4.4.

-Sistema ptico del microscopio

Los microscopios modernos estn diseados para proporcionar imgenes aumentadas y ntidas de los especmenes que se observan. Los
componentes pticos estn colocados en una base estable que permite un intercambio rpido y un alineamiento preciso. El sistema ptico est
constituido por dos juegos de lentes: El objetivo y el ocular.

4.4.1.-Los objetivos
Representan el componente ptico ms importante del microscopio. Su principal funcin consiste en colectar la luz proveniente del espcimen y
proyectar una imagen ntida, real, invertida y aumentada hacia el cuerpo del microscopio.
Constituyen un sistema ptico formado por una o varias lentes, las cuales deben estar centradas y los ejes pticos de cada una deben coincidir
exactamente para formar el eje ptico del sistema. Sus lentes estn hechas a partir de cristales (espatos, fluorita, entre otros) con un alto grado de
calidad y funcionamiento; su precio depende del poder de aumento, resolucin y de la correccin de las aberraciones. Muchos fabricantes elaboran
objetivos que pueden ser intercambiados y empleados en microscopios de otras marcas comerciales.
Clasificacin:
Tomando en cuenta el grado de correccin de las aberraciones hay dos categoras de objetivos para el microscopio, los objetivos acromticos y los
objetivos apocromticos. En cada categora se distinguen an dos grupos, los objetivos secos y los objetivos de inmersin (64, 65, 66):
Objetivos acromticos: Presentan correccin cromtica para la luz azul y roja. Correccin de esfericidad para el verde. Dan mejores resultados con
filtro de luz de color verde y son ideales para microfotografa blanco y negro. Se asume que un objetivo es acromtico cuando no posee ninguna
denominacin.
Objetivos semi-apocromticos: Elaborados a partir de cristales de fluorita. Corrigen para el azul, el rojo y en cierto grado para el verde. La correccin
de esfericidad es para dos colores, el verde y el azul. Dan buenos resultados con luz blanca y estn mejor diseados para la microfotografa en colores.
Objetivos apocromticos: Poseen el ms alto nivel de correccin de aberraciones y por ello, son ms costosos. Presentan correccin cromtica para
cuatro colores (azul oscuro, azul, rojo y verde); correccin de esfericidad para dos o tres colores. Son los mejores objetivos para microfotografa y video
a color. Debido a su alto grado de correccin, estos objetivos poseen mayores aperturas numricas que los acromticos y las fluoritas. Esto puede ser
un inconveniente puesto que el campo de observacin se presenta un poco curvo.
Los tres tipos de objetivos proyectan imgenes con cierta distorsin que se manifiesta como curvaturas y al ser corregidos para este defecto se
denominan plan-acromticos, plan-fluoritas o plan-apocromticos.
Objetivos secos y objetivos de inmersin:
Estos objetivos difieren entre s por la naturaleza del medio interpuesto entre el cubre-objeto de la lmina histolgica y la lente frontal del objetivo. En
los objetivos secos el medio interpuesto es el aire cuyo ndice de refraccin (n=1) es muy diferente del ndice del vidrio porta y cubre-objeto (n=1,5). Por
el contrario, en los objetivos denominados de inmersin el medio que separa al cubre-objeto de la lente frontal del objetivo es un lquido cuyo ndice de
refraccin es lo ms prximo al del vidrio. Este lquido puede ser agua destilada (n=1,33) o mejor an aceite de cedro, que posee un ndice de
refraccin (n=1,515) casi idntico al del vidrio.
La ventaja de los objetivos de inmersin consiste en la disminucin o eliminacin de la refraccin de los rayos luminosos entre el aire y el objetivo, en
consecuencia la luminosidad de la imagen est aumentada, mientras que en los objetivos secos, est disminuida. El empleo de la inmersin aumenta el
ngulo de apertura del objetivo y permite mayor resolucin gracias a la captura de una mayor cantidad de rayos luminosos refractados (11, 64) (ver fig.
3-5) y solo puede utilizarse con objetivos de mayor aumento.

ptica finita y ptica infinita:

La microscopia de luz o fotnica ha experimentado cambios radicales en sus sistemas pticos en los ltimos aos. El tubo que soporta tanto el revlver
por un extremo, como el ocular por el otro, se confeccionaba con una determinada longitud y los fabricantes elaboraban objetivos que funcionaban para
esa longitud (longitud finita) que fue estandarizada a 160mm y en algunos casos (Leitz) a 170mm. En muchos modelos de microscopios modernos el
tubo no es rectilneo y los rayos de luz transmitidos desde el objetivo hacia el ocular son desviados por prismas, especialmente en los microscopios
trinoculares para fotografa. Emplear objetivos diseados para una determinada longitud de tubo en otro microscopio que no corresponda produce
incremento en las aberraciones de esfericidad, ocasionado por una longitud de tubo diferente.
Los microscopios modernos poseen un ensamble complejo de lentes, espejos y prismas que transmiten la luz desde el objetivo al ocular y actualmente
casi todos los fabricantes estn elaborando microscopios que puedan aceptar objetivos diseados para realizar una correccin infinita. Tales objetivos
proyectan una imagen al infinito la cual es captada por otra lente que se introduce en el tubo y que a su vez la proyecta al punto focal del ocular. Los
objetivos con esta correccin poseen el smbolo infinito grabado en la parte externa. Los sistemas corregidos al infinito son significativos porque
corrigen la aparicin de imgenes fantasma que con frecuencia se observa en microscopios anteriores, no obstante estos nuevos modelos son de
mayor tamao (66) (fig. 4-4).

Figura 4-4.-Esquema que muestra el principio de los objetivos con correccin al infinito. Modificado de Microscope objetives.

Olympus Microscopy Resource Center (66).

Estructura de los objetivos:

Generalmente es un tubo cilndrico que contiene en su interior un revestimiento anti-reflejos y las diversas lentes colocadas en serie y alineadas (fig. 45). En la parte externa posee grabadas las especificaciones y caractersticas.

Figura 4-5.-Tipos de objetivos. (a) Objetivo acromtico que contiene una lente frontal y dos pares internos, (b) objetivo semi-apocromtico o fluorita,
con cuatro pares de lentes y (c) objetivo apocromtico que contiene un triplete, dos pares, un menisco y una lente esfrica frontal. Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical
Microscopy (15).

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Nomenclatura de los objetivos:

La identificacin de las propiedades individuales de los objetivos es posible gracias a la nomenclatura grabada en la parte exterior y contiene todas las
especificaciones necesarias para su uso apropiado (11, 15). La minuciosa informacin, generalmente en el idioma ingls, puede contener (fig. 4-6):
Nombre del fabricante: Casa comercial
Aumento linear: Con un rango que puede ir desde 0,5x hasta 200x
Correcciones pticas: Achro, Achromat (acromticos); Fluar, Neofluar (semi- apocromticos); Apo (apocromticos); Plan, Plano (corrige curvatura de
campo); ICS (infinity corrected system), UIS (universal infinity system); N, NPL (normal field o view plan); CF, CFI (chrome-free, chrome free infinity) y
muchas otras especificaciones cuya nomenclatura depende del fabricante.
Apertura numrica: Es un valor que indica el ngulo de apertura del cono luminoso.
Longitud del tubo: Longitud que separa al objetivo del ocular, usualmente en milmetros (160, 170, 220) o con el smbolo (8) para objetivos con
correccin infinita.
Espesor del cubre-objeto a emplear: Ha sido estandarizada a 0,17mm pero hay diversos espesores lo cual produce aberraciones. Algunos objetivos
poseen un collar de correccin en las lentes internas para realizar la correccin y se denominan CR, Corr, w/corr, o pueden tener una escala graduada
mvil para el ajuste.
Distancia focal: Distancia entre el punto focal y la lente frontal del objetivo, expresada en milmetros.
Propiedades pticas especiales: En caso de objetivos que en ciertas condiciones tienen resultados ptimos (para luz polarizada, contraste de fase,
entre otros).
Rosca del objetivo: La mayora de objetivos estn estandarizados de acuerdo a la Royal Microscopy Society para garantizar una compatibilidad
universal y se designan con las siglas RMS, sin embargo, algunos fabricantes tiene sus propias dimensiones. El dimetro general es de 20mm, pero los
objetivos Leica y Nikon son de rosca ms amplia y slo funcionan en sus microscopios. M25 y M32 designan roscas de 25 y 32 mm respectivamente.
Medio de inmersin: Algunos objetivos ameritan el uso de medios de inmersin y para ello se emplea un cdigo de colores o las abreviaciones Oil, Oel
(aceite); HI (homogeneous immersion); W, Water, Wasser (agua) y Gly (glicerol).
Cdigo de colores: Algunos fabricantes marcan sus objetivos con anillos de colores para facilitar la identificacin del aumento (ver tabla 4-1).

Figura 4-6.-Nomenclatura del objetivo. Las propiedades pticas especiales en este objetivo denotan que puede emplearse en Interferencia de
contraste diferencial (DIC differential interference contrast) y la H significa que puede emplearse en microscopios con platina caliente (heating
stage). Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

Cdigo de color de inmersin

Medio de inmersin

Negro

Aceite

Naranja

Glicerol

Blanco

Agua

Rojo

Especial o multiuso

Cdigo de color de aumento

Aumento

Negro

1x, 2.5x

Marrn

2x, 2.5x

Rojo

4x, 5x

Amarillo

10x

Verde

16x, 20x

Azul turquesa

25x, 32x

Azul celeste

40x, 50x

Azul cobalto

60x, 63x

Blanco, crema

100x, 250x, 200x

Tabla 4-1.-Cdigos de color en los objetivos microscpicos.

Modificado de Davison M, Abramowitz M. Optical Microscopy. (15).

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4.4.2.-El ocular
El ocular (del latn oculus = el ojo) est formado por lentes que generalmente son separadas por un diafragma, montadas en las extremidades de un
cilindro que va introducido en la parte superior del tubo. El ocular sirve para observar la imagen real e invertida que produce el objetivo, ejerciendo dos
funciones:
Aumenta la imagen y la transforma en una imagen virtual, derecha con respecto a la imagen del objetivo, pero aun invertida, con respecto al objeto.
Posteriormente el ojo endereza la imagen.
Aplana y aclara el campo ptico o plano circular en el que aparece el objeto.

La lente superior se denomina lente ocular y es la que produce el aumento de la imagen real del objetivo; la lente inferior tambin se denomina
colectora y es la que aplana y aclara el campo (fig. 4-7).

Clasificacin:
Oculares de Huygens: Empleados con los objetivos acromticos y formados por dos lentes plano-convexas cuya convexidad est dirigida hacia el
objetivo y el diafragma se ubica entre ambas. Tambin denominado ocular negativo porque la imagen se forma entre las dos lentes. Muy comn en
modelos de microscopios antiguos (11).
Oculares de Ramsden: Conocido como ocular positivo, formado por varias lentes unidas entre s y colocadas por encima del diafragma.
Generalmente corrigen aberraciones y funcionan de manera ptima con los objetivos corregidos al infinito (15).
Oculares compensadores: Son oculares que corrigen la diferencia de aumento para los diversos colores (diferencia cromtica de aumento) que se
aprecia en los objetivos apocromticos. No tiene buen rendimiento con objetivos acromticos secos.
Oculares de proyeccin: Posee una lente que permite la proyeccin de la imagen en una pantalla colocada a cierta distancia del ocular, ideal para
dibujar o para exhibicin (11).
Oculares aplanticos: Tienen la propiedad de formar un campo perfectamente plano y el poder de resolucin es igual tanto en el centro como en la
periferia del campo ptico (11).
Oculares peri-planticos: Aplanan la curvatura de campo que se produce con objetivos de mayor aumento. Son semejantes a los oculares de tipo
Huygens pero con una doble lente ocular (11).

Figura 4-7.-Modelos de oculares. (a) Ocular de Huygens, (b) ocular compensador y (c) ocular de Ramsden. Los oculares negativos (a y b) poseen el
diafragma entre las dos lentes (colectora y ocular) y los oculares positivos poseen el diafragma por debajo de las lentes (c). Modificado de Digit Life (67).

Uno de los diseos de oculares ms avanzados es el ocular Periplan (38) (fig. 4-8) que contiene siete lentes que corrigen las aberraciones cromticas,
la curvatura de campo y su empleo ptimo es en combinacin con objetivos de gran poder de aumento.

Figura 4-8.-Diagrama de la constitucin del ocular Periplan. Es un ocular negativo.Modificado de M, Abramowitz M. Optical Microscopy. Olympus Microscopy Resource Center (15).

Los modelos de microscopios ms simples poseen un solo ocular (mono-oculares), sin embargo hay microscopios binoculares y algunos modelos ms
modernos son trinoculares, especiales para la microfotografa. Los binoculares tienen los objetivos dispuestos con una inclinacin de 45 para realizar
la observacin cmodamente.

Campo del microscopio:

Se denomina campo del microscopio al crculo visible que se observa en el ocular. Tambin podemos definirlo como la porcin del plano visible
observado a travs de las lentes. Si el aumento es mayor, el campo disminuye, lo cual quiere decir que el campo es inversamente proporcional al
aumento del microscopio. La forma del campo est determinada por el diafragma fijo del ocular, que generalmente es de forma circular, no obstante el
campo puede ser cuadrado y esta forma es muy til al realizar estudios de coprologa o hematologa, en donde se requiere reconstruir la totalidad del
campo de observacin de la preparacin, lo cual se dificulta con un campo circular clsico al quedar zonas superpuestas (11).

El ocular produce un aumento adicional a la imagen proporcionada por el objetivo. El valor de este aumento est inscrito en la superficie del ocular y
generalmente es de 10x, 12.5x, 15x, 20x o 25x. Otro valor es el nmero de campo que consiste en el dimetro en milmetros de la apertura fija del
diafragma, la cual puede variar desde 18mm hasta 26.5mm.
Los oculares modernos poseen otro tipo de inscripciones que denotan sus caractersticas:
UW: Ultra wide, en oculares que poseen un campo visual muy amplio.
H: Para un alto punto focal del observador que usa lentes durante la observacin microscpica.
K, C, comp: Para oculares compensadores.
Plan-comp: Objetivos que corrigen curvatura de campo y dan campos planos.

Otra de las aplicaciones del ocular consiste en la cuantificacin o medicin de estructuras del espcimen en estudio. En ciertos casos es relevante
conocer el nmero, tamao o dimensiones de las clulas y dems elementos del tejido.
Usualmente se coloca en el plano de la apertura fija del diafragma una pieza circular de vidrio con una escala o gradilla (fig. 4-9), la cual aparece
enfocada y superpuesta a la imagen del espcimen al encontrarse en el plano de formacin de la misma. Los oculares para la medicin poseen un
mecanismo de enfoque mediante rotacin. Se debe calibrar la escala de medicin del ocular con cada objetivo que se use (15). En la actualidad se
puede emplear algn software de computacin para realizar mediciones sobre las imgenes digitales y obtener datos muy precisos, no obstante, el
mtodo ms econmico y de uso ms generalizado es la medicin con los oculares.
En ocasiones se coloca en el diafragma del ocular una estructura filamentosa (alambre, pestaa, cerda) denominada sealador, con la finalidad de
indicar de manera especfica alguna estructura en particular en el campo de observacin. El sealador se aprecia como una lnea oscura que parte del
borde del campo hacia el centro del mismo.
Muchos oculares modernos poseen una copa de goma cuya finalidad es, por una parte colocar los ojos a la distancia correcta de observacin y por
otra, impedir la formacin de reflejos luminosos que dificulten la visualizacin. Algunos microscopios binoculares poseen un mecanismo de enfoque del
ocular que ajusta las dioptras en caso que el observador posea una disminucin de su agudeza visual. El ajuste se realiza por separado tanto para el
ojo derecho como para el izquierdo; de igual manera se ajustan a la distancia interpupilar del observador (usualmente entre 55 y 75 mm).

Figura 4-9.-Microfotografa de un frotis de sangre perifrica en la que se observa un campo rectangular con una escala de divisiones precisas, que en
este caso son en el orden de 1/10 mm. Para determinar el tamao de una clula se cuenta el nmero de divisiones que ocupa y la cifra se divide entre
el aumento del objetivo empleado, dando como resultado un valor que corresponde al tamao de la misma. Si la clula mide 7 divisiones, corresponde
a 7/10mm; si el aumento del objetivo es 100x, se divide 0.7mm:100 = 0.007mm = 7m. Tomado de Kapitza H G. (1997). Microscopy from the very begining. 2 ed. (13).