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p53 regula negativamente la transcripcin de la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2

Investigacin del Cncer

cancerres.aacrjournals.org
Publicado OnlineFirst 28 de noviembre 2011 ; doi: 10.1158/0008-5472.CAN-11-1215
Cancer Res. 15 de enero 2012 72; 560

p53 regula negativamente la transcripcin de

la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2
Tanupriya Contratista 1 y Chris R. Harris 1 , 2 , 3
+ Afiliaciones de los autores

Autor correspondiente:
Chris R. Harris, del Instituto del Cncer de Nueva Jersey, Room 3529, 195 Poco Albany
Street, New Brunswick, NJ 08901 Telfono:. 732-235-5590; Fax: 732-235-6618; E-mail:
harrisch@umdnj.edu

Abstracto
En las clulas cancerosas, la conversin aberrante de piruvato en lactato en lugar de
acetil-CoA en presencia de oxgeno se conoce como el efecto Warburg. Se conocen por
completo las consecuencias y los mecanismos de esta peculiaridad metablica. Aqu
mostramos que el estado de p53 es un factor determinante del efecto Warburg. De tipo
salvaje expresin de p53 disminucin de los niveles de piruvato deshidrogenasa quinasa-2
(PDK2) y el producto de su actividad, la forma inactiva del complejo piruvato
deshidrogenasa (P-PDC), ambos de los cuales son los principales reguladores del
metabolismo de piruvato. Disminucin de los niveles PDK2 y P-PDC, a su vez promueven
la conversin de piruvato en acetil-CoA en lugar de lactato. Por lo tanto, p53 de tipo
salvaje produccin de lactato limitada en las clulas cancerosas a menos PDK2 podra
ser elevado. En conjunto, nuestros resultados establecieron que p53 de tipo salvaje
impide manifestacin del efecto Warburg mediante el control de PDK2. Estos hallazgos
aclaran un nuevo mecanismo por el cual p53 suprime la tumorignesis actuando a nivel
del metabolismo celular del cncer. Cancer Res.; 72 (2); 560-7. 2011 AACR .

Introduccin
Las clulas cancerosas y no cancergenos pueden diferir en el metabolismo de la
glucosa. En lneas celulares de cncer, tanto como 90 por ciento de glucosa se
c onvierte
en lactosa ( 1 ), mientras que las clulas no tumorales tienden a oxidar completamente la
glucosa en dixido de carbono. La alta produccin de lactato por las clulas tumorales se
produce incluso en presencia de oxgeno y se conoce como la gluclisis aerbica o el
"efecto de Warburg." Aunque observ en primer lugar por Otto Warburg ( 2, 3 ), la
gluclisis aerobia ha dibujado ms inters en la investigacin ltimamente, y se Se
espera que las drogas que atacan el efecto Warburg demostrarn ser eficaz en la lucha
contra la formacin de tumores. No est completamente claro por qu el efecto Warburg
se ve favorecida por las clulas tumorales, pero se supone, es beneficioso para la
proliferacin celular. La gluclisis produce ATP ms rpidamente que la fosforilacin
oxidativa, lo que puede favorecer el crecimiento rpido si la glucosa es abundante.
Adems, la interrupcin de la gluclisis puede desviar intermedios glicolticos hacia la
sntesis de molculas del ciclo celular importantes, tales como desoxirribonucletidos y
fosfolpidos, lo que sera favorable para la replicacin del ADN y la sntesis de la
membrana ( 4 ). Otra consideracin es que la oxidacin completa de la glucosa produce
especies reactivas de oxgeno (ROS;. Ref. 5 ), que conduce a la apoptosis ( 6 ), por lo
que las clulas tumorales pueden restringir la fosforilacin oxidativa como un mecanismo
de supervivencia.
En este estudio, hemos probado si la protena supresora de tumores p53 ayuda a
prevenir el efecto Warburg. Aproximadamente la mitad de todos los tumores albergar una
mutacin en el p53 gen ( 7 ), y los tumores restantes probable que tenga mutaciones en
una o ms de las muchas vas afectadas por p53. p53 desempea varios papeles clave
en la prevencin de tumores, tales como la induccin de la detencin del ciclo celular, la
senescencia, o la apoptosis en respuesta al dao del ADN ( 8 ). Ms recientemente, la
p53 se ha demostrado que afectan el metabolismo celular, tales como la va mTOR ( 9 ).
Clnicamente, p53 mutaciones se correlacionan con un aumento de la absorcin del
anlogo de la glucosa 18 FDG ( 10 ), que es un marcador para la gluclisis aerbica.
Estos datos sugieren que p53 podra reducir la absorcin de glucosa y / o catabolismo de
la glucosa por los tumores. De hecho, como se detalla en la seccin de discusin, p53
es conocido para aumentar la expresin de genes que debera disminuir la gluclisis ( 11,
12 ). Sin embargo, p53 tambin se sabe que aumenta la expresin de los genes que

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deben aumentar el metabolismo de la glucosa ( 13, 14 ). Por lo tanto, el mecanismo

preciso por el cual metabolismo de la glucosa altera p53 no ha sido completamente
claro.
Decidimos probar el efecto de p53 en un punto de decisin clave en el metabolismo de la
glucosa: la conversin de piruvato, el producto final de la gliclisis, en acetil-CoA, que es
uno de los puntos de entrada en el ciclo del cido ctrico. Este punto de decisin es
controlado en gran parte por la enzima piruvato deshidrogenasa quinasa isoenzima-2
(PDK2), que inactiva la produccin de acetil-CoA mediante la fosforilacin de la PDC. Se
demuestra que la transcripcin de PDK2 es regulada negativamente por p53. Por lo tanto
p53 puede afectar la caracterstica ms singular del efecto Warburg, la produccin de
lactato.

Materiales y Mtodos
Los plsmidos
Un plsmido que expresa PDK2 bajo CMV el control del promotor se adquiri de Origene.
pCMV-wtp53 fue un regalo de Arnold Levine, y el plsmido de control pCMV-fsp53 fue
preparado mediante la insercin de 2 marco turno mutaciones en el p53 gen. plsmidos
pHA-E2F1, E2F2-pHA y pCMV-neo fueron regalos de Alain Nepveu. Pdk2/luciferase
humano se prepar mediante PCR de la PDK2 promotor a partir del ADN genmico
humano, usando los cebadores 5'-AAAAGGTACCCTATTGGTTCGCCCGGAGTT-3 'y 5'TTTCTCGAGCGGCCGCGACTTTGGTTGTGG-3'. El producto de PCR se insert en los
Kpn I y Xho I sitios de pGL3-Basic (Promega). Murino Pdk2/luciferase se prepar por
PCR de la PDK2 promotor a partir del ADN genmico de ratn, usando los cebadores 5'AAAAGGTACCGAGCACAGCCCAGGAA-3
'y
5'AAAAGGATCCGGCTCGGGCTTGGATCTCGCT-3'. El producto de PCR se digiri con
Kpn I y Bam HI, a continuacin, insertado en los Kpn I y Bgl II de los sitios pGL3-Basic.
Lneas celulares
MCF7 se obtuvo de la American Type Culture Collection. MCF7 CL.17 se construy
mediante la transfeccin de un plsmido que expresa PDK2 bajo el control del CMV
promotor. Colonias resistentes a G418 se seleccionaron para la expresin PDK2 en
presencia y ausencia de nutlin-3a. MCF7shp53 fue proporcionado amablemente por
Xinbin Chen. Las lneas celulares de EB y EB1 fueron regalos de Arnold Levine, y el
HCT116, HCT116 ( p53 - / - ) y HCT116 ( p21 - / - ) fueron regalos de Bert Vogelstein. Las
lneas celulares que no fueron autenticadas por los autores despus de la recepcin. Las
clulas se cultivaron en medio de Eagle modificado de Dulbecco (DMEM) -10% de FBS
(MCF7, EB, y EB1) o en McCoys-10% de FBS (HCT116 y sus derivados). MCF7 CL.17 y
MCF7shp53 se cultivaron en DMEM-10% suplemento de FBS con 1 mg / ml de G418 o 1
mg / ml de puromicina, respectivamente. Medios se compraron de Invitrogen y FBS se
adquiri de Sigma-Aldrich. Las clulas se mantuvieron a 37 C en presencia de dixido
de carbono al 5%.
Transferencias de Western y RT-PCR
Para el anlisis de protenas, lisados
fueron aislados por extraccin ensayo de
radioinmunoprecipitacin en presencia de inhibidores de la proteasa y de fosfatasa
(Sigma-Aldrich). Veinte microgramos de extractos de protenas se separaron usando
NuPage 4% a 12% geles Bis Tris (Invitrogen). PDK2 y PDH E1 antisueros fueron
adquiridos de Novus Productos Biolgicos. P-PDH E1 antisueros fueron adquiridos de
Merck Biosciences. Antisueros PDK1 se adquirieron de Assay Designs. -actina y la
caspasa 7 antisueros fueron adquiridos de Sigma-Aldrich. La caspasa 9 antisueros fueron
de Tecnologas de Sealizacin Celular. Para el anlisis de ARN, el ARN se extrajo
usando columnas RNeasy (Qiagen), despus se convierte en ADNc usando reactivos de
transcripcin inversa (Applied Biosystems). Todos los ensayos TaqMan fueron adquiridos
de Applied Biosystems. Los ensayos se leen en tiempo real utilizando un Applied
Biosystems 7500 y normalizado a -actina ARNm.
Ensayos de inmunoprecipitacin de la cromatina
Dos millones de clulas EB1 se trataron con cloruro de 200 mol / L de zinc, o tratado de
forma simulada, durante 7 horas. Las clulas fueron tratadas durante 10 minutos con
0,01% de formaldehdo a 37 C. Las clulas se lavaron y se lisaron, entonces la
cromatina se fragmentados utilizando una de Sonic Dismembrator 50 (Fisher Scientific)
en 30% a 40% de salida en 3 series de 15 segundos. Un kit para la inmunoprecipitacin
de la cromatina (ChIP) se adquiri de Millipore. Los antisueros contra E2F1 (Novus
Biologicals) y la histona acetil-H4 (Millipore) fueron utilizados para experimentos de
inmunoprecipitacin. La inmunoprecipitacin se llev a cabo segn lo recomendado por el
fabricante. Las cantidades relativas de PDK2 promotor en las muestras precipitadas se

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analizaron utilizando concentraciones de 70 nmol / L de 2 oligonucletidos, 5'CCGGAGTTGTTTGTGAGTGG-3 'y 5'-GCCTCCTCCCTACCCTTG-3'. Las cantidades
relativas de PDK2 promotor en las preparaciones de entrada (nonimmunoprecipitated)
tambin se determinaron y se usaron para la normalizacin. Verde SYBR se utiliza para
controlar amplificaciones por PCR en tiempo real.
Ensayos de lactato
Las clulas se colocaron en placas de 6 pocillos en placas de cultivo de tejido de
plstico a una densidad de 500.000 clulas. Despus de 24 horas, se aadi DMEM
fresco-FBS al 10% junto con 10 mmol / L de nutlin-3a (Sigma-Aldrich) o sulfxido de
dimetilo (DMSO) solo. Despus de 4 horas, se retiraron y se reemplazaron con medio
fresco que contena DMSO o nutlin-3a medios de comunicacin. Despus de 12 horas
adicionales, se retiraron y se centrifugan a travs 10K spin columnas (BioVision) para
eliminar los restos celulares y las enzimas que contaminan los medios de comunicacin.
El flujo de bajo peso molecular a travs de lactato fue ensayada utilizando el kit de
ensayo de lactato II (BioVision). Un control sin clulas se utiliza para obtener un nivel
basal de lactato en los medios de comunicacin. Cada condicin de ensayo se tomaron
muestras en los pocillos por cuadruplicado. La cantidad de lactato se normaliz al
nmero de clulas viables en los mismos pozos, tal como se determin por ensayo de
guayaba ViaCount (Millipore).
Luciferasa y otros experimentos de transfeccin transitoria
HCT116 ( p53 - / - ) las clulas se colocaron en placas de 6 pocillos en placas de plstico
de cultivo de tejidos a una densidad de 500.000 clulas. Una cantidad de 0,8 g de pPdk2luciferasa (ya sea humano o murino PDK2 promotor) se transfect junto con 0,8 g de
purificado nativo de Renilla luciferasa (Prolume Ltd). Nativo de Renilla se utiliz debido a
Renilla reporteros fueron sensibles a E2F1 aadido, E2F2 y p53. Tambin se ha aadido
fue de 0,8 g de pCMV-p53wt, pCMV-p53fs, pha-E2F1, E2F2-pHA o pCMV-neo.
Lipofectamina 2000 (Invitrogen) se utiliz para la transfeccin como se recomienda por el
fabricante. Despus de 24 horas, las clulas transfectadas se lisaron y se ensayaron
para la luciferasa utilizando un kit de luciferasa dual GLO (Promega). Todos los siRNAs
se compraron de Ambion y se transfectaron con Siport, segn lo recomendado por el
fabricante. Para la precipitacin de p21, HCT116 ( p53 - / - ) se transfectaron clulas y 24
horas ms tarde, las clulas se tripsinizaron y se volvieron a sembrar para los
experimentos de luciferasa. Para la precipitacin de p53, MCF7 fueron transfectadas y 24
horas ms tarde, las clulas se tripsinizaron y se replated para el tratamiento nutlin-3a.
Experimentos con ratones
De tipo salvaje o isognica p53 ( - / - ) ratones machos fueron irradiados con 10 Gray
gamma de una fuente de cesio. Los ratones no tena problemas de salud visibles en el
momento del ensayo. Se utilizaron tres ratones de ambos fondos, y tambin se
estudiaron 3 ratones no tratados de ambos orgenes. Seis horas despus de la
irradiacin, los ratones fueron sacrificados con dixido de carbono, de acuerdo con el
Comit de la Universidad de Rutgers Animal Institucional de Cuidado y Uso. Bazo o
revestimiento epitelial de cncer de colon se aislaron y se extrajo el ARN, convertidos en
ADNc, y se cuantificaron por tiempo real PCR transcriptasa inversa (RT-PCR) como se
describe anteriormente.

Resultados
El lactato se produce a partir de piruvato, el producto final de la gliclisis. Como se
muestra en la figura. 1 , piruvato tambin se puede convertir en acetil-CoA, que puede
entrar en el ciclo del cido ctrico. Produccin de acetil-CoA es catalizada por el PDC,
cuya actividad est controlada por la accin de varias quinasas y fosfatasas. Pdc puede
ser inactivado por la fosforilacin, que debe causar la produccin de ms de lactato.
Debido a que la produccin de lactato es un componente clave del efecto Warburg en las
clulas cancerosas, decidimos probar si p53 puede influir en la fosforilacin de PDC.
Figura 1.

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Un punto de decisin en el
metabolismo del piruvato. En el
tenedor a la izquierda, el piruvato
se convierte en lactato, que
regenera NAD + , que puede ser
utilizado para conducir ms la
gluclisis y la produccin de ms
de piruvato. En el tenedor

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derecho, piruvato se convierte en
acetil-CoA, que se puede convertir en dixido de carbono por el ciclo del
cido ctrico. El tenedor derecho es catalizada por la CDP, el cual es
regulado negativamente por fosforilacin. PDK2 es el principal inactivador de
la CDP, pero PDK1, Pdk3 y PDK4 son empleados por ciertos tipos de
clulas. La fosforilacin de PDC puede ser revertida por cualquiera de las 2
fosfatasas, PDP1 o PDP2.

Corrimos nuestros experimentos en la lnea celular de carcinoma de mama humano

MCF7, que codifica p53 natural de su promotor natural. Para probar los efectos de p53 en
la produccin de lactato, desafiamos a la lnea celular mediante la adicin de nutlin-3a,
un compuesto que aumenta la actividad de p53 al interferir con la interaccin entre p53 y
su regulador negativo Mdm2 ( 15 ). Como se muestra en la figura. 2A , la adicin de
nutlin-3a disminuy la cantidad de fosforilados Pdc, sin alterar la cantidad de no
fosforilada PDC.
Figura 2.
Western blots de protenas
implicadas en el metabolismo de
piruvato. A, las clulas MCF7 se
trataron con 10 mmol / L de nutlin3a o maqueta tratada con DMSO
durante 24 horas. La protena se
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extrae luego borr Western
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utilizando antisueros contra fosfoDescargar como diapositivas de Pow erPoint
PDC (P-PDC), PDC PDK2 o
PDK1 o -actina. B, clulas MCF7
transfectadas con ARNsi de control negativo o de p53 fueron tratados con 10
mmol / L de nutlin o DMSO durante 24 horas, despus se lisaron y
transferencia Western para PDK2.

La fosforilacin de PDC puede ser controlado por 4 PDKs diferentes, es decir, PDKs 1 a
4 y 2 por fosfatasas piruvato deshidrogenasa (diferentes . Fig. 1 ). PDKs 1, 3, y 4 se
expresan slo en determinados tipos de clulas, o en momentos de estrs celular ( 16 ).
PDK2 es ms frecuente, con la expresin en todos los tejidos. De hecho, en condiciones
normales, PDK2 es visto como el punto de control clave en la conversin de piruvato a
acetil-CoA reaccin porque responde alostricamente a los rpidos cambios locales en el
sustrato y el producto: aumenta la actividad PDK2 especficos si los niveles de acetilCoA y NADH aumentan, pero disminuye si los niveles de piruvato aumentan ( 16 ).
Decidimos probar si afecta a la expresin de p53 PDK2.
Como se muestra en la figura. 2A , los niveles PDK2 cayeron tras el tratamiento nutlin3a. Debido nutlin-3a puede producir efectos fuera de la meta, as como se buscan efectos
cuando p53 es derribado utilizando siRNA. Tras la reduccin de p53, el efecto de nutlin3a sobre la protena PDK2 disminuy ( . Fig. 2B ). Tambin se examinaron la expresin
de PDK1 y vimos ningn efecto de nutlin-3a por Western blot ( Fig. 2A ) o RNA anlisis (
fig. 3A ). Los niveles de transcripcin de pdk3, PDP1 y PDP2 tampoco se modificaron (
Fig. 3A ), a pesar de que no fueron capaces de analizar estas protenas por Western blot,
ya sea debido a la falta de antisueros o baja expresin (no se muestra). MCF7 no pareca
expresar ARNm para PDK4.
Figura 3.
El anlisis de la transcripcin de
genes implicados en el
metabolismo del piruvato. A, se
midieron las concentraciones de
mRNA y mRNA normalizado a actina utilizando en tiempo real
RT-PCR tras 24 horas de
tratamiento con DMSO (D) o 10
Ver una versin ms grande:
mmol / L nutlin-3a (N). Ensayos
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TaqMan se usaron para los
siguientes genes: Pdc fosfatasas
1 o 2 (PDP1, PDP2); PDK1,
Pdk3, o PDK2. Para las mediciones de PDK2, las clulas fueron tratadas
primero con cualquiera de control de siRNA (sicont) o p53 siRNA (sip53)

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antes de DMSO o tratamiento nutlin-3a. B, EB ( p53 null) o EB1 (zincinducible p53 clulas) fueron tratados con 200 mmol / L de zinc durante 8
horas, o bien tratarse de burla. ARNm para PDK2 se midi por tiempo real de
RT-PCR y ARNm normalizado a -actina. C, fusiones de promotor se
generaron entre un reportero de luciferasa de lucirnaga y, o bien secuencias
de PDK2 o el ratn PDK2 humanos. Estas fusiones, o vector vaco pGL3
bsico, se cotransfectaron en HCT116 ( p53 - / - ) las clulas con un plsmido
que expresa ya sea p53 de tipo salvaje (wtp53) o un plsmido de control en el
que el p53 gen se inactiv con 2 mutaciones marco turno (fsp53). Despus de
24 horas, la actividad de luciferasa se
ensay y se normalizaron a un control
de transfeccin.

A diferencia de los otros mediadores de la CDP fosforilacin, PDK2 transcripcin

disminuy despus de la adicin de nutlin-3a ( Fig.. 3A ). Este efecto sobre los niveles de
ARNm de PDK2 es dependiente de p53, ya que la reduccin de p53 por el uso de ARNsi
impidi la regulacin transcripcional por nutlin-3a ( Fig.. 3A ). Tambin hemos probado los
efectos de p53 en PDK2 estabilidad de la protena, pero el tratamiento nutlin-3a de MCF7
no alter PDK2 vida media de protenas (datos no presentados). La transcripcin PDK2
es downregulated por p53 en otras lneas celulares, como se muestra en la figura. 3B .
La lnea de clulas de colon humano EB1 expresa p53 de un promotor inducible por zinc
y zinc disminuy la transcripcin de PDK2. En la lnea celular de EB, que codifica p53
pero no es lo contrario isognicas, cinc no afecta a la transcripcin de PDK2.
Tambin fusionamos un pequeo segmento del promotor PDK2 humano para el gen de la
luciferasa de lucirnaga ( . Fig. 3C ). Esta fusin del promotor mostr la actividad del
promotor en ausencia de p53, pero fue fuertemente reprimida en presencia de p53. Un
ratn promotor Pdk2/luciferase fusin tambin se downregulated por p53 ( . Fig. 3C ).
A continuacin, hemos probado si p53 puede controlar la expresin de PDK2 in vivo . De
tipo salvaje y isognicas p53 nula ratones fueron irradiados para activar p53. Seis horas
despus de la irradiacin, los ratones fueron sacrificados, y el colon y el bazo fueron
aisladas de 3 tratada o de 3 animales no tratados. La respuesta a p53 a la irradiacin es
muy rpida en estos tejidos ( 17 ). Como se muestra en la figura. 4A y B , la cantidad de
PDK2 ARNm tanto en el colon y el bazo disminuy tras la irradiacin de ratones de tipo
salvaje, pero no tras la irradiacin de p53 knockout mice. Por lo tanto p53 disminuye
PDK2 la transcripcin in vivo . Curiosamente, para ambos tejidos el nivel de ARNm PDK2
fue mayor en los ratones de tipo salvaje no tratados que en los no tratados de p53
ratones nulos.
Figura 4.

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Anlisis de PDK2 la transcripcin

en ratones. La cantidad de ARNm
en PDK2 de tipo salvaje o p53
ratones knockout dos puntos (A) o
el bazo (B) se mide 6 horas
despus de la irradiacin y se
normaliz a ARNm de -actina.
Se muestran los datos de 3
ratones. Tambin se examinaron
no irradiados (NT) ratones.

Regresamos a los sistemas de clulas cultivadas para investigar el mecanismo de la

represin de la PDK2 promotor de p53. p53 puede reprimir la transcripcin de ciertos
promotores al unirse directamente al ADN, pero el PDK2 promotor no tiene motivos de
unin a p53 tampoco se ha observado unin a la p53 PDK2 promotor de chip (datos no
presentados). Otro mecanismo comn mediante el cual p53 reprime promotores se
muestra en la figura. 5A , en la que p53 inhibe la actividad de factores de transcripcin
E2F ( 18, 19 ), que activan mediante la promocin de la acetilacin de histonas ( 20, 21 ).
Este tipo de regulacin depende de la activacin transcripcional de p53-dependiente de la
p21 inhibidor de la quinasa dependiente de ciclina, cuya expresin impide la fosforilacin
de las protenas de la familia de retinoblastoma (Rb, p107, p130 y), que reprime factores
E2F ( fig. 5A ). Anlisis de la PDK2 promotor revel muchas secuencias ricas en GC que
podran servir como sitios de unin a E2F (datos no presentados).

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Figura 5.
La prueba de un modelo de
represin dependiente de p53
mediante fusiones
transcripcionales PDK2. A,
modelo de represin: P53 induce
p21, que inhibe las quinasas
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dependientes de ciclina que
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fosforilan protenas de la familia
del retinoblastoma. Protenas Rb
hipofosforilada inhiben activadores
de la transcripcin de la familia E2F, lo que resulta en la desacetilacin de
las histonas tales como la histona H4 y la disminucin de la actividad del
promotor. B, el HCT116 ( p53 - / - ) lnea celular se trat primero con siRNA
desmontables expresin de p21, o bien se trata con un control de siRNA.
Luego, las clulas fueron transfectadas con un reportero Pdk2/luciferase
humana junto con un plsmido que expresa p53 o p53 marco de cambios.
Doble-represin es la relacin de la actividad transcripcional en ausencia
frente a la presencia de p53. C, los plsmidos que expresan el E2F1 o
transcripcin E2F2 factores o vector pCMV-neo vacas se cotransfectaron con
la fusin transcripcional Pdk2/luciferase humano. La cantidad de luciferasa se
midi despus de 24 horas. D, el promotor humano de fusin Pdk2/luciferase

se cotransfect ya sea de tipo salvaje de p53 o p53 marco desplazada.

Despus de 17 horas, la tricostatina A (TSA) se aadi para inhibir la
desacetilacin de histonas, o bien los cultivos fueron tratados mock con
DMSO. La luciferasa fue ensayada 7 horas despus de la adicin de TSA.
Doblar la represin es la relacin de la transcripcin en ausencia frente a la
presencia de p53.

El uso de un Pdk2/luciferase fusin transcripcional reportero construir, hemos probado 3

partes del modelo en la figura. 5A : la influencia de la expresin de p21 en PDK2
promotor de la represin, el efecto de los factores E2F E2F1 y E2F2 en PDK2 la
activacin del promotor, y el efecto de la desacetilacin de histonas en la represin. En
primer lugar, derribaron la expresin de p21 utilizando siRNA. Reduccin de p21
disminuy la represin de Pdk2/luciferase por p53 ( . Fig. 5B ). Siguiente, la
cotransfeccin con plsmidos que expresan bien E2F1 o E2F2 activa Pdk2/luciferase la
transcripcin ( . Fig. 5C ). Finalmente, un inhibidor de la histona desacetilasa, tricostatina
A, impidi parcialmente la represin de la transcripcin PDK2 por p53 ( Fig.. 5D ).
Los datos de fusiones transcripcionales deben tomarse con cautela debido a que estas
construcciones carecen de secuencias ms distales, que tambin pueden influir en la
transcripcin. Por lo tanto, as como se buscan los efectos de p21, E2F1, y la
desacetilacin de histonas en PDK2 genmica. Para la prueba de p21 efectos, se utiliz
3 versiones de la lnea de clulas de colon humano HCT116. La lnea parental tiene de
tipo salvaje de p53 y p21 , mientras que las versiones isognicas son eliminados de
ambas copias de p53 o de ambas copias de p21 . Se compar la cantidad de PDK2
mRNA en cada lnea celular con y sin tratamiento con nutlin-3a. La lnea de clulas de
tipo salvaje mostr que el 60% de represin de la transcripcin PDK2 despus del
tratamiento nutlin-3a, pero PDK2 transcripcin no fue reprimido, ya sea en el p53 o p21
knockout lneas ( . Fig. 6A ). Estos datos mostraron que tanto p53 y p21 se requieren
para la represin de la transcripcin por PDK2 nutlin-3a.
Figura 6.
Pruebas de mecanismo de p53
dependiente de la represin de
PDK2 genmico. Una, la cantidad
Ver una versin ms grande:
de PDK2 ARNm en relacin con
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-actina se determin tras el
tratamiento 24 horas nutlin-3a (o
tratamiento simulacro de DMSO)
de 3 lneas celulares isognicas: HCT116, HCT116 ( p53 - / - ), o HCT116 (
p21 - / - ). Doblar la represin se determin mediante la comparacin de la
cantidad de ARNm normalizado en ausencia de la cantidad de ARNm en
presencia de nutlin-3a. B y C, la lnea de clulas de colon EB1 humano tiene
de p53 inducible por zinc y se trat con cinc durante 7 horas o tratado de
forma simulada. Protena / cromatina enlaces cruzados se forman por

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p53 regula negativamente la transcripcin de la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2

tratamiento con formaldehdo. La presencia de PDK2 promotor en complejo
con cualquiera de E2F1 (B) o H4-acetil histona (C) se determina mediante
inmunoprecipitacin de los complejos protena / de la cromatina, seguido por
cuantificacin de PDK2 secuencias promotoras en tiempo real por PCR.

Para la prueba de la importancia de E2F1 y la desacetilacin de histonas en PDK2

genmico, se realiz un experimento de chip en las clulas EB1, que reprimen PDK2
transcripcin de una manera dependiente de p53 ( . Fig. 3B ). E2F1 unida menos bien a
la PDK2 promotor de p53 cuando se induce con el zinc ( . Fig. 6B ). Esto sugiere que la
activacin de la transcripcin E2F1 de PDK2 est bloqueada por p53. Por otra parte,
cuando EB1 se trata con zinc, la acetilacin de la histona H4 disminuy, lo cual es
consistente con la cromatina ms compacta y disminucin de la transcripcin ( . Fig. 6C
). Compactacin de la cromatina puede liberar E2F1 de la PDK2 promotor.
Por ltimo, para determinar las consecuencias funcionales de la regulacin a la baja de
PDK2 por p53, hemos diseado una lnea celular en la que la expresin PDK2 est bajo
control de un promotor, por CMV , que es menos reprimida por p53. La nueva lnea
celular, MCF7 CL.17, expresa niveles casi fisiolgicos de PDK2 en la presencia de
DMSO, pero conserva su expresin PDK2 incluso en la presencia de nutlin-3a ( Fig.. 7A
). Luego ensay la produccin de lactato. Como se muestra en la figura. 7B , la
produccin de lactato por MCF7 disminuy ms de 2 veces tras el tratamiento nutlin-3a,
pero la produccin de lactato fue restaurada en su mayora MCF7 CL.17. La produccin
de lactato no disminuy en absoluto en otra lnea celular, MCF7shp53, en el que la
expresin de p53 es derribado por el ARN corto horquilla. Estos datos mostraron que p53
disminuye la produccin de lactato por MCF7 por la disminucin de la transcripcin de
PDK2.
Figura 7.
Las consecuencias funcionales de
regulacin a la baja de PDK2 por
p53. Una, MCF7 CL.17 fue
diseado para expresar de forma
estable PDK2 bajo el control del
CMV promotor como se describe
en Materiales y Mtodos. MCF7 y
MCF7 CL.17 se trataron con
DMSO o 10 mmol / L de nutlin-3a
Ver una versin ms grande:
durante 16 horas y se lisaron. El
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lisado se utiliz para generar una
transferencia de Western contra
PDK2 y -actina, como se
muestra. B, MCF7, MCF7 CL.17, y MCF7shp53 se trataron con DMSO o 10
mmol / L de nutlin-3a durante 16 horas, seguido por el ensayo de lactato en
los sobrenadantes de cultivo de tejidos. Se muestra disminucin veces en la
produccin de lactato tras tratamiento nutlin-3a. Las diferencias en la
disminucin veces entre MCF7shp53 y MCF7, y entre MCF7 CL.17 y MCF7,
estaban decididos a ser estadsticamente significativa ( P valor inferior a 0,01)
por el de Student de dos colas t prueba. C, MCF7 o MCF7 CL.17 se trataron
con DMSO o con 10 mmol / L de nutlin-3a durante 72 horas y despus
lisadas. Transferencias de Western contra caspasas procesados
7 o 9, o
control de carga--actina se muestran.

Una posible consecuencia de la disminucin de la expresin PDK2 se incrementa la

fosforilacin oxidativa, que puede producir ROS a travs de la cadena de transporte de
electrones ( 5 , 22 ). ROS puede daar el ADN, y un importante mecanismo de supresin
tumoral por p53 es la induccin de la apoptosis en presencia de alta ROS. De hecho,
PDK2 ha sido previamente demostrado para reducir ROS y para disminuir la apoptosis (
23 ). Decidimos probar si la apoptosis dependiente de p53 requiere regulacin a la baja
de PDK2. Debido MCF7 no expresa caspasa 3 ( 24, 25 ), no hemos podido ver los
eventos finales de apoptosis en esta lnea celular. Sin embargo, un paso temprano clave
en la apoptosis es el procesamiento proteoltico de procaspases 7 y 9, que son aguas
arriba de la caspasa 3 ( 26 ). Cuando tratamos MCF7 con nutlin-3a, transformacin de las
caspasas 7 y 9 ocurrido ( . Fig. 7C ). Por el contrario, las caspasas 7 y 9 no se procesan
cuando MCF7 CL. 17 se trat con nutlin-3a. Estos datos indican claramente que los
eventos apoptticos tempranas no ocurren a menos que p53 puede regular negativamente
la transcripcin de PDK2.

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p53 regula negativamente la transcripcin de la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2

Discusin
Un papel de p53 en la regulacin negativa del efecto Warburg se supuso anteriormente,
principalmente debido al efecto de p53 en la transcripcin de genes implicados en la
glicolisis y la fosforilacin oxidativa. Por ejemplo, p53 activa la transcripcin de proyecto
TIGAR, cuyo producto gnico puede reducir la cantidad de fructosa 2/6 bifosfato ( 11 ),
que es un regulador positivo de enzimas glucolticas fosfofructoquinasa y piruvato
quinasa. P53 tambin disminuye la transcripcin de las isoenzimas del transportador de
glucosa 1 y 4 ( 12 ). Pero el efecto preciso de p53 en la gluclisis aerbica no era cierto
porque algunas actividades de p53 probablemente aumentaran la gluclisis. Una
actividad clave requerida para la absorcin de glucosa, hexoquinasa-2, es en realidad
upregulated por p53 ( 13 ). El glicoltica mutasa enzima fosfoglicerato tambin est
regulada positivamente por p53 ( 14 ).
Se demuestra que la activacin de p53 causa una disminucin en la produccin de
lactato por la lnea celular de carcinoma de mama humano MCF7. Debido a que la
produccin de lactato en presencia de oxgeno es el paso clave en la gluclisis aerbica,
este estudio proporciona un enlace crtico entre la p53 y la regulacin a la baja del efecto
Warburg. Tambin ponen de manifiesto que la activacin de p53 en los resultados de una
mayor cantidad de la forma activa, no fosforilada del PDC y cantidades reducidas de
PDK2, un importante quinasa del PDC. Por ltimo, se muestra que la adicin de nuevo
PDK2 bajo el control de un promotor heterlogo impide p53 de la regulacin negativa de
la produccin de lactato. PDK2 ha sido siempre visto como el guardin principal sobre el
metabolismo de piruvato. Por lo tanto p53, que ha sido llamado el controlador de acceso
celular para el crecimiento y la divisin ( 27 ), parece regular a la baja el efecto Warburg
mediante el control de la expresin del controlador de acceso de metabolismo del
piruvato.
Anteriormente, se pensaba que la actividad PDK2 para ser modulados de una manera
estrictamente postraduccional, a travs de la inhibicin por piruvato o la activacin por la
acetil-CoA ( 16 ). El nuestro es el primer estudio que sugieren que el control de la
transcripcin PDK2 tambin puede ser importante en el metabolismo de piruvato. P53
disminuye la cantidad de PDK2 la transcripcin. En experimentos separados, se muestra
que se requiere para p21 dependiente de p53 represin de tanto una fusin
transcripcional PDK2 ( . Fig. 5B ) y genmico PDK2 ( Fig.. 6A ). E2F1 puede activar la
transcripcin de Pdk2/luciferase ( . Fig. 5C ) y tambin se une a la activa, pero no a la
forma menos activa de la genmica PDK2 promotor ( . Fig. 6B ). Finalmente, un inhibidor
de histona desacetilasa reduce la represin de la fusin Pdk2/luciferase ( Fig.. 5D ),
mientras que la acetilacin de la histona H4 en el PDK2 promotor disminuye tras la
activacin de p53 ( . Fig. 6C ). Estos datos apoyan el modelo en la figura. 5A , en la que
p53 previene la activacin de la transcripcin PDK2 mediante la inhibicin de un activador
de E2F. Aunque el modelo de la figura. 5A sugiere que otra protena clave supresor de
tumores, Rb, tambin puede estar implicado en el efecto Warburg travs del control sobre
PDK2 transcripcin, no apareci directamente el papel de Rb en PDK2 transcripcin.
Sigue siendo posible que uno de los otros miembros de la familia de la protena del
retinoblastoma miembro, p107 o p130, es ms importante que Rb en PDK2 la
transcripcin; Alternativamente, un mecanismo independiente de la familia de protenas
Rb no se puede descartar en este momento. Sin embargo, es de destacar que el control
Rb/E2F sobre otro Pdk gen, PDK4 , se ha demostrado ( 28 ).
Adems de disminuir la transcripcin PDK2, p53 tambin puede disminuir la actividad
PDK2 indirecta y despus de la traduccin. Por ejemplo, en ratones p53 promueve la
expresin del transportador de tiamina ( 29 ). Mayor absorcin de tiamina pirofosfato de
tiamina aumenta celular, que es un cofactor de la PDC y que es tambin un inhibidor de
la fosforilacin de PDC PDK2 ( 30 ). Adems, la acetil-CoA activa PDK2, as que ms
rpida conversin de acetil-CoA en citrato durante el ciclo del cido ctrico puede servir el
mismo papel que la regulacin negativa PDK2 transcripcin. Esto se podra lograr
mediante la aceleracin de pasos intermedios de la oxidacin de piruvato. En efecto, en
el msculo de p53 parece controlar la gluclisis aerbica a travs de la regulacin
positiva de SCO2 ( 31 ), que codifica una protena que ayuda en el montaje del
componente de la oxidasa del citocromo C de la va de la fosforilacin oxidativa. Actividad
SCO2 Superior puede disminuir acetil-CoA y inactivar PDK2. En el hgado, p53 tambin
puede regular al alza la glutaminasa-2, lo que puede acelerar el ciclo del cido ctrico
mediante la conversin de la glutamina en el ciclo del cido intermedio -cetoglutarato
ctrico ( 32 ). As, el mecanismo por el cual la p53 regula a la baja la actividad PDK2
puede diferir dependiendo del tipo de clula y tejido, as como las fuentes de carbono
disponibles.
El laboratorio de Michelakis ha demostrado previamente que PDK2 es importante para el
crecimiento de algunas lneas celulares humanas, y que un inhibidor de PDK2, cido

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p53 regula negativamente la transcripcin de la piruvato deshidrogenasa quinasa PDK2

dicloroactico (DCA), puede bloquear el crecimiento de tumores en modelos de

xenoinjerto ( 23 ). Por otra parte, el DCA puede haber disminuido la progresin de los
glioblastomas en un pequeo ensayo en humanos de 5 pacientes ( 33 ). Nuestro trabajo,
que une PDK2 a factores clave de cncer tales como p53, p21, E2F1, y, posiblemente,
Rb, refuerza la idea de que PDK2 juega un papel en la biologa del tumor. Otras
isoenzimas Pdk se han relacionado con los genes del cncer. Como se mencion
anteriormente, PDK4 puede ser activado por la va Rb/E2F1 ( 28 ). PDKs 1 y 3 se activan
por HIF-1 ( 34-36 ), que puede permitir que los tumores para controlar el metabolismo de
la glucosa en condiciones de limitacin de oxgeno. Por estas razones, parece probable
que la fosforilacin de la PDC llegar a ser importante en la formacin de tumores o la
progresin.
El control sobre la expresin PDK2 puede ser central para algunos aspectos de la
biologa de p53. En primer lugar, la induccin de la apoptosis no se produjo cuando la
p53 no podra regular negativamente PDK2 ( Fig.. 7C ). Se cree que el dao del ADN para
activar la p53 para activar la transcripcin de genes que producen ROS, que causan ms
dao en el ADN que desencadena an ms la actividad de p53, creando as un bucle de
realimentacin positiva que eventualmente conduce a la apoptosis ( 37, 38 ). Regulacin
a la baja de PDK2 por p53 puede ser suficiente para producir ROS en los niveles
requeridos para la apoptosis. En segundo lugar, otro papel de p53 es disminuir la
metstasis tumoral mediante la prevencin de la invasin (revisado en Muller y colegas;.
Ref. 39 ). Por el contrario, la secrecin de lactato, que acidifica el microambiente del
tumor, se cree que aumenta la invasin ( 40, 41 ). Por lo tanto, la capacidad de disminuir
la produccin de lactato a travs de la represin de PDK2 puede ayudar a explicar el
efecto de p53 sobre la metstasis.

Divulgacin de potenciales conflictos de inters

No se revelaron los posibles conflictos de inters.

Reconocimientos
Los autores agradecen a la Fundacin Raymond y Beverly Sackler para la financiacin de
este estudio y tambin agradecen a Arnold Levine, Robert Harris, y Evan Vosburgh de
valiosos consejos, y Angie Teresky y Rich Clausen para la asistencia tcnica.
Los gastos de publicacin de este artculo fueron sufragados en parte por el pago de
cargos por pgina. Este artculo debe ser, por tanto, por la presente marcado anuncio de
conformidad con 18 USC Seccin 1734 exclusivamente para indicar este hecho.
Recibido 17 de abril 2011.
Revisin recibida 10 de noviembre 2011.
Aceptado 21 de noviembre 2011.
2011 Asociacin Americana para la Investigacin del Cncer.

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