Guia de Practicas Agresion y Defensa Biologica para Enfermeria y Obstetricia Upn-2014

Agresin y Defensa
GUA DE PRCTICA DE
LABORATORIO
AGRESION Y DEFENSA BIOLOGICA

EQUIPO DOCENTE:
Marzal Melendez Miguel
.@upnorte.edu.pe
Mori Castro, Jaime Alberto
jaime.mori@upnorte.edu.pe
Contreras Contreras Ana
.@upnorte.edu.pe
ROL DE PRCTICAS DE LABORATORIO
Agresin y Defensa
Prctica 01
CONTENIDO
Prologo
Instrucciones Generales
Normas de Bioseguridad
Prctica 02
Reconocimiento del microscopio: observaciones microscpicas.
Prctica 03
Preparacin y esterilizacin de material y medios de cultivo

Preparacin del material para tinciones, tipos de tinciones utilizadas para
Prctica 04
Prctica 05
el reconocimiento de bacterias
Coloraciones Tincin diferencial Gram.
Prctica 06
Medios de cultivo: aislamiento y siembra de bacterias.
Prctica 07
Mtodo de cultivo y descripcin morfolgica de hongos.
Prctica 08
Antibiograma
Prctica 09
Medios de cultivo y observacin de la morfologa de hongos
Prctica 11
Reconocimiento de rganos y tejidos linfoides

A. Reconocimiento de clulas de inmunidad innata y adaptativa.
Prctica 12
Prctica 13
Prctica 14
Prctica 15
FECHA
B. Receptores TCR y BCR

Activacin y mecanismos efectores de Linfocitos T
A. Reaccin antgeno-Anticuerpo.
B. Estructura y funcin de los anticuerpos
A. Vas de activacin del complemento.
B. Inmunidad frente a infecciones
PROLOGO
Los docentes de asignatura esperamos que a lo largo de las prcticas, ustedes vayan
descubriendo la importancia que tiene esta materia en la formacin del mdico.
Durante el desarrollo de las prcticas conocern las distintas relaciones que se
establecen entre los individuos y los agentes infecciosos o nocivos del ambiente en
que vivimos, que conducen al desarrollo de diferentes mecanismos de defensa o que
permiten la instauracin de diversos procesos patolgicos.
Junto con ello aprendern diferentes metodologas que son utilizadas en el diagnstico
inmunolgico de las enfermedades, que permiten el desarrollo de tests o pruebas de
inmunodiagnstico o el diseo de estrategias inmunoqumicas para el estudio y/o
purificacin de macromolculas de inters inmunolgico.
Tambin, esperamos que los contenidos procedimentales aqu impartidos, les brinden
las bases para una mejor comprensin de los temas y de las materias relacionadas
que cursarn con posterioridad.
Agresin y Defensa
Finalmente, creemos necesario aclararles que esta disciplina se encuentra en un

constante avance, por lo que esperamos desarrollar en ustedes una genuina
comprensin de los contenidos enseados. Ello les facilitar la incorporacin en el
futuro de nuevos conocimientos a travs de procesos de formacin permanente.
INSTRUCCIONES GENERALES
1. La Gua de Prcticas est diseada para proporcionar al alumno la ayuda
suficiente para realizar su entrenamiento en el Laboratorio de prcticas de la
asignatura.
2. Es responsabilidad del alumno leer detenidamente la gua de prcticas.
3. Las prcticas son realizadas en el Laboratorio de Prcticas, en fecha y
horario establecidos en el silabo.
4. Es obligacin y responsabilidad del alumno realizar las prcticas de
laboratorio con mandil blanco, limpio y totalmente abotonado o cerrado.
5. Es obligacin y responsabilidad del alumno cumplir con la entrega de
informes y tareas exigidas por los docentes, en fecha y horas establecidas. .
6. Es obligacin y responsabilidad del alumno cumplir con las Normas de
Bioseguridad en todo momento mientras permanezca en el laboratorio de
prcticas.
7. El alumno est obligado a seguir los procedimientos de la Gua de Prcticas
y las directrices que los docentes de prctica dispongan para la ejecucin de
dichos procedimientos.
8. El alumno est obligado a conservar los buenos modales, la cortesa y el
respecto entre los profesionales compaeros y docentes durante las
prcticas.
PRACTICA 01
Agresin y Defensa
NORMAS DE BIOSEGURIDAD
I. OBJETIVOS DE LA PRCTICA
Identificar y debatir las normas generales de Bioseguridad usados durante los

procedimientos rutinarios del laboratorio de inmunologa.
II. INTRODUCCIN
La prevencin de accidentes se apoya en el conocimiento de las situaciones
potencialmente peligrosas y en las conductas apropiadas para afrontarlas. La
imprudencia, ya sea por ignorancia, por negligencia o por exceso de confianza, es la
causa de la mayora de los accidentes en nuestro mbito laboral. Remitindonos al
trabajo de laboratorio, consideramos tres tipos de riesgos: A) biolgico; B) fsico y
mecnico; C) qumico. En este breve compendio, consideramos el riesgo de clase A,
por considerar que los alumnos se han familiarizado con las medidas elementales de
precaucin de las otras dos clases de riesgo, en asignaturas previas.
Las normas de bioseguridad es el Conjunto de medidas preventivas destinadas a
proteger la salud y la seguridad del personal que trabaja en el laboratorio frente a
diferentes riesgos, ya sea por agentes biolgicos, fsicos, qumicos o mecnicos.
Tambin se considera como bioseguridad a las medidas que no pongan en riesgo al
material biolgico a procesar. Las medidas de bioseguridad son responsabilidad de
todos los integrantes de laboratorio, desde el jefe hasta el personal de limpieza. Debe
existir dentro del laboratorio un Manual de Bioseguridad especfico para el rea que
se desarrolla dentro de ese espacio fsico del laboratorio, por ejemplo el rea de
inmunologa debe tener su propio manual de bioseguridad para inmunologa. El
personal antiguo y nuevo debe ser continuamente adiestrado, con evaluaciones y
capacitacin peridica y permanente
1. Agentes de riesgo involucrado frecuentemente con la bioseguridad:
A. Agentes biolgicos:
Virus, bacterias hongos o parsitos que pueden ser transmitidos por ingestin,
inhalacin, inoculacin y por contacto directo a travs de la piel y mucosas.
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B. Agentes fsicos y mecnicos: Temperatura extrema, radiaciones ionizantes,

contactos elctricos o conexiones defectuosas, vidrios resquebrajados de
recipientes daados, tubos rotos.
C. Agentes qumicos: Corrosivos (destruyen y alteran tejidos), Txicos (por
inhalacin, ingestin o contacto directo con mucosas o piel) o Carcingenos,
Inflamables, Explosivos
2. Barreras protectivas
La bioseguridad en un laboratorio clnico se fundamenta en la contencin de los
agentes de riesgo, principalmente infecciosos, para lo cual se disea mtodos seguros
para el manejo de estos agentes; como tcnicas de procesamiento de muestras,
equipos de proteccin personal y diseo del edificio. Existen 2 tipos de barreras
protectivas:
a. Barreras Primarias:
Proteccin personal y del medio ambiente interno contra agentes infecciosos y
qumicos. Necesita buena prctica microbiolgica, proteccin personal, vacunas.
b. Barreras Secundarias:
Proteccin del medio ambiente externo. Requiere de buen diseo de edificacin y
buenas prcticas operacionales.
3. CLASIFICACION DE AGENTES BIOLOGICOS POR GRUPO DE RIESGO
a. Grupo de Riesgo I:
Agentes con escaso riesgo individual y para la comunidad, con poca probabilidad
de provocar enfermedad, no se le conoce factores de virulencia y pueden ser
susceptibles a antimicrobianos. Ejemplos: Acanthamoeba, Bacillus subtillis, B.
cereus, Saccharomyces cerevisiae
b. Grupo de Riesgo II:
Agentes con riesgo individual moderado para el humano, pero limitado para la
comunidad. En el laboratorio pueden causar infeccin grave; pero se cuenta con
medidas profilcticas (vacunas) y de tratamiento eficaces. La propagacin es
limitada, peroes de riego para el personal. Ejemplos: Acinetobacter, Aeromonas,
Bordetella,
Bartonella
bacilliformis,
Blastomyces
dermatiditidis,
Clostridium,
Corynebacterium, Entamoeba hitolytica, E.coli enteropatgena, Leishmania,
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Listeria monocytogenes, Mycobacterium (no clase III), Mycoplasma, Plesiomonas,

Pseudomonas,
Staphylococcus,
Calymmatobacterium,
Campylobacter,
Treponema
Haemophilus,
pallidum,
Legionella,
Vibrio,
Leptospira,
Neisseria, Salmonella typhi, S. Paratyphi A, Shigella, Streptococcus, Yersinis, Virus

Hepatitis B
c. Grupo de Riesgo III:
Proteccin personal y del medio ambiente interno contra agentes infecciosos y
qumicos. Necesita buena prctica microbiolgica, proteccin personal, vacunas
Sin embargo, provocan enfermedad grave en el humano; pero limitada ya que no
se propagan de persona infectada a otra. Ejemplo: Brucella, Coccidiiiodes immitis,
Histoplasma capsulatum, Mycobacterium bovis, Mycobacterium tuberculosis,
Mycoplasma mycoides, Paracoccidiodes brasilensis, Pasteurella mutocida, Taenia
solium, Trypanosoma cruzi, Yersinia pestis.
d. Grupo de Riesgo IV:
Agente de alto riesgo individual y para la comunidad, de propagacin fcil entre
personas directa o indirectamente.
Ejemplos: VIH, virus de fiebres hemorrgicas como de Marburg, Junin, Machupo,
Ebola, Hantavirus y Dengue (serotipo 4)
4. TIPOS DE LABORATORIO SEGN EL RIESGO
a. Laboratorio con nivel de Bioseguridad 1. Laboratorio bsico que trabaja con
agentes infecciosos de bajo riesgo, tipo 1. El Laboratorio no est separado del
edificio. El trabajo se realiza en mesones. Ejm: Centros de salud, hospitales,
universidades, laboratorios de diagnstico.
b. Laboratorio con nivel de Bioseguridad 2. Laboratorio bsico equipado con
cmaras de bioseguridad tipo 2 y otros dispositivos personales para proteger al
operador. reas de trnsito limitado, y se maneja agentes de riesgo 2 y 3. Ejm:
Hospitales regionales, laboratorios de salud pblica (INS)
c. Laboratorio con nivel de Bioseguridad 3. Laboratorio con infraestructura de
contencin, con reas de acceso restringido y equipado con barreras de
contencin para el operador. Se manejan agentes del tipo 3, y el personal es
especializado. Ejm: Laboratorio de diagnstico especializado o de investigacin.
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d. Laboratorio con nivel de Bioseguridad 4. Laboratorio de contencin mxima con

recintos separados o aislados. Con sistemas de apoyo exclusivo, barreras de
contencin, infraestructura diseada para contencin mxima para el personal y
comunidad. Con agentes infecciosos clase IV. Ejm: Laboratorios especializados
para la investigacin.
III. DESARROLLO DE LA PRACTICA
A. MATERIALES
Alcohol, Agujas y jeringas descartables, Bolsas plsticas negras,

naranjas, rojas, Beaker de vidrio y plstico, Colorantes: Azul de metileno
u otro
Curitas, gasas, esparadrapo, Guantes de ltex, Hojas de bisturi
Jabn lquido, Lancetas, Laminas portaobjeto
Recipientes con Hipoclororito de sodio 5%
Pizeta con Hipoclororito de sodio 5%, Micropipetas, Mangos de bistur
Papel Kraff, Papel lente, Papel toalla, Placas de microtitulacin para

ELISA
Puntas de plstico para micropipetas, Solucin salina o buffer fosfato pH

6.5, Agua destilada
B. PROCEDIMIENTO
B.1. Debate de las Normas de Bioseguridad
1. Escucha y preste atencin a las Normas de Bioseguridad que se estn
impartiendo a travs de la conferencia en Power Point sobre Bioseguridad.
2. Durante la charla se debatirn algunas de estas normas y las buenas
prcticas de laboratorio.
3. A continuacin debes reconocer cuales de los elementos mostrados en la
mesa son peligrosos y requieren cuidados especiales para su manipulacin.
Adems debes ser capaza de identificar si en la mesa de trabajo existen
elementos de bioseguridad para contenerlos y manipularlos adecuadamente.
4. Ahora ests listo para realizar tus actividades de aprendizaje.
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III. ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE

1. Lee con atencin las siguientes normas de bioseguridad que se mencionan a
continuacin, las cuales son de uso frecuente durante las prcticas de inmunologa
y en el trabajo rutinario en cualquier rea del laboratorio clnico:
1)
Prohibido el ingreso de personas ajenas al laboratorio.
2)
Usar mandil blanco manga larga y mantenerlo totalmente cerrado durante el

trabajo.
3)
Llevar siempre el cabello recogido o mantenerlo recortado.
4)
Usar guantes de ltex para procesar las muestras.
5)
Toda muestra debe ser considerada potencialmente infecciosas.
6)
Identificar clara y adecuadamente el material que ser procesado.
7)
El operador debe desinfectar el rea de trabajo antes y despus de cada

actividad, con hipoclorito de sodio 5%, fenol 5%, cresol 3% u otro
desinfectante por 30 min.
8)
Descontaminar la superficie de trabajo por lo menos una vez al da o en

casos de salpicadura de material infeccioso.
9)
Descontaminar el material infeccioso antes de eliminarlo. El material

procesado (lquido o slido) debe ser eliminado apropiadamente, y de
preferencia descontaminado antes de salir del ambiente de trabajo. El
material contaminado debe ser esterilizado en cajas de metal con tapa, lo
antes posible.
10)
Identificar el material infeccioso a descartar.
11)
No pipetear nunca con la boca. Usar succionadores de goma o pipeteador

automtico.
12)
Prohibido comer, beber, fumar, guardar y calentar alimentos en el ambiente

de procesamiento de muestras,
13)
Prohibido aplicarse cosmticos.
14)
Prohibido usar el celular en la zona de trabajo, ya sea para contestar o

realizar llamadas.
15)
Los sonidos en el laboratorio deben ser de volumen bajo-moderado.
Agresin y Defensa
16)
Lavarse las manos despus de manipular el material infeccioso, animales o

al salir del laboratorio.
17)
Evitar la formacin de aerosoles al momento de mezclar tubos o centrifugar.
18)
Usar mascarillas cuando sea necesario.
19)
Mantener las manos lejos de la boca, nariz, ojos y cara; estemos con o sin
guantes. (previene la autoinoculacin)
20)
No acumular material procesado o contaminado en el mesn, refrigeradora o

estufa.
21)
Trapear los pisos a diario con trapeador limpio y solucin desinfectante.
22)
Las piezas de vidrio no descartables (pipetas Pasteur, lminas, etc) deben

ser desinfectadas y esterilizadas en depsitos horizontales cuando este
llenos las 2/3 partes, o al final del da de trabajo.
23)
Transportar adecuadamente las muestras, dentro y fuera del rea de trabajo.

Usar gradillas o contenedores plsticos cerrados para el transporte.
24)
Dejar el mandil en el ambiente de trabajo (No pasear con el mandil en otros

ambientes inadecuados como la cafetera, saln, pasillos, etc).
25)
Lavar el mandil apropiadamente y separada de otra ropa de uso comn en la

familia.
26)
Tener conocimiento de los procedimientos mnimos de emergencia y

primeros auxilios, as como de la ubicacin de extinguidores y botiqun de
primeros auxilios.
27)
Uso apropiado de los equipos, y calibracin de los mismos.
2. Debate con tus compaeros y seale solo 10 reglas de bioseguridad, mencionadas

en la pregunta 1, que consideras indispensables para un laboratorio donde se
evalen muestras biolgicas.
3. Debate con tus compaeros si existe alguna regla de bioseguridad que no se
cumpla o se requiera implementar en el laboratorio de prcticas.
4. Debate las siguientes preguntas:
a)
Qu medidas de bioseguridad tomaras para el transporte de muestras de

sangre en tubos de vidrio?
b)
Qu medidas de bioseguridad tomara si un tubo de vidrio con sangre cae al

piso del laboratorio de prcticas y se rompe?
Agresin y Defensa
c)
Qu smbolos de bioseguridad conoces? Sabes su significado? Cules

de estos smbolos eres capaz de reconocer en el laboratorio de prcticas?
SEMANA 02 - PRCTICA 02
MICROSCOPIA
EL MICROSCOPIO es un instrumento ptico de mucha utilidad en la prctica
biolgica; por ello el estudiante debe conocerlo perfectamente, saber manejarlo y
sobre todo, cuidarlo.
OBJETIVOS:
Conocer el microscopio compuesto y sus partes.
Determinar el tipo de imagen que proporciona.
Conocer el manejo y cuidado.
Estimar el tamao de los objetos que se observan en el microscopio.
MATERIALES:
Microscopio compuesto.
Papel milimetrado.
Papel impreso con letras A, E y F mayscula.
Gotero y agua.
Porta y cubre objetos.
Fotografa de revistas.
Agua de pecera o estancada
MICROSCOPIO COMPUESTO.
Es un instrumento sumamente delicado que sirve para observar objetos muy
pequeos, generalmente invisibles a simple vista. Su invento data de 1590 y se les
atribuye a las holandesas ZACARIAS Y JANNSEN:
Partes del microscopio compuesto.
El microscopio compuesto, consta de tres partes:
Sistema mecnico.
Sistema de iluminacin.
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Agresin y Defensa
Sistema ptico.
A.- Sistema mecnico.

Tiene por funcin sostener a los otros dos sistemas y costa de las siguientes
partes:
Base, pie o soporte.
Columna, brazo o agarradera.
Platina.
Tornillos macro y micrmetros.
Pinzas de ajuste al objeto.
B.- Sistema de iluminacin.

Tiene por funcin recoger los rayos de luz y llevarlo hasta el objeto. Formado por:
Focos.
Diafragma
Condensador
C.- Sistema ptico.

Es el sistema que tiene por funcin la formacin de la imagen del objeto.
Ocular.
Objetivos (generalmente 4, contenidos en el revolver)

CUIDADOS DEL MICROSCOPIO.
1. Toda vez que se tenga que trasladar el microscopio de un lugar a otro, se

tomara al mismo de su base con la mano izquierda y de su columna con la
derecha.
2. El sistema ptico solamente se puede limpiar con papel muy suave, especial
para el fin.
3. Colocar la lmina porta objetos sobre la plantilla o masa y ajustarla con las
pinzas, luego tratar de centrar el objeto en el agujero de la plantilla.
4. Terminado el trabajo con el microscopio, ste deber quedarse con el objeto de
menor aumento, con el condensador en su parte ms baja y el sistema de
pinzas en su lugar y con la plantilla en su parte ms baja.
5. Nunca se dejaran ni porta ni cubre objetos en la plantilla del microscopio.
PARTES DEL MICROSCOPIO
A continuacin encontrars las partes bsicas de un microscopio de luz.
A. Ocular Sostiene los lentes que aumentan la magnificacin
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Agresin y Defensa
B. Revlver- Est debajo del cabezal, contiene los objetivos

C. Brazo-Sostiene el tubo
D. Pinzas- Sostienen la muestra a observarse
E. Ajuste grueso o tornillo macromtrico- Mueve el tubo o la platina hacia arriba o
hacia abajo
F.
Ajuste fino o tornillo micromtrico- Enfoca la imagen
Interruptor- Para encender o apagar la fuente de luz
H. Base- Sostiene el microscopio

I.
Fuente de luz
J.
Diafragma- Regula la cantidad de luz que pasa a travs del espcimen
K. Cabezal- Est sobre el revlver, debajo del tubo que contiene el ocular
L.
Platina- Base horizontal que sostiene las laminillas
M. Objetivos-Tienen lentes de diferente magnificacin y pueden rotar de posicin.

N. Tornillo del carril- sirve para mover el carril a la derecha, izquierda, arriba o
abajo
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Agresin y Defensa
BREVE HISTORIA DEL MICROSCOPIO

1608 Z. Jansen construye un microscopio con dos lentes convergentes.
1611
Kepler sugiere la manera de fabricar un microscopio compuesto.
1665 Hooke utiliza un microscopio compuesto para estudiar cortes de corcho y

describe los pequeos poros en forma de caja a los que l llam "clulas".
Publica su libro Micrographia
1674 Leeuwenhoek informa su descubrimiento de protozoarios. Observar bacterias
por primera vez 9 aos despus.
1828 W. Nicol desarrolla la microscopa con luz polarizada.
1849 J. Quekett publica un tratado prctico sobre el uso del microscopio.
13
Agresin y Defensa
1838 Schleiden y Schwann proponen la teora de la clula y declaran que la clula

nucleada es la unidad estructural y funcional en plantas y animales.
1876 Abb analiza los efectos de la difraccin en la formacin de la imagen en el
microscopio y muestra cmo perfeccionar el diseo del microscopio.
1881 Retzius describe gran nmero de tejidos animales con un detalle que no ha
sido superado por ningn otro microscopista de luz. En las siguientes dos
dcadas l, Cajal y otros histlogos desarrollan nuevos mtodos de tincin y
ponen los fundamentos de la anatoma microscpica.
1886 Zeiss fabrica una serie de lentes, diseo de Abb que permiten al microscopista
resolver estructuras en los lmites tericos de la luz visible.
1908 Khler y Siedentopf desarrollan el microscopio de fluorescencia.
1930 Lebedeff disea y construye el primer microscopio de interferencia.
1932 Zernike inventa el microscopio de contraste de fases.
1937 Ernst Ruska y Max Knoll, fsicos alemanes, construyen el primer microscopio
electrnico.
1952 Nomarski inventa y patenta el sistema de contraste de interferencia diferencial
para el microscopio de luz.
1981 Aparece el microscopio de efecto tnel (MET).
PASOS A SEGUIR EN EL USO DE MICROSCOPIO A MENOR AUMENTO.
1. Colocar el objetivo de menor aumento.
2. Iluminar el microscopio, para lo cual se debe bajar el condensador hasta su
parte ms baja; abrir el diafragma y acercar el ojo al ocular. Mediante
movimiento del espejo, buscar un campo visual perfectamente iluminado.
3. Colocar la lmina porta objeto sobre la platina o mesa y ajustarla con las pinzas
luego tratar de controlar, el objeto en el agujero de la platina.
4. Subir la platina hasta que llegue a un tope (aprox. 0.5 cm. del objetivo de
menor aumento.
5. Colocar el ojo en el ocular ir bajando lentamente la platina utilizando el
macromtrico hasta encontrara la imagen del objeto.
6. Trate de aclarar la imagen moviendo el micrmetro.
INVESTIGACIN SOBRE LA ESTIMACIN DEL TAMAO DE LOS OBJETOS QUE
SE VEN EN EL MICROSCOPIO.
14
Agresin y Defensa
1. Corte un pedazo de papel milimetrado y haga un montaje en hmedo. Enfoque

con el menor aumento. Determine el dimetro del campo visual a pequeo
aumento exprselo en micras.
2. Corte un pedazo de fotografa de una revista y haga un montaje en hmedo.
Observe en pequeo aumento cuente el nmero de puntos que pasa por el
dimetro del campo visual ya que cuando el dimetro de su campo visual,
estimo el tamao de puntos y especies en micras.
3. Suma el tamao de todos los puntos y de todos los espacios que pasen por el
dimetro del campo visual. Si la suma corresponde al dimetro de su campo
visual, su estimado es correcto; en caso contrario, estime nuevamente el
tamao de los puntos y espacios.
4. Enfoque la porcin de fotografa con el mayor aumente y cuente el nmero de
nmeros de puntos y espacios que pasan por el dimetro del campo visual, ya
que conoce el tamao de los puntos y de los espacios, determine el dimetro
del campo visual con el mayor aumento.
5. A manera de prctica, determine el dimetro de su cabello. Qutese un cabello
y crtelo en cedazos muy pequeos y trate de unirlos. Haga un montaje en
hmedo y determine su dimetro a mayor aumento.
MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO DE DISECCION.
Es un instrumento ptico constituido por un sistema simple de lentes convergentes
con gran poder de amplificacin.
VENTAJAS DEL MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO DE DISECCION.
Ampliacin directa sin invertir la imagen del objeto observado.
Permite la visin tridimensional del objeto.
La distancia de trabajo es grande, por lo que permite la manipulacin del

objeto problema.
Emplea luz directa o reflejada.
Permite la observacin de objetos que son muy grandes para el microscopio

compuesto.
PARTES DEL MICROSCOPIO ESTEREOSCOPIO DE DISECCION.
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Agresin y Defensa
La base con platina de cristal y pinza de fijacin.
El soporte para el cuerpo del microscopio.
Los objetivos contenidos en un revolver que puede ser una caja o una cpsula
fija.
Los oculares contenidos en los tubos del mismo nombre y que se encuentran
ubicados en el extremo superior del cuerpo.
El tornillo de enfoque ubicado a un costado del soporte.
CUESTIONARIO
1.
Qu entiende por poder de ampliacin?
2.
Qu entiende por poder resolucin?
3.
Con qu factor o factores est relacionado el poder de resolucin?
4.
Qu diferencias encuentra cuando observa un mismo objeto a travs del

microscopio compuesto y del microscopio de diseccin?
5.
Qu entiende por apertura numrica?
6.
Qu tipo de imagen da el ocular y el objetivo?
7.
Cul es la mxima capacidad de resolucin que tiene un microscopio ptico?
8.
Cmo se calcula el nmero de aumento de una muestra?
9.
Explique el fundamento del microscopio electrnico, cuantas clases de

microscopio electrnico se conocen, explique cada uno de ellos.
10. Explique la diferencia que hay entre equipo y material

11.
Esquematice el equipo y material de uso ms frecuente en el laboratorio de

microbiologa
12.
Esquematice lo observado en el microscopio (observaciones microscpicas)

DESARROLLO DE LA PRCTICA
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
Material biolgico:.
Observacin:..
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Agresin y Defensa
Objetivo:..
Aumento:.
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
BIBLIOGRAFA EMPLEADA
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Agresin y Defensa
SEMANA 03 PRCTICA 03
PREPARACIN Y ESTERILIZACIN DE MATERIAL Y MEDIOS DE CULTIVO
I. OBJETIVOS:
El alumno conozca los principios los principios generales de las tcnicas de
esterilizacin de materiales de vidrio y medios de cultivo de uso comn en
microbiologa. Observar el efecto de las condiciones de asepsia en el control
de la contaminacin microbiana en el laboratorio.
II. INTRODUCCIN
Los microorganismos como otros seres vivos, son susceptibles a los cambios
de condiciones ambientales y como se han podido adaptar a estos cambios, se
encuentran distribuidos en una gran diversidad de hbitats incluyendo
condiciones extremas de tipo fsico y qumico.
Los procesos para poder controlar o eliminar la carga microbiana se
encuentran la desinfeccin y esterilizacin. La esterilizacin es un mtodo
fsico o qumico que elimina a los microorganismos tanto en su forma
vegetativa como su forma de espora, es decir, elimina toda forma viviente; en
cambio la desinfeccin es un proceso en generalmente qumico que slo
elimina la forma vegetativa del microorganismo ms no la espora (espora
forma de resistencia del microorganismo).
La esterilizacin utilizando el calor seco y hmedo es el mtodo fsico ms
frecuente utilizado en microbiologa. El calor seco desnaturaliza a las
protenas:
enzimas
presentes
en
la
estructura
del
microorganismo,
destruyendo a los microorganismos por oxidacin, ejemplo al flamear el asa

bacteriolgica se incinera al microorganismo o cuando se utiliza el calor del
18
Agresin y Defensa
horno a 150 180 C por 2 horas para esterilizar material de vidrio, material
quirrgico de uso en microbiologa.
El calor hmedo generalmente se utiliza para esterilizar medios de cultivo,
soluciones y cultivos bacterianos que se van a desechar, el ms utilizado es el
autoclave que proporciona una temperatura de 121C y 15 libras de presin por
15 minutos es un proceso ms que logra que se destruya las forma ms
resistente de una bacteria que es la espora.
Cuando se requiere esterilizar materiales sensibles al calor como vitaminas,
aminocidos etc. Se esteriliza por filtracin en membrana estriles de 0,2
micras de dimetro y para materiales plsticos se usan gases como xido de
etileno o radiaciones gamma. Las superficies generalmente se desinfectan con
radiaciones U.V. o compuestos qumicos de forma lquida como: fenoles,
compuestos
cuaternarios
de
amonio
(alquildimetil
bencilamonio),
formaldehido, alcoholes, algenos y detergentes.

Cada uno de estos procesos presentan ventajas y desventajas en su uso, los
sistemas de filtracin son eficientes y rpidos para la esterilizacin pero solo
se aplica para pequeos volmenes. Los fenoles y compuestos cuaternarios de
amonio son muy efectivos para la desinfeccin de superficies pero son
corrosivos. Los detergentes y alcoholes presentan actividad limitada contra
esporas bacterianas y algn virus por estas caractersticas es considerado
como un desinfectante.
III. DESARROLLO DE LA PRCTICA
MATERIALES
7 tubos de cultivo de 16 x 150 mm con tapn de baquelita
3 tubos de cultivo de 16 x 150 mm sin tapn de baquelita
9 placas Petri de vidrio
3 pipetas de 1 2 ml
3 pipetas de 10 ml y 1 pipeta Pasteur
3 matraces Erlenmeyer de 250 ml
1 parrilla de calentamiento con agitacin
1 autoclave y 1 potencimetro
19
Agresin y Defensa
1 horno de calor seco

1 mechero Fisher
1 incubadora a 35C
1 hisopo estril, algodn y gasa
Papel manila o papel molde para envolver
Caldo nutritivo y Agar nutritivo
Agar papa dextrosa PDA
Medio mnimo de sales
Soluciones amortiguadoras de pH 4 y 7
PROCEDIMIENTO
El profesor explicar los principios generales del trabajo en el laboratorio de
Microbiologa, enfatizando en la desinfeccin de reas de trabajo como la
desinfeccin de medios de cultivo y los materiales usados en el procedimiento
microbiolgico. Har demostraciones para que el alumno aprenda a envolver y
utilizar el material de uso frecuente en el laboratorio de Microbiologa.
PREPARCIN DE MATERIAL DE VIDRIO Y MEDIOS DE CULTIVO
1.
Lavar
cuidadosamente
las
placas
Petri
con
escobilln y detergente. Enjuagar con abundante agua corriente.

2.
Escurrir el exceso de agua y enjuagarlas con agua

destilada teniendo en cuenta enjuagar las paredes internas del material. Dejar
escurrir el material sobre una toalla o papel de envoltura. No secar el material
con algn otro medio.
3.
Secado el material se procede a envolver las placas

Petri, pipetas con papel molde, para los tubos y matraces se elaboran tapones
de algodn y gasa, se debe tener en cuenta que el tapn tape con facilidad el
tubo o matraz, luego se colocar un capuchn de papel.
4.
Prepara 20 ml de Caldo Nutritivo (CN) en un matraz

Erlenmeyer de 250 ml y ajustar a un pH de 6,5 7,0 en un potencimetro,
agregando con una pipeta Pasteur poco a poco solucin de HCL 0.1 M o
solucin NOH 0.1 M, en caso que el pH sea ms alcalino o cido
respectivamente. Vaciar 5 ml en cuatro tubos de cultivo con tapn de
baquelita que se cerrar sin llegar al tope.
5.
Prepara 120 ml de Agar Nutritivo (AN), calentar la

mezcla en una parrilla con agitacin constante hasta ebullicin durante 1
20
Agresin y Defensa
minuto (cuidar que no se derrame) y seguidamente vaciar 5 ml de medio en

tres tubos con tapn de rosca. Enjuagar inmediatamente la pipeta para evitar
que el agar se solidifique. El resto se esteriliza en autoclave.
6.
Preparar 120 ml de medio de cultivo Agar Papa

Dextrosa PDA en un matraz de 250 ml. ajustar el pH del medio a 5.0 5.6.
colocar un magneto de agitacin y calentar hasta ebullicin durante 1 minuto
(cuidar que no se derrame). Luego vaciar 7 ml del medio en tres tubos que se
taparn con tapn de algodn y gasa. El resto se esteriliza en autoclave.
7.
Prepara 120 ml de medio de cultivo Mnimo de Sales

(MM) en un matraz Erlenmeyer de 250 ml.
ESTERILIZACIN DE MATERIALES Y MEDIOS DE CULTIVO:

1.
Las placas Petri y pipetas envueltas se colocan en horno a 150C

durante 2 horas. Despus de sacarlas, dejarlas enfriar y abrir los paquetes
slo en rea asptica.
2.
Los medios de cultivo se esterilizan en autoclave de acuerdo a lo

siguiente:
a) Revisar que el nivel de agua coincida con la marca del tubo indicador. Si es
necesario aadir agua destilada.
b) Conectar la autoclave y poner la perilla de control en calentamiento alto.
Colocar los medios y materiales en la canasta de la autoclave y colocarla
dentro.
c) Cerrar la tapa, apretar las manijas de dos en dos en posicin encontrada y
esperar que salga el vapor de agua por el orificio de purgado. Despus
cerrar este orificio con la vlvula de seguridad.
d) Dejar que el equipo se caliente hasta alcanzar 121C o 15 libras de presin,
revisando continuamente la escala del manmetro. Alcanzada esta
temperatura deber bajarse el nivel de calentamiento moviendo la perilla de
control a nivel medio o bajo.
e) Mantener el equipo en estas condiciones durante 15minutos.
f) Apagar la autoclave y dejar que baje la presin a nivel 0. Quitar la vlvula
de seguridad y con la ayuda de guante de asbesto o toalla hmeda abrir
cuidadosamente la tapa de atrs hacia adelante para evitar quemaduras por
la salida de vapor.
21
Agresin y Defensa
PREPARACIN DE PLACAS PETRI Y TUBOS CON MEDIO DE CULTIVO:

1. Los tubos con medio de cultivo con agar, se debern colocar en una
superficie inclinada para que el medio se solidifique a una distancia prxima
de 1 a 2 cm de la boca del tubo.
2. Dejar que los medios de cultivo en matraces que se han sacado de la
autoclave se enfren a una temperatura aprox. de 40 50 C, temperatura en la
cual podamos sostener el matraz en la palma de la mano sin sentir un calor
excesivo.
3. Cerca del mechero etiquetar 3 placas con AN, 3 placas con PDA, 3 placas con
MM. Los medios de cultivo se sirven (vierten) en las placas Petri
aproximadamente 25 a 3 ml, esto se realizar en un rea asptica ceca del
mechero o una campana de flujo laminar.
4. Dejar que solidifiquen los medios (aproximadamente 30 minutos) luego
envolver las placas Petri con papel molde o en bolsas plsticas limpias; se
debe tener en cuenta que las placas deben ser colocadas en forma invertida.
5. Guardarlas en refrigeracin hasta 24 horas antes de utilizarlas.
PRUEBA DE ESTERILIDAD DE MATERIALES
1. Colocar los tubos con agar inclinado y las placas Petri en forma invertida en
una estufa de incubacin ajustada a 30C durante 24 48 horas.
2. Revisar los tubos y placas Petri para detectar la presencia de contaminantes,
por la aparicin de turbidez, formacin de nata superficial y/o presencia de
precipitado en el medio lquido y la presencia de colonias microbianas en la
superficie en el medio slido.
3. Si no hay contaminacin en los medios, se abrir una placa Petri de cada
medio durante 1 minuto en el laboratorio o zonas cercanas al laboratorio y se
etiquetar como al aire.
4. La otra placa de cada medio de cultivo se abre durante 30 segundos cerca del
mechero y se etiquetar en rea asptica.
5. La tercera placa de cada medio se conservara sin abrir y se etiquetar como
control.
IV. RESULTADOS
22
Agresin y Defensa
A) Realizar la descripcin morfolgica de las colonias obtenidas en las placas

con diferentes medios de cultivo (AN, PDA, MM) y con los distintos
tratamientos en relacin a la placa control.
B) Reportar el crecimiento en forma cualitativa:
(-) no hay crecimiento
(+) poco crecimiento
(++) crecimiento regular
(+++) crecimiento abundante
C) Discuta los resultados y determine si la esterilizacin en autoclave y horno

fue adecuada, as como el manejo de los materiales.
CUADRO 1
Descripcin morfolgica de los microorganismos en las placas Petri con
diferentes medios de cultivo
MEDIO DE
CULTIVO
AGAR NUTRITIVO
ABIERTA AL AIRE
ABIERTA EN
CONTROL
REA ASEPTICA
(AN)
MNIMO DE SALES
(MM)
AGARA PAPA
23
Agresin y Defensa
DEXTROSA
(PDA)
CUESTIONARIO
1 Cules son los mtodos de esterilizacin ms utilizados en Microbiologa?
Qu tipo de materiales se esteriliza en cada uno de esos mtodos?
2 Explique cules son las diferencias entre los procesos de esterilizacin,
desinfeccin y asepsia. Cmo se relacionan estos procedimientos con la
pasteurizacin.
PREPARACIN DEL MATERIAL PARA TINCIONES, TIPOS DE TINCIONES
UTILIZADAS PARA EL RECONOCIMIENTO DE BACTERIAS
I. Objetivos:
El propsito de esta prctica es hacer una introduccin preliminar al
conocimiento de los colorantes y las tcnicas bsicas de coloracin, quedando
reservadas las coloraciones especiales. La finalidad de las coloraciones, entre
otras, hacer visible los grmenes y revelar su estructura. El estudio
microscpico de un germen puede ser realizado de diversa manera, incluidos
los preparados en fresco. Pueden adems utilizarse tcnicas especiales. Como
el contraste de fases, el campo oscuro, la fluorescencia, etc.
II. Materiales:
Del Laboratorio:
Microscopio compuesto
Colorantes bsicos, cidos,
De los alumnos:
Lminas porta objetos y

laminillas cubre objetos.
neutros y Gram.
Goteros, palillos mondadientes
Alcohol
Aguja N 21
Aceite de cedro o de inmersin
Muestra
biolgica
para
24
Agresin y Defensa
coloracin Gram.
III. Actividades del Alumno
1. Lea cuidadosamente la informacin que se da a continuacin, para que est en
condiciones de resolver la prctica.
2. Si bien es posible el examen microscpico de clulas y queden preservadas,
esto es, fijadas y coloreadas para un mejor estudio.
3. Un preparado ideal, deber mostrar las clulas con la misma organizacin
morfolgica y composicin qumica que cuando estaban vivas, sin embargo
esto no es posible y presentan imperfecciones, debido a las tcnicas utilizadas.
IV. Fundamento
Para la obtencin de un preparado se debe tener en cuenta las siguientes
consideraciones:
Fijar: Es dar muerte a la clula

La fijacin tiene por objeto:
a)
Evitar la autlisis, que es la destruccin de la clula por sus propias

enzimas.
b)
Impedir la actividad y proliferacin de las bacterias.
c)
Aumentar la afinidad de las estructuras celulares a los colorantes

citolgicos, hacindolos as, ms fcilmente coloreables.
La fijacin puede efectuarse por medio de agentes fsicos como el calor,

esto es muy utilizado para fijar bacterias, comnmente se emplea la fijacin
qumica, mediante sustancias llamadas fijadores, como las protenas son
las principales molculas estructurales de las clulas, los fijadores deben
actuar sobre ellas, hacindolas insolubles. Algunos fijadores como el
Cloruro de mercurio y el cido pcrico precipitan las protenas, mientras
otros solamente causan su coagulacin como el aldehdo frmico,
tetrxido de osmio y aldehdo glutmico glutaraldehido estos ltimos
son los ms utilizados en microscopa electrnica, porque coagulan las
protenas, lo que causan modificaciones mnimas en la estructura celular.
Colorear: La coloracin es el proceso mediante el cual, un cuerpo toma

color bajo la accin de otro cuerpo o sustancia llamada colorante.
25
Agresin y Defensa
La coloracin de la estructura celular se basa en el principio de afinidad.

Especificar entre ciertos colorantes y la estructura particular de la clula.
Casi todas las organelas e inclusiones son transparentes o incoloras, lo que
dificulta su estudio microscpico; para superar esta dificultad se han ideado
numerosos procedimientos de coloracin, que hacen visible los diversos
componentes celulares. La mayora de colorantes citolgicos se comportan
como bases o como cidos.
En los colorantes bsicos: el grupo qumico responsable de la coloracin es
catinico, por lo tanto lleva carga elctrica positiva, es decir que el grupo
qumico o cromforo se combina con los grupos cidos o aninicos de las
molculas celulares.
En los colorantes cidos: el grupo cromforo es aninico, por lo tanto lleva
carga elctrica negativa, tiende a combinarse con los componentes celulares
bsicos que son elctricamente positivos.
La coloracin de las clulas se debe principalmente a la combinacin de los
colorantes con las protenas. La disociacin inica de las protenas depende
del pH, por ello su afinidad por un colorante cambia segn sea el pH de la
solucin.
Se llama punto isoelctrico de una protena al valor del pH en el cual su
disolucin inica es mnima, esto es, que en su punto isoelctrico, la protena
tiene el mnimo de afinidad por los colorantes. En un pH superior al punto
isoelctrico, los grupos COOH de la protena ionizan y esta presta basoflia,
en un pH inferior al punto isoelctrico, predomina la disociacin de los grupos
NH2 de la protena y esta se comporta como acidfila.
Coloraciones
Bacterianas:
En
general
las
bacterias
otros
microorganismos son transparentes lo que dificulta su estudio cuando los

exmenes se realizan en fresco. Por tal razn, cuando se quiere conocer los
detalles morfolgicos, es necesario recurrir a tinciones.
Colorante: es aquella sustancia que tiene la propiedad de comunicar color a
otros cuerpos de cualquier naturaleza. Para que una sustancia sea colorante
debe estar compuesta por:
Molcula incolora + Cromforo + Auxocromo = Colorante
Cromgeno
26
Agresin y Defensa
Cromgeno: Son las molculas que poseen potencialidad de coloracin; esta

potencialidad est conferida por un radical llamado cromfero.
Cromfero: Son grupos de tomos no saturados, susceptibles de dar
coloracin a las molculas de las cuales forman parte: la fuerza de los
cromferos vara con la naturaleza de sus tomos y de su estructura.
Algunos de estos grupos dan reaccin bsica. Ejm:
Grupo Azo: -N = N-
: Grupo indemnico N=
Otros dan reaccin cida. Ej:

Grupo Nitro
: -NO2
Auxocromo: son grupos no saturados debido a esta instauracin influyen en le

color. Pueden ser:
a)
Simples: Cuando cada uno encierra un tomo no saturado.

Ejm: -OH
b)
SO3H; NH2
Compuestos: Cuando cada uno encierra dos tomos no saturados.

Ejm: Grupo hidroxilaminados NHOH
Grupo hidroxinicos NHNH2
Grupo thiohidroxilaminado SNH2
Los colorantes de mayor aplicacin son los derivados de alquitrn de hulla

(anilinas) ej: Cristal violeta, violeta de genciana, fucsina bsica, safranina, azul
de metileno y verde de malaquita. Actan mejor mediante la adicin de
mordientes, porque aumenta la permeabilidad de la pared celular y la
membrana citoplasmtica. En general las bacterias tienen afinidad por los
colorantes derivados de la anilina o especialmente por aquellos de carcter
bsico estos colorantes llevan en su parte cromfera carga electro-positiva, la
que tendra una fuerte afinidad por los grupos electro-negativos que
normalmente presentan las bacterias en su protoplasma, entre los cuales se
encuentran los cidos nucleicos y derivados.
Colorantes: Pueden ser:
A) NATURALES: Carmn, hematoxilina, tornasol.
B) ARTIFICIALES: estos a su vez pueden ser:
27
Agresin y Defensa
a)
Bsicos: como la timidina, violeta de genciana, fucsina

bsica.
b)
cidos: cida pcrica, fucsina cida, eosina.
c)
Neutros: eosinato azul de metileno.
d)
Indiferentes: Sudn III.
Soluciones empleados en coloraciones comunes

a) Azul de metileno de Leffler:
Azul de metileno..0.31 gr
Alcohol etlico..30 gr
Solucin de KOH al 0.01%.......................100 ml
b) Violeta de genciana fenicada
Violeta de genciana1 gr
cido fnico cristalizado.....2 gr
Alcohol etlico.10 ml
Agua destilada100 ml
c) Violeta de genciana de Hucker
(Cristal violeta oxalato de amonio)
Cristal violeta..2 gr
Oxalato de amonio0.8 gr
Agua destilada...80 ml
d) Fucsina fenicada de Ziehl
Fucsina bsica..0.3 gr
cido fnico..5 gr
Alcohol etlico10 ml
Agua destilada 100 ml.100 ml
e) Solucin Yodo-yodurada (lugol dbil)
Yodo..1gr
Yoduro de potasio..2 gr
Agua destilada.300 ml
f)
Solucin Yodo-yodurada (lugol fuerte)

Yodo..1gr
Yoduro de potasio..2 gr
Agua destilada.200 ml
g) Solucin de safranina
28
Agresin y Defensa
Safranina O (sol. al 2.5% en alcohol etlico).10 ml

Agua destilada100 ml
h) Alcohol ter (licor de Hoffman)
Mezcla a partes iguales de alcohol de 95 con ter.
i)
Alcohol acetona
Alcohol 95..80 ml
Acetona20 ml
j)
Alcohol clorhdrico
cido clorhdrico3 ml
Tcnicas de Coloracin. Pasos generales de una coloracin

a)
Extensin en lmina porta objeto con aza bacteriolgica (micrn) u otro

instrumento. El aza debe ser esterilizada al rojo en el mechero, antes y
despus del empleo.
b) Fijacin su objeto es adherir firmemente la preparacin sobre la lmina. Se

emplea para este fin el calor suave o el alcohol ter; este ltimo es
indispensable cuando se trata de muestras serosas.
c)
Tincin con el colorante o con el grupo de colorantes elegidos.
d) Lavado a chorro moderado (que el lquido no saque la muestra a analizar).

e)
Secado puede utilizarse el calor suave o el aire.
f)
Observacin
Nota: Nunca observe una lmina coloreada, antes de que seque, sobre todo
cuando va a utilizar lente de inmersin.
A. Coloracin Simple
Es aquella que emplea un solo colorante que puede ser cido o bsico. Ejm: la
coloracin con el azul de metileno.
Procedimiento
e)
Extensin de un frotis (sustancia examen mucosa bucal).
f)
Fijacin (alcohol, calor, otros fijadores)
g)
Coloracin de 01 a 15 minutos (con colorante cido o bsico)
h)
Lavado en agua de cao.
i)
Secado al medio ambiente o calor moderado.
29
Agresin y Defensa
j)
Observacin con el objetivo de mayor aumento o de

inmersin
B.
Coloracin Neutra
Es aquella en la que se emplea un solo colorante, que en su constitucin entra una
parte cida y otra bsica.
Procedimiento
a) Extensin o frotis (sustancia examen sangre).
b) Coloracin con un colorante neutro (wright).
c) Agregar doble cantidad de agua destilada.
d) Dejar en reposo durante 05 minutos aproximadamente.
e) Lavar con agua de cao.
f) Secado al medio ambiente o calor moderado.
g) Observacin con el objetivo de mayor aumento o de inmersin.
C.
Coloraciones compuestas:
Aquellas que se emplean ms de 1 colorante. La ms comn es de Gram, que fue
creada por Christian Gram estudiante dans entre 1884 y 1886: Coloracin
diferencial Gram
OBSERVACIONES
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
CUESTIONARIO
1. Qu precaucin es fundamental antes de colocar aceite de cedro sobre la lmina
coloreada?
30
Agresin y Defensa
2. Cul es la posicin del condensador en una observacin de una muestra

coloreada en inmersin?
3. Cul es la posicin correcta del condensador en una observacin en fresco y a
mediano aumento?
4. Cada uno de los fijadores qumicos presentan cualidades deseables a la vez
ciertos inconvenientes, por ello se preparan las mezclad fijadoras, que contienen
proporciones variables de los fijadores simples. con qu objeto cree ud. se hace
uso de estas mezclas fijadoras, teniendo en cuenta las propiedades de estas
sustancias qumicas?
BIBLIOGRAFIA UTILIZADA
COLORACIONES TINCIN DIFERENCIAL GRAM
I.
Objetivos:
El estudiante clasifique algunas especies bacterianas en grampositivas y
gramnegativas de acuerdo a la tincin diferencial Gram. Observe la morfologa
bacteriana.
II.
Materiales:
Material y reactivos
Gradilla.
Mechero de alcohol.
Portaobjetos
Fsforo
Asa bacteriolgica
Lpiz para vidrio
Safranina.
Muestras
biolgicas:
hisopado nasal,
bucal,
Papel absorbente.
Hisopos
Aceite de inmersin.
Cristal violeta
Lugol.
Alcohol 95%.
secrecin
contaminada
III.
Actividades del Alumno
31
Agresin y Defensa
Tincin Diferencial de Gram

La tcnica de coloracin de Gram es de gran utilidad en Bacteriologa, ya que
permite diferenciar las bacterias en Gram Positivas y Gram Negativas. Casi la
mitad de las bacterias, son Gram positivas y el resto Gram negativas.
El mtodo fue descubierto por Christian Gram (Dans), en 1884, quien observ
que en cortes histolgicos que contenan bacterias coloreadas con violeta de
genciana y tratadas con solucin acuosa de yodo, este colorante podra ser
removido del corte histolgico con el empleo de alcohol, pero no de las bacterias.
Posteriormente descubri que no todas las bacterias retenan al violeta de
genciana sino que algunas eran decoloradas por accin del alcohol. A las primeras
las llam Gram positivas y a las segundas Gram negativas. Estas que quedan
incoloras son teidas luego mediante el empleo de un colorante de contraste como
la safranina, para hacer posible su observacin. Existen muchas modificaciones de
esta coloracin, pero fundamentalmente es lo mismo.
Tcnica
1. Previa la fijacin de la muestra, preparar 3 extensiones (esparcir con el aza
bacteriolgica delimitando el rea) en la forma ya indicada.
2. Cubrir la extensin con cristal violeta y dejar actuar durante un minuto.
3. Lavar con agua corriente, cuidando que no se arrastre la preparacin y sacudir
para eliminar el exceso de agua.
4. Cubrir la extensin con lugol y dejar actuar por dos a tres minutos.
5. Lavar con agua corriente.
6. Decolorar con alcohol al 95 96% o alcohol acetona, aproximadamente 10
segundos hasta observar el alcohol transparente.
8. Contrastar con safranina, para esto cubrir la extensin con safranina y dejar
actuar por 10 a 30 segundos.
10. Secar la preparacin al aire o colocndola entre papel absorbente.
11. Colocar una gota de aceite de inmersin sobre la preparacin y observar al
microscopio con objetivo de inmersin.
Interpretacin:
32
Agresin y Defensa
Las bacterias Gram positivas retienen el cristal violeta y se teirn en azul

morado. Las Gram negativas se tien en rojo rosa.
Los grmenes Gram negativos, son los que han cedido (perdido) al color violeta
por accin del alcohol acetona y por haber quedado sin coloracin, han estado
aptos para tomar el segundo colorante que es la safranina (color rojo).
La accin del lugol en esta coloracin, es conseguir una mayor fijacin del violeta
por parte de los grmenes gran positivos, por unin del colorante con el yodo del
lugol.
ACTIVIDAD
1.
Esquematice Lo Observado En Prctica: Procedimiento Y

Resultados
OBSERVACIONES
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
Material biolgico:.
Observacin:..
Objetivo:..
Aumento:.
CUESTIONARIO
2. Cul es comportamiento ms usual de los cocos y cul es el de los bacilos en la
coloracin de gram?
3. Cul es el fundamento de la tincin diferencial de Gram?
33
Agresin y Defensa
4. Cul es la funcin que desempea el lugol en esta coloracin?

5. Podra remplazarse la safranina con el azul de metileno u otro colorante, como
colorante contraste en la coloracin de gram.
6. Escribir el nombre cientfico (gnero y especie), de 5 bacterias grampositivas y 5
gramnegativas.
7. Explicar: por qu algunos microorganismos grampositivos en un cultivo joven
pueden volverse gramnegativos cuando ste envejece?
8. Qu otras coloraciones bacterianas se utilizan en el laboratorio hable y
fundamente las que son para bacilos cido alcohol resistentes. esporas y cpsulas.
B.A.A.R
Esporas
Cpsula
MEDIOS DE CULTIVO: AISLAMIENTO Y SIEMBRA DE BACTERIAS.
I. Objetivos:
1. Conozca la forma como se puede sembrar una bacteria en un medio artificial.
2. Aplicar y fundamentar el crecimiento bacteriano en medios artificiales.
3. Identificar bacterias grampositivas y gramnegativas que crecen en los medios de
cultivo
II. Materiales:
Asa bacteriolgica
Mechero de alcohol o cocinilla elctrica
Placas petri con medios de cultivo McC y agar nutritivo
Viales con McC y agar nutritivo
Alcohol, algodn
Muestras biolgicas (grampositivas y negativas).
Estufa para la incubacin de los medios ya sembrados
34
Agresin y Defensa
III. Actividades del Alumno

1. Lea cuidadosamente la informacin que se da a continuacin, para que est en
condiciones de resolver la prctica.
2. Cada uno de los asistentes a la prctica deber realizar las respectivas siembras
en los medios de cultivo.
FUNDAMENTO
Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio
lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Los medios de cultivo
contienen distintos nutrientes que van, desde azcares simples hasta sustancias
complejas como la sangre o el extracto de caldo de carne.
Para aislar o purificar una especie bacteriana a partir de una muestra formada por
muchos tipos de bacterias, se siembra en un medio de cultivo slido donde las
clulas que se multiplican no cambian de localizacin; tras muchos ciclos
reproductivos, cada bacteria individual genera por escisin binaria una colonia
macroscpica compuesta por decenas de millones de clulas similares a la original.
Si esta colonia individual se siembra a su vez en un nuevo medio crecer como
cultivo puro de un solo tipo de bacteria.
Muchas especies bacterianas son tan parecidas morfolgicamente que es imposible
diferenciarlas slo con el uso del microscopio; en este caso, para identificar cada
tipo de bacteria, se estudian sus caractersticas bioqumicas sembrndolas en
medios de cultivo especiales. As, algunos medios contienen un producto que inhibe
el crecimiento de la mayora de las especies bacterianas, pero no la de un tipo que
deseamos averiguar si est presente. Otras veces el medio de cultivo contiene
determinados azcares especiales que slo pueden utilizar algunas bacterias.
En algunos medios se aaden indicadores de pH que cambian de color cuando uno
de los nutrientes del medio es fermentado y se generan catabolitos cidos. Si las
bacterias son capaces de producir fermentacin, generan gases que pueden ser
apreciados cuando el cultivo se realiza en un tubo cerrado.
35
Agresin y Defensa
Con otros medios de cultivo se identifica si las bacterias producen determinadas

enzimas que digieren los nutrientes: as, algunas bacterias con enzimas hemolticas
(capaces de romper los glbulos rojos) producen hemlisis y cambios apreciables
macroscpicamente en las placas de agar-sangre. Los diferentes medios y tcnicas
de cultivo son esenciales en el laboratorio de microbiologa de un hospital, pues
sirven para identificar las bacterias causantes de las enfermedades infecciosas y
los antibiticos a los que son sensibles esas bacterias.
SIEMBRA
Procedimiento que consiste en acondicionar el microorganismo a un medio de
cultivo frtil, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que en condiciones ptimas
de temperatura y tiempo de incubacin, pueda desarrollar y multiplicarse IN VITRO.
Se siembra con dos finalidades:
a.
Para hacer un aislamiento y
b.
Para hacer un trasplante.
PROCEDIMIENTO
Permite la separacin de los microorganismos al estado de pureza a partir de una
muestra problema. Se requiere un medio slido con gran superficie para que los
microorganismos al ser diseminados sobre el medio, generen su progenie (cepa) por
formacin de colonias separadas.
Si se aslan especies distintas, cada colonia tendr caracteres especiales. La
morfologa bacteriana ser tambin distintiva.
TRANSPLANTE
Significa la separacin primaria de la cepa a un medio de cultivo apropiado en tubo,
que puede ser lquido o slido. Se conserva la cepa para y por subsiguientes
trasplantes en medios especiales, se logra conocer las propiedades culturales y
bioqumicas y como resultado, la identificacin especfica.
1.
AISLAMIENTO DE BACTERIAS AEROBIAS EN PLACAS DE AGAR

A.-AISLAMIENTO POR ESTRAS
36
Agresin y Defensa
La placa de estras se utiliza fundamentalmente para aislar cultivos puros de muestra

que contienen flora mixta. En este aislamiento podemos estudiar la morfologa y
coloracin de las colonias, susceptibilidad a los antibiticos, etc.; conocimiento de gran
valor para el diagnstico y la identificacin. Las superficies del agar deben ser suaves
y hmedas pero sin exceso de humedad (podra haber superposiciones de colonias).
Todo el proceso se debe realizar junto al mechero para evitar contaminacin.
Procedimiento:
a)
Con la mano derecha flamear el asa de siembra, al rojo, mantenindola

verticalmente en el mechero.
b)
Utilizando los dados de la mano izquierda, quitar el tapn de algodn (o

tapa rosca) del tubo que contiene la muestra, y tomar una cantidad ligera de
inculo, enseguida se vuelve a tapar el tubo.
c)
Con la mano izquierda se toma la placa petri de agar, se manipula con los
dedos para levantar parcialmente la tapa.
d)
Con la mano derecha se toma el asa y se distribuye el inculo por estras

en Zig-Zag, con escasa separacin unas de otras (1 a 3 mm). La distribucin
puedes ser por estra simple (inculo descrito en un solo plano por todo el
medio) u estra en triangulo o cuadrado (estras descritas en 3, 4,5, planos en
el mismo medio). El nmero se estras depende de la cantidad de inculo y los
planos de siembra ensayados. Se debe evitar romper el medio.
Sobre las primeras estras, desarrollara unas masas microbianas indiferenciadas;

en las estras internas, un desarrollo casi uniforme con una que otra colonia
pequea ligeramente aislada y en las ultimas, escasas colonias de desarrollo
normal y diferenciadas. En caso de aislamiento por planos; las ltimas son
colonias definidas y diferenciadas. Estas deben ser las elegidas para el
trasplante y obtencin de cepas puras.
El aislamiento por torundas es idntico al del estriado.
37
Agresin y Defensa
B.- AISLAMIENTO POR DISEMINACIN

Procedimiento:
1.
Mediante la pipeta pasteur estril se toma una mnima cantidad de inculo. El

dedo ndice de la mano derecha debe cubrir la abertura superior, para evitar se
vaci el contenido.
2.
El inculo es depositado en un margen del agar.
3.
Con la varilla horizontal de la esptula de Digralsky (o alambre doblado del

asa), se distribuye el inculo por toda la superficie del medio, evitando pasar
dos veces por el mismo plano. La tapa de la placa debe levantarse slo lo
necesario, para evitar contaminacin.
C.- AISLAMIENTO POR DIFUSIN (conteo en placas)
Esta tcnica se aplica de preferencia para anlisis cuantitativos bacterianos. Por

ejemplo para conocer el nmero de microorganismos por mililitro en muestra de agua,
leche alimentos, etc.
Para reparar las diluciones bsicas pueden utilizarse agua amortiguada esterilizada,
su locin esterilizada de NaCl al 0.85 % o medio de cultivo esterilizado.
Procedimiento:
1.
De la muestra problema, con una pipeta Pasteur se saca 1 ml de inculo y se

lleva a un tubo que contiene 9 ml de dilucin bsica. Este tubo corresponde a la
dilucin 1:10 (1/10 10-1).
38
Agresin y Defensa
2.
De la dilucin 1:10 se saca un 1 ml y se le va a otro tubo con 9 ml de dilucin.

Esta dilucin corresponde a 1:10.
3.
De la dilucin 1:10 se saca 1 ml y se trasfiere a otro tubo con 9 ml de dilucin

bsica. Este tubo es la dilucin 1:1000. Las diluciones pueden continuar o no,
segn convenga al experimento.
4.
De cada tubo de dilucin se trasmite 1 ml a una placa petri esterilizada.
5.
Introduzca de 15 a 18 ml de agar fundido esterilizado y enfriado a 45C, en

cada una de las placas que contienen los diluyentes.
6.
Mezclar el medio agar con el inculo haciendo girar la placa petri. Dejar que
solidifique el medio, con una superficie plana.
7.
Ponga a incubar las placas, en posicin invertida de 24 a 48 horas.
8.
Escoger una placa que contenga de 30 a 300 colonias, cuente el nmero de

colonias. Multiplique el nmero de colonias por la dilucin de la muestra. Por
ejemplo si la placa de dilucin 1:10 muestra 40 colonias tenemos 4 x 10 = 400;
en clculo de poblacin bacteriana del espcimen original seria 400
microorganismos por mililitro y se registra como cuenta estndar de placa por
mililitro.
2.
METODOS
DE
SIEMBRA
TRASPLANTE
DE
BACTERIAS
AEROBIAS EN TUBOS.
A. Transferencia de medios de cultivos puros lquidos a medios lquidos en
tubos.
1)
Flamear el asa de siembra y luego dejarla enfriar.
2)
Quitar el tapn de algodn del tubo con la muestra y con el asa en aro
tomar en inculo, tapar el tubo y retirarlo.
3)
Tomar el tubo con medio lquido (ejemplo: caldo de tioglicolato) e

introducir en asa, hasta aproximadamente de profundidad talar el tubo y
agitarlo.
4)
Incubar a 37C por 24 horas.
5)
La turbidez del caldo cultivado indica la presencia de microorganismos;

en caso contrario el caldo es transparente.
B. Transferencia de cultivos puros en medios semislidos (medio CTA o base de

Agar Trypticasa), etc., para pruebas de motilidad y pruebas de fermentacin)
39
Agresin y Defensa
1)
Utiliza el asa en punta (o aguja de Kolle), previamente esterilizada, tocar

con la punta la colonia escogida de la placa (introducir la aguja al medio, si
la muestra es lquida en tubo).
2)
Quitar el tapn del tubo que se va a inocular y atraviese el medio

aproximadamente hasta la mitad, con un movimiento recto vertical, teniendo
cuidado de retirar la aguja a lo largo de la misma senda (siembra por
puntura).
3)
Incubar a 37 por 24 horas. La Nisseria debe inocularse intensamente, y

solo en superficies del medio CAT.
Los cultivos inoculados por picadura muestran crecimiento fuera de la lnea de

inoculacin, mientras que el medio circundante permanece claro.
La fermentacin en medios semislidos que contienen carbohidratos puede
determinarse generalmente mediante un cambio de color del indicador
incorporado.
C. Transferencia de cultivos puros en medios inclinados especiales. (Agar triple
Azcar Hierro o TSI, y el kliger Iron Agar o KIA con dos azcares), para pruebas de
fermentacin de SH2 y Co2.
Procedimiento:
1. Examine la placa y escoja la colonia que se va a transferir.
2. Esterilizar el asa en punta y dejarlo enfriar (para medios inclinados
normales se utiliza el asa en ero)
3. Levantar la placa y tocar la colonia con la punta del asa.
4. Quitar el tapn del tubo que contiene e l medio inclinado y atraviese la
masa hasta la mitad de su profundidad, con un movimiento recto, e
inocule la superficie inclinada pasmado la aguja a lo largo de la superficie
inclinada desde el fondo hasta la parte superior.
5. Incubar a 37 C por 18 a 48 horas.
Medio Kliger (KIA)
Es un agar en tubo inclinado con mucho fondo, que contiene dos azucares (glucosa al
0.18 u lactosa al 18) con sulfato de hierro y rojo temol como indicador de pH. Este
medio presenta una dbil tonalidad rosada o salmn. Se siembra a la ves en
40
Agresin y Defensa
superficies y profundidad. (Por picadura). Despus de la incubacin permite obtener 4

respuestas:
Fermentacin de la glucosa (viraje al amarillo del fondo). Fermentacin
de la lactosa (viraje al amarillo de la superficie), producto de SH2 (precipitado negro de

sulfato ferroso) y formacin de gas en la fermentacin de la glucosa (burbujas o
desprendimiento del agar).
Si la bacteria fermentada de glucosa, como este azcar a halado una pequea
cantidad (0.18), los cidos formados en superficie (en presencia de oxigeno) son
rpidamente neutralizados por las aminas voltiles producidas por la descarboxilacin
oxidativa de las protenas no modificando el pH de la superficie ni su color, pero en
profundidad. Los cidos formados en la fermentacin anaerbica de la glucosa hacen
variar el pH del fondo cuyo color vara al amarillo. Si se produce, adems, ola
fermentacin rpida de la lactosa, que se ala en mayor cantidad (1%), los cidos
modifican en pH de la superficie del medio, que vira a amarillo.
3. AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS ANAEROBIOS.
Los microorganismos anaerbicos constituyen la flora bacteriana predominante en el
ser humano y se halla constantemente en el tracto intestinal, vas respiratorias y
aparato genitourinario. Aun cuando los anaerbicos se encuentren comnmente en
heridas y abscesos, hay que tener presente que pueden participar en cualquier tipo de
infeccin.
Para el trabajo de laboratorio con estos microorganismos es preciso obtener
condiciones de anaerobiosis. Esta atmsfera de anaerobiosis tiene doble finalidad:
eliminar y reducir la tensin de oxgeno y mantener el ambiente sin este o a la menor
contraccin posible. Algunos procedimientos son sofisticados, otros son ms sencillos.
Si bien la mayora puede detectarse en los cultivos a las 18 36 horas (prcticamente
como los aerobios), hay algunas especies, como Bacteroides nodosus o Enbacterius
lentum que pueden tardar varios das en crecer en medios habituales. La va
metablica utilizada por estos grmenes permite la liberacin de sustancias de
metabolismo intermediario, como cidos grasos voltiles de cadena corta, como el
cido butrico, etc. De olor desagradable y fcilmente detectable, que facilita el
diagnostico.
41
Agresin y Defensa
ACTIVIDAD
1. Esquematice Lo Observado En Prctica: Procedimiento Y Resultados
CUESTIONARIO
1. Cul es tipo de siembra de bacterias se emplea con mayor frecuencia en la
clnica y que medios de cultivo se emplea?
2. Al iniciar la siembra porque Ud. debe gastar la muestra biolgica?
3. Qu tipo de bacterias Ud. siembra en agar sangre y debido a que fundamntelo?
4. En cuanto a los resultados de la prctica fundamente los resultados en el mcc y de
que bacterias se cree que son
5. Debido a que algunas colonias bacterias que dio en mcc son rosadas con un
precipitado y otras cremosas.
6. Explique qu medio o medios de cultivo empleara si, el paciente tiene una
infeccin a vas urinarias bajas.
7. La siembra de un microorganismo en un medio de cultivo es una prueba
microbiolgica confirmatoria para determinar la especie de microorganismo
causante de la patologa
8. Explique a que se llaman: cultivo puro y cepa bacteriana.
42
Agresin y Defensa
43
Agresin y Defensa
MTODO DE CULTIVO Y DESCRIPCIN MORFOLGICA DE HONGOS
OBJETIVO
Que el alumno aprenda las tcnicas de cultivo y manipulacin de diferentes tipos de
hongos. Que el estudiante conozca las principales caractersticas morfolgicas de los
hongos (microscpicas y macroscpicas) de los hongos.
INTRODUCCIN
Los hongos son organismo eucarioticos de mayor tamao que las bacterias se
caracterizan por carecer de movimiento y no realizar la fotosntesis, es decir son
organismos hetertrofos. A ser organismos hetertrofos dependen de nutrientes
orgnicos que son solubilizados diferentes enzimas especficas y son absorbidos a
travs de su pared celular y membrana plasmtica. Por el nmero de clulas los
hongos son unicelulares (levaduriformes) y pluricelulares (filamentosos: mohos),
algunos hongos presentan las dos formas, es decir, son dimrficos generalmente este
44
Agresin y Defensa
tipo de hongos son patgenos, para que sean dimorficos va a depender de las
condiciones ambientales como son nutrientes y temperatura.
Los hongos levaduriformes presentan una forma oval o esfrica, ampliamente
distribuida en la naturaleza, frecuentemente se encuentran en la superficie de algunas
frutos y hojas (superficie polvosa). Las levaduras se reproducen asexualmente por
gemacin donde a partir de la clula madre brota una protuberancia o yema que
posteriormente se separa de la clula madre. El cuerpo o estructura vegetativa propia
de los hongos filamentosos mohos se denomina talo que est constituido de hifas y
al conjunto de hifas se le denomina micelio. El mecanismo de reproduccin de los
hongos es asexual donde las hifas vegetativas se fragmentan o por la produccin de
esporas en las estructuras de nominadas conidiforos y esporangiosporas. Los
hongos presentas estructuras de reproduccin sexual y sirve para clasificar algunos
hongos en 3 subdivisiones o phylum: Zygomicota, Ascomycota y Basidiomycota.
Del total de hongos estudiados solo se conocen 150 especies patgenas para el
humano pero tambin hay hongos que causan patologas en plantas y animales. Los
hongos tienen gran importancia en el desarrollo de la vida, sobre todo en el proceso de
degradacin
de
materia
orgnica
(biorremediacin),
produccin
de:
bebidas
alcohlicas, medicamentos (penicilina), cura de quesos, alimentacin, controladores

biolgicos (bioinsecticida), adems es de importancia en la asimilacin de nutrientes
por la planta al formar las micorrizas que es la asociacin de hongos con las races de
las plantas.
MATERIALES:
4 placas Petri con 25 ml de PDA
4 placas Petri con 25 ml de medio Czapek Dox
3 tubos de cultivo inclinados con 7 ml de PDA
3 matraces Erlenmeyer de 250
1 probeta de 100 ml y 1 vaso de precipitacin de 100 ml
1 mechero y 5 portaobjetos y cubreobjetos
1 aguja de diseccin y 1 asa de siembra
Cinta adhesiva transparente
Microscopio ptico de campo claro y Aceite de inmersin
Autoclave e Incubadora a 30C y Azul de lactofenol
45
Agresin y Defensa
PROCEDIMIENTO
Se proporcionara tubos de cultivo con Aspergillus niger, Penicillum chrysogenum,
Rhizopus oligosporum, Trichoderma viride y de levadura Saccharomyce cerevisiae.
El alumno inocular cada una de las cepas en las placas Petri con dos medios de
cultivo: a) Czapk Dox a base de sales y sacarosa y b) Agar Papa Dextrosa (PDA),
que es un medio complejo. Para la descripcin macroscpica de cada especie en los
dos medios de cultivo y la observacin microscpica la realizar aplicando la tcnica
de cinta Scotch con azul de lactofenol.
SIEMBRA DE HONGOS:
1. Para la siembra de hongos filamentosos, se deber separar una parte del micelio
de los tubos de cultivo con aguja de diseccin, previamente calentada en la llama
del mechero y fra.
2. Colocar el micelio en el cetro de una placa Petri con PDA y de la misma manera
inoculara la caja con medio de Czapek Dox.
3. Las levaduras se inocularn por estra cruzada sobre la superficie de las placas, en
forma semejante a la realizada para la siembra de bacterias.
4. Colocar las placas envueltas en papel o bosas de plstico en forma invertidas
dentro de una incubadora a 28 30C durante 3 a 5 das.
DESCRIPCIN MACROSCPICA DE LEVADURAS Y MOHOS
1. Hacer la descripcin de la forma, tamao y aspecto, textura y color de las colonias
de Saccharomyse cerevisiae.
2. En los cultivos de mohos (hongos filamentosos) describir la forma, tamao y el tipo
de colonia, s como las caractersticas del micelio (algodonoso, aterciopelado,
velloso, areo o pegado al medio) el color del micelio, el color de esporas, cambios
en el medio de cultivo etc.
DESCRIPCIN MICROSCPICAS DE LEVADURAS
1. De las colonias de levaduras preparar un frotis fijado al calor y teirlo con azul de
metileno.
2. Hacer observaciones al microscopio con objetivo 40x y 100x.
DESCRIPCIN MICROSCPICA DE MOHOS EN MONTAJE CON CINTA
ADHESIVA
46
Agresin y Defensa
1. Se corta una cinta de 4 5 cm de cinta adhesiva transparente tomndola slo por

los extremos.
2. Cerca del mechero se abre la placa Petri y se presiona ligeramente la cinta
adhesiva transparente sobre la periferia de la colonia.
3. Colocar la cinta con la muestra adherida sobre la una gota de azul de lactofenol,
previamente colocada en el centro del portaobjeto (lmina). La cinta adhesiva
transparente har como si fuera el cubreobjetos (laminilla) por lo que deber
presionar evitando la formacin de burbujas, sin alterar demasiado la estructura.
4. Dejar reposar durante 3 5 minutos y hacer las observaciones en el microscopio
con los objetivos de 10x y 40x.
5. Localizar en las preparaciones hifas, estructuras especiales como conidiforos,
conidios, esporagioforos, esporangios y rizoides. Determine si las hifas presentan
septos o no.
RESULTADOS
A. Reportar sus observaciones en el cuadro. Hacer los dibujos de las observaciones
morfolgicas de cada uno de los microorganismos y colorearlos.
B. Comparar las observaciones realizadas con los esquemas de la figura
C. Investigar en la bibliografa como se clasifican los hongos observados en la
prctica.
47
Agresin y Defensa
Asperguillus niger
Saccharomyce cerevisiea
Penicillum
Rhizopus
Descripcin macroscpica en PDA

Color y tamao:
Aspecto:
Textura:
Descripcin microscpica en PDA
Aumento Total:
Micelio con o sin septos Tamao:
Estructuras de reproduccin:
Clasificacin (phylum):
CUESTIONARIO
1. Cules son las principales estructuras caractersticas de mohos y levaduras?
2. Elaborar un cuadro comparativo de caractersticas morfolgicas, nutricionales y
sensibilidad a antibiticos de hongos y bacterias. Mencione las diferencias que hay
entre las esporas de hongos y las esporas de bacterias.
3. Mencione y explique, brevemente, 4 problemas patolgicos causados por los
hongos y 4 beneficios que tienen los hongos en el desarrollo de las actividades
humanas y biolgicas.
BIBLIOGRAFIA
..
..
..
..
48
Agresin y Defensa
ANTIBIOGRAMA
En 1921, Fleming haba observado la accin antibactericida de una sustancia
presente en las secreciones nasales, llamada lisozima.
En 1928, cuando estudiaba el virus de la gripe encontr que en la placa en la que
estaba cultivando unas bacterias haba crecido moho y que alrededor de este se
haba formado un rea libre de estafilococos. Esta capa contena alguna sustancia
que inhiba el crecimiento de la bacteria. A este principio activo lo llamo Penicilina,
ya que proceda del hongo Penicillium notatum. Sin embargo, problemas tcnicos
no le permitieron purificar ni producir la penicilina por lo que no lleg a usarla
clnicamente.
En 1938, los britnicos Ernst Boris Chain y Howard Walter Florey iniciaron una
investigacin detallada y sistemtica de este antibitico y lograron, en 1940, tras su
traslado a EEUU, la fabricacin industrial y el empleo mdico de la penicilina, lo que
supuso la salvacin de incontables vidas durante la Segunda Guerra Mundial. En 1945
49
Agresin y Defensa
los tres investigadores fueron galardonados con el Premio Nobel de Fisiologa y

Medicina.
El primer antibitico aislado fue la actinomicetina (Gratia & Dath, 1924). Los primeros
antibiticos usados en clnica fueron la gramicidina y la tirotricina (Ren Dubos,
1939.
ANTIBIOGRMA
Por qu realizar un antibiograma?
El primer objetivo del antibiograma es el de medir la sensibilidad de una cepa
bacteriana que se sospecha es la responsable de una infeccin a uno o varios
antibiticos. En efecto, la sensibilidad in vitro es uno de los requisitos previos para la
eficacia in vivo de un tratamiento antibitico. El antibiograma sirve, en primer lugar,
para orientar las decisiones teraputicas individuales.
El segundo objetivo del antibiograma es el de seguir la evolucin de las resistencias
bacterianas. Gracias a este seguimiento epidemiolgico, a escala de un servicio, un
centro de atencin mdica, una regin o un pas, es como puede adaptarse la
antibioterapia emprica, revisarse regularmente los espectros clnicos de los
antibiticos y adoptarse ciertas decisiones sanitarias, como el establecimiento de
programas de prevencin en los hospitales.
Hay pues un doble inters: Teraputico y epidemiolgico.
Cundo realizar un antibiograma?
Siempre que una toma bacteriolgica de finalidad diagnstica haya permitido el
aislamiento de una bacteria considerada responsable de la infeccin.
Establecer esta responsabilidad exige una colaboracin entre el bacterilogo y el
clnico. En efecto, en ciertas circunstancias, el microbilogo no podr determinar con
certeza que el aislamiento de una bacteria exige un antibiograma, sin los datos clnicos
que le aporta el mdico. Por ejemplo, una bacteria no patgena puede ser responsable
de la infeccin de un enfermo inmunodeprimido o en un lugar determinado del
50
Agresin y Defensa
organismo. La presencia de signos clnicos puede ser tambin determinante para la

realizacin de un antibiograma (por ejemplo: la infeccin urinaria con un nmero
reducido de grmenes).
SENSIBILIDAD BACTERIANA A LOS ANTIBITICOS
La determinacin de la Concentracin Inhibidora Mnima (CIM) es la base de la
medida de la sensiblidad de una bacteria a un determinado antibitico. La CIM se
define como la menor concentracin de una gama de diluciones de antibitico que
provoca una inhibicin de cualquier crecimiento bacteriano visible.
Es el valor fundamental de referencia que permite establecer una escala de actividad
del antibitico frente a diferentes especies bacterianas.
Hay diferentes tcnicas de laboratorio que permiten medir o calcular de rutina, y de
manera semicuantitativa, las CIM (mtodos manuales y mtodos automatizados o
semiautomatizados).
Estos diferentes mtodos de rutina permiten categorizar una cierta cepa bacteriana en
funcin de su sensibilidad frente al antibitico probado. Esta cepa se denomina
Sensible (S), Intermedia (I) o Resistente (R) al antibitco.
Para un determinado antibitico, una cepa bacteriana es, segn la NCCLS:
o Sensible, si existe una buena probabilidad de xito teraputico en el caso de un
tratamiento a la dosis habitual.
o Resistente, si la probabilidad de xito teraputico es nula o muy reducida. No es de
esperar ningn efecto teraputico sea cual fuere el tipo de tratamiento.
o Intermedia, cuando el xito teraputico es imprevisible. Se puede conseguir efecto
teraputico en ciertas condiciones (fuertes concentraciones locales o aumento de la
posologa).
Ciertas molculas son representativas de un grupo de antibiticos. Los resultados (S,
I, R) obtenidos con estas molculas pueden ser ampliados a los antibiticos del grupo,
que en ese caso no es necesario ensayar (Ejemplo: Equivalencia entre la cefalotina
que se ensaya y las restantes cefalosporinas de 1 generacin que no es necesario
probar, ya que el resultado puede deducirse del obtenido en la cefalotina). Este hecho
51
Agresin y Defensa
permite ensayar un nmero reducido de antibiticos, sin limitar por ello las
posibilidades teraputicas.
INTERPRETACIN DE UN ANTIBIOGRAMA
Ciertos mecanismos de resistencia se expresan dbilmente in vitro, cuando se
inscriben en el DNA bacteriano. Su expresin en el organismo, en donde las
condiciones en cuanto a medios son diferentes, expondra al riesgo de fracaso
teraputico. Para evitar esto, el antibiograma debe ser interpretado de manera global a
fin de descubrir, a travs de la comparacin de las respuestas para cada antibitico, un
mecanismo de resistencia incluso dbilmente expresado. As, gracias a la
interpretacin, una cepa que aparece como falsamente sensible ser categorizada
como I o R (Ejemplo: Una cepa de Klebsiella pneumoniae productora de BLSE puede
aparecer sensible in vitro a las cefalospornas de 3" generacin. El resultado de
Sensible debe ser corregido a Intermedio o Resistente, ya que la utilizacin de estos
antibiticos correra el riesgo de provocar un fracaso teraputico).
RESISTENCIA BACTERIANA
Cada antibitico se caracteriza por un espectro natural de actividad antibacteriana.
Este espectro comprende las especies bacterianas que, en su estado natural, sufren
una inhibicin de su crecimiento por concentraciones de su antibitico susceptibles de
ser alcanzadas in vivo. A estas especies bacterianas se les dice naturalmente
sensibles a dicho antibitico. Las especies bacterianas que no se encuentran incluidas
dentro de dicho espectro se denominan naturalmente resistentes.
El antibitico no crea resistencia, pero selecciona las bacterias resistentes eliminando
las sensibles. Es lo que se conoce con el nombre de presin de seleccin. El aumento
de la frecuencia de las cepas resistentes va unido cas siempre al uso intensivo del
antibitico en cuestin.
o LA RESISTENCIA NATURAL es un carcter constante de todas las cepas de una
misma especie bacteriana. El conocimiento de las resistencias naturales permite

prever la inactividad de la molcula frente a bacterias identificadas (despus del
crecimiento) o sospechosas (en caso de antibioterapia emprica). En ocasiones,
constituye una ayuda para la identificacin, puesto que ciertas especies se
52
Agresin y Defensa
caracterizan por sus resistencias naturales. Ejemplos: Resistencia natural del

Proteus mirabilis a las tetraciclinas y a la colistina. Resistencia natural de la
Klebsiella pneumoniae a las penicilinas (ampicilina, amoxicilina).
o LA RESISTENCIA ADQURIDA es una caracterstica propia de ciertas cepas,
dentro de una especie bacteriana naturalmente sensible, cuyo patrimonio gentico

ha sido modificado por mutacin o adquisicin de genes. Contrariamente a las
resistencias naturales, las resistencias adquiridas son evolutivas, y su frecuencia
depende a menudo de la utilizacin de los antibiticos. En el caso de numerosas
especies bacterianas, y teniendo en cuenta la evolucin de las resistencias
adquiridas, el espectro natural de actividad no es ya suficiente para guiar la eleccin
de un tratamiento antibitico. En ese caso, se hace indispensable el antibiograma.
o UNA RESISTENCIA CRUZADA es cuando se debe a un mismo mecanismo de
resistencia. En general, afecta a varios antibiticos dentro de una misma familia

(Ejemplo: La resistencia a la oxacilina en los estafilococos se cruza con todas los lactmicos). En ciertos casos, puede afectar a antibiticos de familias diferentes
(Ejemplo: La resistencia por impermeabilidad a las ciclinas se cruza con la
resistencia al coloranfenicol y al trimetoprima).
o UNA RESISTENCIA ASOCIADA es cuando afecta a varios antibiticos de familias
diferentes. En general, se debe a la. asociacin de varios mecanismos de

resistencia (Ejemplo: La resistencia de los estafilococos a la oxacilina va
frecuentemente asociada a las quinolonas, aminoglicsidos, macrolidos y ciclinas).
Con el fin de tener en cuenta la evolucin de las resistencias adquiridas y, por
consiguiente, proporcionar a los mdicos datos tiles cuando deben proceder a la
eleccin emprica de una antibioterapia, la nocin de espectro clnico completa la de
espectro natural. Definido para cada antibitico, este espectro clnico se incluye en el
Resumen de las Caractersticas del Producto (RCP). Este espectro integra no
solamente datos bacteriolgicos (espectro natural, frecuencia de las resistencias
adquiridas), sino tambin datos farmacocinticas y clnicos (las especies descritas en
el espectro son aquellas para las que se ha demostrado la actividad clnica del
producto). El espectro clnico se revisa regularmente para tener en cuenta la evolucin
de las resistencias adquiridas.
53
Agresin y Defensa
ANTIBIOGRMA REALIZADO POR EL MTODO DE DIFUSIN EN AGAR

En esta fotografa se muestra un ejemplo de antibiograma realizado por el mtodo de
difusin en agar por medio de discos.
En la imagen de la izquierda se muestra una vista general de una placa con

crecimiento bacteriano y con seis discos de antibiticos. La zona de color claro que
ocupa la mayor parte de la placa es el crecimiento bacteriano en las zonas no
inhibidas. Los crculos negros que rodean a cinco de los seis discos marcan las zonas
en que los respectivos antibiticos han inhibido, con mayor o menor eficacia, el
crecimiento del microorganismo a estudio.
El sexto disco (AM-10) no tiene a su alrededor halo de inhibicin lo que indica la
resistencia del microorganismo a ese antibitico.
La foto de la derecha, un plano ms cercano de la mitad superior de la placa, permite
observar con ms detalle lo sealado en el prrafo anterior. Puede verse adems, con
gran claridad, la especial disminucin de la intensidad de crecimiento del
microorganismo en la zona interior del halo de inhibicin del disco de CTX-30, debido
probablemente a la aparicin de mutantes resistentes de dicho microorganismo
capaces de soportar en mayor medida que el resto el efecto inhibitorio del antibitico.
El mtodo Kirby-Bauer (mtodo de difusin en agar) es empleado para determinar la
sensibilidad de un agente microbiano frente a un antibitico o quimioterpico. Este
54
Agresin y Defensa
mtodo comprende lo que se denomina un antibiograma o prueba de susceptibilidad

bacteriana frente a drogas especficas.
Sobre la superficie de una placa de agar Mller-Hinton (medio de cultivo rico, diseado
especialmente para hacer ensayos de sensibilidad) se inocula una cantidad
estandarizada de bacterias, sembrndolas de forma pareja para obtener despus de la
inoculacin un "csped" bacteriano. A continuacin se colocan discos de papel de filtro
impregnados con concentraciones conocidas de los diferentes antibiticos. La eleccin
de los antibiticos a probar depende del germen y del foco de infeccin.
El antibitico difundir desde el papel filtro al agar de forma radial. Se incuba la placa
durante 18-24 horas a 37C (respetar este parmetro, porque temperaturas menores
pueden disminuir la velocidad del crecimiento del germen y la difusin del antibitico,
dando halos irregulares difciles de medir), y luego se miden los halos de inhibicin de
desarrollo, interpretndose de acuerdo a tablas confeccionadas previamente. Los
resultados se expresan como: Sensible (S), Intermedio o Moderadamente sensible (I)
y Resistente (R).
El tamao del halo de inhibicin de desarrollo variar en base a los siguientes
parmetros o variables:
1. La concentracin de la droga.
2. Sensibilidad bacteriana.
3. Coeficiente de difusin de la droga en el agar.
4. Tiempo y temperatura de incubacin.
5. pH y composicin del medio. Se usan preparados comerciales que den
resultados reproducibles, por ejemplo: agar Mller-Hinton. Son cultivos
aceptados por el comit de la OMS para la normalizacin de las pruebas de
susceptibilidad.
6. Profundidad del medio en las placas. Esto est estandarizado: se emplean
placas de 9 cm de dimetro, y se agrega siempre el mismo volumen de medio
de cultivo: 15 ml por placa. De esta manera las placas poseen siempre la
misma altura de agar.
7. Tamao del inculo. Debe estar estandarizado ya que si ste es muy pequeo
dar una sensibilidad mayor a la real, y si el inculo es muy denso pueden
aparecer mutantes resistentes.
55
Agresin y Defensa
En los mtodos de difusin de mutantes resistentes aparecen como colonias aisladas

dentro del halo de inhibicin, por lo tanto esto indica que no se puede usar ese
antibitico y se debe informar como resistente. La forma rigurosa de estandarizar un
inculo es normalizando la turbidez por un mtodo fotomtrico utilizando una
suspensin de sulfato de bario como estndar, segn la escala de Mac Farland.
ERRORES AL REALIZAR UN ANTIBIOGRAMA
Dentro de las posibilidades que se cuentan estn: densidad del inculo mal
estandarizada, utilizacin de cultivos no puros, humedad o sequedad excesiva del
medio de cultivo que puede conducir a un crecimiento demasiado confluente o pobre,
y deterioro de los discos de aplicacin.
LIMITACIONES DE ESTE MTODO
Es un mtodo solo cualitativo, orientado al tratamiento. No es aplicable a
microorganismos de crecimiento lento ni a microorganismos anaerobios. Antibiticos
como la polimixina o la vancomicina no tienen buena difusin en agar.
CIM
La Concentracin inhibitoria mnima (CIM), en microbiologa, es la concentracin
ms baja de un antimicrobiano que inhibe el crecimiento visible de un microorganismo
despus de la incubacin repentina. Las concentraciones inhibitoria mnimas son
importantes en los diagnsticos de laboratorio para confirmar la resistencia de
microorganismos para un agente antimicrobiano y adems para monitorizar la
actividad de los nuevos agentes antimicrobianos.
Las CIMs pueden ser determinadas mediante mtodos de dilucin en caldo
normalmente siguiendo la directriz de un cuerpo de referencia tal como el CLSI, BSAC
o EUCAST. Otro, mtodo ms moderno es el mtodo E-test usando tiras de un
gradiente de concentracin antibitica.
Las tiras E-test crean elipses de inhibicin microbiana. Los puntos en donde se toma el
CIM dentro de la elipse de inhibicin es el punto donde el crecimiento bacteriano cruza
la tira
56
Agresin y Defensa
En medicina, las concentraciones inhibitoria mnimas no solo se usan para determinar

la cantidad de antibiticos que recibir el paciente sino tambin el tipo de antibiticos
usados, que a su vez reduce la oportunidad de resistencia microbiana a agentes
antimicrobianos especficos.
Antes de empezar
O No se puede tocar nada que vaya a tomar contacto con la muestra biolgica con las
manos (depresor, asa de siembre, torunda,...) para evitar contaminaciones.
O Una vez utilizado este material ha de ser eliminado en un contenedor especial.
Estos contenedores sern llevados posteriormente a una planta de tratamiento de
residuos biolgicos, donde sern incinerados.
O Todos los materiales o muestras tomadas deben estar perfectamente identificados:
nombre, grupo, fecha e indicativo del tipo de muestra.
O Al acabar la prctica, se deben lavar bien las manos.
SIEMBRA EN CAMADA DEL MICROORGANISMO PROBLEMA

O Tomamos con una jeringa una pequea cantidad de suero fisiolgico estril (2-5 ml)
y lo vertemos en un tubo de ensayo.
O A partir de la placa problema, que contiene colonias del microrganismo cuya
sensibilidad a los antibiticos queremos determinar, tomamos una muestra
SUPERFICIAL de UNA SOLA COLONIA con un asa de siembra.
O Introducimos el asa de siembra con la muestra en el tubo y agitamos el asa para
realizar una suspensin de las bacterias en el suero fisiolgico. Al acabar echamos
al contenedor de residuos el asa de siembra.
O Introducimos una torunda estril en el tubo y se pasa muy suavemente por la
superficie de una placa agar-sangre nueva. En esta ocasin realizaremos una
siembra en csped, es decir, por toda la superficie de la placa, para conseguir que
crezca bacterias de modo masivo (no interesa aislar bacterias como en la prctica
del frotis farngeo). Es importante que la siembra sea SUPERFICIAL, sin
profundizar en el medio de cultivo.
57
Agresin y Defensa
O Se tapa la placa y se rotula indicando en el nombre, grupo y fecha y marcando con

una A la tapa (antibiograma)
COLOCACIN DE LOS DISCOS DE ANTIBITICO
o
Tomamos ahora con las pinzas o aguja N 21 (previamente se ha incinerado a

la llama de un mechero) NUNCA CON LAS MANOS- un disco (monodisco)
de cada uno de los antibiticos que se facilitan (cada disco es un papel de filtro
que contiene una suspensin de uno o varios antibiticos a la concentracin
teraputica).
Se deposita el disco suavemente sobre la placa, sin tocar con la superficie con
las pinzas (no suceder esto si lo hace con una aguja, solo debe esperar que el
monodisco se adhiera al medio). Es muy importante que el disco contacte con
el medio de cultivo en un nico sitio (si ce en otro sitio dejarlo ah) flamear la
aguja.
Realizamos la misma operacin con los otros cinco antibiticos, colocando los
nuevos discos separados de los anteriores, formando un hexgono.

Evitar que en la placa, donde se realiza el antibiograma, colocar demasiados
debidos que los halos de inhibicin del crecimiento bactriano se entrecruzarn
y no podr hacer una buena lectura.
C
C
l
R
f
P
S
t
T
E
INCUBACIN Y OBSERVACIN:
o
Se llevan las placas a incubar a 37C (temperatura corporal), durante 18 a 24
horas.
Luego de este perodo se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el
crecimiento bacteriano.
58
Agresin y Defensa
MEDICIN DEL HALO DE INHIBICIN

o
Por la parte posterior de la placa incubada se medir el dimetro de los halos

de inhibicin que se han formado alrededor de los discos de antibitico a los
que la bacteria problema es sensible.
Anota los datos en la representacin (en la tabla anexa), indicando con un

nmero del 1 al 6, el antibitico colocado en el disco y dibujando la presencia o
ausencia de halos y su tamao en mm
TRASLADA LOS DATOS A LA TABLA SIGUIENTE:

TAMAO DEL HALO
DISCO
1.
2.
3.
4.
5.
6.
ANTIBITICO
DE INHIBICIN mm
SENSIBLE
INTERMEDIO
RESISTENTE
Con ayuda de las tablas que se te proporcionan determina si la bacteria es Sensible

(S), Intermedio (I) o Resistente (R) a cada antibitico y antalo en la tabla, en las
columnas correspondientes
Mediante un antibiograma podemos establecer qu tratamiento ser el ms adecuado
para el paciente afectado por una infeccin por la bacteria que estemos estudiando.
QU SON LOS HALOS DE INHIBICIN?
59
Agresin y Defensa
Alrededor de cada disco de antibitico, las bacterias sensibles a ese antibitico no

habrn podido reproducirse y, por lo tanto, no forman colonias, dejando un hueco
alrededor del disco.
POR QU SE MIDEN LOS HALOS?
No basta con ver si las bacterias han crecido o no alrededor del antibitico para saber
si son o no sensibles. Hay que saber cunto no han crecido. Solo si el halo de
inhibicin es suficientemente grande, usando el antibitico a la CONCENTRACIN
TERAPUTICA la que el antibitico puede alcanzar en el lugar de la infeccin sin
que se produzcan efectos txicos o secundarios- se dice que la bacteria es sensible al
antibitico. Por eso se mide el efecto y se consultan las tablas.
CUESTIONARIO
1 Los antibiticos son sustancias de origen natural, producidas por bacterias y
hongos, que impiden el crecimiento o la reproduccin bacteriana. Es til emplear
antibiticos contra la gripe? Por qu?
2 Qu es y qu indica la presencia de un halo de inhibicin?
3 En nuestro intestino grueso existen bacterias: es lo que se conoce como flora
intestinal. Por qu son beneficiosas estas bacterias para nuestro organismo?
60
Agresin y Defensa
4 Qu ocurrira si empleramos un antibitico de amplio espectro es decir, que

acta contra un conjunto muy variado de bacterias- teniendo en cuenta lo
contestado en la pregunta anterior?
5 uno de los problemas sanitarios ms graves en la actualidad es la aparicin de
cepas bacterianas resistentes a los antibiticos existentes. Se ha culpado de esto a
la gran capacidad de mutacin de las bacterias y a la costumbre de no terminar los
tratamientos con antibiticos (5 das, generalmente) y suspenderlos cuando se nota
cierta mejora. Podras explicar por qu esta conducta puede provocar la aparicin
de resistencias?
BIBLIOGRAFA UTILIZADA
.
SEMANA 09 - PRACTICA 09
PARTE A
MTODOS DE DIAGNSTICO PARASITOLGICO.
Detallar los procedimientos de obtencin y manejo de muestras de heces

para realizar estudios parasitolgicos.
Analizar y describir los procedimientos frecuentemente usados, en el

diagnstico de parsitos intestinales.
Realizar el examen directo y mtodos de concentracin de heces.
II. INTRODUCCIN
Puesto que el diagnstico de la parasitosis intestinal depende del hallazgo de huevos
o larvas de helmintos y quistes o trofozotos de protozoos en heces, la coleccin y el
manejo adecuado de las muestras son indispensables para la bsqueda e
identificacin de los parsitos en el laboratorio.
61
Agresin y Defensa
Son factores que interfieren en el examen, la ingestin de medicamentos previa a la

coleccin y las muestras viejas o conservadas en forma inadecuada. La cantidad de
heces para un examen rutinario es del tamao de una nuez o de cinco a seis
cucharadas. Las muestras se depositan en un recipiente de boca ancha, con tapa
hermtica y limpia, no debe contaminarse con agua, orina o cualquier otro material
extrao; no debe obtenerse de la taza del ba, ni del suelo. En lactantes, la muestra
se obtiene mediante la cucharilla recta.
Las muestras deben ser etiquetadas con el nombre del paciente, hora de coleccin y
fecha. Generalmente se recomienda examinar tres muestras en serie y en das
sucesivos. Las heces blandas, diarreicas y lquidas, deben examinarse dentro de las
primeras horas de haber sido colectadas, si esto no es posible, las heces deben
depositarse en una solucin conservadora. Ej.: Formol 10%, alcohol polivinilico (PVA),
merthiolate yodo (MIF) o fenol-alcohol-formol (PAF). Las heces formadas pueden ser
examinadas durante el mismo da de su coleccin. Si no es posible pueden ser
refrigeradas durante 24 horas o conservadas (una parte de material fecal por tres de la
solucin conservadora).
A. Examen directo - Fundamentos
Principalmente se busca en muestras frescas, la presencia de formas evolutivas de
parsitos de tamao microscpico sean estos trofozotos, quistes de protozoos:
Entamoeba histolytica, Giardia lamblia, Balantidium coli, etc.; as como larvas
(Strongyloides stercoralis), o huevos de helmintos: scaris lumbricoides, Trichuris
trichiura, Hymenolepis nana, Taenia sp., Fasciola heptica, etc.).
Elementos normales: En un examen microscpico suelen encontrarse como elementos
normales estructuras reconocibles y otras no, fruto de la ingestin de alimentos. Las
ms frecuentes son:
Fibras vegetales, Cristales de oxalato de calcio, Granos de almidn, esporas de
hongos, fosfato amnicomagnesio, granos de polen, fibras musculares lisas, fibras
musculares estriadas, cristales de cidos grasos, grasa neutra, abundantes bacteria.
62
Agresin y Defensa
B. MATERIALES
Muestras de heces fresca
Lmina porta objeto y laminilla cubreobjetos
Mondadientes
Suero fisiolgico (SF) 0.85%
Lugol
Microscopio de luz
C. PROCEDIMIENTO
1. Recolecte la muestra de heces en un envase limpio y tpela. Asegrese de no
mezclar papel higinico u orina con la muestra.
2. Transporte la muestra hasta el laboratorio a temperatura ambiente.
3. Coloque una gota de salina en una lmina portaobjeto.
4. Aada una cantidad pequea de muestra de heces utilizando un aplicador de
madera y mzclela con la solucin salina. Proceda igual agregando lugol.
5. Site un cubreobjetos sobre la muestra y examine bajo el microscopio (10X
40X).
6. Evalu la muestra y determine si hay parsitos presentes. El diagnstico
definitivo se logra demostrando la presencia de parsitos. En algunas
ocasiones es necesario hacer exmenes repetidos en das consecutivos antes
de establecer que la muestra est negativa.
Esquema:
SF
Movilidad
(Trofozotos)
Lugol
Tincin
Vacuolas
Ncleos
Lectura al microscopio
63
Agresin y Defensa
DIAGNSTICO
En las muestras de heces es posible observar parsitos intestinales, aplicando las
determinadas tcnicas segn los casos; por lo que en la prctica se estudiar el
material fresco, igualmente las preparaciones que han sido fijadas y coloreadas con
hematoxilina frrica.
RESULTADOS: Dibuje y seale las principales caractersticas de la muestra
64
Agresin y Defensa
PARTE B
RECONOCIMEINTO DE PROTOZOARIOS
Identificar y diferenciar protozoarios de importancia mdica en el Per.
Evaluar las formas diagnsticas e infectivas de los protozoarios
II. INTRODUCCIN
Los parsitos intestinales se identifican rutinariamente por sus caractersticas
morfolgicas en los anlisis de laboratorio de la materia fecal, conocidos como
examen coprolgico y examen coproscpico, mediante observacin microscpica en
montajes hmedos con solucin salina o con solucin de lugol como colorante.
Tambin se pueden hacer extendidos para realizar posteriormente coloraciones
permanentes, como la coloracin de hematoxilina frrica o la coloracin tricrmica, los
cuales facilitan la identificacin al revelar detalles estructurales no detectables en los
montajes hmedos.
En algunos casos se pueden tomar biopsias intestinales para identificar la patologa
producida por el parsito y observarlo en el tejido, en este caso se puede utilizar la
coloracin de hematoxilina-eosina, que aunque no es una coloracin especfica para
parsitos permite detectar algunos detalles del parsito buscado.
Los protozoos intestinales se presentan generalmente bajo tres formas de vida:
El trofozoito o forma vegetativa, que generalmente es el que produce la

patologa
65
Agresin y Defensa
El quiste o forma de resistencia que desarrolla el parsito para poder sobrevivir

en condiciones adversas
El prequiste que es una forma intermedia
Todos los protozoos que se transmiten por va oro-fecal presentan formas qusticas,
mientras los que se transmiten por contacto ntimo o por vectores, generalmente no
presentan esta forma de resistencia. En el intestino humano se pueden encontrar
protozoos patgenos y protozoos comensales, la aparicin de estos ltimos puede
deberse a varios factores como son las condiciones de salubridad e higiene y factores
inmunolgicos; su aparicin, aunque no amerita tratamientos para su erradicacin,
puede dar una idea de estas condiciones en los pacientes, por lo tanto en los anlisis
de laboratorio generalmente se informa su presencia. Despus de las heces, la
sangre es la muestra ms estudiada. La presencia de parsitos puede no ser
constante. Los mtodos estndar ms empleados son: Extensin fina y preparacin
de gota espesa o gota gruesa. Otras posibilidades: Extensin en fresco, Movilidad (en
caso de Trypanosomas).
Algunos de los PROTOZOOS perjudiciales para el Hombre son:
Trypanosoma cruzi, que es transmitido por TRIATOMINOS (vinchuca,

Chirimacha) y produce lo que se conoce como MAL de CHAGAS.
Leishmania sp que produce leishmaniosis cutnea que se transmite entre

animales y hombres por la picadura de flebtomos como la LUTZOMYA (son
insectos parecidos a mosquitos pero un poco ms chicos).
Trichomona vaginalis que es un protozoario que vive en los genitales y se

transmite entre humanos al momento de mantener relaciones sexuales sin
proteccin.
Giardia lamblia, que en general se transmite por consumir agua contaminadas

con quistes, est tambin es una zoonosis (se transmite de animales a
hombres).
Toxoplasma gondii, que es el responsable de la toxoplasmosis en humanos,

debe ser uno de los protozoarios ms conocidos. Esta enfermedad se
transmite tambin entre animales y hombres, aunque necesita de la presencia
de un gato para que el protozoario realice su ciclo biolgico completo. En
general es peligroso para mujeres embarazadas ya que ataca al feto y provoca
abortos.
66
Agresin y Defensa
Entamoeba histolityca, es una ameba parsita que vive en el Intestino del

hombre, cuya mucosa (clulas que tapizan el Intestino) destruye. Produce la
Disentera Amebiana, que es una diarrea con prdida de sangre.
Plasmodium vivax, Plasmodium falciparum, los cuales son responsables de

MALARIA.
III. DESARROLLO
A. MATERIAL
Heces frescas o formoladas, pool de parsitos
Lminas coloreadas con frotis de heces
Lminas coloreadas con hematoxilina ferrica o tricrmica
Pipetas, baguetas, suero fisiolgico y lugol.
Aceite de inmersin, lminas y laminillas.
Solucin sulfocrmica o legia
Microscopio de luz.
B. PROCEDIMIENTO
1. Revise bajo el microscopio de luz las lminas coloreadas entregadas por el
docente.
2. La observacin debe ser realizada a 40x y 100X. use aceite de inmersin para
observaciones a 100X.
3. Dibuje sus observaciones, Identifique el estadio del parasito, Seale la forma
diagnstica e infectiva.
4. Use los esquemas proporcionados en la gua como material de ayuda.
C. RESULTADOS
Dibuje o esquematice los parsitos observados en prcticas, sealando sus
principales caractersticas morfolgicas, estadio evolutivo, la forma diagnstica
y la forma infectiva.
67
Agresin y Defensa
68
Agresin y Defensa
69
Agresin y Defensa
D. ESQUEMAS DE AYUDA
70
Agresin y Defensa
Adulto de Lutzomyia peruensis
Trypanosoma cruzi
71
Agresin y Defensa
Trypanosoma
TRIATOMINOS
72
Agresin y Defensa
73
Agresin y Defensa
Diferencias morfolgicas de Plasmodium en sangre perifrica

RECONOCIMEINTO DE HELMINTOS
IV. OBJETIVOS DE LA PRCTICA
Identificar y diferenciar helmintos (Nematodos, Trematodos, Cestodos) de

importancia mdica en el Per.
Evaluar las formas diagnsticas e infectivas de los protozoarios
V. INTRODUCCIN
74
Agresin y Defensa
Los metazoarios o helmintos son mucho ms complejos que los protozoos, sus clulas
se agrupan formando rganos y tejidos; se reproducen sexualmente pudiendo ser
hermafroditas o presentar sexos separados. Son ovparos con excepcin de filarias,
Dracunculus spp y Trichinella spp, que son vivparos.
Los helmintos incluyen dos Phylum o clases:
1. Platelmintos: gusanos de cuerpo plano, entre los que se incluyen:
1.1.
Cestodos: son hermafroditas, tienen el cuerpo plano y segmentado, y cuando

parasitan al hombre en su estadio adulto, se ubican en intestino delgado. El
rgano de fijacin es el esclex, provisto de estructuras especialmente
adaptadas para esta funcin, estas pueden ser ventosas y btrides o ganchos.
Del esclex surge un cuello del que se genera el cuerpo, por brotacin,
constituido por segmentos, denominados progltides. Cada progltide es una
unidad funcional completa; a medida que se alejan del cuello van madurando,
denominndose a los ms distantes progltides maduros. En ellos el tero
ocupa casi su totalidad y se encuentran repletos de huevos, los que se
liberarn al romperse los segmentos. Se los conoce como tenias por ejemplo
Taenia saginata, Taenia solium, Echinococcus granulosus, etc.
1.2.
Trematodes: a excepcin del gnero Schistosoma, tambin son hermafroditas y

su cuerpo es chato pero indiviso. El estadio adulto es parsito de vertebrados,
est cubierto por una cutcula resistente y presentan discos suctorios, rganos
de fijacin, en la cara ventral. Poseen un tubo digestivo incompleto que se
inicia en la boca, llamada citostoma. Poseen un poro genital por donde se
eliminan los huevos. El ciclo evolutivo es indirecto y cumplen parte de l en el
agua. Los huevos, a excepcin del gnero Schistosoma, presentan un oprculo
por el que se libera la larva, denominada miracidio. El primer husped
intermediario es un molusco, puede haber un segundo husped intermediario
dependiendo de la especie
1.3.
Nematelmintos o Nematodos: son gusanos cilndricos, tienen sexos separados.

Su cuerpo est recubierto por una cutcula, con cavidad pseudocelmica, tubo
digestivo completo que se inicia en la boca y termina en el ano. La boca est
75
Agresin y Defensa
rodeada por tres labios, salvo en las uncinarias que presentan una cpsula
bucal con elementos cortantes; estas estructuras producen pequeos pero
mltiples traumas en la mucosa intestinal que contribuyen a la produccin de la
anemia macroctica que suele asociarse a estas parasitosis. Los huevos tienen
diferentes caractersticas que son tiles para el diagnstico de las diversas
especies. Del huevo se liberar una larva, en el tubo digestivo o en el medio
ambiente. Los estadios larvarios son varios y se producen mudas entre estadio
y estadio. El hombre se infecta por va oral, como en el caso de Ascaris
lumbricoides, por va cutnea, como en el caso de las uncinarias o por va
parenteral, como por ejemplo las filarias. Slo unas pocas especies son
parsitos del hombre y existen, a diferencia de los cestodes y trematodes,
muchos nematodos de vida libre.
VI. DESARROLLO
A. MATERIAL
Heces frescas o formoladas, pool de parsitos
Lminas coloreadas con frotis de heces
Lminas coloreadas con hematoxilina ferrica o tricrmica
Pipetas, baguetas, suero fisiolgico y lugol.
Aceite de inmersin, lminas y laminillas.
Solucin sulfocrmica o lega
Microscopio de luz.
B. PROCEDIMIENTO
5. Revise bajo el microscopio de luz las lminas coloreadas entregadas por el
docente.
6. La observacin debe ser realizada a 40x y 100X. use aceite de inmersin para
observaciones a 100X.
7. Dibuje sus observaciones, Identifique el estadio del parasito, Seale la forma
diagnstica e infectiva.
C. RESULTADOS
76
Agresin y Defensa
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Agresin y Defensa
Fasciola heptica
78
Agresin y Defensa
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Agresin y Defensa
80
Agresin y Defensa
Esquema de Dipylidium caninum.

A. Esclex B. Progltido C. Cpsula ovgera D. Huevo E. larva Cisticercoide
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Agresin y Defensa
82
Agresin y Defensa
RECONOCIMIENTO DE RGANOS Y TEJIDOS LINFOIDES
Identificar y diferenciar los principales rganos y tejidos linfoides, a travs del

reconocimiento macroscpico de la anatoma murina y el anlisis microscopio de
cortes histolgicos.
II. INTRODUCCIN
Las clulas del sistema inmune estn localizadas y organizadas dentro de
tejidos y rganos linfoides.
Estos rganos y tejidos constituyen el sistema
linftico y estn distribuidos ampliamente en todo el cuerpo.

De acuerdo a sus funciones estos rganos y tejidos linfoides se clasifican en
dos grupos:
rganos linfoides primarios, que constituyen el ambiente idneo para la

divisin de las clulas madre y su maduracin en clulas B y T. Dichos
rganos son la mdula sea roja, que se encuentra en los huesos planos y
en las epfisis de los huesos largos de adultos, y el timo. Las clulas madre
pluripotenciales de la mdula sea roja son el origen de las clulas B
maduras y las clulas pre-T, de las cuales estas ltimas emigran al timo y
maduran en l.
rganos y tejidos linfoides secundarios, donde tiene lugar gran parte de las
respuestas inmunitarias, y comprenden los ganglios linfticos y el bazo.

A. MATERIALES
Aceite de Inmersin
Alcohol etlico 96
Algodn
Bolsa plstica
Depsito o bolsa plstica para descarte de desechos slidos.
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Agresin y Defensa
Guantes de ltex
Laminas portaobjeto con cortes histolgicos
Laminillas cubreobjetos
Microscopio
Papel lente
Soporte de coloracin
B. PROCEDIMIENTO
B.1. Observacin microscpica de rganos y tejidos linfoides
1. Reconoce y ordena el material de trabajo.
2. Enciende el microscopio y coloca el primer aumento. Recuerda que
primero debes observar a 10X y luego a 40X, y finalmente pasara a 100X.
Las lminas teidas siempre se observan a 100X o inmersin.
3. Trata de reconocer las clulas de origen linfoide (linfocitos) y de origen
mieloide (Fagocitos mononucleares) presentes en la muestra.
4. Trate de reconocer la estructura de los tejidos u rganos linfoides que
esta observando.
III. ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE
1. Investigue y complete la ubicacin y nombre de las siguientes estructuras (organos
y tejidos linfoides) sealadas en las figuras N 1.
Tenga en cuenta que debe
sealar reconocer y ubicar rganos linfoides capsulados (timo, bazo, ganglio axilar,
ganglio cervical, ganglio poplteo), reconocer y ubicar tejidos linfoides no
capsulados (Tejido linfoide asociado a mucosa: Placas de Peyer, tejido intestinal y
tejido del tracto respiratorio).
2. Confeccione una tabla indicando brevemente la funcin inmunolgica principal de
cada rgano o tejido.
Qu cosas nuevas aprendi en esta prctica?
84
Agresin y Defensa
Figura 1
OBSERVACION DE TEJIDOS Y ORGANOS LINFOIDES DE RATON
VASOS
AXILARE
S
FEMUR
Fuente
comn de
medula sea
85
Agresin y Defensa
PARTE A:
RECONOCIMIENTO DE CLULAS DE INMUNIDAD INNATA Y ADAPTATIVA
Identificar y diferenciar las principales clulas de la inmunidad innata y adaptativa

presentes en la sangre, a travs del reconocimiento microscopio en frotis de
sangre perifrica.
II. INTRODUCCIN
En la sangre se encuentran presentes clulas y molculas del sistema inmune
innato y adaptativo. La observacin microscpica de clulas a travs de tcnicas
de coloracin son herramientas tiles para identificar anormalidades y dao de
las clulas, del tejido, presencia del infiltrado celular, diferenciar tipos y
cantidades de clulas inmunitarias, expresin de molculas, presencia de
agentes etiolgicos, etc.; proporcionando as informacin valiosa para la
interpretacin clnica o estudios de investigacin.
El frotis de sangre perifrica obtenido por puncin capilar y teido con Wrigth o
Giemsa, suministra un medio para estudiar la sangre y determinar las variaciones y
anormalidades de estructura, forma, tamao y nmero de las clulas sanguneas:
eritrocitos, glbulos blancos y plaquetas. Debido a esto, el frotis sanguneo es til en
el estudio de algunas alteraciones hematolgicas y como indicador de la respuesta y
los efectos deletreos de diferentes tratamientos. Es un examen fcil de practicar, est
al alcance de cualquier mdico, y se puede practicar hasta en el lugar ms remoto
donde las posibilidades de laboratorios ms sofisticados no estn disponibles. En esta
prctica el frotis sanguneo ser el medio para familiarizarnos y ayudarnos en el
reconocimiento de las clulas del sistema inmune innato y adaptativo.
III. FUNDAMENTO
86
Agresin y Defensa
La frmula leucocitaria tiene por objetivo determinar los porcentajes de las distintas
clases de leucocitos normales y anormales en la sangre. A partir de los porcentajes
puede incluso calcularse el nmero real de cada clase de leucocitos por mm3 de
sangre (valor absoluto), conocindose el total de leucocitos.
1. Caractersticas de los eritrocitos:
1.1.
Tiene el aspecto en forma de disco bicncavo, anucleado. Dan el color rojo a la

sangre por poseer hemoglobina. Mide aproximadamente 7 um.
2. Caractersticas de los leucocitos:

2.1. Granulocitos: Aquellos que tienen grnulos especficos: neutrfilos, eosinfilos y
basfilos. Los grnulos observados en extendido estn cargados de lisosomas y
enzimas hidrosolubles que son agentes antibacterianos necesarios para la digestin
de partculas fagocitarias. As tenemos:
2.1.1 Neutrfilos.
2.1.1.1 Neutrfilos en cayado: Es el granulocito en banda. Mide de 10 um a 14 um,
ncleo condensado que puede presentar una o dos constricciones, pero no tiene
puente de cromatina. El citoplasma presenta grnulos especficos e inespecficos,
membrana celular lisa, citoplasma de color ligeramente rosado dependiendo de la
coloracin.
2.1.1.2 Neutrfilos segmentados: Mide igualmente de 10 um a 14 um, ncleo que
presenta mayor condensacin y est formado por varios lbulos (hasta 4) unidos por
puentes de cromatina. El citoplasma est cargado de grnulos.
Alteraciones leucocitarias de los neutrfilos
Granulaciones txicas: Son grnulos basfilos ms oscuros que lo normal y

se observan durante el transcurso de infecciones severas y estadios txicos.
Vacuolas txicas: Se observan en el citoplasma de los neutrfilos durante

infecciones severas y estados txicos.
Cuerpos de Dohle: Son reas teidas de azul en el citoplasma de los

polimorfonucleares neutrfilos y se encuentra en infecciones, especialmente en
neumonas.
Polisegmentacin: Son neutrfilos con 5 ms lobulaciones. Se observa en

las anemias por deficiencia de vitamina B-12 y cido flico, Sndrome de Down
y otras anomalas.
Existe aumento en el nmero de neutrfilos (neutrofilia) en:
87
Agresin y Defensa
Infecciones bacterianas por agentes pigenos.
Abscesos y septicemias.
Procesos inflamatorios y necrosis tisular.
Trastornos metablicos por intoxicacin.
Procesos malignos: Carcinoma.
Hemorragias y hemlisis.
Postesplenectoma.
Existe disminucin de neutrfilos (neutropenia) en:

-
Aplasia medular.
Agentes citotxicos.
Granulopoyesis inefectiva (anemias megaloblsticas).
2.1.2. Eosinfilos: Son parecidos a los neutrfilos, miden aproximadamente 9 um.

Generalmente el ncleo es bilobulado y lo que ms caracteriza a esta clula es la
presencia de grnulos color naranja-marrn vistos claramente, muchas veces estos
grnulos hacen que se pierda la membrana celular por el rompimiento de esta, ya que
estas clulas son muy frgiles.
Existe aumento de eosinfilos (eosinofilia) en:
-
Infecciones parasitarias.
Reacciones alrgicas.
Enfermedades cutneas.
Neoplsias.
2.1.3. Basfilos: La caracterstica ms importante de esta clula es la cantidad de

grnulos de color azul negruzco que se encuentra ocupando toda la clula (esto
cuando la clula es madura) y parte de la clula cuando sta es inmadura. Mide
aproximadamente 12 um. Presenta un ncleo que muchas veces no logra observarse
por la cantidad de grnulos que contiene histamina y heparina.
2.2. Agranulocitos: No poseen grnulos. Aqu tenemos a los linfocitos y monocitos.
2.2.1. Linfocitos: Miden de 6 um a 10 um, presentan generalmente un ncleo
ligeramente oval que ocupa casi toda la clula, la cromatina es densa, citoplasma
escaso, y puede contener grnulos azurfilos inespecficos.
88
Agresin y Defensa
Pueden encontrarse tambin una alteracin de los linfocitos llamados linfocitos

atpicos, que miden de 15 um a 20 um, ncleo irregular, indentado, excntrico y puede
observarse nuclolos. El citoplasma es amplio, color azul tenue, y puede presentar
grnulos azurfilos y vacuolas. Estas clulas pueden observarse en mononucleosis
infecciosa, hepatitis viral, herpes zoster, enfermedades autoinmunes, y normalmente
pueden hallarse hasta en 5 %.
2.2.2. Monocitos: Son los leucocitos de mayor tamao en la sangre (12 um a 15 um).
Su ncleo es generalmente excntrico, aunque puede ser central. Su cromatina
nuclear es laxa, distribuida en forma regular, la forma del ncleo generalmente es de
una madeja de lana o arrionada, aunque puede tener forma de un abastonado. El
citoplasma es de color grisceo y puede presentar grnulos inespecficos (azurfilos).
Los monocitos se encuentran elevados en: Enfermedades como la Tuberculosis,
endocarditis bacteriana, enfermedades virales como sarampin, rubola, etc.,
colagenosis, neoplasias, etc.
IV. DESARROLLO DE LA PRACTICA
A.
MATERIALES
Aceite de Inmersin, Alcohol etlico 70, Algodn, Agua destilada o

buffer fosfato pH 6.5, Batera de coloracin Wrigth
Mandil de laboratorio, Cronmetro, Curitas circulares (opcional)
Delantal plstico
Depsito plstico descartador de material punzocortante
Depsito o bolsa plstica para descarte de desechos slidos.
Encendedor
Guantes de ltex
Goteros o pipetas
Pipeteadores manuales o automticos
Laminas portaobjeto limpias
Laminillas cubreobjetos
Lancetas
Microscopio
Mechero de alcohol
89
Agresin y Defensa
Papel lente para microscopio
Soporte de coloracin
A. PROCEDIMIENTO
(Si no comprende algn paso, solicite ayuda de los instructores)
B.1. Preparando el frotis o extendido de sangre
1. Ubica todos los materiales que usaras ene este procedimiento. Este material
debera estar sobre la mesa de trabajo.
2. Ponte los guantes de ltex.
3. Con un algodn empapado en alcohol desinfecta el dedo que se va a pinchar
(usa del dedo de un compaero. Procura que sea de la mano que no use para
escribir).
4. Coge una lanceta estril por el extremo romo, cuidando de no tocar la punta
para que se mantenga estril, y luego pncha el extremo lateral de la yema del
dedo medio. El pinchazo debe ser profundo, de tal manera que la sangre salga
por simple flexin de la falange, sin necesidad de apretar.
5. Deposita una gota de sangre en un extremo de la lmina portaobjeto.
6. Una vez recogida la sangre necesaria vuelve a limpiar el dedo con el algodn
mojado en alcohol y coloca un curita en el dedo lastimado.
7. Para realizar el frotis (extensin) se proceder como indica el siguiente dibujo:
A. Deposita una pequea gota de
sangre
en
un
extremo
del
portaobjetos.
Si la cantidad de sangre es excesiva
las clulas quedarn apelotonadas
en
la
extensin
ser
difcil
observarlas.
Coloca
el
segundo
portaobjetos
formando un ngulo de unos 45 con

el primero y asegurndote de que
apoya todo el borde.
90
Agresin y Defensa
Desliza lentamente el portaobjetos hacia la gota de sangre hasta que entren en

contacto. Vers como la sangre se extiende por el borde.
B. Desliza ahora el porta en el sentido contrario en un movimiento rpido y procurando
que no pierda el contacto con el otro. (Si no entiendes, avisa al instructor)
C. Todo el procedimiento se debe realizar apoyado en la mesa y sujetando el porta
como indica el dibujo.
D. Deja secar el frotis al aire y luego con ayuda del mechero completaras el proceso
de secado. Para usar el mechero debes acercar la lmina portaobjeto por la parte
posterior que no contiene el frotis, luego con movimientos cortos y moderados sobre el
mechero logrars secar adecuadamente. Ahora la lmina esta lista para la coloracin.
B.2. Coloracin de Wrigth para extendidos de sangre
1. Con ayuda de un gotero o pipeta, coloca 1,0 ml del colorante Wright sobre el
frotis, espera 2 minutos.
2. Luego aadir 2,0 ml de agua destilada o buffer fosfato pH 6.5 y deja reposar
otros 2 minutos.
3. Enjuaga el frotis teido con el agua o buffer fosfato pH 6,5 hasta que los bordes
del frotis se muestran ligeramente rojizos.
4. Seca el frotis teido muy cuidadosamente al aire libre o con ayuda del
mechero. (La intensidad de la coloracin puede ser ajustada por una mayor
dilucin o por mayor o menor tiempo de reaccin con el colorante).
B.3. Observacin al microscopio
1. Enciende el microscopio y ubica el frotis en la platina del microscopio.
2. Coloca el primer aumento (generalmente son el objetivo de 5 o 10X) y enfoca
el frotis usando la perilla macro y micromtrica.
3. Ajusta la luz del condensador y el diafragma.
4. Ubica el objetivo en la cola del extendido. Recuerda que los extendidos de
sangre se leen por el extremo mas alejado de donde colocaste la gota de
sangre, y este extremo generalmente se llama cola del extendido. (La parte
media del extendido se llama cuerpo, y el extremo donde iniciaste el
extendido se llama cabeza). En la cola las clulas estn muy bien
separadas unas de otras, y esto te permitir observarlas y diferenciarlas
individualmente.
91
Agresin y Defensa
5. Ahora cambia al objetivo de 40X y podrs empezar a leer la lmina.

6. Si no puedes diferenciarlas a este aumento, entonces debes usar el aumento
de 100X; pero recuerda que con este objetivo debes colocar previamente en la
lmina una gota de aceite de inmersin.
7. Las caractersticas morfolgicas y de coloracin de cada clula presentes en el
frotis sanguneo se muestran a continuacin en las siguientes tablas. Esto te
ayudar a reconocerlas, por eso debes leer cuidadosamente esta informacin.
ERITROCITOS
Tipo celular
Eritrocitos
Aspecto
Forma de disco bicncavo.
Anucleados. Dan el color rojo a
la sangre por poseer
Hemoglobina.
Tamao
Abundancia
Coloracin
7 m
(referencia)
~700 por cada

Leucocito
Rojo
amarillento
LEUCOCITOS (Abundancia: ~1 por cada 700 eritrocitos)
Granulocitos
Tipo celular
Neutrfilos
Eosinfilos
Agranulocitos
Basfilos
Aspecto
Tamao
Ncleo con 3-5 lbulos unidos

por un filamento. Granulacin
muy fina, difcilmente
perceptible.
Ncleo con dos lbulos unidos
por un delgado filamento. Las
granulaciones acidfilas dan
una coloracin rojiza al
citoplasma.
Ncleo voluminoso bilobulado.
Los grnulos basfilos son
gruesos, tien el citoplasma de
color oscuro y frecuentemente
dificultan la observacin del
ncleo.
Linfocitos
Ncleo esfrico que ocupa la

mayor parte de la clula.
Citoplasma muy escaso.
Monocitos
Ncleo ovoide, en forma de

rin o de herradura. El ncleo
es ms claro que el de los
linfocitos (cromatina
menos densa)
Abundanci
a
Coloracin
12 m
~1 de cada
2
leucocitos
Ncleo: Prpura oscuro

Grnulos: Lila-rojizos
Citoplasma: rosa plido
9 m
~3 de cada
100
leucocitos
Ncleo: Azul
Grnulos: rojo a rojonaranja
Citoplasma: Azul
12 m
~1 de cada
200
leucocitos
Ncleo: Prpura o azul

oscuro
Grnulos: Prpura muy
oscuro
6-8 m
~1 de cada
3
leucocitos

Citoplasma: Azul claro
(celeste)
~1 de cada
15
leucocitos

Citoplasma: Azul claro
(celeste)
9-12 m
V. ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE
1. Usando las siguientes tablas, debers dibujar los diferentes tipos de clulas que
observas en el frotis, tratando de calcular su tamao aproximado utilizando como
92
Agresin y Defensa
referencia el tamao de los glbulos rojos. No olvides poner junto a cada dibujo los
aumentos con los que has realizado la observacin.
2. Luego, debes completar la informacin solicitada en los espacios en blanco. No
olvides seala qu rasgos o caractersticas te han permitido identificar cada tipo de
clula.
3. Luego debes reconocer y discutir que clulas presentes en el frotis sanguneo
participan en la inmunidad innata y adaptativa, y que funciones inmunolgica tiene
cada una de ellas. Recuerda que en todo momento puedes discutir tus respuestas
con los dems compaeros de mesa o usando tus libros.
Eritrocito
Caractersticas morfolgicas y de coloracin diferentes con otras clulas
Caractersticas y funciones inmunolgicas
Aumento: .. X
Neutrfilo
Aumento: .. X
Eosinfilo
Aumento: .. X
93
Agresin y Defensa
Basfilo
Caractersticas morfolgicas y de coloracin diferentes con otras

clulas
Aumento: .. X
Monocito

clulas
Aumento: .. X
Linfocito

clulas
Aumento: .. X
PARTE B
94
Agresin y Defensa
RECEPTORES TCR y BCR

Identificar y diferenciar la estructura molecular de los receptores de reconocimiento

de antgeno de los linfocitos T, usando representaciones grficas.
II. INTRODUCCIN
El nexo entre la inmunidad innata y adaptativa es la presentacin del antgeno a
los linfocitos T por parte de las clulas presentadoras de antgeno o APC (del
ingles antigen presenting cells). La inmunidad adaptativa se inicia con el
reconocimiento del antgeno por parte del Linfocito T a travs de su receptor
para antgeno, el cual tambin recibe el nombre de Receptor de Clula T o TCR
(del ingls T cell receptor).
El TCR- es una molcula proteica heterodimera, conformadas por dos
cadenas
polipeptdicas transmembrana, denominadas y ; ambas unidas
covalentemente entre s por puentes disulfuro. Cada Cadena esta a su vez

constituida por: Dos regiones globulares unidas a carbohidratos (una regin
variable (V) amino terminal y una regin constante (C) carboxilo terminal), una
regin transmembrana hidrofbica, y una cola citoplasmtica corta. La
expresin del TCR esta codificada por genes. En la cadena , la regin variable
est codificada por los genes V y J, y la regin constante est codificada por el
gen C. En la cadena , la regin variable est codificada por los genes V, D y J,
y la regin constante est codificada por el gen C. Las regiones variables de las
cadenas y del TCR- , forman los sitios de unin para el antgeno. La
recombinacin de los genes de la regin variable hace posible la expresin de
un gran nmero de TCR- capaces de reconocer una gran diversidad de
antgenos. La molcula CD3 es una molcula proteica compleja formada por 4
cadenas polipeptdicas, denominadas , , y . Cada una de las cadenas , y
presentan una regin extracelular grande, una regin transmembrana con
cargas negativas y una cola citoplasmtica que contiene una secuencia
conservada ITAM (del ingles Immunoreceptor Tyrosine-Based Activation Motif)
rica en Tirosinas. Mientras que la cadena presenta una regin extracelular muy
corta,
una
regin
transmembrana
con
cargas
negativas
una
cola
95
Agresin y Defensa
citoplasmtica larga que contiene tres regiones ITAMs. Las cadenas , y

forman heterodmeros entre s: - y -; mientras que la cadena forma un
homodmero - unidos entre s por puentes disulfuro. La molcula CD3 se une
al TCR- no covalentemente a travs de cargas inicas en la regin
transmembrana.
El Linfocito B reconoce a los antgenos a travs de su receptor especfico
denominado Receptor de la Clula B o BCR (del ingls B cell receptor),
constituido por molculas de inmunoglobulina de membrana (mIg). Los LB
reconocen al antgeno a travs de su Complejo de Reconocimiento del antgeno,
conformado por el BCR (mIg) y dos protenas accesorias denominadas Ig e Ig.
El BCR lo constituye una molcula de inmunoglobulina de membrana (mIg) de
tipo IgM. Estructuralmente el BCR es una protena simtrica formada por dos
cadenas pesadas idnticas denominadas cadenas H (del ingles Heavy) y dos
cadenas ligeras idnticas denominadas cadenas L (del ingles Light).
Ambas cadenas presentan una regin amino-terminal variable (V), una
regin carboxi-terminal constante (C) y se encuentran organizadas en regiones
globulares denominados dominios de Ig.
Las cadenas pesadas H son de tipo y son las que se encuentran ancladas a la
membrana del LB. Presentan una regin V formada por 1 dominio de Ig
denominado VH (del ingls Variable Heavy Chain), una regin constante formada
por 4 dominios de Ig denominados CH1, CH2, CH3 y CH4 (del ingls Constant
Heavy Chain), una regin transmembrana hidrofbica, y una cola citoplasmtica
corta. Las cadenas ligeras L, pueden ser de tipo o . Presentan una regin V
formada por 1 dominio de Ig denominado VL (del ingls Variable Light Chain) y
una regin constante formada por 1 dominio de Ig denominado CL (del ingls
Constant Light Chain). Las regiones variables de las cadenas H y L se unen
entre si para formar el sitio de unin para el antgeno. Finalmente las cadenas
pesadas se unen entre si para dar lugar a la estructura final de la mIg. Las
uniones entre las cadenas son de tipo covalente, a travs de puentes disulfuro.
La expresin del BCR esta codificada genticamente. En la cadena H, la regin
variable est codificada por los genes V, D, J y la regin constante est
codificada por el gen C. En la cadena L, la regin variable est codificada por
los genes V, J y la regin constante est codificada por el gen C o C. La
recombinacin de los genes que conforman la regin variable hace posible la
96
Agresin y Defensa
expresin de un gran nmero de BCR capaces de reconocer una gran diversidad

de antgenos. Sin embargo, el dominio citoplasmtico del BCR es demasiado
corto para poder traducir una seal de reconocimiento y activacin, razn por la
cual requiere de otras protenas accesorias.
A.
MATERIALES
Pliegos de papelografos de color blanco
Plumones punta gruesa color verde, rojo, azul, negro.
B.
PROCEDIMIENTO
El presente trabajo grupal comprender las siguientes actividades:

Evaluacin de entrada al inicio del trabajo grupal correspondiente al tema de la
prctica.
Presentacin y discusin sobre las preguntas y/o actividades propuestas
durante el trabajo grupal.
Evaluacin de salida individual correspondiente a las actividades desarrolladas
en el trabajo grupal.
Durante el taller los estudiantes no podrn hacer uso de libros, copias o alguna otra
fuente bibliogrfica, impresa o electrnica.
C.
RESULTADOS
Los alumnos presentarn de manera expositiva los resultados de la discusin grupal.

El alumno que expondr los resultados ser seleccionado al azar.
IV.
PREGUNTAS DE REVISIN
1.
Dibuje la estructura del complejo de reconocimiento del

antgeno, identificando sus componentes moleculares.
2.
Confeccione un cuadro identificando: Componente

celular, molculas de Seal 2, sus respectivos ligandos o receptores, y la
funcin que desempea en el reconocimiento del antgeno.
3.
A travs de un esquema o dibujo (elaborado por usted)

identifique las citocinas que intervienen en el reconocimiento de antgeno y
activacin del linfocito T, y seale la funcin de la citocina durante estos
procesos.
4.
A travs de un esquema o dibujo explique las diferencias

entre la respuesta Th1 y Th2.
97
Agresin y Defensa
5.
Esquematice (diseado por usted mismo) el complejo de

reconocimiento del antgeno del linfocito B, identificando sus componentes
moleculares.
6.
A travs de un esquema (diseado por usted mismo)

explique los eventos durante la activacin del LB, en una respuesta T
dependiente.
7.
A travs de un esquema (diseado por usted mismo)

explique los eventos durante la activacin del LB, en una respuesta T
independiente.
PARTE A:
REACCIN ANTGENO-ANTICUERPO
I.
OBJETIVOS DE LA PRCTICA
Evidenciar la reaccin antgeno-anticuerpos y su utilidad en el diagnstico clnico,

mediante la realizacin y visualizacin del ensayo de aglutinacin para determinar el
grupo sanguneo.
II.
INTRODUCCIN
El diagnstico inmunolgico es una de las herramientas ms tiles del laboratorio

clnico en el diagnstico rpido de las enfermedades infecciosas y son de gran ayuda
para el mdico en la interpretacin clnica de la enfermedad y el tratamiento efectivo.
El Inmunodiagnstico se basa en la deteccin in vitro de la reaccin antgenoanticuerpo (Ag/Ac) en muestras biolgicas de los pacientes, y su deteccin permite
conocer o inferir si el paciente sufre infeccin activa aguda (reciente) o crnica
(pasada), el estado de su inmunidad humoral y celular frente al agente infeccioso o las
vacunas o al tratamiento, y ha contribuido con la evaluacin epidemiolgica de muchas
enfermedades trasmitidas por agentes infecciosos.
La unin de anticuerpos a sus respectivos antgenos especficos mediante enlaces
dbiles (puentes de hidrgeno, fuerzas de Van der Walls, interacciones electrostticas
e hidrofbicas) genera complejos moleculares Ag-Ac, los cuales son relativamente
estables in vitro cuando existen concentraciones equivalentes de anticuerpo y
98
Agresin y Defensa
antgeno. Sin embargo, es necesario un adecuado proceso de estandarizacin de la

reaccin Ag-Ac antes de su empleo en el Inmunodiagnstico, debido a la prdida de
estabilidad por factores externos como el pH y temperatura de reaccin.
El trmino afinidad se utiliza para describir la fuerza de la unin entre el sitio de unin
del AC y el sitio de su unin al Ag. Los Ac y Ag pueden tener varios sitios de unin y la
suma de todas las fuerzas de unin presentes en el Ac o Ag se denomina afinidad
funcional o avidez. Existen varios tipos de reaccin Ag-Ac usados frecuentemente en
el laboratorio clnico:
Aglutinacin, precipitacin, inmunofluorescencia, enzimoinmunoensayos (Ej. ELISA),
inmunocromatografa,
inmunohistoqumica,
inmunoblot,
quimioluminiscencia,
citometra de flujo, entre otros. En general estos procedimientos son considerados

directos cuando detectan antgenos en la muestra del paciente, o indirectos si detectan
anticuerpos. Mientras que la aglutinacin y precipitacin permiten visualizar
directamente la formacin de complejos Ag-Ac; otros ensayos como el ELISA, western
blot, inmunofluorescencia, inmunohistoqumica o radioinmunoensayo
requieren
reactivos adicionales marcados con enzimas, fluorocromos o radioistopos.

Los precipitados inmunolgicos son complejos insolubles formados por la unin de
anticuerpos (precipitinas) y antgenos (precipitingenos) que se encuentran en
solucin. Para la formacin de na malla de precipitado se requiere que tanto las
precipitinas como los precipitingenos sean menos bivalentes.
Esta reaccin tiende a ocurrir ms rpido con el aumento de la temperatura, aunque la
precipitacin ms compleja es obtenida usualmente a temperaturas bajas (0-4C).
Est determinada por el fenmeno de zona, lo cual quiere decir que la mxima
precipitacin ocurre en un punto o zona de equivalencia que para poder ser visible es
necesario determinar las proporciones ptimas de los reactivos.
Las reacciones de aglutinacin consisten en la agregacin de material en partculas,
tales como clulas o material sinttico por los anticuerpos llamados aglutininas. La
reaccin toma lugar sobre la superficie de las partculas que poseen el antgeno
disponible para los sitios de unin especfica de los anticuerpos. La aglutinacin es un
ejemplo de una reaccin inmune secundaria. Las primeras reacciones de aglutinacin
involucraban aglutininas bacterianas en experimentos llevados a cabo por los primeros
bacterilogos. Este trabajo llev a la formulacin de la idea de anticuerpos. La utilidad
99
Agresin y Defensa
de este simple procedimiento dio lugar a la era del serodiagnstico en microbiologa.

El uso prctico de los procedimientos de aglutinacin se ha expandido de las reas de
la infectologa e inmunohematologa para el estudio de enfermedades infecciosas,
autoinmunes, ensayos endocrinolgicos y otros. Las tcnicas clsicas de aglutinacin
directa han dado lugar a una variedad de tcnicas que involucran el recubrimiento de
partculas portadoras con antgeno o anticuerpo, ya sea por procesos de adsorcin
pasiva o a travs de la unin covalente de los antgenos al portador, mediante
manipulacin qumica.
Por ltimo, la determinacin del grupo sanguneo se basa en la reaccin antgenoanticuerpo, la cual se puede llevar a cabo de forma directa (determinando los
antgenos presentes en la superficie del eritrocito del paciente al contacto con el
reactivo anti A, B, AB o D) o indirecta (determinando los anticuerpos presentes en el
suero del paciente y enfrentndolo a eritrocitos conocidos (A, B o AB).
III.
FUNDAMENTO
El grupo sanguneo son los tipos en que se ha clasificado la sangre de las personas en
relacin con la compatibilidad de los hemates y suero de otro individuo que la
recibe.Segn la clasificacin de Landsteiner (clasificacin universal) se denominan: O,
A, B, AB. Se caracterizan por las diferentes combinaciones de dos aglutingenos
existentes en los glbulos rojos y de dos aglutininas contenidas en el suero.
Los eritrocitos poseen antgenos en su membrana que son distintos para cada
individuo; las pruebas utilizadas para establecer la hemoclasificacin sangunea
relacionada a los diversos grupos sanguneos, aprovechan las caractersticas
inmunolgicas que expresa cada individuo de acuerdo a su particular codificacin
gentica. En dichas pruebas se evidencian los antgenos y/o anticuerpos sanguneos,
de acuerdo a su comportamiento in vitro. En el sistema ABO se investigan tanto
antgenos o aglutingenos como los anticuerpos o isoaglutininas naturales.
El factor Rh es un aglutingeno encontrado en 1940 por Landsteiner y Weiner, en los
glbulos rojos de primates (Macacus Rhesus) y que tambin existe normalmente en el
85 % de los humanos, que por esta causa se denomina Rh positivos. En el sistema
Rh, existen varios antgenos: D, C, c, E, e; sin embargo, de rutina, solo se determina la
presencia del antgeno D en los eritrocitos y de acuerdo a su presencia o ausencia se
dice que un individuo es Rh D positivo o Rh D negativo.
100
Agresin y Defensa
IV.
REACTIVOS Y MATERIALES
-
Guantes de ltex., Mandil laboratorio, Depsito plstico para descarte

de material punzocortante.
Plumn indeleble, Lminas porta objetos, Palillos desechables o varillas

de vidrio.
Lancetas, Algodn.
Kit comercial de sueros tipificadores Anti-A, Anti-B y Anti-D (Anti-Rh).
Alcohol 70.
Reactivos:
V.
PROCEDIMIENTO
1.
Ubique y ordene todos los materiales que se utilizarn en

este procedimiento. Este material deber estar sobre la mesa de trabajo.
2.
Colocarse los guantes de ltex.
3.
Con un algodn empapado en alcohol desinfecta el dedo

que se va a pinchar (organcese con un compaero de su grupo para que se le
tome la muestra de sangre. Procure que sea de la mano que no use para
escribir).
4.
Tome una lanceta estril por el extremo romo, cuidando

de no tocar la punta para que se mantenga estril, y luego pincha el extremo
lateral de la yema del dedo medio. El pinchazo debe ser profundo, de tal
manera que la sangre salga por simple flexin de la falange.
5.
Deposita una gota de sangre en una lmina porta objetos

(por triplicado) marcadas como Anti-A, Anti-B y Anti-D.
6.
Una vez recogida la sangre necesaria vuelve a limpiar el

dedo con el algodn empapado en alcohol, mantener el dedo presionado
durante algunos minutos.
7.
Agregar una gota de los antisueros A, B y D en cada una

de las lminas, segn corresponda.
8.
Mezclar cada preparacin con un palillo o varilla de

vidrio, en forma lenta y homognea.
9.
Rotar manualmente cada lmina con cuidado.
10.
Observar aglutinacin y registrar los resultados.
101
Agresin y Defensa
11.
Interpretacin: Positivo: La aglutinacin fuerte de los

glbulos rojos en presencia de cualquier anticuerpo ABO y Rh. Las reacciones
positivas muestran 3+ de aglutinacin. Negativo: La presencia de una
suspensin uniforme (0) de glbulos rojos.
VI.
1. Qu diferencias existen entre las reacciones de aglutinacin y precipitacin?

2. Por qu es importante conocer el grupo sanguneo?
3. Qu otros mtodos existen para determinar el grupo sanguneo?
PARTE B
ESTRUCURA Y FUNCION DE LOS ANTICUERPOS
I.
Identificar y diferenciar la estructura molecular y la funcin de los anticuerpos.
II.
INTRODUCCIN
Los anticuerpos o inmunoglobulinas, son glicoprotenas producidos por los LB, que
pueden ser expresados en membrana o secretados por los LB diferenciados en
clulas plasmticas.
Los anticuerpos se unen a antgenos especficos durante las fases de reconocimiento
y efectora de la inmunidad humoral:
En la fase de reconocimiento a travs de la mIg o BCR.
En la fase efectora a travs de anticuerpos secretados por los LB
diferenciados.
Todas las molculas de anticuerpo secretadas por una clula plasmtica, tendrn la
misma especificidad que el BCR que inicialmente fue activado.
Todas las molculas de anticuerpo presentan la misma estructura bsica: dos cadenas
pesadas idnticas denominadas cadenas H y dos cadenas ligeras idnticas
denominadas cadenas L.
102
Agresin y Defensa
Ambas cadenas presentan una regin amino-terminal variable (V), una regin carboxiterminal constante (C) y se encuentran organizadas en regiones globulares
denominados dominios de Ig.
El nmero de dominios de la regin constante vara en los diferentes tipos o isotipos
de anticuerpos.
Se conocen 5 isotipos de inmunoglobulinas denominados: IgM, IgD, IgG, IgE e IgA.
Las cadenas pesadas H son de diferente clase, dependiendo del isotipo de Ig:
1.
Las IgM, presentan cadenas H de tipo
2.
Las IgD, presentan cadenas H de tipo
3.
Las IgG, presentan cadenas H de tipo
4.
Las IgE, presentan cadenas H de tipo
5.
Las IgA, presentan cadenas H de tipo
Las cadenas ligeras L, pueden ser de tipo . Las regiones variables de las cadenas
H y L se unen entre s para formar el sitio de unin para el antgeno. Finalmente las
cadenas pesadas se unen entre s para dar lugar a la estructura final de la mIg. Las
uniones entre las cadenas son de tipo covalente, a travs de puentes disulfuro.
Cada anticuerpo contiene por lo menos dos regiones de unin al antgeno, formado
por un par de dominios VH y VL. Adicionalmente presentan una regin llamada
bisagra, que le da la flexibilidad necesaria a la molcula de Ig. Las regiones variables,
amino-terminales participan en el reconocimiento del antgeno. Reciben este nombre
por la alta variabilidad de los aminocidos que la conforman.
Cada anticuerpo contiene por lo menos dos regiones de unin al antgeno, formado
por un par de dominios VH y VL
Las regiones constantes, carboxi-terminales no participan en el reconocimiento del
antgeno. Pero, las regiones constantes, de las cadenas H, interactan con otras
clulas y molculas efectoras del sistema inmune para llevar a cabo varias acciones.
III.
103
Agresin y Defensa
A.
MATERIALES
B.
PROCEDIMIENTO
Evaluacin de entrada al inicio del trabajo grupal correspondiente al

tema de la prctica.
Presentacin y discusin sobre las preguntas y/o actividades

propuestas durante el trabajo grupal.
Evaluacin de salida individual correspondiente a las actividades

desarrolladas en el trabajo grupal.
C.
RESULTADOS

IV.
1.
Esquematice (diseado por usted mismo) el complejo de reconocimiento del

antgeno del linfocito B, identificando sus componentes moleculares.
2.
A travs de un esquema (diseado por usted mismo) explique los eventos

durante la activacin del LB, en una respuesta T dependiente.
3.
A travs de un esquema (diseado por usted mismo) explique los eventos

durante la activacin del LB, en una respuesta T independiente.
4.
Dibuje (hgalo usted mismo) la estructura bsica de una molcula de

anticuerpo y seale sus partes.
104
Agresin y Defensa
5.
Confeccione un cuadro (diseado por usted mismo) identificando: Isotipos,

concentracin srica, funciones del anticuerpo.
6.
A travs de un esquema o dibujo (diseado por usted mismo) explique a que se

denomina respuesta primaria y respuesta secundaria.
7.
A travs de un cuadro (diseado por usted mismo) identifique las citocinas que
intervienen en activacin del linfocito B, sealando la funcin que desempea.
PARTE A:
SISTEMA DEL COMPLEMENTO
I.
Identificar y diferenciar la estructura molecular y la funcin de las protenas de las tres

vas principales de activacin del complemento.
II.
INTRODUCCIN
El sistema del complemento est constituido por ms de 30 protenas que se

encuentran en el plasma y en la superficie de muchas clulas, las cuales interactan
entre si y con otros componentes del sistema inmunitario en forma altamente regulada.
La activacin del complemento implica la fragmentacin (clivaje) secuencial de las
protenas (proteolisis), para generar enzimas con actividad proteoltica denominados
zimgenos y dar lugar a una cascada de activacin. A los componentes del
complemento se les designa con la letra C (de complemente), seguido de un nmero.
Cuando estos componentes van adems seguidos de una letra minscula a o b,
indican que han sufrido fragmentacin por proteo lisis. La letra a se usa para designar
al fragmento de menor tamao (que es el que queda libre) y la letra b para designar al
fragmento de mayor tamao (que es el que forma parte del complejo de activacin).
Existen tres vas para la activacin de este sistema: la va clsica, la va alterna y la
va de las lectinas o de unin a manosa. Estas vas difieren en el inicio de la
activacin, luego confluyen en un punto comn que es la ruptura enzimtica de la
molcula C3 y finalmente comparten una va comn que conduce a la formacin del
105
Agresin y Defensa
complejo de ataque a la membrana; un complejo lipoflico de protenas plasmticas

que abre poros en la superficie celular y lleva a la lisis de las clulas.
La va clsica del complemento se activa por la unin del complejo C1 a la regin Fc
de los anticuerpos. Los anticuerpos capaces de activar el complemento son: la IgG en
su dominio CH2 y la IgM en su dominio CH3, nicamente cuando estn unidos a un
antgeno. La IgM es ms eficiente que la IgG en la activacin del complemento, y
dentro de las sub-clases de IgG, las ms eficientes son la IgG1 y la IgG3.
III.
A.
MATERIALES
B.
PROCEDIMIENTO

tema de la prctica.
Presentacin
discusin
sobre
las
preguntas
y/o
actividades

C.
RESULTADOS

IV.
1.
Esquematice y explique la activacin de la va clsica del complemento.
2.
Esquematice y explique la activacin de la va alternativa del complemento.
106
Agresin y Defensa
3.
Esquematice y explique la activacin de la va de las Lectinas del

complemento.
4.
Esquematice la accin de las anafilotoxinas
5.
Construya un cuadro sealando los componentes del complemento y la funcin

que desempean.
PARTE B
INMUNIDAD FRENTE A INFECCIONES
I.
Identificar, analizar y diferenciar la respuesta defensiva frente a diferentes agentes

patgenos.
II.
INTRODUCCIN
Una amplia variedad de agentes infecciosos (virus, bacterias, protozoos, hongos y

helmintos) son capaces de infectar a los seres humanos. En muchos casos, el agente
infeccioso puede colonizar un tejido u rgano y mantener su nmero sin causar dao
(colonizacin). La enfermedad infecciosa ocurre cuando ocasiona signos y sntomas
de inflamacin o de perturbacin funcional de los rganos dando lugar a un problema
clnico y no es una consecuencia inevitablemente asociada a infeccin.
Existen una gran variedad de mecanismos mecnicos, qumicos, celulares e
inmunolgicos que se han desarrollado a lo largo de la evolucin de la especie
humana para prevenir la invasin de los microorganismos. Entre estos ltimos el ms
importante es el sistema inmune.
Las reacciones de defensa del cuerpo pueden producirse de forma especfica o
inespecfica. Las respuestas inespecficas, aunque indiscriminadas y no especficas de
Ag, tienen la ventaja de intervenir rpidamente durante una infeccin aguda y pueden
permitir la supervivencia del hospedador hasta que las respuestas especficas
congreguen nuevas defensas. Las respuestas inespecficas, la mayora de las cuales
107
Agresin y Defensa
se producen minutos u horas despus de la infeccin, componen lo que se denomina

respuesta o inmunidad natural o innata cuyo nivel no se incrementa por inmunizacin
repetida. En contraposicin, la inmunidad adaptativa o Ag especfica, se incrementa
por inmunizacin repetida del Ag que la induce, tarda en aparecer das o semanas tras
la exposicin primaria, pero con frecuencia es indispensable para una completa
resolucin de la enfermedad. Aunque la mayor parte de los mecanismos de defensa se
describen por separado son sistemas ntimamente relacionados que rara vez actan
independientemente.
La respuesta inmune especfica normalmente es lenta y no muy efectiva cuando se
enfrenta a un microorganismo por primera vez. Sin embargo, cuando se induce
memoria inmunolgica, la segunda vez es mucho ms rpida y efectiva. Esta
respuesta, que se caracteriza por poseer especificidad y memoria, est mediada tanto
por linfocitos T como B que poseen receptores especficos de Ag en su membrana
capaz de reconocer variados determinantes antignicos.
Las respuestas inmunes adaptativas pueden ser de tres tipos principales considerando
los principales mecanismos efectores. Los monocitos son incapaces de destruir ciertos
patgenos, pero su capacidad de destruccin aumenta considerablemente si son
activados por citocinas secretadas por clulas Th1. Esta activacin es mediada por
IFN-g, aunque otras linfocinas, especialmente TNF juegan un papel coestimulador de
la actividad de IFN. La activacin de macrfagos implica un mayor aumento de todos
los mecanismos de destruccin de los mismos especialmente de aquellos
dependientes de oxgeno y de NO.
Los linfocitos B segregan Acs especficos con la cooperacin de los linfocitos Th2 y en
menor medida por los Th1. Estos Acs son capaces de erradicar ciertas infecciones por
varios mecanismos:
Previenen la unin de los microorganismos a sus receptores tisulares y

celulares.
Neutralizan o inactivan directamente al microorganismo; ocurre cuando

los Acs se unen a un Ag que posee
una funcin vital para el parsito,
como pueden ser las toxinas.
Activan la fijacin y el sistema del C promoviendo la lisis de los

microorganismos.
108
Agresin y Defensa
Favorecen la fagocitosis de los monocitos, macrfagos y PMNs a travs

de la unin a los FcR (opsonizacin) y
Promueven las reacciones de citotoxicidad celular dependiente de Ac

(ADCC) de las clulas citotxicas y eosinfilos
III.
A.
MATERIALES
B.
PROCEDIMIENTO

tema de la prctica.
Presentacin
discusin
sobre
las
preguntas
y/o
actividades

C.
RESULTADOS

IV.
Esquematice y explique el mecanismo de neutralizacin
Esquematice y explique el mecanismo de opsonizacin y fagocitosis
Esquematice y explique el mecanismo de ADCC
109
Agresin y Defensa
Mencione tres ejemplos de vacunacin sealando que tipo de

mecanismo es el que activa
Qu es un adyuvante y para qu sirve?
A travs de un esquema o dibujo (diseado por usted mismo) explique a

que se denomina respuesta primaria y respuesta secundaria.
110

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Agresin y Defensa

AGRESION Y DEFENSA BIOLOGICA

ROL DE PRCTICAS DE LABORATORIO

Reconocimiento del microscopio: observaciones microscpicas.

Preparacin y esterilizacin de material y medios de cultivo

Medios de cultivo: aislamiento y siembra de bacterias.

Mtodo de cultivo y descripcin morfolgica de hongos.

Medios de cultivo y observacin de la morfologa de hongos

Reconocimiento de rganos y tejidos linfoides

B. Receptores TCR y BCR

Finalmente, creemos necesario aclararles que esta disciplina se encuentra en un

Identificar y debatir las normas generales de Bioseguridad usados durante los

B. Agentes fsicos y mecnicos: Temperatura extrema, radiaciones ionizantes,

Corynebacterium, Entamoeba hitolytica, E.coli enteropatgena, Leishmania,

Listeria monocytogenes, Mycobacterium (no clase III), Mycoplasma, Plesiomonas,

Neisseria, Salmonella typhi, S. Paratyphi A, Shigella, Streptococcus, Yersinis, Virus

d. Laboratorio con nivel de Bioseguridad 4. Laboratorio de contencin mxima con

Alcohol, Agujas y jeringas descartables, Bolsas plsticas negras,

Curitas, gasas, esparadrapo, Guantes de ltex, Hojas de bisturi

Jabn lquido, Lancetas, Laminas portaobjeto

Recipientes con Hipoclororito de sodio 5%

Pizeta con Hipoclororito de sodio 5%, Micropipetas, Mangos de bistur

Papel Kraff, Papel lente, Papel toalla, Placas de microtitulacin para

Puntas de plstico para micropipetas, Solucin salina o buffer fosfato pH

III. ACTIVIDADES DE APRENDIZAJE

Prohibido el ingreso de personas ajenas al laboratorio.

Usar mandil blanco manga larga y mantenerlo totalmente cerrado durante el

Llevar siempre el cabello recogido o mantenerlo recortado.

Usar guantes de ltex para procesar las muestras.

Toda muestra debe ser considerada potencialmente infecciosas.

Identificar clara y adecuadamente el material que ser procesado.

El operador debe desinfectar el rea de trabajo antes y despus de cada

Descontaminar la superficie de trabajo por lo menos una vez al da o en

Descontaminar el material infeccioso antes de eliminarlo. El material

Identificar el material infeccioso a descartar.

No pipetear nunca con la boca. Usar succionadores de goma o pipeteador

Prohibido comer, beber, fumar, guardar y calentar alimentos en el ambiente

Prohibido aplicarse cosmticos.

Prohibido usar el celular en la zona de trabajo, ya sea para contestar o

Los sonidos en el laboratorio deben ser de volumen bajo-moderado.

Lavarse las manos despus de manipular el material infeccioso, animales o

Evitar la formacin de aerosoles al momento de mezclar tubos o centrifugar.

Usar mascarillas cuando sea necesario.

No acumular material procesado o contaminado en el mesn, refrigeradora o

Trapear los pisos a diario con trapeador limpio y solucin desinfectante.

Las piezas de vidrio no descartables (pipetas Pasteur, lminas, etc) deben

Transportar adecuadamente las muestras, dentro y fuera del rea de trabajo.

Dejar el mandil en el ambiente de trabajo (No pasear con el mandil en otros

Lavar el mandil apropiadamente y separada de otra ropa de uso comn en la

Tener conocimiento de los procedimientos mnimos de emergencia y

Uso apropiado de los equipos, y calibracin de los mismos.

2. Debate con tus compaeros y seale solo 10 reglas de bioseguridad, mencionadas

Qu medidas de bioseguridad tomaras para el transporte de muestras de

Qu medidas de bioseguridad tomara si un tubo de vidrio con sangre cae al

Qu smbolos de bioseguridad conoces? Sabes su significado? Cules

Conocer el microscopio compuesto y sus partes.

Determinar el tipo de imagen que proporciona.

Conocer el manejo y cuidado.

Estimar el tamao de los objetos que se observan en el microscopio.

Papel impreso con letras A, E y F mayscula.

Porta y cubre objetos.

Agua de pecera o estancada

A.- Sistema mecnico.