I) Introduccin

Las bacterias son seres microscpicos, existe un grupo que son beneficiosas
para la vida del hombre pero tambin otras pueden llegar a ser muy
perjudiciales. No solo por ello es que su estudio es muy importante sino porque
tambin forman parte de los ciclos biolgicos y geolgicos que rigen la vida en
nuestro planeta y sin ellos la vida no se sustentara.
Segn Tortora ( 2007), una gran cantidad de microorganismos son casi
incoloros cuando se les observa a travs de un microscopio ptico estndar,
por ello a menudo es preciso prepararlos para la observacin y una de las
maneras de hacerlo consiste en someterlos a tincin. Ello significa
simplemente colorear los microorganismos con un colorante que destaque las
estructuras. Sin embargo antes de teir los microorganismos se les debe de
fijar (adherir) al portaobjetos, lo cual se realizar pasndolo varias veces sobre
la mecha de un mechero Bunsen.
En el presente trabajo, lo primero que haremos es la preparacin que se debe
de realizar para fijar una muestra en la lmina de vidrio, pues cada
procedimiento por separado es muy importante. Y por ltimo, ya fijado las
muestras, procederemos a la tincin simple de las muestras con colorantes
bsicos, utilizaremos tres colorantes: azul de metileno, cristal violeta y fucsina.
Estos ayudaran a teir las partes negativas de las clulas.
II) Objetivos:

Fijar una muestra de bacterias para tincin, es decir, adherir

al
portaobjetos para realizar la tincin.
Aprender el procedimiento a seguir para no contaminar la muestra a
estudiar ni los materiales a usar.
Realizar una Tincin Simple de la muestra con colorantes bsicos.
Observar la muestras de: Bacillus sp, Staphylococcus sp, Escherichia coli
una vez teidas en el microscopio y graficar sus formas.

III) Marco Terico

II.1 Fijacin de Bacterias
Proceso que tiene como finalidad inmovilizar las clulas bacterianas sobre el
portaobjetos para que no sean arrastradas en los procesos posteriores de
teido y de lavado. Aunque es inevitable que la fijacin cause la muerte de los
microorganismos y altere alguna de sus caractersticas, con un procesamiento
adecuado se minimizan estas alteraciones. (Gamazo, 2005)
II.2 Tinciones
Son procedimientos para teir bacterias que normalmente no seran visibles
al microscopio ptico por ser transparentes. Las tinciones se efectan

generalmente sobre bacterias se desecadas o calentadas para coagular

protenas (fijacin). (Prieto, 2006)

II.2.1 Tincin Simple

Es una solucin acuosa de o alcohlica de un colorante bsico. Aunque los
diferentes colorantes se unen de forma especfica a las distintas partes de las
clulas, el propsito principal de una tincin simple es destacar al
microorganismo completo para que se vean las formas y las estructuras
celulares bsicas. (Tortora, 2007)
II.3 Colorantes
En trminos generales los colorantes se clasifican como cidos y bsicos; esta
denominacin no indica necesariamente su pH de reaccin en solucin, sino en
cambio, si una parte significativa de la clula es aninica o catinica.
(Koneman, 2008)
II.3.1 Colorantes Bsicos
Desde el punto de vista prctico, los colorantes bsicos tien estructuras
cidas, como la cromatina del ncleo de las clulas. (Koneman, 2008)
Dentro de estos encontramos al Azul de metileno, Cristal violeta y Fucsina.
II.3.1.1 Azul de Metileno
Es una sal bsica. Un indicador de oxido-reduccin que , cuando se incorpora
en el medio, denota cambios en el potencial de oxidacin-reduccin.
(MacFaddin, 2003)
II.4 Bacillus sp
Son organismos que se dividen exclusivamente a travs de
sus ejes menores. La mayora de estos se observan como
bastones aislados. Algunos bacilos presentan el aspecto
hebras de paja y otros presentan extremos afinados y se
asemejan a cigarros. (Tortora 2007)
II.5 Staphylococcus sp
Son parsitos comunes de los humanos y animales y ocasionalmente causan
infecciones serias. Son organismo aerobios, con metabolismo respiracin
tpica. Son catalasa positivos, lo que permite diferenciarlos de las especies del
gnero Streptococcus y otros gneros de coco Gram, que son relativamente
tolerantes a medios con baja actividad de agua, resistiendo bastante bien

hbitats secos y salinos. Estas tambin son caractersticas

de los Staphylococcus sp los cuales son pigmentados para su
identificacin. (Madigan )
II.6 Escherichia coli
Es un bacilo Gram negativo, con una cadena de ADN, aerobio facultativo,
con flagelos pertricos, pilis y microcapsulas. Forma parte de la flora nativa
intestinal y se encuentra en calidad de saprobio sin causar dao. (Romero
2007)
IV) Materiales y Mtodos
Ejercicio N1
Preparacin de una muestra fija de bacterias para tincin
III.1.1 Materiales:
Lmina porta objeto y cubre
objeto
Mechero de alcohol.
Asa de klle.
Algodn.
Alcohol.
Piseta con agua.

Muestra conteniendo bacterias

Tubo de ensayo N1 con

agar-agar y Staphylococcus
sp
Tubo de ensayo N2 con
agar-agar y Escherichia coli
Tubo de ensayo N3 con
agar-agar y Bacillus sp

 III.1.2 Mtodo:
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.

Desengrasar la lmina porta objeto con alcohol y algodn.

Colocar una gota de agua en la lmina porta objeto.
Prender el mechero de alcohol.
Esterilizar el asa de klle (flamear).
Colocar el tubo de ensayo delante del mechero de alcohol.
Sacar el algodn cuidadosamente del tubo de ensayo (girar el algodn).
Pasar de manera rpida la parte superior del tubo de ensayo por la llama
del mechero.
8. Raspar suavemente la muestra con el asa de klle; sin romper el agaragar y esparcirla en la lmina porta objeto.
9. Antes de tapar el tubo de ensayo se debe de pasar por la llama del
mechero de alcohol, y flamear el asa de klle para dejarla libre de
microorganismos.
10.Secar la lmina porta objeto con la llama del mechero hasta que
adquiera un color blanco.
11.Repetir el mismo procedimiento de fijacin para las tres muestras.

Ejercicio N2
Tincin simple con colorantes bsicos
III.2.1 Materiales:
Lminas
fijadas
de
microorganismos.
Aceite de inmersin (aceite de
cedro).
Colorantes bsicos
Azul de metileno
Cristal violeta
Carbolfucsina
Soporte para tincin.
Piseta con agua.
Papel secante.
III.2.2 Mtodo:
1. Cubrir cada lmina fijada de microorganismos con unas gotas del
colorante adecuado: Staphylococcus
sp
con azul de metileno,
Escherichia coli con Cristal violeta y Bacillus sp con Carbolfucsina.
2. Colocar cada una de las lminas en el soporte para tincin.
3. Esperar el tiempo adecuado para cada colorante, en el caso del azul de
metileno 60, cristal violeta 10 y carbolfucsina 5.
4. Terminado el tiempo de teido, lavar con el agua de la piseta.
5. Secar la lmina con el papel secante y agregar una gota de aceite de
cedro en la parte teida.

6. Llevar al microscopio y observarla con un G.A = 1000X , tener en cuenta

que la distancia de trabajo entre la muestra y el lente objetivo es cero,
es decir, se encuentra en contacto.
V) Resultados

Gnero: Staphylococcus sp
G.A: 1000
Forma: cocos (esfrica)
Agrupacin: Racimo
Color: Azul de metileno

Gnero: Escherichia
coli
G.A: 1000
Forma: Cocobacilo
Agrupacin: Ninguna
Color: Cristal violeta

VI) Discusiones
-

Gnero: Bacillus sp
G.A: 1000
Forma: Abastonada
(bastoncillo)
Agrupacin:
Streptobacilo
Color: Carbolfucsina

Segn William (1965), afirma que si el espacio comprendido entre el

objetivo y el cubre-objeto est ocupado por aire, los rayos ms
divergentes sern refractados tan lejos que no penetraran en el objetivo,
con lo que la imagen perder definicin , es por esta razn que en la
presente practica se requiri de un aceite especial para llenar el espacio
entre el lente y la muestra, para impedir la desviacin de los rayos
luminosos, segn este autor este aceite no debe ser desecante para
evitar que se endurezca durante sobre el objetivo o cubre objetos
cuando estos tardan en limpiarse, siendo el aceite de cedro el ms
conveniente para llevar a cabo esta prctica.


- Segn William (1965): Las especies bacterianas no conservan una
forma definida con carcter permanente. De hecho en algunos
microorganismos pueden observarse tales cambios morfolgicos que, en
determinadas circunstancias, resulta casi imposible su identificacin.
Semejantes variaciones son causadas por el ambiente impuesto al
microorganismo por el investigador. Este es el caso de la Escherichia
coli, la cual al ser inoculada en un medio que contenga un agente tensoactivo, como el cristal violeta, las clulas que normalmente tienen forma
de bastoncillo, aparecen a la vista como filamentos de mucha mayor
longitud. Por otra parte, si se eleva la tensin superficial demedio por
adicin de cloruro clcico, pueden aparecer esfricas. Es por esta razn
que en la prctica realizada, se observ a esta bacteria
como
cocobacilo.

- Segn Merchant (1975), describe a los grmenes pertenecientes al

grupo de los bacilos aerobios y esporulados son cilndricos,
generalmente flagelados, crecen en cadenas y forman colonias grandes
e irregulares en los medios slidos. Asimismo, describe a la Escherichia
coli como un bacilo corto de 0,5 micras de ancho por 1-3 micras de
largo, variando desde formas coloides bipolares, hasta largos filamentos.
Frecuentemente se presenta aislado, pero no son raras las cadenas
cortas. Mientras que el gnero Staphylococcus sp tiene forma esfrica y
ovoide, agrupados generalmente en racimos, aunque en los medios de
cultivo se ven con frecuencia parejas y cadenas cortas.

- Segn Carter (1985), las formas bacterianas bsicas son tres: bastones
rectos(bacilos), esferas(cocos) y espirales o bastones curvos
( espiroquetas, espirilo y Vibrio). Existe una variacin considerable en
estas formas bsicas, Con frecuencia se observan formas ovoides,
filamentosas y cocobacilares, este es el caso de la Escherichia coli
observada en la prctica de laboratorio.
Carter afirma tambin que los cocos se encuentran formando diferentes
agrupaciones de acuerdo a los planos en que se produce su divisin, los
Staphylococcus sp se agrupan en forma de racimos tal y como se
observ en laboratorio.

VII) Conclusiones
1. Se concluye que la fijacin de una muestra de bacterias es importante
para la realizacin de una buena tincin y posterior observacin en el
microscopio, ya que esta operacin pretende que las bacterias se
adhieran al portaobjetos por coagulacin de sus protenas plasmticas
mediante la accin del calor.
2. Se concluye que es preferible una tincin simple, ya que esta operacin
ofrece orientacin sobre la presencia, concentracin, morfologa y modo
de agrupacin bacteriana.

3. Se concluye que el colorante a usar para la tincin de la bacteria

Eschericha coli es el cristal violeta, debido a su rpida reaccin y a que
esta bacteria contiene abundante materia orgnica lipidia en su cpsula.

VII) Bibliografa

Caro C., Castaeda L., Castro V., Castro M., Mansilla R., Opisso J. y
Quintana A, 2010 , Manual de Prcticas: Biologa General,
Lima
Per.
Prieto Prieto, Rosa Jos. Microbiologa en ciencias de la Salud. Segunda
Edicin. Editorial Elsevier. Ao 2006. Capitulo 2: La clula bacteriana. Pg
9.
Gamazo, Lpez- Goi, Daz. Manual prctico de Microbiologa. Tercera
Edicin. Editorial Masson.
Ao 2005. Capitulo 3: Observacin de
Microorganismos. Pg 24
Romero Cabello. Microbiologa y parasitologa humana. Tercera Edicin.
Editorial Medica Panamericana. Ao 2007. Pg. 753

VIII) Cuestionario
1.- Cules son las asociaciones ms frecuentes en bacterias?
Se consideran: cocos, bacilos, espirilos y espiroquetas.
1. Cocos o micrococos: Incluyen las bacterias de tamao variable, cuya
forma es esfrica u ovoide y generalmente son aerobios estrictos.
Algunas veces estas bacterias tienden a agruparse. Cuando se presentan
asociadas dos bacterias reciben el nombre de diplococos.
En otras ocasiones los micrococos se renen formando grupos de cuatro
elementos dispuestos en cuadro, y se denominan entonces tetracocos,
tetrgenos
o
ttradas.
Las sarcinas, son especies de bacterias cocales que se dividen en tres
planos perpendiculares para formar paquetes de ocho, diecisis, treinta y
dos, o ms micrococos. Son anaerobios obligados y cido-tolerantes por lo
que pueden crecer en un pH inferior a 2 despus de fermentar azcar.
Algunas especies como Sarcina ventriculi producen una capa fibrosa y
gruesa de celulosa que se dispone alrededor de la pared celular y funciona
como cemento para mantenerse adheridas entre s.

Cuando los cocos se agrupan en tres, cuatro o ms clulas dispuestas en

forma lineal reciben el nombre de estreptococos que desempean funciones
importantes en la produccin de leche cida y otros fermentos. Para
distinguir los estreptococos no patgenos de las especies patgenas, el
gnero Streptococcus presenta tres divisiones: Lactococcus, importante en
la industria lctea y Enterococcus que son principalmente de origen fecal.
Algunos estreptococos se envuelven en una cubierta gelatinosa y
constituyen una forma de agrupacin que recibe el nombre de leuconostoc,

que pueden ser heterofermentativos, y descomponen el citrato para

obtener diacetilo y acetona.

Otro tipo de asociacin que utilizan las bacterias cocales es la

formacin de agregados compactos denominados zoogleas, en las
cuales se encuentran los microorganismos includos dentro de una
envoltura gelatinosa.
2. Bacilos: Son bacterias que tienen forma de bastoncillo, se pueden
encontrar en grupos de dos denominados diplobacilos, o en cadenas
similares a las que presentan los cocos por los que se les llama
estreptobacilos.
El gnero ms representativo de esta morfologa lleva el nombre
Bacillus, el cual se caracteriza por la formacin de endosporas.
Son tiles en la produccin de antibiticos tales como bacitracina,
gramicidina y polimixina, entre otros. Tambin se han utilizado como
biocontroladores en la erradicacin de ciertas plagas en cultivos de
importancia econmica, de las cuales son parsitos.
3. Espirilos: Son bacterias bacilares, helicoidales con movilidad flagelar,
que se clasifican dentro de las Gram negativas. Los espirilos con muchas
vueltas a pesar de su semejanza morfolgica con las espiroquetas, se
diferencian de ellas porque poseen flagelos bacterianos tpicos externos
mientras las espiroquetas poseen flagelos periplsmicos o filamentos
axiales internos.
4. Espiroquetas: Son bacterias filiformes, flexibles, muy largas, que
presentan forma de espiral con diez o ms vueltas. En algunas ocasiones
con un flagelo en cada extremo (como por ejemplo el espirilo
responsable de la sfilis: Treponema). Habitualmente se hallan en
ambientes acuticos o en el cuerpo de animales. El cilindro
protoplsmico de estas clulas se encuentra rodeado por una membrana
de tres capas conocida como cubierta celular externa, adems poseen
una estructura nica que le permite la movilidad llamada filamento axial,
compuesta de un flagelo que atraviesa el cuerpo celular y se sita entre
la pared delgada flexible y la envoltura externa. Las espiroquetas
pueden encontrarse como parsitos en humanos mientras otras viven
libres en agua o madera.
2. En qu rango de tamaos se definen las bacterias?
El micrmetro (m) es la unidad de medida que se utiliza para
determinar el tamao bacteriano, equivale a 1/1.000 mm o 1/25.00
pulgadas. La mayora est dentro de un rango aproximado de 0.5 a 2.0
m de ancho y 1 a 10 m de largo. Hay especies bacterianas que
pueden medir mucho ms, como las formas alargadas que pueden estar
en el rango de 2 a 100 m de longitud a ms.
3. Cules son las formas bacterianas ms frecuentes?

Bacilos (bacterias con forma de barras): Con forma de barras o varillas,

los bacilos suelen ser bacterias de tipo Gram positiva o negativa.

Cocos (bacterias con forma de esferas): Con su caracterstica forma

esfrica, las bacterias conocidas como cocos tienen la capacidad de vivir

como clulas individuales o bien de enlazarse hasta forman cadenas y
racimos.

Espirilos (bacterias con forma de espirales): Los espirilos, como bien nos

indica su nombre, poseen una marcada forma de espiral. stas son bacterias
Gram negativas y terribles para la salud.
4. Qu diferencia a una tincin directa de una tincin negativa?
Tincin Directa: utiliza solo un colorante, el cual debe ser bsico para
que la clula bacteriana se tia. Permite demostrar la morfologa general
de una clula de manera rpida, en su conjunto se observarn del color
de colorante empleado. Los ms empleados son cristal violeta, azul
metileno y fucsina fenicada.
Tincin Negativa: Este mtodo es ideal para observar inclusiones
refrctiles que no se tien fcilmente, tales como grnulos de azufre,
acido poli--hidroxibutrico, esporas o capsulas bacterianas. Por otra
parte, no es adecuado para medir bacterias, pues estas generalmente se
observarn de mayor tamao.
Para hacer esta tincin se impregna una preparacin de bacterias con
tinta china (suspensin coloidal de carbn) o nigrosina. Las partculas de
carbn no penetran la clula bacteriana, sino que tien su entorno y la
bacteria aparecer como un cuerpo refrctil sin teir. Generalmente se
combina esta tincin con una simple.
5.-Qu importancia le atribuye a las diferencias en reactividad
de los colorantes empleados?
Casi todos los colorantes empleados son sales, compuestos formados
por iones cargados electrnicamente. El azul de metileno y el cristal
violeta, usados en la experiencia, son colorantes bsicos los cuales el
agente que tie es el ion cargado positivamente, y se combinan con los
componentes cidos de la clula como ADN y ARN. Es decir se combinan
con los componentes celulares en funcin a sus respectivas cargas por lo
tanto los factores como fuerza inica, composicin del medio,
temperatura y pH; afectan las tinciones y podran ser causantes de
alteraciones de no preverlos.
6. Cul es la funcin del aceite de cedro?

 El aceite de cedro (aceite de inmersin) permite obtener una imagen

de gran tamao y al mismo tiempo de gran nitidez. Cuando se trabaje
con un lente de inmersin la distancia de trabajo ser mnima.
7. Cul es la funcin del lente objetivo de inmersin?
El lente objetivo de inmersin produce el aumento de las imgenes de
las muestras, por lo tanto se hallan cerca de las mismas. Para observar a
travs de este objetivo es necesario colocar una gota de aceite de cedro
entre el objetivo y la preparacin, de manera que la lente frontal entre
en contacto con el aceite de cedro.