pipetas pasteur
Centrfuga
Laminillas Cubreobjeto

Reactivos:
1. Solucin de Ficoll Hipaque

2. PBS (Solucin salina amortiguadora

con fosfatos)

3. Azul de Tripn al 1% acuoso

4. PBS-Glicerol

Ficoll 400................................... ....... 9 grs. Agua

destilada .................................. 115.0 ml
Hipaque al 50%.................................. 30 ml.
Cloruro de Sodio.................................. 17
grs. Fosfato dibsico de sodio (7 H2O).....
2.35 grs. Fosfato monobsico de
sodio............. 0.45 grs. Agua destilada
c.s.p............................ 2.0 litros. Ajustar
pH a 7.4 con HCl 6 N.
PBS..................................................... 1.0
ml Glicerol...............................................
7.0 ml

Obtencin de muestras para estudio de sangre perifrica:

i.

ii.

Por venipuntura, extraer la sangre en una jeringa que contenga heparina a concentracin de
10 U.I. por ml, mantener en agitacin lenta a temperatura ambiente. No dejar transcurrir
ms de 4 horas antes de procesar la muestra.
Otra forma es obteniendo por venipuntura sangre venosa en un tubo con EDTA, mezclar y
puede ser conservada a temperatura ambiente hasta por 48 horas.

Mdula sea:
Por puncin medular o de cresta iliaca, extraer 2 5 ml de mdula sea en una jeringa que contenga
10 ml de PBS y 150 UI de heparina. Esta dilucin es indispensable para obtener una adecuada
separacin de clulas mononucleares. Las muestras de mdula que no son diludas en el momento
de su obtencin deben rechazarse. La agitacin y tratamiento hasta el procesamiento es igual que
para sangre perifrica.

Obtencin a partir de ganglio:

a) Se coloca el ganglio en un mortero, se cubre con PBS y se punza con una aguja; sta accin
facilitar la salida de las clulas. A partir de esta emulsin se obtendrn las clulas a
investigar.

b) Otra forma es colocar el ganglio en un mortero y presionarlo con el piln y a la vez se va

agregando PBS, formndose as un machacado de donde se obtendrn las clulas a
investigar.

Mtodo:
1. Dilur la muestra de sangre perifrica heparinizada o con EDTA 1:2 (2 ml de sangre + 2 ml
de PBS ). Las muestras de mdula sea ya diludas no deben diluirse nuevamente.

Tubo con sangre 2ml

ms 2 ml del buffer
PBS

2. En un tubo sobre un volumen de 2 ml de ficoll-hipaque, depositar cuidadosamente en zona

la muestra diluda. La mezcla se evita si la muestra se desliza por la pared del tubo en tanto
ste se mantiene inclinado.

Tubo con 2 ml de
sangre ms 2 ml de
PBS y luego
aadimos Ficoll, que
es la parte

3. Centrifugar a 1000 3000 r.p.m. durante 20 30 minutos en centrfuga refrigerada o a

medio ambiente.

Halo con clulas

mononucleares, eso
lo extraemos, para
su estudio de
linfocitos T

4. Separar de la interfase formada la capa de linfocitos con una pipeta de Pasteur.

5. Lavar las clulas mononucleares dos veces con PBS, centrifugando a 3,000 r.p.m. durante
10 minutos cada vez.

Al separar el Halo
con clulas
mononucleares,
separamos y lo
lavamos 2 veces
con PBS. Al ltimo

6. Contar en cmara de Neubauer o en contador electrnico y ajustar en PBS la densidad

requerida ( Un milln de clulas por c.c.)
7. Podemos realizar comprobacin de
viabilidad celular, colocando una gota de
azul de Tripn al 1% + 1 gota de clulas en
una lmina porta-objetos, cubrirla con una
laminilla cubre-objetos y observar al
microscopio. Las clulas muertas se vern
de color azul y las vivas o viables se vern
refringentes. Una buena obtencin de
mononucleares debe presentar menos del
5% de clulas muertas.

Esquema de la gradiente de densidad.

En
el
microscopio
observamos las clulas con
Azul de tripan que sirve
para ver si es VIABLE,
solo las clulas muertes se
vern de color azul.

Interpretacin
Observaremos como los componentes de la muestra se ubicaran a diferentes niveles dentro del tubo
segn su propia densidad. La capa de mononucleares obtenida es bastante pura y contiene linfocitos
y monocitos, los que se pueden distinguir por su morfologa, antgenos de superficie, capacidad
fagoctica, actividad enzimtica, adherencia.
Notas:
La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologas utilizadas para este
fin.
Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos celulares, permite mantener
una buena viabilidad celular para realizar otros anlisis.
No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir por las paredes del tubo y
de inmediato debe ser centrifugada.

CUESTIONARIO
1.- En qu consiste la separacin celular por medio de partculas magnticas?
Separacin Inmunomagntica
Estas tcnicas se basan en el uso de anticuerpos unidos a la superficie de unas esferas formadas por
un material superparamagntico (es decir, que solo son magnticas en presencia de un campo
magntico) recubierto de un polmero. Los anticuerpos se unen de manera especfica a un antgeno
presente en la superficie de un tipo celular concreto y, mediante un simple imn, se pueden separar
las clulas unidas a los anticuerpos de las dems. Existen en el mercado dos sistemas de separacin
de clulas basados en el uso de esferas metlicas unidas a anticuerpos: Dynabeads y MACS.
a. Dynabeads (Life technologies)
Son unas esferas de poliestireno en cuyo interior hay partculas superparamagnticas que contienen
hierro, homogneamente distribuidas. Su tamao es uniforme, con un dimetro de 4,5 micras
(comparable al tamao de una clula). Sobre su superficie se pueden unir covalentemente diversos
ligandos biorreactivos: anticuerpos primarios, anticuerpos secundarios, estreptavidina,
oligonucletidos, etc.

b. Microesferas MACS (Magnetic-activated cell sorting) (Miltenyi Biotec)

Son partculas supe paramagnticas formadas por xido de hierro y polisacridos (dextranos). Son
muy pequeas, con un dimetro aproximado de 50 nm, y se encuentran unidas a anticuerpos
especficos. Al ser tan pequeas, no alteran ni la estructura, ni la funcin, ni la actividad de las
clulas. No son txicas y son biodegradables. La separacin se lleva a cabo haciendo pasar la
muestra a travs de una columna que contiene una matriz de esferas ferromagnticas recubiertas de
un material inerte que no daa las clulas. Cuando se coloca la columna sobre un imn, las esferas
crean un campo magntico de gran intensidad que atrae fuertemente las microesferas MACS y las
clulas unidas a ellas, mientras que las clulas que no se han unido a las microesferas MACS
fluyen libremente a travs de la columna. Se necesita un campo magntico muy intenso porque las
microesferas son muy pequeas y las clulas estn mnimamente marcadas.

2.- Qu es el Ficoll?
El Ficoll es un polmero de carbohidrato y metrizamida (compuesto denso que contiene yodo) y que
permite que se hundan los eritrocitos y los granulocitos (debido a su mayor densidad = 1.077), y
que floten las clulas mononucleares (linfocitos y monocitos); por ello, que tras la centrifugacin
nos ser fcil obtener las clulas mononucleares de sangre perifrica.

3.- Qu es el Hipaque?
3.a) Hypaque meglumina
Marca del diatrizoato de meglumina, es un agente de diagnstico, radiopaco y soluble en agua. Es
un derivado triyodado del cido benzoico con 47.06% de yodo unido orgnicamente. Est
constituido por un anin yodado (diatrizoato) y un catin radiolcido (meglumina). Es una solucin
acuosa estril con 60 g de la sal meglumnica del cido diatrizoico por cada 100 ml de solucin. La
solucin es transparente, incolora o amarillo plida, y el pH ha sido ajustado entre 6.5 y 7.7 con

cido diatrizoico o solucin de meglumina. Es una solucin relativamente termoestable y puede ser
autoclavada sin que se produzcan efectos deletreos, pero debera ser protegida de la luz fuerte. La
solucin al 60% contiene edetato de calcio disdico 1:10.000 como agente estabilizador
secuestrante. Cada 1 ml contiene aproximadamente 282 mg de yodo unido orgnicamente. La
viscosidad de la solucin es 6.17 cp a 25 C y 4.12 cp a 37 C. Es hipertnica a la sangre, con una
osmolalidad de 1.415 mosm/kg (determinado por VPO). Una solucin al 13% (p/v) es isotnica. Es
un slido microcristalino, incoloro, muy soluble en agua. Qumicamente corresponde a 3.5diacetamida-2, 4, 6-triyodobenzoato de meglumina (C11H9I3N2O4.C7H17NO5) con un peso molecular
de 809.13.
3.b) Hypaque-76
Marca de diatrizoato de meglumina y diatrizoato sdico, es un agente de diagnstico, radiopaco
soluble en agua. Se presenta bajo la forma de una solucin acuosa estril al 76 %, que contiene 66%
(p/v) de diatrizoato de meglumina y 10% (p/v) de diatrizoato sdico. Es un derivado triyodado del
cido benzoico con 37% (p/v) de yodo unido orgnicamente. Cada ml contiene 370 mg de yodo y
3.68 mg (0.16 mEq) de sodio. Est constituido por un anin yodado radiopaco -diatrizoato- y los
cationes radiolcidos, meglumina y sodio. Es el yodo unido orgnicamente del anin la parte de la
molcula que opacifica las estructuras internas para visualizacin por medio de los rayos X y la
fluoroscopa. La solucin es hipertnica a la sangre, con una osmolalidad de 2016 mosm/kg
(determinado por VPO). La viscosidad es de 9 cp a 37 C. El pH ha sido ajustado entre 6 y 7.7
usando Na2CO3 con HCI o NaOH. El pKa es 3.4 para el cido diatrizoico. Se ha agregado edetato
de calcio disdico al 0.01% como agente estabilizador secuestrante. La solucin es transparente,
incolora o amarillo plida. El diatrizoato meglumina corresponde al 1-deoxi-1-(metilamino)-Dglucitol-3.5-diacetamida-2,4,6-triyodobenzoato (sal). El diatrizoato sdico corresponde al 3.5
-diacetamida-2,4,6- triyodobenzoato monosdico.

INTRODUCCIN

En estos 2 informes que presentaremos a continuacin, bsicamente detallaremos en el

primer informe como extraer clulas mononucleares a partir de sangre perifrica, luego los
estudiaremos y por ltimo en el informe posterior extraeremos Linfocitos T.
Una Clula mononuclear de sangre perifrica (PBMC) es una clula sangunea
caracterizada por poseer un nico ncleo redondo, como los linfocitos o los monocitos.
Estas clulas sanguneas son un componente crtico en el sistema inmune, concretamente
para combatir las infecciones.
Estas clulas se obtienen a menudo de la sangre usando ficol, un polisacrido hidroflico
que separa capas de la sangre, con monocitos y linfocitos formando un buffy coat bajo la
capa del plasma. Este buffy contiene las PBMCs.
Las PBMCs tienen vastos usos clnicos y en investigacin. Por ejemplo, se emplean en la
investigacin del virus HIV porque las PBMCs incluyen los linfocitos T4, que el HIV
infecta
Los linfocitos T o clulas-T pertenecen al grupo de leucocitos que son conocidos como
linfocitos. Estas clulas tienen ncleos de forma ovoide que ocupan la mayora del espacio
intracelular.
Los linfocitos T son los responsables de coordinar la respuesta inmune celular
constituyendo el 70 % del total de los linfocitos que segregan protenas o citocinas.
Tambin se ocupan de realizar la cooperacin para desarrollar todas las formas de
respuestas inmunes, como la produccin de anticuerpos por los linfocitos B.
Se diferencian de los linfocitos B y de las clulas NK (o clula Natural Killer, en espaol
asesina natural) por poseer un receptor especial en la superficie de la membrana, el
receptor de linfocitos T (tambin llamado TCR, por su denominacin en ingls T cell
receptor). Sin embargo, en un frotis microscpico de sangre no es posible distinguir uno de
otro a simple vista.

CONCLUSIN

La separacin por gradiente de densidad fue una de las primeras metodologas utilizadas
para este fin.
Esta metodologa tiene la particularidad que adems de separar grupos celulares, permite
mantener una buena viabilidad celular para realizar otros anlisis.
No olvides que la muestra de sangre debe ser colocada en zona, es decir por las paredes del
tubo y de inmediato debe ser centrifugada.
La muestra usada debe ser fresca.
Los glbulos rojos de carnero pueden ser lavados en solucin salina fisiolgica hasta que no
se observe hemlisis o sea el sobrenadante debe ser incoloro y transparente.
La formacin completa de las rosetas se da a las 18 24 horas a una temperatura de 2 8
C (refrigeracin)
Realiza el clculo de los linfocitos T de la muestra trabajada.