Electroforesis en gel de poliacrilamida

Es una de las tcnicas ms ampliamente usada para caracterizar

mezclas complejas de protenas. La electroforesis en poliacrilamida es un
mtodo conveniente, rpido y econmico a nivel de muestra pues se
requieren slo cantidades del orden de microgramos de protena.
Las protenas presentan una carga elctrica neta si se encuentran en un
medio que tenga un pH diferente al de su punto isoelctrico y por eso
tienen la propiedad de desplazarse cuando se someten a un campo
elctrico. La velocidad de migracin es proporcional a la relacin entre
las cargas de la protena y su masa. Cuanto mayor carga por unidad de
masa ms rpida ser la migracin.
Aplicaciones.
cidos nucleicos
En los cidos nucleicos la direccin de migracin es del electrodo
negativo al positivo, y esto es debido a la carga negativa presente en el
esqueleto azcar-fosfato. En los fragmentos de ADN dobles, la velocidad
de migracin es inversamente proporcional a su tamao. En fragmentos
simples de ADN y ARN, dichas molculas tienden a plegarse de forma
compleja y a migrar de forma ms complicada, segn la estructura
terciaria formada tras el plegamiento.
Protenas
Las protenas no tienen una estructura predecible como los cidos
nucleicos, y por tanto sus velocidades de migracin no son similares
entre las protenas. Incluso puede que no migren ni al aplicar una fuerza
electromotriz. En estos casos, las protenas se desnaturalizan mediante
la adicin de un detergente. Los detergentes otorgan una carga neta
negativa a la protena que les permite migrar a travs del gel de
poliacrilamida en relacin directa a su masa, ya que la cantidad de
cargas negativas que se unen a la protena depende del tamao de sta.
Por otro lado, el agente reductor rompe los enlaces bisulfuros, separando
a la protena en sus sub-unidades. La desnaturalizacin hace que pierdan
su estructura terciaria y cuaternaria por tanto su velocidad de migracin
es proporcional al tamao. As, los ms grandes se desplazan ms
lentamente.
Riesgos por mal manejo
o El mal manejo del gel es muy txico
o Si no se tiene el poro correcto para separar molculas, puede
haber riesgo de que otras molculas tambin pasen.

Electroforesis bidimensional
Es una tcnica de alta resolucin cuyo objetivo es la separacin de
mezclas de protenas altamente complejas. Las protenas son separadas
secuencialmente por dos criterios fsicos. Las protenas son separadas en
un gel con gradiente de pH en condiciones desnaturalizantes de acuerdo
con su punto isoelctrico. Tras esta separacin por carga las protenas
son separadas de acuerdo con su masa molecular por electroforesis
discontinua en gel de poliacrilamida. Tras la tincin del gel las protenas
aparecen formando manchas circulares.
Aplicaciones
Se emplea en estudios comparativos de patrones proteicos de
diferentes individuos. Pueden compararse por ejemplo, los patrones de
protenas de un individuo sano frente a un individuo enfermo o de un
mismo individuo expuesto a diversas situaciones.
Se utilizan para analizar los efectos de diferentes tratamientos con
frmacos o la exposicin a sustancias txicas.
Riesgos de mal uso
o Malos resultados en tratamientos de sustancias txicas
o Mala separacin de molculas

Cromatografa
Es la tcnica para separar componentes de una mezcla, y su posterior
anlisis, basadas en que las distintas sustancias que forman los
componentes de una mezcla se dejan arrastrar a diferentes velocidades
sobre un soporte. El soporte puede ser papel, un gas, otro lquido, etc. Es
un mtodo fsico de separacin de componentes.
Aplicaciones
Se utiliza para lograr la separacin de los componentes de una
mezcla como para medir la proporcin de cada elemento en la
mezcla.
Riegos de mal uso.
o
o

Mala lectura en UV
Si no se pone suficiente muestra no se puede leer

Inmunoblot
Es una tcnica analtica usada para detectar protenas especficas en una muestra
determinada. Mediante una electroforesis en gel se separan las protenas atendiendo
al criterio que se desee: peso molecular, estructura, etc. Luego son transferidas a
una membrana adsorbente para poder buscar la protena de inters
con anticuerpos especficos contra ella. Finalmente, se detecta la unin antgenoanticuerpo por actividad enzimtica, fluorescencia entre otros mtodos. De esta forma
se puede estudiar la presencia de la protena en el extracto y analizar su cantidad
relativa respecto a otras protenas.

Aplicaciones
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa,
como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la inmunologa.
Existe toda una industria especializada en la venta de anticuerpos contra
decenas de miles de protenas diferentes.

Riesgo de mal uso

o Mal control de anticuerpos
o Non se identifica la protena por la mal lectura