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NOMBRE:
Angel Ricardo Blanco Blanco
MATERIA:
Microbiologia
MAESTRA:
IIA. Nancy Deyanira Hernandez
TRABAJO:
Antologa Unidad 1-7.
UNIDAD NO. 1
INTRODUCCIN A LA MICROBIOLOGA
1.1.
Por ltimo, la vertiente aplicada que estuvo en la base de la creacin de la Microbiologa, mantuvo su
vigencia, enriquecida por continuos aportes de la investigacin bsica, y hoy muestra una no menos
prometedora perspectiva de expansin a mltiples campos de la actividad humana, desde el control
de enfermedades infecciosas (higiene, vacunacin, quimioterapia, antibioterapia) hasta el
aprovechamiento econmico racional de los mltiples procesos en los que se hallan implicados los
microorganismos (biotecnologas).
gnica (una de las hiptesis sugeridas); cada molcula de viroide contiene uno o dos dominios
conservados que modulan la virulencia.
Los RNAs satlites son pequeas molculas de tamao similar al de los viroides de plantas (330-400
bases), que son empaquetados en cpsidas de determinadas cepas de virus (con cuyos genomios no
muestran homologas). Se replican slo en presencia del virus colaborador especfico, modificando
(aumentando o disminuyendo) los efectos patgenos de ste.
Los virusoides constituyen un grupo de RNA satlites no infectivos, presentes en el interior de la
cpsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los viroides, replicndose exclusivamente
junto a su virus colaborador.
Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por Stanley
Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema nervioso central
de mamferos (por ejemplo, el "scrapie" o prurito de ovejas y cabras, la encefalitis espongiforme
bovina), incluyendo los humanos (kuru, sndrome de Gerstmann-Strassler, enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob). Se definen como pequeas partculas proteicas infectivas que resisten la
inactivacin por agentes que modifican cidos nucleicos, y que contienen como componente
mayoritario (si no nico) una isoforma anmala de una proteina celular. Tanto la versin celular normal
C
Sc
(PrP ) como la patgena (PrP en el caso del "scrapie") son glicoprotenas codificadas por el mismo
gen cromosmico, teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las caractersticas
distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosacridos que
adquieren por procesamiento post-traduccional.
A diferencia de los virus, los priones no contienen cido nucleico y estn codificados por un gen
celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva sntesis poseen molculas de PrP que reflejan el
gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la molcula del PrP que caus la infeccin
previa. Se desconoce su mecanismo de multiplicacin, y para discernir entre las diversas hiptesis
propuestas quiz haya que dilucidar la funcin del producto normal y su posible conversin a la
isoforma patgena infectiva.
Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de la enfermedades por priones son
simultneamente infectivas y genticas, una situacin inslita en la Patologa humana, habindose
demostrado una relacin entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de Creutzfeldt-Jakob. El
gen del prin (Prn-p) est ligado genticamente a un gen autosmico (Prn-i) que condiciona en parte
los largos tiempos de incubacin hasta el desarrollo del sndrome.
1.1.2.2. Los enfoques de estudio como objeto formal de la Microbiologa
El objeto formal de la Microbiologa viene determinado por todos aquellos aspectos (caractersticas
estructurales, fisiolgicas, bioqumicas, genticas, taxonmicas, ecolgicas, entre otras) y enfoques
desde los que se puede estudiar a los microorganismos y que conforman el cuerpo bsico de
conocimientos de esta ciencia.
Por otro lado, la Microbiologa tambin se ocupa de las distintas actividades microbianas en relacin
con los intereses humanos, tanto las que pueden acarrear consecuencias perjudiciales (y en este caso
estudia los nichos ecolgicos de los correspondientes agentes, sus modos de transmisin, los
diversos aspectos de la microbiota patgena en sus interacciones con el hospedador, los mecanismos
de defensa de ste, as como los mtodos desarrollados para combatirlos y controlarlos), como de las
que reportan beneficios (ocupndose del estudio de los procesos microbianos que suponen la
obtencin de materias primas o elaboradas, y de su modificacin y mejora racional con vistas a su
imbricacin en los flujos productivos de las sociedades).
Figura 1. Esquema de los 5 reinos clsicos de Wittaker y sus relaciones evolutivas: reino Metazoa (Animalia),
reino Metafita (Plantae), reino Fungi (Hongo), reino Protista (Protozoo) y reino Procariota (Monera)
En el ao 1978 se descubre que las arquibacterias, hasta ese momento incluidas dentro del Reino
Mnera, eran un nuevo tipo de seres vivos, tan distantes evolutivamente de las bacterias como de los
eucariontes. En el ao 1990 Woese incorpora estos descubrimientos a un nuevo esquema sobre la
evolucin y clasificacin de los seres vivos, planteando que la evolucin habra ocurrido en tres lneas
o linajes filogenticos principales, y no en dos (procariontes y eucariontes), como postulaba el
paradigma clsico.
Esta nueva visin se caracteriza por considerar a las arquibacterias, actualmente denominadas
archeas, como una tercera forma de vida, muy diferentes a los eucariontes y procariontes clsicos, el
cambio propuesto por Woese resalta las diferencias, hasta ahora ocultas, entre organismos
procariotas.
Todos estos cambios y nuevas propuestas han sido posibles gracias al estudio y comparacin de
secuencias de macromolculas conservadas en todos los seres vivos (denominadas relojes
moleculares), tales como el RNA ribosomal (especialmente el RNAr 16S) y algunas protenas
conservadas (como los factores traduccionales EF-G y EF-Tu). Tras una gran labor experimental,
Woese se centr en un conjunto de informacin gentica en particular descubierto en el llamado 'RNA
mitocondrial 16s'. Esta secuencia de cdigo gentico aparece en el genoma de todos los seres
vivos. Es una secuencia perfectamente conservada, lo cual significa que ha evolucionado muy
lentamente, por lo que puede ser utilizada para rastrear los cambios evolutivos sucedidos a lo largo de
perodos de tiempo muy largos.
El giro paradigmtico ocurrido en las dos ltimas dcadas, se ve plasmado en el nuevo rbol
filogentico propuesto por Woese para la evolucin de los seres vivos. Esta nueva clasificacin se
basa en una visin tricotmica (tres linajes principales) e incorpora un nuevo nivel o rango taxonmico
denominado Dominio (superior a Reino). Estos tres nuevos linajes evolutivos reciben las siguientes
denominaciones: dominio Bacteria, dominio Archaea y dominio Eukaya (Figura 2).
En el rbol filogentico de la vida, la distancia entre dos especies cualesquiera, trazada a lo largo de
las lneas que las conectan, es proporcional a las diferencias entre su RNA mitocondrial. Las especies
con secuencias prcticamente idnticas estn presumiblemente relacionadas y son representadas en
el rbol, unas cerca de las otras; aquellas que estn ampliamente separadas, son parientes ms
lejanos, y cuando se combina cierta cantidad de datos es posible inferir linajes. Cuando se emplea
este mtodo con nuestras familiares plantas y animales, estos trazos en el rbol de la vida son muy
similares a los de los rboles evolutivos deducidos de la anatoma estructural, pero la gran sorpresa
lleg cuando se aplic esta tcnica al mundo microbiolgico.
Dentro del Dominio Bacteria existen varios linajes bacterianos diferentes, cada uno de ellos
estrictamente debera corresponder a un reino diferente, sin embargo por razones de ndole histrica,
se les denomina Divisiones o Phyla. Hoy en da se describen 80 Divisiones o Phyla en el Dominio
Bacteria, siendo la gran mayora de estas bacterias fotolitotrficas, quimiolitotrficas, ambientales y no
patgenas para el hombre, muchas de ellas son fundamentales en varios ciclos geoqumicos del
planeta (carbono, nitrgeno, fsforo, entre otros). El Dominio Archaea contiene al menos dos reinos
(divisiones o Phyla) nuevos: Crenarchaeota y Euryarchaeota. El Dominio Eukarya histricamente
comprendera los Reinos (Dominios o phyla) Fungi, Animalia, Plantae y Protozoa (llamados a veces
Protista); pero actualmente, se conserva a los 3 primeros, mientras que el antiguo Reino Protozoa, se
fragmenta en mltiples Reinos (Divisiones o Phyla) tales como: Microsporidios, Diplomonadas,
Apicomplexa, Alveolados, Stramenopiles, Excavados, entre otros.
As, los microorganismos se encuentran ubicados en los tres dominios: Archea, Bacteria y Eukarya,
este ltimo comprende a todos los linajes microbianos constituidos por clulas eucariticas.
Figura 2. rbol filogentico de la vida, Este rbol filogentico se basa en la comparacin de secuencias del RNA
ribosomal 16 S. La raz se localiz mediante el estudio de los factores traduccionales EF-Tu y EF-G (Woese, et
al., 1990).
Los virus no se incorporan a esta clasificacin por el hecho de no estar conformados por clulas y
constituirse en seres vivos slo en unin a una clula viva preexistente. Sus orgenes no estn claros,
algunos investigadores opinan que derivaran de entidades celulares y por lo tanto no seran
primitivos. Otros investigadores piensan que corresponderan a remanentes de una etapa de la
evolucin pre-celular de la vida, por lo que en este caso se consideraran entes primitivos.
Recientemente se descubri una nueva familia de virus denominada Mimivirus, que se caracteriza por
infectar amebas y poseer un genoma de DNA mayor que el de algunas bacterias (dos veces mayor
que el genoma de la bacteria Micoplasma genitalium). Algunos investigadores piensan, en base al
estudio de las secuencias de algunas enzimas de estos virus, que esta familia podra corresponder a
virus arcaicos, anteriores incluso al origen de las clulas eucariontes. En todo caso, hoy en da no
existe consenso entre los investigadores respecto al origen de los virus y no parece posible, al menos
al corto plazo, dilucidar experimentalmente tal cuestin.
que encontr en sus propias heces), la estructura estriada del msculo, la circulacin capilar, a
descubrir los espermatozoides y los glbulos rojos (por lo que tambin se le considera el fundador de
la Histologa animal), as como a detallar diversos aspectos estructurales de las semillas y embriones
de plantas. Simultneamente el ingls Robert Hooke, usando microscopios compuestos, describi los
hongos filamentosos en 1667, y descubri la estructura celular de las plantas en 1665, acuando el
trmino clula. Sin embargo, estas observaciones no condujeron a ninguna investigacin acerca de
las posibles actividades de los microorganismos, ni como agentes de fermentaciones ni de
enfermedades infecciosas ya que el desarrollo de la qumica y de la medicina era demasiado primitivo.
Una vez descubiertos los microorganismos por Leeuwenhoek se empez a especular sobre el origen
de estos animculos, por lo que se formaron dos escuelas: la abiognesis (generacin espontnea)
apoyada por los preformacionistas y la biognesis (los animculos se originaban a partir de
animculos padres). La doctrina de la generacin espontnea fue puesta en entredicho por los
experimentos de Redi quien acu la expresin "Omne vivum ex ovo" (1668), tras comprobar que los
gusanos encontrados en la carne provenan de los huevos que previamente haban depositado en la
carne las moscas.
Los descubrimientos de Redi tuvieron el efecto de desacreditar la teora de la generacin espontnea
para los animales y plantas, pero la reavivaron respecto de los recin descubiertos animlculos, una
cosa eran los huevos de moscas y otra los microorganismos. En 1745 Needham hirvi trozos de carne
para destruir los organismos preexistentes y los coloc en un recipiente abierto, posteriormente,
observ colonias de microorganismos sobre la superficie y concluy que se generaban
espontneamente a partir de la carne.
En 1769, Spallanzani repiti el experimento pero tapando los recipientes, no apareciendo las colonias,
lo que contradeca la teora de la generacin espontnea. Pero Needham argument que el aire era
esencial para la vida incluida la generacin espontnea de microorganismos y este aire haba sido
excluido en los experimentos de Spallanzani. En 1836 Franz Schulze pas el aire a travs de unas
soluciones cidas fuertes hacia el interior de un recipiente con carne hervida. Al ao siguiente Theodor
Schwann pas el aire a travs de tubos calientes. Los microorganismos no aparecan en ningn caso
ya que los microorganismos presentes en el aire haban sido aniquilados. Sin embargo, los que
apoyaban la generacin espontnea comentaban que el cido y el calor alteraban el aire de tal
manera que impeda la generacin espontnea de los microorganismos. En 1864 Pasteur pone fin a la
controversia sobre el origen de los microorganismos al utilizar matraces con cuello de cisne, el aire
pasaba libremente a travs del cuello, pero los microorganismos no aparecan en la solucin ya que
las partculas de polvo y microorganismos sedimentaban en el recodo del cuello. Estos experimentos
de Pasteur promovieron el reconocimiento de la biognesis, de esta forma quedaba definitivamente
aclarado el origen de los microorganismos, y se abra la Edad de Oro del estudio cientfico de las
formas de vida no observables a simple vista. Los ltimos escpticos quedaron silenciados cuando en
1877 John Tyndall aplic su sistema de esterilizacin por calentamiento discontinuo (hoy conocida
precisamente como tindalizacin), que evidenci la existencia de formas microbianas de reposo muy
resistentes al calor, lo cual fue confirmado poco ms tarde por Ferdinand Cohn al descubrir las
esporas bacterianas.
Sin duda desde la Prehistoria los hombres utilizan con provecho las fermentaciones. Las teoras
cientficas de esa poca reconocan la presencia de levaduras en la fermentacin alcohlica, pero
estas levaduras eran consideradas como compuestos qumicos complejos, sin vida. Esta era la teora
mecanstica liderada por los qumicos alemanes von Liebig y Whler. Luis Pasteur, qumico francs,
propuso la teora vitalstica y demostr que las clulas viables de levaduras causan fermentacin en
condiciones anaerbicas; durante dicha fermentacin el azcar presente en el mosto es convertido
principalmente en etanol y CO 2. En 1866, Pasteur public la obra titulada "Estudios sobre el vino, sus
enfermedades, causas que las provocan. Nuevos procedimientos para la conservacin y
envejecimiento". Entre las mejoras aconsejadas haba un mtodo para aumentar la calidad de la
conservacin de los vinos consistente en calentarlos a una temperatura de 68 C durante 10 minutos y
despus enfriarlos rpidamente. Esta tcnica ha venido a ser conocida como pasteurizacin y es
ahora ampliamente utilizada en el tratamiento de la leche.
En 1546, Girolano Fracastoro sugiri que las enfermedades podan deberse a organismos tan
pequeos que no podan verse y que eran transmitidos de una persona a otra. Sin embargo, el
descubrimiento de que las bacterias pueden actuar como agentes especficos de las enfermedades
infecciosas en los animales fue realizado a travs del estudio del carbunco, infeccin grave de los
animales domsticos que es transmisible al hombre. La demostracin concluyente de la causa
bacteriana o etiologa del carbunco la proporcion en 1876 Robert Koch, mdico alemn, seis aos
despus Koch anunci al mundo que haba encontrado la bacteria del carbunco (Bacillus anthracis).
Posteriormente l y sus colaboradores descubrieron las bacterias que causan la tuberculosis y el
clera. El descubrimiento posterior de los virus (Dimitri Ivanovski en 1892; el virus del mosaico del
tabaco pasaba los filtros que retenan a las bacterias), agentes que no crecen en medios artificiales en
el laboratorio como lo hacen las bacterias, han permitido realizar algunas modificaciones en los
postulados de Koch. Este trabajo sobre el carbunco condujo rpidamente a la edad de oro de la
bacteriologa. En 25 aos la mayora de los agentes bacterianos de las principales enfermedades
humanas haban sido descubiertos y descritos.
Actualmente es difcil comprender la magnitud de la miseria y devastacin causada por los
microorganismos antes de 1950. En Europa, durante el perodo de 1347-1350 ocurri una epidemia
de peste bubnica, conocida como la "muerte negra" y causada por la bacteria Yersinia pestis, se
estim que murieron 25 millones de personas. Con el conocimiento de que los microorganismos
causaban enfermedades, los cientficos se dedicaron a investigar la prevencin y el tratamiento. Los
hospitales adoptaron la antisepsia (Joseph Lister. 1860) la cual previene la diseminacin de las
enfermedades infecciosas mediante la inhibicin o destruccin de los agentes causantes. Tambin se
descubri la inmunizacin (Pasteur, 1880), proceso que estimula las defensas del cuerpo frente a la
infeccin. Se empez a aplicar la quimioterapia (Paul Ehrlich, Gerhard Domagk, y Alexander
Fleming), tratamiento de las enfermedades con una sustancia qumica. Tambin influy la sanidad
pblica, sobre todo la higiene relacionada con los alimentos y aguas.
Antes de 1940 el conocimiento del fenmeno gentico provena de las investigaciones sobre plantas y
animales, pero no se saba si estos resultados se podan aplicar a los microorganismos. En 1944
Oswald Avery, Colin MacLeod y MacLyn McCarty descubrieron el papel del DNA en la gentica
bacteriana. Encontraron que el material de DNA de un tipo de neumococos puede transferir una
caracterstica hereditaria a otro tipo de neumococos. Posteriormente, en 1953 Watson, Crick y Wilkins
descubrieron la estructura molecular del DNA. Estos descubrimientos, junto con otros, establecieron
que la informacin gentica de todos los organismos est codificada en el DNA. Esto hizo de los
microorganismos un modelo muy atractivo para la investigacin gentica. Actualmente y utilizando la
tecnologa del DNA recombinante o ingeniera gentica se pueden transferir fragmentos de DNA de un
organismo a otro.
solucin definitiva a esta cuestin dependa, de nuevo, de un desarrollo tcnico, que a su vez iba a
suministrar una de las herramientas caractersticas de la nueva ciencia: los mtodos de cultivo puro.
Los primeros cultivos puros fueron obtenidos por el miclogo Brefeld, quien logr aislar esporas de
hongos y cultivarlas sobre medios slidos a base de gelatina. Por su menor tamao, este mtodo se
haca inviable para las bacterias, por lo que se recurri a un mtodo basado en diluciones: Lister, en
1878 realiz diluciones secuenciales de cultivos mixtos, hasta lograr muestras en las que exista una
sola clula. Pero la tcnica era larga y tediosa y, adems, normalmente slo se lograban aislar clulas
del tipo bacteriano ms abundante en el cultivo original; sin embargo, el experimento sirvi para
confirmar la naturaleza particulada de los agentes de las fermentaciones.
Por aquella poca Koch buscaba con ahnco mtodos ms sencillos de cultivo puro, indispensables
para proseguir sus investigaciones sobre bacterias patgenas. Primero emple rodajas de patata
como sustrato slido nutritivo sobre el que se podan desarrollar colonias macroscpicas de bacterias
que presentaban morfologa caracterstica, que Koch interpret como resultantes del crecimiento a
partir de clulas individuales. Pero enseguida recurri a compactar el tpico caldo de cultivo a base de
carne (diseado por Loeffler) aadindole gelatina (1881). El medio slido as logrado era
transparente, lo que permita visualizar fcilmente los rasgos coloniales, y contena los nutrientes
adecuados para el crecimiento de una amplia gama de bacterias. stas eran inoculadas en la
superficie del medio con un hilo de platino pasado previamente por la llama, por la tcnica de siembra
en estra. Sin embargo, la gelatina presentaba los inconvenientes de ser atacada por determinados
microorganismos, y de tener un bajo punto de fusin; ambos problemas se solventaron cuando en
1882 el mdico alemn Walter Hesse, introdujo el agar (polisacrido extrado de algas rojas) como
nuevo agente solidificante. El trabajo de Koch ya citado tuvo la trascendental consecuencia de derribar
las ideas pleomorfistas, y supuso la primera propuesta del concepto de especie dentro del mundo
bacteriano. En 1887 Petri, un ayudante de Koch, sustituy las engorrosas bandejas de vidrio cubiertas
con campanas, usadas hasta entonces para los cultivos slidos, por un sistema manejable de placas
de cristal planas, que se conoce como cajas de Petri.
El desarrollo de los medios selectivos y de enriquecimiento fue una consecuencia de las
investigaciones llevadas a cabo por Beijerinck y Winogradsky entre 1888 y los primeros aos del siglo
XX, sobre bacterias implicadas en procesos biogeoqumicos y poseedoras de caractersticas
fisiolgicas distintivas (quimioauttrofas, fijadoras de nitrgeno, entre otras). Estos medios, donde se
aplica a pequea escala el principio de seleccin natural, se disean de forma que su composicin
qumica definida favorezca slo el crecimiento de ciertos tipos fisiolgicos de microorganismos, nicos
capaces de usar ciertos nutrientes del medio. Otra importante aportacin a este perodo de cultivo
dentro del desarrollo de la Microbiologa surgi del uso de medios diferenciales, en los que se
manifiesta algn rasgo bioqumico o metablico, lo que contribuye a la identificacin microbiana. Fue
Wrtz quien, en 1892, introdujo el uso de indicadores de pH, incorporados en los medios, lo cual
permita revelar la produccin de acidificaciones por fermentacin en ciertas bacterias.
Grandes naturalistas como Haeckel, Strassburger y Abb interaccionando con una poderosa industria
ptica y qumica. Estas influencias recprocas se plasmaron en numerosos proyectos que reflejaban la
efervescencia de las ciencias naturales tras la estela de Darwin (cfr. Jahn et al., 1985).
Concretamente, la industria ptica de Abb y Zeiss, pudo satisfacer la necesidad de Koch de
perfeccionar el microscopio compuesto, introduciendo lentes acromticas y una iluminacin inferior
provista de condensador. El mismo Abb desarroll en 1878 el objetivo de inmersin en aceite. Por
otro lado, la industria qumica BASF, que por aquella poca se encontraba en pleno auge de patentes
de nuevos colorantes, suministr al laboratorio de Koch una serie de derivados de anilina que tean
las bacterias permitiendo su fcil visualizacin al microscopio en frotis de tejidos infectados. En 1875
Carl Weigert ti bacterias con pirocarmn, un colorante que ya vena siendo usado desde haca unos
aos en estudios zoolgicos. En aos sucesivos se fueron introduciendo el azul de metileno (Koch,
1877), la fuchsina, y el violeta cristal. En 1882-1883 Ziehl y Neelsen desarrollan su mtodo de cidoalcohol resistencia para teir Mycobacterium tuberculosis. En 1884 el patlogo dans Christian Gram
establece una tincin de contraste que permite distinguir dos tipos bacterianos en funcin de sus
reaccin diferencial de tincin y que, como se vera mucho ms tarde, reflejaba la existencia de dos
grupos de bacterias con rasgos estructurales distintivos. En 1890 Loeffler logra visualizar flagelos
bacterianos por medio de su tcnica de impregnacin argntica. Como veremos ms adelante, la
misma industria de colorantes alemana previa a la primera guerra mundial fue decisiva tambin para
los comienzos de la quimioterapia.
Estas innovaciones tcnicas (mtodos de cultivo, microscopa y tinciones) fueron fundamentales (junto
con los sistemas de esterilizacin abordados en el anterior apartado) para la consolidacin de la
Microbiologa como ciencia, permitiendo eliminar las grandes dosis de especulacin que hasta
entonces haban predominado.
que no reducan nitrgeno en vida libre; ms tarde (1890) aport la prueba definitiva de que las
bacterias aisladas eran capaces de nodular especficamente ciertas especies de leguminosas,
adquirindose de esta forma la facultad de fijar nitrgeno en su asociacin con la raz de la planta.
Irnicamente el nombre definitivo para las bacterias de los ndulos de leguminosas (Rhizobium) fue
propuesto por Frank, quien durante mucho tiempo se haba negado a reconocer los resultados de
Hellriegel y Willfahrt, y que haba oscilado en sus opiniones, desde suponer que la fijacin de
nitrgeno era un rasgo general de las plantas, hasta creer que las estructuras intranodulares
observadas a microcopio (bacteroides) eran grnulos de reserva (incluidas las que l mismo observ
en plantas no leguminosas de los gneros Alnus y Eleagnus, originadas por una bacteria bautizada en
su honor -Frankia); incluso cuando se convenci de que los simbiontes eran bacterias (y no hongos o
mixomicetes), pensaba que stas slo estimulaban a que las plantas fijaran nitrgeno en sus hojas; su
conversin (y an as incompleta y con reticencias) no lleg hasta 1892. El aislamiento de los
bacteroides intranodulares (Prazmowski, 1890), y la relacin entre su formacin y la fijacin de
nitrgeno (Nobbe y Hiltner, 1893) complet esta primera oleada de investigacin sobre este tema que
tanta trascendencia presentaba para la Agronoma. Estos estudios estn en la base de todos los
ulteriores trabajos de Microbiologa Agrcola, de modo que esta especiliadad fue incorporada
tempranamente a los laboratorios cientficos y estaciones experimentales.
Las obras trascendentales de Winogradsky y Beijerinck abrieron un nuevo horizonte para el estudio de
la diversidad microbiana. La escuela de Beijerinck, en la Universidad Tcnica de Delft, fue continuada
por A.J. Kluyver y C.B. van Niel, siendo este ltimo el padre de la escuela norteamericana desde su
establecimiento en California, ya que form a figuras tan importantes como R.Y. Stanier, R.E. Hungate
o M. Doudoroff. La escuela holandesa fundada por Beijerinck tuvo asimismo otra fructfera colonia en
la ciudad alemana de Konstanz, donde N. Pfennig continu el trabajo emprendido junto a van Niel en
Delft. Todos estos autores, y sus colaboradores, fueron realizando contribuciones esenciales sobre
una amplia diversidad de bacterias, descubriendo la variedad de las bacterias fotosintticas, los tipos
de organismos litotrficos, y profundizando en multitud de aspectos estructurales y fisiolgicos de las
bacterias recin descubiertas. Como dice T.D. Brock en una recensin de Kluyver (1961) los hombres
de la escuela de Delft de Microbiologa General fueron pioneros en una poca en la que la mayora de
los investigadores estaban demasiado fascinados por problemas aplicados en medicina, agricultura o
industria, como para preocuparse por microorganismos quimiosintticos o fotosintticos, o por
aquellos que muestran fermentaciones inusuales.... Pero, como en tantas otras ocasiones, este
enfoque de ciencia bsica ha sido extraordinariamente frtil, y aparte de la profundizacin en la unidad
y diversidad de la vida ha dado origen a penetrantes percepciones en multitud de problemas
planteados, tarde o temprano, a las ciencias biolgicas.
Neurospora, con lo que se inicia el estudio de la base bioqumica de la herencia, y convierten a este
hongo en una valiosa herramienta de trabajo en esta lnea de investigacin.
Las estrategias diseadas por Beadle y Tatum fueron aplicadas por Luria y Delbrck (1943) a cultivos
bacterianos, investigando la aparicin de mutaciones espontneas resitentes a fagos o estreptomicina.
La conexin de estos experimentos con las observaciones previas de Griffith (1928) sobre la
transformacin del neumococo, llev a Avery y colaboradores (1944) a demostrar que el principio
transformante portador de la informacin gentica es el ADN. En 1949 Erwin Chargaff demuestra
En Microbiologa se han seleccionado modelos de estudio y algunos de stos se han analizado con
gran profundidad, ello se ve reflejado en el nmero de publicaciones por microorganismo; por
ejemplo, E. coli es la bacteria en la que ms investigacin se hace y entre los hongos ms estudiados
se encuentra Saccharomyces. Sin embargo, una vez que se detecta un microorganismo de inters se
puede avanzar muy rpido en su conocimiento basado en lo que se sabe en otros microorganismos,
este ha sido el caso del virus del SIDA y en Helicobacter pylori, de este ltimo, por su importancia
mdica, se secuenciaron dos cepas, se han secuenciado las islas de patogenicidad de muchas cepas
y se han implementado experimentos de citoxicidad en diferentes lneas celulares de humano.
UNIDAD NO. 1
MTODOS Y TCNICAS MICROBIOLGICAS BSICAS.
qumicos.
Protozoos:
Plancton:
Fuente de alimento de peces, ballenas, calamares.
Suelo
El suelo es otro de los ambientes donde abundan los microorganismos. Debido
a que en este medio se depositan diversos residuos, ocurren cambios en la
naturaleza y ambiente, todos estos cambios, sin embargo, son modulados y
controlados por diferentes clases de microorganismos.
Bacterias, hongos, algas, protozoos y virus son abundantes y se presentan en
cantidades de miles de millones de organismos por gramo de suelo. Debido a
la gran diversidad de microorganismos, al realizar un cultivo muestra slo se
puede recuperar un pequeo sector de todos los miles de microorganismos
presentes. Es por ello que se requiere de muchos estudios para conocer y
clasificar a los microorganismos. Esta es una labor extenuante porque, como ya
mencionamos, existe un gran nmero de microorganismos por cada gramo de
suelo.
Fijacin de Nitrgeno
Transformacin del N2 atmosfrico en nitrgeno de un compuesto.
Microorganismos no simbiticos:
Viven libres en independientes en el suelo
Microorganismos simbiticos:
Aire
Este ambiente es distinto de los anteriores. Ac los microorganismos no
cuentan con las condiciones necesarias para su crecimiento ni reproduccin
sino slo servir como vehculo o medio de transporte que las esparcir por los
diferentes ambientes, ya sea en forma de gotitas o acompaadas de polvo.
La cantidad de microorganismos presentes en el aire est en funcin de las
fuentes de contaminacin y la sobrevivencia de los microorganismos est
definida por las condiciones atmosfricas, humedad, luz solar y temperatura.
Contenido microbiolgico del Aire
Dentro de los edificios
No todos los microorganismos son benficos para los animales, algunos tienen
interacciones negativas. Existen las depredaciones por hongos y nematodos; las
que alteran el habitad: Eutroficacin: agota el oxgeno disuelto y puede provocar
la muerte de los peces, alteraciones en los alimentos (bioacumulacin), la
produccin de toxinas y las que causan infecciones.
Plantas
Las plantas son un habitad microbiano que varia dependiendo de la temperatura
de las plantas a lo largo del da como del ao. Los microorganismos no se
transfieren fcilmente de planta a planta y stos se hospedan principalmente en
las races de la misma donde realizan las funciones simbiticas. Los
microorganismos satisfacen sus requerimientos bsicos para su crecimiento y
reproduccin; as como los microorganismos se benefician con las plantas, las
plantas tambin tienen influencia de los microorganismos: el reciclado y la
solubilizacin de los nutrientes minerales; sntesis de vitaminas, aminocidos,
auxinas, citoquinas y giberelinas; sntesis de sustancias alelopticas
(antagnicas) inhiben crecimiento de otras plantas.
2.1.2.6 Micromanipulacin
Mediante un micromanipulador se puede usar una micropipeta para obtener un
solo microorganismo de una suspensin de clulas en un lquido, mientras se
examina la preparacin con el microscopio. La clula aislada es luego transferida
a un medio estril.
Micromanipulador
Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una poblacin mixta (suelo,
fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad como variedad de
microorganismos potencialmente tiles que debemos seleccionar. Para ello lo primero que hacemos
es utilizar medios selectivos donde crezca el tipo de microorganismo que nos interesa aislar.
A este medio se le pueden aadir inhibidores para eliminar los que no nos interesan. Por ejemplo, si
queremos obtener un microorganismo aerobio lo creceramos en presencia de O 2 con lo que los
anaerobios no creceran; o bien si queremos seleccionar hongos, aadiramos cloranfenicol,
antibitico que acta frente a bacterias pero que no afecta a los hongos.
Los parmetros generales que tenemos que tener en cuenta son la fuente de carbono, fuente de
nitrgeno, aireacin, temperatura, pH e inhibidores. Posteriormente se reaslan en cultivo puro
aquellos microorganismos que hemos aislado para su posterior estudio.
De acuerdo con estos criterios, los microorganismos se ubican en cuatro clases nutricionales las
que se describen en el cuadro 1. No obstante, la versatilidad fisiolgica de los microorganismos
determina que la clasificacin expuesta no sea de ninguna manera estricta, como lo demuestran
los siguientes ejemplos: algunos microorganismos fotoauttrofos crecen tambin en la oscuridad
comportndose como quimiohetertrofos. Esta versatilidad se conoce con el trmino de facultativo.
Asimismo, algunas bacterias y algas fotoautotrficas son incapaces de sintetizar alguno de sus
constituyentes celulares a partir de CO2, por lo que generalmente viven asociadas con otros
microorganismos que le proporcionan este componente y cuando se les cultiva en medios
artificiales es necesario suministrar ese compuesto orgnico. Es importante recalcar que aun
cuando el grupo bacteriano es, desde el punto de vista estructural, el ms simple de los
microorganismos (procariotes); fisiolgicamente es el ms complejo y el nico en el que se
encuentran todos los tipos nutricionales descritos.
antes mencionados. Y los nutrientes como vimos anteriormente son esos famosos compuestos
qumicos que la clula necesita para vivir.
Las distintas especies bacterianas tienen diferentes requerimientos nutricionales (a veces especficos)
y condiciones fisicoqumicas que les permiten permanecer viables.
Los nutrientes requeridos en grandes cantidades son denominados macronutrientes mientras que los
micronutrientes son necesarios en cantidades trazas.
Entre los primeros se encuentran C, H, O, N (los ms abundantes), P, S, K, Ca, Fe y Na, y entre los
segundos podemos citar Cr, Co, Cu, Mn, Mo, Ni, Se, W, V, Zn. Algunos organismos, adems de los
minerales, necesitan muy pequeas cantidades de nutrientes de naturaleza orgnica llamados
factores de crecimiento. stos son vitaminas, aminocidos, purinas y pirimidinas. Los organismos que
tienen tales requerimientos se denominan auxtrofos para diferenciarse de los prottrofos que son
independientes de tales factores.
MACRONUTRIENTES
Vamos a comenzar hablando de los macronutrientes, como dijimos anteriormente estos son los que la
clula requiere o consume en mayor cantidad, precisamente por ser suministro de la mayor parte de
energa metablica, o de funcionamiento en la clula, a continuacin mostraremos una tabla en la que
se detalla los principales macronutrientes, su fuente natural en el ambiente, y su forma suministrada
en los medios de cultivo:
Ahora analizaremos cada uno de ellos, con sus respectivas funciones en el medio de cultivo y por lo
tanto en el requerimiento nutricional de los microorganismos.
Carbono: Muchas procariotas necesitan algn tipo de compuesto orgnico como fuente de
carbono. Los estudios nutricionales han demostrado que las bacterias pueden asimilar varios
compuestos orgnicos carbonados y usarlos para hacer nuevo material celular. Los aminocidos, los
cidos grasos, los cidos orgnicos, los azucares, las bases nitrogenadas, los compuestos aromticos
y sin fin de compuestos orgnicos de otro tipo pueden ser por una u otra bacteria. Algunos procariotas
son auttrofos, capaces de construir todas sus estructuras orgnicas a partir del dixido de carbono
con la energa obtenida de la luz o de compuestos inorgnicos. En peso seco, una clula tpica
contiene un 50% de carbono; el carbono es el principal elemento de todas las clases de
macromolculas. La ms utilizada es la glucosa (una pentosa).
nitrgeno natural disponible esta en forma inorgnica, como el amoniaco (NH3), nitratos (NO3) o N2.
La mayora de las bacterias son capaces de utilizar amoniaco como nica fuente de nitrgeno, y
muchas pueden utilizar nitratos. El nitrgeno gaseoso puede ser usado como fuente de nitrgeno en
algunas bacterias, las bacterias fijadoras de nitrgeno.
Potasio: El potasio es necesario en todos los organismos. Una gran diversidad de enzimas lo
requiere especficamente, como por ejemplo algunas implicadas en la sntesis de protenas.
Algunos procariotas pueden crecer en ausencia total de hierro. Por ejemplo las bacterias Lactobacillus
plantarum y Borrelia burgdorferii no contienen hierro. El Mn 2+ sustituye en estas bacterias al hierro
como componente metlico de las enzimas que normalmente contienen Fe+2.
MICRONUTRIENTES
Los micronutrientes como dijimos anteriormente son los que la clula consume en menos cantidades,
pero eso no quiere decir que son menos importantes que los macronutrientes, para nada, en realidad
son igual de importantes que los que se consumen en grandes cantidades. Los micronutrientes son
metales, muchos de los cuales tienen una funcin estructural en varias enzimas. La tabla presentada
a continuacin resume los principales micronutrientes en los sistemas vivos y enzimas que los
contienen.
Debido a que la necesidad de estos elementos trazas es muy pequea en cuanto a su concentracin,
con frecuencia no es necesario aadirlos a los medios de cultivo para cultivar microorganismos en el
laboratorio. No obstante, si un medio de cultivo contiene compuestos muy puros, disueltos en agua
destilada de elevada pureza, puede darse una deficiencia en algn elemento traza. En tales casos, se
aade al medio una pequea cantidad de una solucin de metales traza a fin de suministrar los
metales necesarios.
Es importante recalcar que el hierro como vemos se encuentra dentro de los micronutrientes pero
generalmente se lo considera como uno macro, ya que en realidad dentro de todos los metales
sealados, es el que ms es utilizado por ciertas clulas, se la lleg a considerar micro por su
naturaleza metlica, pero por su importancia y requerimiento elevado en las clulas se lo considera
como un macronutriente.
categora, hay algunos grupos que crecen mejor a presiones parciales de oxgeno ms bajas (0,2
atmsferas) que las del aire y se les denomina microaerfilos.
Otros microorganismos, obtienen energa por la va fermentativa o por respiracin anaerobia, que no
implica la necesidad de oxgeno como oxidante terminal. En muchos casos el oxgeno puede actuar
como una sustancia txica o bien inhibir el crecimiento. A estos microorganismos se les denomina
anaerobios obligados.
Otros microorganismos pueden crecer tanto en ausencia como en presencia de oxgeno molecular,
alternando la respiracin con la fermentacin, a estos se les denomina anaerobios facultativos. Un
caso particular son las bacterias del cido lctico, que no son sensibles al oxgeno molecular y en
presencia de ste, continan la fermentacin.
Esterilizacin con calor seco: La accin bactericida del calor seco se debe a la oxidacin fsica de
un procedimiento lento o coagulacin de la protena bacteriana por quemadura. En ausencia de
humedad se necesita una temperatura ms alta,ya que en esta forma los microbios son destruidos al
absorber el calor. Pueden ser dos tipos:
Directa: flameado o incineracin ms utilizada enlaboratorios y en algunos hospitales
pequeos.
Indirecto: aire caliente u horno de Pasteur con temperatura de 160C a 180C por 1 a 2 horas
siendoel ms eficaz y seguro el elctrico.
Esterilizacin con calor hmedo:El calor hmedo es la forma de vapor saturado a presin es eficaz
para la destruccin de todas las formas microbianas, incluso espora. La muerte de las bacterias es
causada por la desnaturalizacin y coagulacin de su protena o su sistema intercelular enzimaprotena. Estas reacciones son catolizadas por medio del agua. Estas pueden de dos tipos:
Calor hmedo discontinuo: algunos medios de cultivo que contiene carbohidratos como
lagelatina, leche, etc. no soportan temperaturas elevadas.
Vapor a presin: conocido como autoclave, que posee todos los requisitos indispensables
comogrados de temperatura y tiempo de exposicin, que junto con el tamao del autoclave y el flujo
delvapor, la densidad y el tamao de la carga en la cmara aumentan la tasa se muerte de
losmicroorganismos, en una temperatura de 121C 132C durante 15 minutos o ms.
Esterilizacin
por
radiacin:
La ionizacin por radiacin genera iones al liberar electrones de lostomos, estos se desprenden
violentamente con tomos adyacentes y se une a ellos, o bien se desprenden del segundo tomo. La
energa liberada se transforma en energa trmica o qumica la cual causa la muerte de los
microorganismos al romper la molcula del ADN e impide la divisin molecular y la propagacin de la
vida. Las principales fuentes de radiacin ionizante son las partculas Beta y rayos gamma.
Esterilizacin por gas xido de etileno:
Este es un gas incoloro, soluble en agua y en solventes comunes, se emplea para esterilizar objetos
sensibles al calor, este proceso es relativamente lento. El poder bactericida depende de la
concentracin del mismo gas, temperatura, humedad y tiempo de exposicin. La actividad esporicida
se produce por aniquilacin de los grupos terminales hidroxilo,carboxilo, amino y sulfridrilo.
3.
4. Mtodos basados en pruebas bioqumicas
Las pruebas bioqumicas han sido ampliamente
utilizadas para diferenciar bacterias. Estas pruebas se fundamentan en demostrar si el microorganismo es capaz de fermentar azcares, la
presencia de enzimas, la degradacin de compuestos, la produccin de compuestos coloreados, etc. Aun bacterias fuertemente relacionadas
pueden separarse en dos especies diferentes con
base a pruebas bioqumicas. Por ejemplo,
las bacterias entricas gram negativas, forman un grupo muy grande y heterogneo cuyo
hbitat natural es el tracto gastrointestinal de humanos y otros animales. Esta familia, Enterobacteriaceae, incluye a varios patgenos que causan sndromes diarreicos. Un gran
nmero de ensayos han sido desarrollados de manera de identificar rpidamente al patgeno, para que posteriormente el mdico, con base al reporte, indique el tratamiento adecuado,
o para que los epidemilogos puedan localizar la fuente de la infeccin.
Existen flujogramas, como el que se describe a continuacin
riana, mediante pruebas bioqumicas de microorganismos. Por
coco bacilo gram negativo, facultativo, fermentador de glucosa,
la presencia de una enterobacteria, para determinar su gnero
esquema.
Fermenta
No
Si
Pueden utilizar
No
Shigella:
produce lisina
Decarboxilasa
Si
Pueden utilizar
No
Si
Escherichia
No
Si
Enterobacter
Los gneros clnicamente ms importantes de la familia Enterobacteriaceae son: Escherichia, Salmonella, Shigella, Citrobacter y Enterobacter. El gnero Escherichia, Enterobacter y Citrobacter fermentan la lactosa con produccin de cido y gas, a diferencia de
los gneros Salmonella y Shigella que no fermentan la lactosa.
Por otra parte, los medicamentos no estriles y/o productos cosmticos deben estar exentos de microorganismos patgenos tales como: Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli,
Salmonella spp. Staphylococcus aureus. Estos productos deben ser controlados pa- ra
verificar la ausencia de estos microorganismos. En la USP se describen los procedimientos a seguir para la identificacin de estas bacterias, que se resumen en procedimientos de enriquecimiento, aislamiento y pruebas bioqumicas para su identificacin fi- nal.
El tiempo necesario para la identificacin de bacterias puede reducirse considerablemen- te
con el uso de sistemas miniaturizados basados en pruebas bioqumicas. Estas herramientas
que permiten reducir el tiempo del reporte, en primer lugar fueron elabora- dos para
bacterias de importancia mdica, tales como las enterobacterias. Estos siste- mas han
sido diseados para realizar varias pruebas bioqumicas simultneamente y permitir la
identificacin en un tiempo ms corto. Cada uno de los ensayos, consta de tu- bos
miniaturizados que contienen el medio de cultivo que se hidratan al inocularlos con la
suspensin bacteriana pura. Las pruebas se clasifican en grupos; a cada uno de resulta- dos
positivos de los ensayos de se le asigna un determinado valor numrico, obtenindo- se un
cdigo que corresponder a un determinado gnero o especie en un texto de la base de
datos.
Con fines de control microbiolgico, la USP indica cuales son las pruebas bioqumicas
mnimas que se requieren para la identificacin de los microorganismos objetables, pero no
descarta que se utilicen sistemas miniaturizados donde se realizan un nmero mayor de
pruebas bioqumicas.
Existen muchas casas comerciales que producen sistemas miniaturizados para diferen- tes
tipos de microorganismos adems de las enterobacterias. Cada casa fabricante tiene su
propia presentacin, clculos, manuales, etc.
Una limitacin de este tipo de mtodo de identificacin es la aparicin de cepas mutantes y la
adquisicin de plasmidios que pueden dar origen a cepas con caractersticas diferen- tes.
Este tipo de mtodo de identificacin tambin ha sido desarrollado para la identifica- cin de
levaduras y de otros hongos.
en
Bacterias:
Borrelia burghdoferi, Vibrio cholerae, Helicobacter pylori, Stahylococcus aureus,
Chlamydea trachomatis, Shigella dysenteriae, Treponema pallidum, Escherichia coli
enterotoxinognica, Mycobacterium tuberculosis y Legionella pneumonophilia, Campylobacter jejuni.
Virus: Parvovirus, Herpes-simplex virus, Rotavirus, Papillomavirus, Virus del dengue,
Virus Varicella-Zoster, Virus de la Rubola, Adenovirus, Rhinovirus.
A continuacin se presentan una lista con ejemplos de bacterias que han sido
detec- tadas e identificadas por medio de sondas de ADN:
Son los mejores porque en ellos se paraliza el crecimiento de las clulas microbianas, pero
stas no han muerto. As se garantiza al mximo la estabilidad gentica, por evitarse la
aparicin de generaciones sucesivas. An as no se puede descartar algn cambio originado
por el mtodo preparatorio en si mismo. Los mtodos de conservacin pertenecientes a este
grupo son dos: Congelacin y liofilizacin.
a
140C.
Tampoco se da crecimiento en las clulas conservadas por este mtodo, puesto que se les ha
quitado el agua mediante la liofilizacin, que es un proceso suave. Con ello la estabilidad
gentica es alta, pero a veces no tanto como en la congelacin, porque la liofilizacin se
consigue por sublimacin del hielo de las clulas. Por lo tanto, primero tenemos que congelar el
agua libre de las clulas y despus eliminarla mediante el vaco, sin que haya necesidad de
subir la temperatura, lo que acabara afectando a la viabilidad del microorganismo. Para este
proceso se emplean los aparatos denominados liofilizadores, de los que hay muchos modelos
en el mercado. Las clulas microbianas as conservadas se someten a un tratamiento ms
complejo que en el caso de la congelacin, pues la liofilizacin se hace en dos etapas y se
aade la sublimacin del agua a la congelacin previa. Sin embargo, este es un mtodo muy
recomendable por su comodidad para el almacenamiento y para el envo de las cepas, pues
una vez conseguidos los lifilos pueden almacenarse a temperatura ambiente (18C-20C), con
lo cual su envo es muy cmodo.
Los factores que hay que tener en cuenta para hacer una buena liofilizacin son lgicamente
los mismos que influyen en la congelacin, a los que habr que aadir otros que surgen como
consecuencia de la deshidratacin. Sin embargo, antes de pasar a explicar stos, tenemos que
hacer unas breves consideraciones sobre los que antes hemos mencionado para el caso de la
congelacin. La congelacin puede hacerse rpida o lentamente, la primera sumergiendo los
tubos en nitrgeno lquido. Respecto a los crioprotectores, ya vimos que se pueden utilizar
varios dependiendo del tipo de microorganismo, pero para liofilizar no se debe utilizar glicerol,
debido a su elevado punto de evaporacin y a su higroscopicidad, que provoca que los lifilos
queden muy viscosos. Tampoco es conveniente utilizar el dimetilsulfxido, porque es algo
txico, y al concentrarse por la evaporacin del agua puede daar a las clulas microbianas.
Por lo tanto, para la liofilizacin se recomiendan como crioprotectores el inositol para la mayora
de las bacterias y la leche descremada para hongos y actinomicetos, pero para algunos
microorganismos pueden ser ms convenientes otros crioprotectores, como por ejemplo el
glutmico-glutamato para las bacterias lcticas, mezclas de glucosa con caldo hgado o
chopped meat (sin carne) para bacterias anaerobias, etc.
Los nuevos factores que influyen especficamente en la eficacia de la liofilizacin como medio
de conservacin son:
1 Tipo de microorganismo. Hay algunos microbios que no resisten la liofilizacin y
lgicamente sern aquellos que contengan ms agua en su interior. Algunos hongos
filamentosos, especialmente los no esporulados, no se pueden guardar liofilizados y
hay que recurrir a otros mtodos.
Temperatura durante la sublimacin. Debe ser lo ms baja posible, sin subir por encima
de 50C.
Mtodos alternativos.
Son los que se utilizan cuando no se pueden emplear los mtodos de eleccin, bien por
carecer de los equipos necesarios, o bien porque la cepa microbiana no resiste los tratamientos
de la conservacin por estos mtodos. Conviene tener en cuenta que nunca se debe usar un
nico mtodo alternativo, sino que se recomienda conservar el microorganismo empleando
varios de estos mtodos.
a
Mtodos restringidos.
En este grupo se engloban mtodos no empleados habitualmente, pero a los que es necesario
recurrir a la hora de conservar grupos de microorganismos muy determinados que no resisten
bien la liofilizacin o la congelacin, como por ejemplo los gneros bacterianos Spirillum,
Rhodospirillum, etc. Los cuatro mtodos que vamos a citar se basan en la paralizacin del
crecimiento por eliminacin del agua disponible para las clulas.
a Desecacin en papel de filtro.
Se utiliza un papel bastante absorbente (Whatmann n 3) que se impregna con una solucin
muy densa de clulas y se deja secar al aire (en condiciones estriles). Tambin es posible
desecarlos por el procedimiento que se llama desecacin lquida (L-Dry) porque se utiliza para
ello el liofilizador, pero sin que haya habido congelacin previa de las clulas. El vaco
producido por el liofilizador deseca las clulas, pero hay que evitar que un vaco excesivo
provoque evaporacin brusca con ebullicin o que la temperatura disminuya demasiado,
ocasionando la congelacin incontrolada de las clulas.
b
Se aaden las clulas a estos sustratos que las protegern al desecar. Los microorganismos
productores de esporas se pueden conservar durante bastante tiempo por este mtodo.
c
ste es un procedimiento bastante eficaz. Las clulas se encuentran en una matriz de alginato
y la eliminacin del agua se hace por tratamiento con soluciones hipertnicas sucesivas y
posterior desecacin al aire hasta que se pierde un 70% de su contenido en agua. Estas bolitas
de alginato se pueden conservar en tubos cerrados hermticamente y a temperaturas de entre
4C y 18C, pudindose guardar incluso a 80C debido al bajo contenido en agua de las
clulas y la proteccin que suministra el soporte de alginato. Este es un mtodo que se est
utilizando incluso para la conservacin de algas y clulas vegetales.
d
Para su conservacin por este mtodo se mezclan las clulas con sal y se dejan desecar
espontneamente. Debido a la higroscopicidad de la sal, la desecacin no es total, pero las
clulas dejan de multiplicarse por ser insuficiente el nivel de agua disponible.
Por ltimo, y a modo de resumen, unas consideraciones finales. Cualquiera que haya sido el
mtodo empleado en la conservacin de las cepas microbianas, cuando stas se recuperan
para hacer nuevos lotes para su conservacin o para trabajar con ellas, se recomienda no
utilizar directamente las clulas que se han estado guardando, porque stas vienen de una
situacin de estress ms o menos fuerte (sobre todo cuando se han conservado por
liofilizacin) y por lo tanto no son adecuadas para ningn tipo de prueba. Primero habra que
revitalizarlas o rejuvenecerlas sembrndolas en un medio no selectivo, es decir, un medio que
asegure lo ms posible el crecimiento, y a partir de este primer crecimiento ya se puede
trabajar con ellas, cultivndolas en medios selectivos cuando sea necesario. Igualmente hemos
de tener presente que, dada la enorme diversidad microbiana, cada microorganismo soportar
determinados mtodos de conservacin mejor que otros, o ser necesario tomar precauciones
especiales en su conservacin. Como ya dijimos al comienzo, no existe un mtodo general de
conservacin de los microorganismos, aunque no resulta difcil determinar el ms aconsejable
en cada caso. La mayora de microorganismos de inters sanitario pueden conservarse a largo
plazo con los mtodos generales de congelacin y/o liofilizacin, y para periodos cortos pueden
mantenerse vivos por alguno de los mtodos alternativos si se hace en las condiciones
adecuadas y bien controlados por un microbilogo.
Bacilos
Las formas alargadas o bacilares agrupan una gran cantidad de subtipos morfolgicos. Las
diferencias en anchura, longitud y forma de los extremos de la clula proporcionan una
considerable heterogeneidad a la forma bacilar. En funcin de la tendencia de las clulas hijas
a permanecer unidas, los bacilos presentan tambin agrupaciones celulares caractersticas,
citando como ejemplo las formas en empalizada ( ///// ) o en V ( <<< ) o en letras chinas.
Aunque son hasta cierto punto caractersticos, los agrupamientos de clulas bacilares no tienen
la misma importancia morfolgica que el agrupamiento de cocos.
Espirilos:
El tercer tipo morfolgico es la forma espirilar, que puede considerarse como un bacilo que se
ha torcido adoptando la forma de hlice. Aunque la curvatura se observa ocasionalmente en
muchas formas bacilares, en el gnero Vibrio es suficientemente constante como para tener
importancia diferencial. Los vibrios pueden presentar una forma espirilar si las clulas
permanecen unidas por sus extremos.
Las verdaderas bacterias espirilares pueden ser de dos tipos: con espira rgida o con espira
flexible. Al conjunto de las formas espirilares flexibles se le conoce como espiroquetas. La
clasificacin y diferenciacin de las espiroquetas patgenas se basa en criterios morfolgicos
tales como la longitud de vuelta, el ngulo en los extremos de la clula, la presencia de una
envuelta externa y la composicin del filamento axial.
Caractersticas de las colonias bacterianas.
Cuando las bacterias crecen en la superficie de un medio de cultivo slido, las clulas en
divisin permanecen aproximadamente fijas en su posicin y forman masas de muchos
millones de clulas visibles a simple vista. Las colonias as formadas varan desde un tamao
diminuto, apenas visible, hasta masas de varios milmetros de dimetro.
Su tamao, forma, textura, olor y en algunos casos color son, a veces, muy orientativos para la
identificacin de las bacterias que la componen. Aunque estas caractersticas dependen a
menudo de la naturaleza del medio de cultivo y de las condiciones de incubacin, cuando stas
se controlan cuidadosamente, son muy constantes y, en muchas ocasiones, tienen un valor
diferencial considerable.
La morfologa de las colonias es una de las caractersticas bsicas de las bacterias y es
indispensable su estudio para comenzar correctamente una identificacin preliminar. Las
caractersticas morfolgicas ms importantes de una colonia bacteriana aislada sobre un medio
de cultivo slido son:
Tamao:
El tamao de las colonias bacterianas es, en condiciones de cultivo favorables, bastante
uniforme para cada especie o tipo. La visualizacin del tamao se suele hacer a simple vista,
aunque a veces es preferible utilizar lupas o estereoscopios para poder discernir con mayor
claridad las caractersticas morfolgicas a observar. Las colonias de estreptococos, por ej., son
relativamente pequeas (menos de 1 mm de dimetro), mientras que las de estafilococos o las
de algunos bacilos pueden alcanzar hasta 1 cm de dimetro. Es importante destacar que las
caractersticas de una colonia deben estudiarse siempre sobre el mismo tipo de medio de
cultivo, para evitar las diferencias surgidas por la diferente composicin de los mismos.
El tamao de las colonias bacterianas podemos expresarlo en las siguientes categoras:
Pequeas o puntiformes: 1 mm de dimetro o menor
Medianas: hasta 4 mm de dimetro
Grandes: mayores de 4 mm de dimetro
El tamao de las colonias debe ser considerado y medido en la parte final de la zona de
aislamiento, que es donde presentan su mximo tamao. No deben valorarse ms que colonias
bien aisladas.
Morfologa:
La morfologa de una colonia viene dada por su borde y forma de elevarse sobre el medio de
cultivo.
El borde puede ser liso (redondeado u ovalado) o irregular (aserrado, lobulado o espiculado).
Si pudisemos hacer un corte en un plano perpendicular a la base de la colonia podramos
encontrar las siguientes posibilidades:
semiesfrica o convexa
plana o en disco
acuminada
cerebroide
plana con bordes elevados (en crter).
plana con centro elevado (en huevo frito)
Superficie:
La superficie de la colonia, examinada mediante luz reflejada, puede mostrar un aspecto liso y
brillante a la luz o, por el contrario, una textura irregular, rugosa y mate, sin brillo. Puede
mostrar un aspecto filamentoso o cerebroide.
La utilizacin de una lupa estereoscpica permite la observacin de esta caracterstica
mediante la deteccin del reflejo del filamento de la lmpara en la superficie de la colonia.
Consistencia:
Las colonias bacterianas pueden tener una consistencia variable, desde seca y frgil a
grasienta y cremosa o viscosa y pegajosa. Esta caracterstica slo se aprecia cuando tocamos
las colonias con el asa de siembra.
Podremos observar colonias "duras" que se deslizan fcilmente por la superficie del medio,
siendo difcil manipularlas con el asa. A menudo estas colonias se fragmentan al intentar
cogerlas.
Otras colonias tienen apariencia cremosa, con superficie brillante generalmente y fciles de
manipular con el asa. La mayora de las colonias tienes consistencia mantecosa, siendo muy
fcil obtener pequeas porciones de la misma, que quedan bien adheridas al asa de siembra.
En algunas ocasiones las colonias son extremadamente viscosas y tienden a formar filamentos
mucosos cuando intentamos retirarlas con el asa.
Pigmentacin:
Es caracterstico slo de unas pocas especies bacterianas. La pigmentacin slo se observa en
colonias, y nunca en clulas individuales. Dentro de las bacterias patgenas, una de las formas
pigmentadas ms importantes es Staphilococcus aureus, cuyas colonias son normalmente de
color amarillo dorado. En ocasiones, el pigmento difunde al medio, dando a ste una tonalidad
caracterstica en algunas especies. Pseudomonas, por ejemplo, produce un pigmento verdoso
que puede ser fcilmente reconocido en medios incoloros como el Mueller-Hinton.
Hay que tener especial precaucin para no atribuir una falsa pigmentacin a colonias que se
han desarrollado en medios con determinadas sustancias nutritivas (azcares) e indicadores de
cambio de pH. Por ejemplo, los grmenes que utilizan la lactosa para su metabolismo darn
colonias de color amarillo en un medio que contenga este azcar y un indicador de pH
adecuado.
Hemlisis:
Algunas bacterias, fundamentalmente los cocos, pueden ser capaces de hemolizar los
hematies de un medio nutritivo slido como el agar sangre. Esto es debido a la liberacin de
unas sustancias denominadas hemolisinas. La hemlisis de los hematies adyacentes a la
colonia puede ser intensa o ligera y se observa como un halo verdoso ms o menos claro
alrededor de la colonia. La hemlisis intensa se denomina eta hemlisis; la hemlisis parcial
se conoce como alfa hemlisis y la ausencia de sta se define como gamma hemlisis. La
produccin de hemlisis en una placa de agar sangre es una de las caractersticas que ayudan
a diferenciar los diferentes tipos de estreptococos.
Olor:
Ciertos tipos de bacterias descomponen los sustratos que utilizan para su metabolismo
desprendiendo sustancias voltiles que proporcionan un olor caracterstico a los cultivos puros
de dichas bacterias. Como intentar definir un olor es tan difcil como subjetivo, slo os dir que
celular y para la observacin de abundantes dibujos y esquemas, os remito a la pgina web del
Todars, Texbook on line of Bacteriology, o al cap. 4 del libro Biologa de Microorganismos
(Brock).
Membrana externa
La membrana externa tiene una forma y una constitucin similar a la de otras membranas
biolgicas. Se comporta como una barrera hidrofbica para difusin de una gran cantidad de
sustancias, participa en la conjugacin y en la divisin celular y contiene protenas especiales,
las porinas, que intervienen en la toma de nutrientes y la difusin pasiva de pequeas
molculas hacia el espacio periplsmico. Tambin contiene lipopolisacridos que son los
principales componentes antignicos de superficie.
La funcin de la envuelta celular es la de una barrera osmtica y de un sistema regulador que
separa el citoplasma del medio, y proporciona a la bacteria el entorno relativamente aislado que
necesitan los organismos vivos.
Estructuras externas.
En el exterior de las clulas bacterianas podemos encontrar tres clases de estructuras: los
flagelos, u orgnulos relacionados con la locomocin y quimiotaxis; las fimbrias o pilli, y la
cpsula, o capa mucosa que rodea a la clula. Ninguna de ellas resulta esencial para la
existencia de la clula, pudiendo eliminarse por diversos medios y sin que exista inhibicin del
crecimiento bacteriano o alteracin de su funcin metablica.
Flagelos
Los flagelos bacterianos son prolongaciones filamentosas largas que se extienden ms all de
la superficie celular. Son los responsables de la locomocin de las bacterias y se hallan
implicados en la quimiotaxis y en la percepcin bacteriana. Debido a su delgadez, son difciles
de ver en las preparaciones en fresco, siendo necesario teirlos mediante tcnicas especiales
para ponerlos de manifiesto.
Los flagelos aparecen sobre todo en los bacilos. Su nmero es relativamente constante dentro
de cada especie bacteriana. Los flagelos pueden estar localizados solo en los extremos de la
bacteria o estar repartidos a lo largo de la superficie celular.
Las bacterias flageladas se clasifican segn el nmero y localizacin de los flagelos: las
bacterias que tienen un nico flagelo se denominan montricas; las que tienen dos o mas
flagelos en uno de los extremos de la clula son loftricas; aquellas que tienen penachos en
ambos extremos son anftricas, y si los flagelos estn dispuestos por toda la superficie celular
se denominan pertricas.
Los flagelos se componen de tres porciones claramente diferenciadas: filamento, codo o
manguito y cuerpo basal. El filamento tiene una longitud media de 15 a 25 m y se halla unido
al cuerpo basal a travs del manguito. La composicin proteica del filamento hace que este
posea caractersticas antignicas que a veces son tiles para la identificacin bacteriana. El
manguito flagelar es una especie de "articulacin universal" que permite la transmisin del
movimiento desde el cuerpo basal hasta el filamento. El cuerpo basal es la porcin ms
compleja, encontrndose dentro de la envuelta celular y actuando como un verdadero motor.
Se observan dos tipos de movimiento flagelar: de deslizamiento y de rotacin. Los primeros son
los encargados de dirigir a las bacterias hacia sitios concretos. Una bacteria con movimiento de
traslacin puede llegar a alcanzar hasta los 55 m por segundo. Los movimientos de rotacin
provocaran desplazamientos aleatorios conocindose tambin como volteretas o vuelcos.
Gracias a los movimientos de traslacin, las bacterias son capaces de evitar situaciones
desfavorables o ser atradas hacia las favorables, por ej. la presencia de nutrientes. Esta
capacidad de reaccionar frente a determinados estmulos ambientales se denomina "taxia" o
"fobia" dependiendo de la direccin del movimiento. Un acercamiento hacia zonas oxigenadas
se denominara aerotaxia; un alejamiento de una fuente luminosa seria una fotofobia.
Fimbrias o pillis
Estas estructuras solo pudieron ser descubiertas gracias a la utilizacin del microscopio
electrnico, pues su longitud varia entre 0,3 y 1 m. Pueden aparecer en los extremos de las
clulas o pueden estar distribuidas por toda la superficie en nmero que oscila desde uno a
varios centenares por clula.
Las fimbrias pueden ser de dos tipos diferentes, tanto desde el punto de vista morfolgico como
funcional: los pilli sexuales estn implicados en la formacin de parejas especficas durante la
conjugacin bacteriana, y sirven para iniciar el contacto entre dos clulas, unindolas y
facilitando la transferencia de material gentico. Los pilli sexuales se distinguen de las otras
fimbrias por su mayor longitud y su menor nmero (de uno a diez por clula). Otras fimbrias
parecen tener propiedades adherentes que facilitan la unin a otros tipos de clulas; p. ej.
Eritrocitos o leucocitos. La adherencia es fundamental para la colonizacin bacteriana en el
husped animal.
Cpsula
La cpsula es una estructura de naturaleza polisacrida que rodea completamente a la clula.
El tamao aparente de la cpsula varia ampliamente, siendo con frecuencia mayor que el
dimetro de la bacteria. Su funcin es an objeto de estudio, considerndose que desempea
un importante papel en la proteccin de la bacteria frente a agentes externos tales como la
desecacin, los bacterifagos o los metales txicos. Quizs tenga mayor importancia la
adherencia de las bacterias encapsuladas a superficies inertes de su entorno natural y a
clulas adecuadas para su crecimiento y supervivencia.
Las cpsulas bacterianas no se tien con los procedimientos habituales, pues no retienen
colorantes con facilidad. Se pueden hacer visibles al microscopio ptico suspendiendo las
clulas en tinta china diluida; este mtodo se conoce como tincin negativa. La cpsula
desplaza las partculas de carbn coloidal y las clulas parecen hallarse en lagunas, que
representan las cpsulas, situadas sobre un fondo oscuro. Sin embargo, no todas las cpsulas
impiden la penetracin de las partculas de carbn, y algunas no pueden ser observadas de
este modo.
La cpsula es habitualmente inmunognica, y los anticuerpos inducidos reaccionan con ella.
Los anticuerpos se fijan a la cpsula favoreciendo su fagocitosis o penetrando en la matriz
capsular y reaccionando con los polisacridos. Esta reaccin altera el ndice de refraccin de la
cpsula, de manera que, en preparaciones hmedas no teidas observadas
microscpicamente, aparecen mejor definidas y ms grandes. En 1902, Neufeld aplic este
abultamiento capsular, o reaccin de Quellung, a la identificacin serolgica de neumococos, y
desde entonces se ha utilizado para la identificacin serolgica de diversas bacterias
encapsuladas.
Estructuras internas.
El nucleoide bacteriano
Todo el material gentico de la clula est contenido en una nica molcula de ADN que mide
de 100 a 1400 m de longitud cuando est totalmente extendida. Generalmente la estructura
del DNA es circular, y en la clula se encuentra en una configuracin superenrollada.
Citoplasma
El citoplasma en las clulas bacterianas parece ser menos complejo que el de las clulas
eucariticas. Est considerado como un gel que contiene ribosomas, enzimas y, con frecuencia
grnulos que pueden representar productos de almacenamiento. Los grnulos citoplasmticos
que generalmente se observan son aquellos que se tien con ciertos colorantes bsicos, y se
denominan corpsculos metacromticos. Se consideran como un depsito de energa
reutilizable.
La espora
La espora bacteriana es una estructura compleja que se forma dentro de la clula para
asegurar la supervivencia de la especie ante condiciones ambientales desfavorables. La
formacin de esporas es inherente a algunos tipos de bacilos.
Las esporas pueden observarse en el interior de las bacterias o libremente despus de la
desintegracin de las clulas progenitoras. Cuando son intracelulares, las esporas presentan
forma esferoidal, con el eje longitudinal paralelo al del bacilo. Su anchura puede ser
esencialmente la misma que la de la clula madre, o ser mayor, deformando la pared de la
clula vegetativa.
El tamao y localizacin de las esporas son relativamente constantes dentro de cada especie.
En funcin de su localizacin la espora puede ser central, subterminal (entre el centro y el
extremo), y terminal. En ocasiones, su tamao y localizacin pueden dar lugar a una morfologa
caracterstica, como en el caso del bacilo del ttanos, cuya espora terminal grande confiere a la
clula vegetativa que la contiene forma de palillo de tambor.
La espora es un estado extremadamente resistente en el desarrollo de la clula. No slo es
relativamente impermeable a los colorantes, sino que tambin es mucho ms resistente que las
clulas vegetativas a los efectos perjudiciales del calor, la desecacin, presin hidrosttica y
muchos agentes qumicos. Algunas esporas son extremadamente resistentes a los
procedimientos habituales de esterilizacin, necesitndose un periodo de casi tres horas en
autoclave para asegurar su destruccin.
Normalmente la iniciacin de la esporognesis en clulas que estn creciendo activamente es
inducida por depleccin de nutrientes. En cada clula slo se forma una espora. Cuando la
espora se encuentra en un medio favorable para el crecimiento de las clulas vegetativas,
germina y la clula comienza un nuevo ciclo vegetativo.
crecimiento
Comenzando a partir de la citocinsis, la clula hija resulta pequea y posee un bajo contenido
de ATP resultante del gasto experimentado en el ciclo anterior. La acumulacin del ATP
necesario y el incremento de tamao acontecen durante el intervalo G1 de la interfase. Cuando
adquiere el tamao suficiente y el ATP necesario comienza la fase S, la clula sintetiza ADN
(replicacin del ADN) proceso que da como resultado final "un original y una copia" del ADN,
destinadas a las dos clulas que se originan del proceso. Dado que el proceso de sntesis
consume una gran cantidad de energa la clula entra nuevamente en un proceso de
crecimiento y adquisicin de ATP: la fase G2. La energa adquirida durante la fase G2 se utiliza
para el proceso de mitosis.
Mitosis
las
por un lado, el cromosoma ha debido terminar su replicacin y las copias hijas deben
de estar separadas en extremos opuestos
por otro lado, la clula debe haber alcanzado una longitud umbral
Como ya vimos en el captulo 5, llegado el momento, la protena FtsZ (que hasta entonces
estaba diseminada por toda la clula), se concentra ahora en la parte central, sealando el
plano de la tabicacin: se forma un anillo citocintico o divisoma, en el que la FtsZ se va
contrayendo hacia el interior (hidrolizando GTP hasta GDP). A continuacin se van
ensamblando en el divisoma varias protenas Fts, entre ellas la PBP3, que como vimos es una
transglucosidasa-transpeptidasa especfica del tabique, que va produciendo peptidoglucano en
el septo transversal. La terminacin del tabique seala el final del ciclo celular.
ESPIROQUETAS.
NEGATIVOS AEROBIOS:
GRAM NEGATIVOS:
RICKETTSIAS Y CHLAMIDIAS:
Microorganismos pleomrficos que necesitan para su cultivo clulas vivas donde originan
corpsculos de inclusin.
G. RICKETTSIA. R. prowazecki, R. connori
G. COXIELLA. C. burnetti
F CHLAMYDIACEAE.
G CHLAMYDIA. C. trachomatis. C. psittaci, C. pneumoniae
1. MYCOPLASMAS
Carecen de pared celular. Son los menores microorganismos cultivables en medios
sintticos.
F. MYCOPLASMATACEAE.
G. MYCOPLASMA. M. pneumoniae, M. hominis
G. UREAPLASMA. U. urealyticum
2.
Anaerobios estrictos:
G. PEPTOCOCCUS. P. niger.
G. PEPTOSTREPTOCOCCUS. P. anaerobius
G. SARCINA
3.
4.
Suelen vivir en lugares hmedos y oscuros pero pueden encontrarse en cualquier lugar en el
que haya materia orgnica. Necesitan humedad para desarrollarse.
Unicelulares: levaduras.
1.2
Mecanismos de reproduccin
Reproduccin sexual:
Los que la poseen se denominan hongos perfectos. No suele ser un tipo de reproduccin
frecuente en los hongos que producen patologas al hombre.
Tiene lugar cuando el medio es deficiente en materias nutritivas. Entonces el microorganismo
se defiende formando clulas especiales muy resistentes (esporas).
La produccin de esporas se realiza por la fusin de dos ncleos haploides genticamente
diferentes. As se forma una clula diploide llamada zigoto que tras divisin meitica origina 4
clulas haploides las cuales se rodean de una cubierta formando las esporas.
Existen varios tipos de esporas sexuales:
Zigosporas:
Se producen por la fusin de dos gametos similares que se encuentran en el extremo de las
hifas.
Oosporas:
Se forman por la unin de dos gametos desiguales en cuanto a tamao.
Ascosporas:
Se producen por la unin de dos hifas, desapareciendo la pared celular que las separa.
Posteriormente ocurre la fecundacin, originando de 4 a 8 esporas dentro de un saco
denominado asco.
Basidiosporas:
Se forman por la fusin de dos ncleos de una hifa. Posteriormente los 4 ncleos haploides se
dirigen hacia fuera y se rodean de citoplasma dando lugar a las basidiosporas.
Reproduccin asexual:
Los que slo poseen reproduccin asexual se denominan hongos imperfectos. Tiene lugar
cuando el medio es rico en sustancias nutritivas. Existen varios tipos de reproduccin asexual:
Por gemacin.
En este tipo de reproduccin la clula hija se origina a partir de una yema de la clula madre.
Primero, la clula madre emite una yema al mismo tiempo que divide su ncleo por
estrangulacin. La yema aumenta de tamao y se provee de los elementos constituyentes de la
clula madre y finalmente se estrangula y se separa de la clula madre dando lugar a la clula
hija o blastosporo. Este proceso es caracterstico en levaduras del gnero Saccharomyces.
Por biparticin. Cuando una clula est en condiciones de reporducirse, comienza por dividir su
ncleo en dos ncleos hijos, cada uno de los cuales se rodea de una porcin de protoplasma.
Luego aparece un tabique por el ecuador de la clula, separndola en dos clulas hijas. Este
proceso es caracterstico en las levaduras del gnero Schizosaccharomyces.
Por esporulacin.
Blastosporas: se forman por gemacin, sin separacin entre ellas, originando las
pseudohifas y pseudomicelios.
Aleurispora: similares a las anteriores pero se separan por ruptura del septo.
Reproduccin parasexual:
Es una forma de reproduccin muy rara, que consiste en la unin de una o varias hifas pero sin
existir fusin nuclear, dando unas estructuras con ncleos haploides.
Alimentacin:
Hay muchos hongos comestibles pero tambin hay muchos venenosos. De los comestibles
muchos se cultivan como el champin, la trufa o el nscalo. Pero la seta que ms destaca por
su exquisito sabor es la Amanita caesarea, que fue considerada como el manjar de los csares.
Pero a la hora de su recoleccin hay que tener mucho cuidado y saber distinguirla y
determinarla bien ya que se parece mucho a otra seta tambin del gnero Amanita que es
sumamente peligrosa, llegando a ser mortal.
Tambin hay que destacar el uso de las levaduras para realizar la fermentacin alcohlica en la
produccin del vino, la sidra y la cerveza.
Otros hongos son utilizados para realizar la fermentacin lctica que da lugar a la produccin
de quesos y yogures, y otros son utilizados para la fabricacin del pan.
Medicina:
En el campo de la medicina cabe destacar la utilidad de hongos como el Penicillum del que se
obtiene la penicilina.
Investigacin:
Ecolgica:
porcelana que normalmente retenan a las bacterias, pero siendo incapaz de aislar y crecer el
supuesto microorganismo, abandon la investigacin. Pocos aos ms tarde (1898), y
probablemente sin tener noticias del trabajo de Iwanovski, Beijerink realiz experimentos
similares con el mismo sistema, y en otro rasgo de su genio, enfrentndose a los conceptos de
la poca, avanz la idea de que el agente filtrable (un contagium vivum fluidum, segn su
expresin), deba de incorporarse al protoplasma vivo del hospedador para lograr su
reproduccin. Este tipo de agentes infectivos que atravesaban los filtros de porcelana fueron
llamados en principio virus filtrables, quedando ms tarde su denominacin simplemente
como virus. Aquel mismo ao de 1898 Loeffler y Frosch descubren los virus animales al
comprobar que un virus filtrable es responsable de la glosopeda del ganado. En 1901 Reed
descubre el primer virus humano, el de la fiebre amarilla, y en 1909 Landsteiner y Pope
detectan el de la poliomielitis. A comienzos de siglo Copeman desarrolla su tcnica de
multiplicacin de virus animales en embriones de pollo, con la que P. Rous aisla y cultiva el
virus del sarcoma aviar (1911).
Los virus bacterianos fueron descubiertos en 1915 por F.W. Twort, si bien su trabajo no alcanz
la elegancia y claridad del desarrollado poco ms tarde por el canadiense Flix d'Hrelle
(1917); fue ste quien acu el trmino bacterifago, y supuso correctamente que el fenmeno
de lisis por estos agentes deba de estar ampliamente difundido entre las bacterias. Aunque su
esperanza en la aplicacin de los fagos como elementos bactericidas para uso mdico no pudo
satisfacerse, la contribucin de los virus bacterianos al avance de la gentica y biologa
moleculares ha sido decisiva: de hecho, los primeros estudios cuantitativos sobre replicacin
virsica se realizaron sobre fagos de Escherichia coli, lo que suministr modelos aplicables a
otros virus, incluidos los de animales. En 1925 Bordet y Bal describen por primera vez el
fenmeno de lisogenia, pero las relaciones entre los ciclos ltico y lisognico de los fagos no
fueron aclaradas hasta los estudios de Andr Lwoff (1950).
La primera visualizacin de un virus se debe a las observaciones a microscopio ultravioleta del
bacterilogo ingls Barnard (1925), y en 1939 se realiza la primera fotografa de un virus a
microscopio electrnico. Pero los avances ms significativos en el estudio de la composicin y
estructura de los virus se inician con la purificacin y cristalizacin, por Wendell M. Stanley, del
virus del mosaico del tabaco -TMV- (1935), aplicando procedimientos tpicos de la cristalizacin
de enzimas. Inicialmente Stanley comprob que el TMV contena gran proporcin de protena,
pero poco ms tarde detecta, adems, la presencia de cido nucleico. A partir de aqu, la
Virologa entra en una fase de ciencia cuantitativa, en la que participan numerosos fsicos,
bioqumicos y genetistas, en un esfuerzo interdisciplinar que da origen a la moderna Biologa
Molecular.
Un importante avance metodolgico para el estudio de los virus animales se debi a Enders,
Weller y Robbins (1949), al desarrollar por primera vez un mtodo para la multiplicacin
virsica sobre cultivos de tejidos de mamferos, tcnica que fue perfeccionada ms tarde por el
equipo de Renato Dulbecco. Los recientes progresos en las numerosas tcnicas de biologa
molecular han propiciado una autntica explosin de descubrimientos sobre la biologa de los
virus y de sus clulas hospedadoras; baste citar la replicacin del genomio de ARN de los
retrovirus por reversotranscripcin a ADN, los fenmenos de transformacin oncognica
virsica y su aplicacin a los estudios generales del cncer, el diseo de vacunas
recombinantes por manipulacin in vitro de genomios virsicos, la prxima aplicacin clnica de
la primeras terapias gnicas en humanos recurriendo a vectores virsicos, etc. En el terreno de
las necesidades urgentes, la metodologa existente ha permitido la rpida identificacin y
caracterizacin del virus de la inmunodeficiencia humana, lo que se est traduciendo en una
intensa y racional bsqueda de procedimientos para prevenir y eliminar la inesperada epidemia
de SIDA. En aos recientes han sido descubiertos dos nuevos tipos de entidades infectivas,
subvirsicas: T.O. Diener describi en 1967 la existencia de ARN desnudos infectivos en
plantas, a los que llam viroides, y en 1981 Prusiner puso de manifiesto que determinadas
enfermedades de mamferos se deben a partculas proteicas aparentemente desprovistas de
material gentico, a las que bautiz como priones.
Otro tipo de objetos de estudio de la microbiologa son las entidades no celulares, que a pesar
de no poseer ciertos rasgos atribuibles a lo que se entiende por vida, cuentan con
individualidad y entidad biolgica, y caen de lleno en el dominio de esta ciencia.
Los virus son entidades no celulares de muy pequeo tamao (normalmente inferior al del ms
pequeo procariota), por lo que debe de recurrirse al microscopio electrnico para su
visualizacin. Son agentes infectivos de naturaleza obligadamente parasitaria intracelular, que
necesitan su incorporacin al protoplasma vivo para que su material gentico sea replicado por
medio de su asociacin ms o menos completa con las actividades celulares normales, y que
pueden transmitirse de una clula a otra. Cada tipo de virus consta de una sola clase de cido
nucleico (ADN o ARN, nunca ambos), con capacidad para codificar varias protenas, algunas
de las cuales pueden tener funciones enzimticas, mientras que otras son estructurales,
disponindose stas en cada partcula virsica (virin) alrededor del material gentico
formando una estructura regular (cpsida); en algunos virus existe, adems, una envuelta
externa de tipo membranoso, derivada en parte de la clula en la que se desarroll el virin
(bicapa lipdica procedente de membranas celulares) y en parte de origen virsico (protenas).
En su estado extracelular o durmiente, son totalmente inertes, al carecer de la maquinaria de
biosntesis de protenas, de replicacin de su cido nucleico y de obtencin de energa. Esto
les obliga a un modo de vida (sic) parasitario intracelular estricto o fase vegetativa, durante la
que el virin pierde su integridad, y normalmente queda reducido a su material gentico, que al
superponer su informacin a la de la clula hospedadora, logra ser expresado y replicado,
producindose eventualmente la formacin de nuevos viriones que pueden reiniciar el ciclo.
Los viroides son un grupo de nuevas entidades infectivas, subvirsicas, descubiertas en 1967
por T.O. Diener en plantas. Estn constituidos exclusivamente por una pequea molcula
circular de ARN de una sola hebra, que adopta una peculiar estructura secundaria alargada
debido a un extenso, pero no total, emparejamiento intracatenario de bases por zonas de
homologa interna. Carecen de capacidad codificadora y muestran cierta semejanza con los
intrones autocatalticos de clase I, por lo que podran representar secuencias intercaladas que
escaparon de sus genes en el transcurso evolutivo. Se desconocen detalles de su modo de
multiplicacin, aunque algunos se localizan en el nucleoplasma, existiendo pruebas de la
implicacin de la ARN polimerasa II en su replicacin, por un modelo de crculo rodante que
genera concatmeros lineares. Esta replicacin parece requerir secuencias conservadas hacia
la porcin central del viroide. Los viroides aislados de plantas originan una gran variedad de
malformaciones patolgicas. El mecanismo de patogenia no est aclarado, pero se sabe que
muchos de ellos se asocian con el nucleolo, donde quiz podran interferir; sin embargo, no
existen indicios de que alteren la expresin gnica (una de las hiptesis sugeridas); cada
molcula de viroide contiene uno o dos dominios conservados que modulan la virulencia.
En 1986 se descubri que el agente de la hepatitis delta humana posee un genomio de ARN de
tipo viroide, aunque requiere para su transmisin (pero no para su replicacin) la colaboracin
del virus de la hepatitis B, empaquetndose en partculas similares a las de este virus. A
diferencia de los viroides vegetales, posee capacidad codificadora de algunas protenas.
Los ARNs satlites son pequeas molculas de tamao similar al de los viroides de plantas
(330-400 bases), que son empaquetados en cpsidas de determinadas cepas de virus (con
cuyos genomios no muestran homologas). Se replican slo en presencia del virus colaborador
especfico, modificando (aumentando o disminuyendo) los efectos patgenos de ste.
Los virusoides constituyen un grupo de ARNs satlites no infectivos, presentes en el interior de
la cpsida de ciertos virus, con semejanzas estructurales con los viroides, replicndose
exclusivamente junto a su virus colaborador.
Los priones son entidades infectivas de un tipo totalmente nuevo y original, descubiertas por
Stanley Prusiner en 1981, responsables de ciertas enfermedades degenerativas del sistema
nervioso central de mamferos (por ejemplo, el scrapie o prurito de ovejas y cabras),
incluyendo los humanos (kuru, sndrome de Gerstmann-Strassler, enfermedad de CreutzfeldtJakob). Se definen como pequeas partculas proteicas infectivas que resisten la inactivacin
por agentes que modifican cidos nucleicos, y que contienen como componente mayoritario (si
no nico) una isoforma anmala de una proteina celular. Tanto la versin celular normal (PrPC)
como la patgena (PrPSc en el caso del scrapie) son glicoprotenas codificadas por el mismo
gen cromosmico, teniendo la misma secuencia primaria. Se desconoce si las caractersticas
distintivas de ambas isoformas estriban en diferencias entre los respectivos oligosacridos que
adquieren por procesamiento post-traduccional.
A diferencia de los virus, los priones no contienen cido nucleico y estn codificados por un gen
celular. Aunque se multiplican, los priones de nueva sntesis poseen molculas de PrP que
reflejan el gen del hospedador y no necesariamente la secuencia de la molcula del PrP que
caus la infeccin previa. Se desconoce su mecanismo de multiplicacin, y para discernir entre
las diversas hiptesis propuestas quiz haya que dilucidar la funcin del producto normal y su
posible conversin a la isoforma patgena infectiva.
Recientemente se ha comprobado que, al menos algunas de las enfermedades por priones son
simultneamente infectivas y genticas, una situacin inslita en la Patologa humana,
habindose demostrado una relacin entre un alelo dominante del PrP y la enfermedad de
Creutzfeldt-Jakob. El gen del prin (Prn-p) est ligado genticamente a un gen autosmico
(Prn-i) que condiciona en parte los largos tiempos de incubacin hasta el desarrollo del
sndrome.
Cpsides
La cpside es una cubierta proteica externa que encierra y protege al genoma viral de la accin
de nucleasas y otros factores adversos del medio exterior. Adems, en los virus desnudos
carentes de envoltura, la cpside es la encargada de establecer a travs de alguna de sus
protenas la unin con la clula que ser parasitada por el virus. Asimismo, las protenas de la
cpside contienen los determinantes antignicos contra los que el sistema inmune del husped
elaborar la respuesta de anticuerpos en defensa del organismo.
Hay dos tipos bsicos de estructura que pueden presentar las cpsides
virales: simetraicosadrica, observndose el virin al microscopio de forma aproximadamente
esfrica, osimetra helicoidal, resultando nucleocpsides filamentosas tubulares pero que
pueden estar encerradas dentro de una envoltura que confiere a la partcula forma esfrica o
de bastn.
Envolturas
La envoltura de un virus es una membrana constituida por una doble capa lipdica asociada a
glicoprotenas que pueden proyectarse en forma de espculas desde la superficie de la
partcula viral hacia el exterior.
Los virus adquieren su estructura mediante un proceso de brotacin a travs de alguna
membrana celular. El nmero de glicoprotenas que presentan los virus animales es muy
variable.
Las glicoprotenas virales que forman las espculas son protenas integrales de membrana que
atraviesan la bicapa de lpidos presentando tres dominios topolgicamente diferenciables: 1) un
gran dominio hidroflico hacia el exterior de la membrana; 2) un pequeo dominio hidrofbico
formado por 20-27 aminocidos que atraviesa la capa lipdica y ancla la glicoprotena a la
membrana; 3) un pequeo dominio hidroflico hacia el interior de la partcula viral. Este ltimo
dominio interacta con las protenas de la nucleocpside, ya sea directamente o a travs de
una protena viral no glicosilada denominada M (de matriz), que se encuentra en algunos virus
animales por debajo de la bicapa.
Las glicoprotenas virales cumplen diversas funciones biolgicas durante el ciclo de vida de un
virus, siendo esenciales para la infectividad, ya que actan: 1) en la adsorcin a la clula
husped; 2) en el proceso de fusin que permite la entrada de la nucleocpside viral al
citoplasma; 3) en la brotacin, que permite la salida del virus envuelto a partir de la clula
infectada. Adems las glicoprotenas son el blanco de reaccin para el sistema inmune tanto en
la respuesta humoral como celular.
Los virus se caracterizan, a diferencia de los otros organismos, por presentar una nica especie
de cido nucleico constitutiva que puede ser ADN o ARN, monocatenario o bicatenario con
estructura de doble hlice.
Tipos de ADN virales
La mayora de los virus ADN presentan un genoma bicatenario, con excepcin de los
parvovirus, constituidos por ADN monocatenario. Adems las molculas de ADN viral pueden
ser lineales o circulares.
La conformacin circular que presentan los Papovaviridae y Hepadnaviridae, confiere una serie
de ventajas al cido nucleico respecto de la estructura lineal, otorgndole proteccin frente al
ataque de exonucleasas, facilitando la replicacin completa de la molcula y su posible
integracin al ADN celular. En el caso de los papovavirus, el ADN puede presentar tres
conformaciones: la forma I corresponde a la molcula circular covalentemente cerrada y
superenrollada sobre s misma. Si se produce una ruptura en una unin en una de las cadenas,
la doble hlice se desenrolla y resulta una molcula circular relajada (forma II). Por ltimo, la
forma III es el resultado de una ruptura en la otra cadena que origina una molcula bicatenaria
lineal.
El ADN circular de los hepadnavirus tiene una estructura muy peculiar y de caractersticas
nicas dentro de los ADN virales: una de las cadenas (S, corta) es incompleta, de manera que
el 15-50% de la molcula es monocatenaria; la otra cadena (L, larga) presenta ruptura en un
nico punto de la molcula y adems tiene una protena unida covalentemente en el extremo
5`.
Tipos de ARN virales
Los ARN de los virus animales son en su gran mayora de cadena simple, siendo Reoviridae y
Birnaviridae las nicas familias que presentan como genoma ARN bicatenario. En algunos
grupos de virus, el ARN genmico est segmentado en varios fragmentos, cuyo nmero es
caracterstico de cada familia.
Adems de las caractersticas fsicas y qumicas mencionadas, la polaridad o sentido de la
cadena de ARN es una propiedad fundamental utilizada para definir los distintos tipos de ARN
viral. Se parte de definir como polaridad positiva la secuencia de bases correspondiente al
ARNm y polaridad negativa a la secuencia complementaria a la del ARNm. Un virus es de
cadena positiva cuando su ARN genmico tiene la polaridad que le permite actuar como ARNm,
o sea ser traducido en protenas, inmediatamente despus de haber entrado a la clula.
Por el contrario, en los virus de polaridad negativa el ARN genmico tiene la secuencia
complementaria al ARNm viral; por lo tanto, cuando se produce la infeccin y el ARN viral entra
en la clula debe sintetizar la cadena complementaria que ser el ARNm. Para ello, los virus de
polaridad negativa llevan en el virin asociada a su genoma una ARN polimerasa dependiente
de ARN, enzima denominada transcriptasa, que efecta la transcripcin del ARN mensajero a
partir del ARN genmico.
Ciclo ltico
Se denomina as porque la clula infectada muere por rotura al liberarse las nuevas copias
virales. Consta de las siguientes fases:
Fase de penetracin o inyeccin: el cido nucleico viral entra en la clula mediante una
perforacin que el virus realiza en la pared bacteriana.
Fase de eclipse: en esta fase no se observan copias del virus en la clula, pero se est
produciendo la sntesis de ARN, necesario para generar las copias de protenas de la
cpsida. Tambin se produce la continua formacin de cidos nucleicos virales y
enzimas destructoras del ADN bacteriano.
Fase de ensamblaje: en esta fase se produce la unin de los capsmeros para formar
la cpsida y el empaquetamiento del cido nucleico viral dentro de ella.
Fase de lisis o ruptura: conlleva la muerte celular. Los viriones salen de la clula,
mediante la rotura enzimtica de la pared bacteriana. Estos nuevos virus se encuentran
en situacin de infectar una nueva clula.
Ciclo lisognico
Las dos primeras fases de este ciclo son iguales a las descritas en el ciclo anterior. En la fase
de eclipse el cido nucleico viral en forma de ADN bicatenario recombina con el ADN
bacteriano, introducindose en ste como un gen ms. Esta forma viral se denomina profago, o
virus atenuado, mientras que la clula infectada se denomina clula lisognica.
En este estado el profago puede mantenerse durante un tiempo indeterminado, pudiendo
incluso, reproducirse la clula, generando nuevas clulas hijas lisognicas. El profago se
mantendr latente hasta producirse un cambio en el medio ambiente celular que provoque un
cambio celular, por ejemplo, por variaciones bruscas de temperatura, o desecacin, o
disminucin en la concentracin de oxgeno. Este cambio induce a la liberacin del profago,
transformndose en un virus activo que contina el ciclo de infeccin hasta producir la muerte
celular y la liberacin de nuevos virus.
Lneas Celulares Diploides: Son aquellas que crecen en pasajes sucesivos hasta
aproximadamente 50 subcultivos y que conservan por lo menos en un 75% el cariotipo
correspondiente a la especie de que provienen.
Lneas Celulares Continuas: Permite un nmero finito de subcultivos y son heteroploides.
Para considerar que se ha logrado establecer una lnea continua, esta debe de haber sido
subcultivada por lo menos 70 veces. Las lneas celulares continuas ofrecen las siguientes
ventajas:
Los distintos cultivos celulares varan en cuanto a su susceptibilidad a los diferentes virus, ya
que existe una relacin especfica husped-virus, y es en funcin de los datos clnicos y del tipo
de muestra que se elige el cultivo para inocular el material.
Luego de inoculado el cultivo celular, se incuba a 35-37 C por un perodo de hasta 14 das
promedio, esperando la aparicin de efecto citoptico, toxicidad o degeneracin celular,
observando el cultivo al microscopio a las 24, 48, 72hs y luego 2 veces por semana. Se usan
cultivos celulares no inoculados para control y comparacin con cualquier cambio morfolgico
observado en los cultivos inoculados. El efecto citoptico es la visualizacin de cambios
morfolgicos ms o menos caractersticos en las clulas inoculadas producidas por la accin
del virus sobre el cultivo celular.
Cuando los virus no producen efecto citoptico, se puede recurrir a tcnicas que ponen en
evidencia la presencia de aquel en el cultivo. Las ms usadas son: hemadsorcin,
hemaglutinacin y tinciones con anticuerpos monoclonales. (Ver 2)
Hemadsorcin: Hay virus que durante su multiplicacin intracelular, expresan en la membrana
de la clula husped elementos estructurales virales llamados hemaglutininas, glicoprotenas
capaces de unirse a receptores especficos en la membrana de glbulos rojos de diferentes
especies animales. De modo que si se agregan glbulos rojos a un cultivo inoculado, se puede
poner en evidencia la infeccin de esas clulas a travs de la unin de los glbulos rojos a la
superficie celular.
Hemaglutinacin: Las hemaglutininas pueden ponerse en evidencia en el sobrenadante de los
cultivos utilizando el mismo fundamento que para la hemadsorcin.
Esta tcnica se puede utilizar para una identificacin rpida del virus directamente sobre la
muestra (por ejemplo: clulas eluidas de un lavado nasal, o de un hisopado nasofarngeo), o se
la puede emplear para la confirmacin del efecto citoptico observado en cultivos celulares.
Sin embargo la realizacin de la reaccin es laboriosa, depende mucho de la calidad de los
reactivos, requiere un microscopio de fluorescencia y de una persona con experiencia para
llegar a un diagnstico certero, as como una recoleccin y preparacin de la muestra
adecuada. Aun as, el mtodo, en manos de una persona con experiencia resulta til para la
identificacin rpida de ciertos virus como los virus respiratorios, ya que nos proporciona un
diagnstico etiolgico en el curso de una jornada de trabajo. Adems puede estudiar varias
muestras simultneamente.
El advenimiento de los anticuerpos monoclonales, ha incrementado la especificidad y en
algunos casos la sensibilidad de estos ensayos. Esta tcnica requiere slo 2-4hs, y se ha
reportado una sensibilidad del 70-80 % comparada con cultivos celulares para la identificacin
de virus Herpes Simple, 80-95% para VRS y 71% para Influenza A. La tincin con
inmunoperoxidasa es similar a la de la inmunofluorescencia y es la tcnica de eleccin en
algunos laboratorios. El procedimiento implica unos pocos pasos adicionales ya que en este
caso el anticuerpo monoclonal est marcado con una enzima que requiere la adicin de un
substrato para evidenciar la reaccin por un cambio de color que es visible micro y
macroscpicamente.
TEST DE AGLUTINACION
El test de aglutinacin es un mtodo simple, de un solo paso, que a veces se usa para la
deteccin de antgenos virales en muestras clnicas. Los ensayos de aglutinacin, dependen de
la fijacin inicial de anticuerpos antivirales especficos sobre eritrocitos o partculas de ltex.
Luego este reactivo se incuba con la muestra clnica en la cual se investiga el antgeno y las
partculas se aglutinan si el antgeno adecuado se encuentra presente. Estas pruebas en
general se complementan o se confirman por medio de otros ensayos debido al elevado
porcentaje de reacciones inespecficas.
El test de aglutinacin ha sido usado para detectar antgeno de Rotavirus en heces (el ms
importante) mostrando una buena sensibilidad cuando se lo compara con el EIA para Rotavirus.
Adems es una tcnica rpida y barata. Tambin se la ha usado para detectar antgenos de
Adenovirus.
RADIOINMUNOENSAYO (RIA)
Fue originalmente aplicado para identificar el antgeno de superficie de la Hepatitis B (HBsAg) y
el anticuerpo anti-HBsAg. Estos ensayos tienen una buena sensibilidad y especificidad, pero la
aparicin de un mtodo como el ensayo inmunoenzimtico (EIA) con su mayor tiempo de
conservacin de los reactivos, su costo relativamente ms bajo y la ausencia de residuos
radioactivos, ha reemplazado las tcnicas de RIA en la mayor parte de los casos de deteccin
de antgeno viral.
ENZIMOINMUNOANALISIS (EIA)
Los EIA para la deteccin de antgeno se basan habitualmente en la captura del antgeno por
anticuerpos especficos unidos a una fase slida, en general el pocillo de una microplaca o una
pequea esfera de plstico. El antgeno viral presente en la muestra clnica se combina con el
anticuerpo fijado a la fase slida y el antgeno viral se detecta mediante la adicin de otro
anticuerpo especfico conjugado a una enzima. La enzima conjugada suele ser peroxidasa o
fosfatasa alcalina. El substrato para esas enzimas vara. En la reaccin con la peroxidasa el
substrato es un perxido capaz de oxidar un compuesto qumico incoloro que en su forma
oxidada tiene un color caracterstico.
En el caso de la fosfatasa la desfosforilizacin es la responsable directa de la aparicin del
color. Por esta tcnica se puede procesar gran nmero de muestras en forma rpida y
automatizada, no requiriendo de un observador experimentado para leer los resultados, ya que
estos se leen por medio de espectrofotmetros especialmente diseados, siendo entonces una
tcnica ms objetiva
Clasificacin de virus
Los virus se clasifican en base a su morfologa, composicin qumica y modo de replicacin.
Los virus que infectan a humanos frecuentemente se agrupan en 21 familias, reflejando slo
una pequea parte del espectro de la multitud de diferentes virus cuyo rango de huspedes van
desde los vertebrados a los protozoos y desde las plantas y hongos a las bacterias.
Nomenclatura
El nombre de los virus obedece a distintas consideraciones. Algunas veces se debe a la
enfermedad que ellos producen, por ejemplo el virus polio se llama as porque produce la
poliomielitis. Tambin puede deberse al nombre de los descubridores como el virus del EpsteinBarr, o a caractersticas estructurales de los mismos como los coronavirus. Algunos poseen un
nombre derivado del lugar donde se los hall por primera vez, tal es el caso del virus Coxsackie
o Norwalk.
El ICTV (International Committee on taxonomy of viruses) ha propuesto un sistema universal de
clasificacin viral. El sistema utiliza una serie de taxones como se indica a continuacin:
Orden (-virales)
Familia (-viridae)
Subfamilia (-virinae)
Gnero (-virus)
Especie ( )
VIRUS
ADN
Familia
Gnero
Ejemplo
Comentario
Herpesviridae
Alphaherpes
-virinae
Herpes simplex
virus type
1 (aka HHV-1)
Encefalitis,
estomatitis
aguda, llaga
labial del
resfrado.
Herpes simplex
virus tipo 2 (aka
HHV-2)
Herpes genital,
encefalitis
Varicella zoster
virus (aka HHV3)
Varicela, Herpes
Zster
Epstein Barr
virus (aka HHV4)
Mononucleosis
hepatitis,
tumores (BL,
NPC)
Gammaherp
es-virinae
Betaherpesvirinae
Sarcoma de
Kaposi, asociado
al herpesvirus,
KSHV (aka
Human
herpesvirus 8)
Probablemente:
tumores, inc.
Sarcoma de
Kaposi (KS) y
algunos linfomas
de clulas B
Cytomegaloviru
s Humano (aka
HHV-5)
Mononucleosis,
hepatitis,
pneumonitis,
congnitas
Human
herpesvirus 6
Rosola (aka E.
subitum),
pneumonitis
Human
herpesvirus 7
Algunos casos de
reseola?
Adenoviridae
Mastadenovirus
Adenovirus
Humano
49 serotipos
(especies);
infecciones
respiratorias.
Papovaviridae
Papillomavirus
Papillomavirus
Humano
70 especies;
verrugas y
tumores
Polyomavirus
JC, BK viruses
usualmente poco
graves; JC causa
PML en SIDA
Hepadnavirus
Virus de la
Hepatitis
(crnica), cirrosis,
tumores
hepticos.
Hepadnavirida
e
Hepatitis B
Poxviridae
Orthopoxvirus
Vaccinia virus
Virus de la
vacuna de la
viruela
Monkeypox virus Enfermedad
como la viruela,
zoonosis muy
rara (un brote
reciente en el
Congo; 92 cases
desde 2/96 2/97)
Parvoviridae
Parapoxvirus
Orf virus
Lesiones
drmicas
("pocks")
Parvo-virus
B19 parvovirus
Exantema.
Infecciosa. (5
enfermedad),
crisis aplstica,
prdida fetal.
Dependovirus
Virus Adenoasociado
VIRUS ARN
Familia
Gnero
Ejemplo
Comentario
Picornaviridae
Enterovirus
Polioviruses
3 tipos; meningitis
asptica,
poliomielitis
paraltica
Echoviruses
32 tipos; Aseptic
meningitis, rashes
Coxsachieviruse
29 types; meningitis
asptica,
miopericarditis
Virus de la
Hepatitis A
Hepatitis aguda
(propagacin fecaloral)
Rhinovirus
Human
rhinoviruses
Calicivirus
Norwalk virus
Enfermedad
gastrointestinal.
Hepevirus
Virus de la
Hepatitis aguda
(propagacin fecaloral)
Hepatovirus
Caliciviridae
Hepatitis E
Paramyxovirid
ae
Orthomyxoviri
dae
Paramyxo
-virus
Parainfluenza
viruses
4 tipos; Resfrado
comn, bronquiolitis,
neumona
Rubulavirus
Virus de las
Paperas
Paperas: parotitis,
meningitis asptica
(raro: orquitis,
encefalitis)
Morbillivirus
Virus del
sarampin
Sarampin: fiebre,
exantema (raro:
encefalitis, SSPE)
Pneumovirus
Virus Sincitial
respiratorio
Resfrado
comn(adultos),
bronquiolitis,
neumonia (nios)
Influenzavirus A
Influenza virus
A
Influenzavirus B
Influenza virus
B
Rhabdoviridae
Lyssavirus
Virus de la
Rabies
Rabia: incubacin
larga y despus
enfermedad del SNC
y muerte.
Filoviridae
Filo-virus
Virus de
Fiebre hemorrgica,
muerte
Ebola and
Marburg
Bornaviridae
Bornavirus
Borna disease
virus
No muy claro;
relacionado con
enfermedades
tipo:ezquizofrenia en
algunos animales.
Retroviridae
Oncovirinae
Human Tlymphotropic
virus type-1
Leucemia de clulas
T del adulto. (ATL),
paraparesia
espstica tropical
(TSP)
Spumavirinae
Human foamy
viruses
No se conoce
patologa
Lentivirinae
Virus type1 y 2
de la
inmunodeficien
cia humana
SIDA, enfermedad
del SNC
Rubi-virus
Virus de la
Rubela
Exantema;
malformaciones
congnitas.
Alphavirus
Virus de la
Encefalitis
Transmitida por
mosquitos,
Togaviridae
Flaviviridae
Flavi-virus
Hepacivirus
equina (WEE,
EEE, VEE)
encefalitis
Virus de la
Fiebre Amarilla
Mosquito-born;
fever, hepatitis
(yellow fever!)
Virus del
Dengue
Transmitida por
mosquitos;
hemorrhagic fever
Virus de la
Encefalitis de
San Luis
Transmitida por
mosquitos;
encephalitis
Virus de la
Hepatitis (con
frecuencia: crnica),
cncer heptico
Hepatitis C
Reoviridae
Bunyaviridae
Rota-virus
Rotaviruses
Humano
6 tipos; Diarrea
Colti-virus
Virus de la
Fiebre de
Garrapatas de
Colorado
Transmitido por
garrapatas; fiebre
Orthoreovirus
Reoviruses
Humanos
Enfermedad leve
Hantavirus
Sndrome
Pulmonar por
Hantavirus
Propagado por
roedores;
enfermedad
pulmonar (puede ser
letal, Ej brote de las
"4 esquinas")
Hantaan virus
Propagado por
roedores; fiebre
hemorrgica con
sndrome renal.
Phlebovirus
Esta variabilidad de los virus, sin embargo, aparte de causarnos los problemas mencionados,
se convierte en una herramienta muy til en el estudio de la evolucin de los organismos en el
nivel molecular. El estudio de la variabilidad de los virus ha producido conocimientos en el
mbito de la evolucin, lo cual puede ser aplicado hasta cierto punto y en diferentes formas a la
generalidad de la biologa.
Actualmente se considera a los virus no slo como causantes de enfermedades sino tambin
como agentes muy importantes que colaboran en el mantenimiento del equilibrio ecolgico.
Los virus, adems de producir la disminucin de poblaciones animales o vegetales en un
determinado hbitat, sirven como mediadores en el intercambio gentico entre individuos de
una misma o de diferentes especies, cooperando en la variabilidad de los organismos que son
susceptibles de ser infectados.
Este fenmeno ha sido bastante estudiado en las bacterias que pueden ser infectadas por los
virus denominados bacterifagos (o simplemente fagos) y de esta manera poder intercambiar
informacin entre unas cepas bacterianas y otras, los fagos pueden contener informacin til
para que la clula bacteriana realice ciertas funciones que en otras condiciones no podra
realizar.
En los animales, de modo anlogo, los retrovirus y los adenovirus, entre otros, pueden
introducir informacin nueva a la clula infectada y posteriormente llevarse informacin a una
clula diferente logrando as una comunicacin gentica entre diferentes poblaciones celulares
o individuos.
De esta manera, algunas especies de virus revisten hoy una importancia clave en la medicina
porque pueden servir como vehculo para introducir informacin a clulas con algn defecto
gentico o adquirido que les permita alcanzar un funcionamiento normal. Esta rea de la
biomedicina es actualmente una de las ms apoyadas ya que representa una esperanza en la
cura de enfermedades genticas como la fibrosis qustica y el cncer.
Es imposible dejar de ver a los virus como peligrosos agentes causales de enfermedad, pero a
esto hay que agregar, por una lado, que tambin contribuyen al mantenimiento del equilibrio
ecolgico y, por otro, que en pocos aos pueden ser de gran utilidad en el tratamiento de
muchos problemas que aquejan a los humanos, incluyendo las enfermedades causadas por los
virus mismos.
Factores externos
Condiciones ambientales o culturales: pH, T, Aw, O2, CO2
Condiciones nutricionales: Tasa C/N 10:1, 12:1
Factores internos
Capacidad metablica
MEDIDA DEL CRECIMIENTO MICROBIANO
Se mide por cambios sucesivos en el nmero de clulas o por el peso de la masa de
las clulas. Existen varios mtodos para contar las clulas o estimar la masa de
stas.
A) Recuento de clulas
1) Conteo de clulas al microscopio
Se emplea un dispositivo graduado con 25 cuadrados cuyo volumen y rea es
conocido. Ej.: Cmara de Petroff-Hausser, cmara de Neubauer, hemocitmetro.
Limitaciones: - Es muy tedioso, no es prctico para uun gran nmero de muestras
- No es muy sensible, se necesitan al menos 106 bact/ml para que sean observadas
al microscopio
- No distinguen clulas vivas de muertas
2) Turbidimetra
A travs de un colormetro o espectrofotmetro midiendo la turbidez en unidades de
absorbancia. Debe prepararse curva estndar para cada organismo estudiado.
CICLO DEL CRECIMIENTO POBLACIONAL
Si analizamos el crecimiento microbiano en el tiempo, ste describe una tpica
curva de crecimiento que puede ser dividida en fases distinguibles. La curva de
crecimiento puede dividirse en diversas fases: fase lag, fase exponencial, fase
estacionaria y fase de muerte.
En general, las bacterias crecen con mayor rapidez que los organismos eucariotas y
los eucariotas pequeos se desarrollan ms aprisa que los grandes Cada clula que
se divide en dos. La tasa de crecimiento es exponencial.
c) Fase estacionaria
El crecimiento exponencial se detiene, los nutrientes indispensables se agotan, no
hay incremento o decremento en el nmero de clulas o masa, hay limitacin de
nutrientes y acumulacin de sustancias txicas. Los microorganismos son
fisiolgicamente activos y viables. En un sistema cerrado no se puede llevar a cabo
indefinidamente el crecimiento exponencial
d) Fase de muerte
Si la incubacin contina despus que una poblacin alcanza la fase estacionaria,
las clulas pueden seguir vivas y continuar metabolizando, pero lo ms probable es
que mueran. Si esto ltimo sucede, la poblacin se encuentra en la fase de muerte.
Durante esta fase, el conteo microscpico directo puede permanecer constante
pero la viabilidad disminuye lentamente. En algunos casos, la muerte se acompaa
por lisis celular, dando lugar a una disminucin del conteo de viabilidad.
EFECTO DE LA CONCENTRACIN DE NUTRIENTES
La concentracin de nutrientes puede afectar tanto a la velocidad de crecimiento como al
rendimiento del crecimiento de un microorganismo. A concentraciones muy bajas de nutrientes,
la velocidad de crecimiento se reduce, mientras que a niveles moderados y altos de nutrientes
llega a ser mxima. Si la concentracin aumenta an ms la tasa de crecimiento no se modifica
La dependencia de la tasa de crecimiento con la concentracin de nutrientes fue descrita por J.
Monod en 1950 y recuerda la cintica enzimtica establecida por la ecuacin de Michaelis &
Menten. La concentracin de nutrientes afecta la tasa de crecimiento microbiano y el
rendimiento en masa de los microorganismos. A una tasa mxima de crecimiento, el incremento
en la concentracin de nutrientes da lugar a un aumento en la biomasa total a cosechar.
MEDIOS DE CULTIVO
Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y elementos
qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares. Dependiendo de la fuente de carbono
que utilizan, los microorganismos se pueden clasificar en auttrofos si es el CO2 atmosfrico
(microorganismos que fotosintetizan) y hetertrofos si utilizan carbono orgnico.
Medios de cultivo: Slido y Lquido
Una forma muy til de poder aislar, identificar y conservar los microorganismos es mediante el
uso de medios de cultivo, inicialmente ideados por Pasteur (que como ya sabemos se
considera el padre de la microbiologa), quien se dio cuenta que los microorganismos podan
crecer en soluciones que tuvieran azcar y una fuente de nitrgeno.
Medios semislidos
Se preparan a partir de los medios lquidos, agregando a stos un agente solidificante en una
proporcin menor que para preparar medios slidos. Uno de sus usos es la investigacin de la
movilidad de las bacterias.
Tipo de microorganismo
Mesfilo
Psicrfilo
Psicrtrofo
Termfilo
Los microorganismos psicrtrofos son mesfilos que pueden crecer a temperaturas bajas. Por
tanto, se les puede considerar como psicrfilos facultativos. Esto es importante desde el punto
de vista aplicado porque cuando se encuentran contaminando alimentos, son capaces de
crecer en condiciones de refrigeracin (4 - 8C) y de producir infecciones en los consumidores
del alimento (30 - 35 C).
Desde el punto de vista clnico, los microorganismos capaces de producir infecciones en
pacientes son los mesfilos y algunos psicrtrofos ya que sus temperaturas ptimas de
crecimiento coinciden con las corporales.
El pH intracelular es ligeramente superior al del medio que rodea las clulas ya que, en muchos
casos, la obtencin de energa metablica depende de la existencia de una diferencia en la
concentracin de protones a ambos lados de la membrana citoplasma.
El pH interno en la mayora del microorganismo est en el rango de 6,0 a 8,0. Los rangos de
pH tolerables por diferentes tipos de microorganismos son, tambin, distintos. Hay
microorganismos acidfilos que pueden vivir a pH=1.0 y otros alcalfilos que toleran
pH=10.0.
Hay que considerar que, como consecuencia del metabolismo, el pH del medio de crecimiento
suele tender a bajar durante el cultivo. Por otra parte, la bajada del pH del medio que producen
ciertos microorganismos les confiere una ventaja selectiva frente a otros competidores. As,
por ejemplo, las bacterias lcticas que producen grandes cantidades de cido lctico como
Cromosoma lineal
107-109 pb
Haploide y diploide
La codificacin a protenas varia entre el 3% en humanos y 70% en levaduras.
Presencia de intrones (regiones no codificantes) y exones (regiones codificantes).
Diferentes estrategias detectar y modelar genes en Procariotas y Eucariotas
Varios factores hacen que las estrategias para identificar y modelar genes procariotas y
eucariotas tengan que ser diferentes:
* La organizacin de los genes es ms compleja en los organismos eucariotas,
fundamentalmente por la presencia de intrones. Algunos genes tienen ms de 50 intrones.
* El procesamiento de los ARN primarios puede ocurrir de varias maneras alternativas
(alternative splicing).
* La proporcin de secuencias codificantes frente a secuencias no codificantes es muy
diferente; slo un 1.5% del material gentico en humanos y otros eucariotas superiores, frente
a un 85% en bacterias, en las que las secuencias codificantes solapan a menudo.
* Los genomas eucariotas son ricos en secuencias repetidas, que dificultan el anlisis.
* El nmero de genomas eucariotas secuenciados es mucho menor que el de procariotas, lo
que impone ciertos lmites tcnicos a la hora de aplicar mtodos de prediccin tanto Intrnsecos
como Extrnsecos.
Plsmidos: tipos y funciones.
Los plsmidos, vectores o tambin llamados plasmidios, son molculas de ADN
extracromosmico circular o lineal que se replican y transcriben independientes del ADN
cromosmico. Estn presentes normalmente en bacterias, y en algunas ocasiones en
organismos eucariotas como las levaduras. Su tamao vara desde 1 a 250 kb. El nmero de
plsmidos puede variar, dependiendo de su tipo, desde una sola copia hasta algunos cientos
por clula. El trmino plsmido fue presentado por primera vez por el bilogo molecular
norteamericano Joshua Lederberg en 1952.
Las molculas de ADN plsmidico, adoptan una conformacin tipo doble hlice al igual que el
ADN de los cromosomas, aunque, por definicin, se encuentran fuera de los mismos. Se han
encontrado plsmidos en casi todas las bacterias. A diferencia del ADN cromosomal, los
plsmidos no tienen protenas asociadas.
En la mayora de los casos se considera gentico dispensable. Sin embargo, posee
informacin gentica importante para las bacterias. Por ejemplo, los genes que codifican para
las protenas que las hacen resistentes a los antibiticos estn, frecuentemente, en los
plsmidos. Hay algunos plsmidos integrativos, es decir, que tienen la capacidad de insertarse
en el cromosoma bacteriano. Estos rompen momentneamente el cromosoma y se sitan en
su interior, con lo cual, automticamente la maquinaria celular tambin reproduce el plsmido.
Cuando ese plsmido se ha insertado se les da el nombre de episoma.
Los plsmidos se utilizan en ingeniera gentica por su capacidad de reproducirse de manera
independiente del ADN cromosomal como as tambin porque es relativamente fcil
manipularlos e insertar nuevas secuencias genticas.
Los plsmidos usados en Ingeniera Gentica suelen contener uno o dos genes que les
confieren resistencia a antibiticos y permiten seleccionar clones recombinantes. Hay otros
mtodos de seleccin adems de la resistencia a antibiticos, como los basados en
fluorescencia o en protenas que destruyen las clulas sin uso de antibiticos. Estos nuevos
mtodos de seleccin de plsmidos son de uso frecuente en agrobiotecnologa, debido
a la fuerte crtica de grupos ecologistas contra la posibilidad de presencia de antibiticos en los
organismos modificados genticamente.
Tipos
Una forma de agrupar plsmidos es por su habilidad de transferirse a otra bacteria. Los
plsmidos conjugativos contienen tra-genes, los cuales ejecutan complejos procesos de
conjugacin, como la transferencia sexual de plsmidos a otra bacteria. Los plsmidos no-
conjugativos, son incapaces de iniciar una conjugacin, de all que ellos pueden transferirse
nicamente con la asistencia de los plsmidos conjugativos y lo hacen por accidente. Una
clase intermedia de plsmidos son los movilizables los cuales llevan solo un subtipo de genes
requeridos para la transferencia. Ellos pueden parasitar un plsmido conjugativo,
transfirindose a una alta frecuencia solo en su presencia.
Es posible para plsmidos de diferentes tipos el coexistir en una celular simple.
Siete tipos diferentes de plsmidos han sido encontrados en la E.Coli. Pero normalmente
plsmidos relacionados son incompatibles, en el sentido de que solo uno de ellos sobrevive en
la lnea celular, debido a la regulacin de las funciones vitales de los plsmidos. Por lo tanto,
los plsmidos pueden ser diferenciados de acuerdo a grupos de compatibilidad.
Otra forma de clasificar plsmidos es por funcin. Hay 5 clases principales:
Plsmidos de fertilidad: los cuales contienen tra-genes, son capaces de conjugarse.
Plsmidos de resistencia: los cuales contienen genes que pueden constituir resistencia contra
antibiticos o venenos. Histricamente conocidos como Factores R, antes de que se entendiera
la naturaleza de los plsmidos.
Col-plsmidos: los cuales contienen genes que codifican (determinan la produccin de)
colinas y protenas que pueden matar a otra bacteria.
Plsmidos degradativos: los cuales habilitan la digestin de sustancias inusuales como tolueno
o cido saliclico.
Plsmidos virulentos: los cuales convierten la bacteria en un patgeno.
Los plsmidos pueden pertenecer a ms de uno de estos grupos funcionales.
Los plsmidos solo pueden coexistir como una o ms copias en cada bacteria, debido a la
divisin celular pueden perderse en una de las bacterias segregadas.
Algunos plsmidos incluyen un sistema de adicin o Sistema de Muerte Postsegregacional
(PSK: Postsegregational Killing System). Ellos producen en conjunto un veneno de larga vida y
un antdoto de vida corta. Las clulas hija que retienen una copia del plsmido sobreviven,
mientras que una clula hija que falla al integrar el plsmido muere o sufre una reducida tasa
de crecimiento debido al veneno que obtuvo de la clula padre. Este es un ejemplo de
plsmidos como el ADN replicante.
Variabilidad gentica en microorganismos.
La recombinacin mezcla elementos genticos (genoma o partes de un genoma) de dos
clulas diferentes en una misma clula, dando lugar a un nuevo genotipo. Tiene como
consecuencia la dispersin de la variabilidad gentica entre organismos de una poblacin, y la
transmisin de caracteres genticos entre individuos de un poblacin. En la recombinacin
tiene lugar el apareamiento de molculas de ADN, que son homlogos y el intercambio de
estas cadenas de ADN. Se forma un genotipo recombinante:
En eucariotas, la recombinacin tiene lugar durante la reproduccin sexual. En ella se forman
gametos haploides y durante la fecundacin, se fusionan y forman un cigoto diploide. En
bacterias no existe la reproduccin sexual, pero si tenemos recombinacin, tiene lugar
mediante la transferencia de una porcin del genoma de una bacteria dadora denominada
exogenote a una bacteria aceptora o endogenote. Como consecuencia, se forma un merocigoto
(zigoto parcial). Este merocigoto contiene el genoma entero de laclula aceptora y slo una
parte de la clula dadora. En bacterias, la recombinacin es ocasional (slo de vez en cuando),
fragmentaria (slo se recombina parte del genoma) y no es necesaria para completar el ciclo de
vida de las bacterias. Lo que s es beneficioso es para la poblacin.
MECANISMOS DE RECOMBINACIN
Hay tres tipos:
TRANSFORMACIN: la clula aceptora toma genes de una molcula de ADN (de la clula
dadora) que se encuentra en el medio que rodea a la clula aceptora.
La clula dadora se fragmenta, y tambin lo hace la molcula de ADN. Uno de estos
fragmentos es captado por la clula aceptora, si hay segmentos homlogos tiene lugar el
intercambio de cadenas de ADN RECOMBINACIN propiamente dicha.
El descubrimiento de la transformacin fue muy importante, ya que permiti conocer cul era la
naturaleza del material gentico, se conoci que era el ADN.
Una primera parte del descubrimiento fue realizado por Griffith en 1924.
transferir diferentes genes pero un fago individual solamente puede transferir unos pocos
genes. La transduccin especializada est mediada por fagos lisognicos o fagos temperados y
los genes que se llegan a transferir dependern del lugar donde el profago queda insertado en
el cromosoma. Durante la escisin (separacin) del profago, un error llega a ocurrir
ocasionalmente en el cual un poco del DNA del husped escinde (se separa del cromosoma)
junto con el DNA del fago. Solo puede ser transferido el DNA del husped que est
flanqueando cada lado del sitio donde el profago se ha insertado, (ej. transduccin
especializada). Despus de la replicacin y la liberacin del fago y a travs de la infeccin de la
clula receptora, puede ocurrir una lisogenizacin de la receptora dando como resultado la
transferencia estable de los genes de la donadora. La receptora ahora tendr dos copias de los
genes que le fueron transferidos. Tambin es posible que se lleve a cabo una recombinacin
legtima entre los genes de la donadora y de la receptora.
Importancia La conversin lisognica (mediada por fago) ocurre en la naturaleza y es la
Manipulacin gentica
de microorganismos y mejora de cepas industriales.
En general los organismos aislados de la naturaleza productores de metabolitos de inters
industrial producen a los mismos en niveles muy bajos, por lo tanto se hace necesario
incrementar estos rendimientos para lograr una mayor rentabilidad de los procesos.
Una forma de mejorar el rendimiento es mediante la optimizacin del medio de cultivo y de las
condiciones de operacin, pero esto est limitado por la capacidad de sntesis mxima del
producto deseado que tiene el organismo. La otra posibilidades el mejoramiento gentico de la
cepa.
Como ya se dijo, la productividad potencial de un organismo es controlada por su genoma,
pudiendo el mismo ser modificado para incrementar los rendimientos.
Con el organismo modificado, se reexaminan las condiciones del cultivo para lograr
nuevamente la mxima productividad. Por lo tanto los programas de desarrollo involucran una
continua modificacin gentica del microorganismo, seguida por una readaptacin del medio de
cultivo a los nuevos requerimientos, mejoras de las condiciones de operacin y tambin de los
procesos de extraccin y purificacin.
La obtencin de cepas modificadas genticamente se puede realizar por
1. Seleccin natural de variantes,
2. Mutacin inducida, y
3. Recombinacin gentica.
1. Seleccin natural
Se debe tener en cuenta que en cada divisin celular hay una pequea probabilidad de que
ocurra un cambio gentico, por lo cual no es sorprendente que en una gran masa celular la
poblacin sea heterognea. Esta distribucin puede presentar problemas de rendimientos
debido a que en general las variantes tienen menores niveles de produccin que la poblacin
parental. Estos cambios definitivos (mutaciones) se deben distinguir de las variaciones
fenotpicas que dependen de las condiciones ambientales y que tienen lugar en todas las
clulas de la poblacin que expresan la misma modificacin fisiolgica, dentro de las
variaciones permitidas por su genotipo. En las mutaciones espontneas el elemento
responsable de la mutacin no es conocido, pero igual que las inducidas (el factor mutagnico
se conoce) son estables y hereditarias y tienen una frecuencia estadsticamente medible (tasa
de mutacin).
La frecuencia de mutaciones espontneas vara entre 10-6 a 10-9 mutaciones por genoma y
por generacin. Por lo tanto si se considera un valor de 10 -7 se debern estudiar un gran
nmero de organismos (> 10 7 ) en la bsqueda del tipo deseado.
En la seleccin de variantes naturales, una prctica que todava es utilizada se refiere a la
observacin de las caractersticas morfolgicas de las colonias, las cuales, en manos de un
operador avezado, se asocian con mayor o menor productividad, lo que permite seleccionar y
posteriormente estudiar los clones aislados.
Estos estudios involucran una etapa de crecimiento seguida por ensayos de evaluacin del
producto. En estos casos es ms adecuado realizar las experiencias en Erlenmeyer de hasta
500 ml, ya que si bien demanda una considerable mano de obra, los resultados de ensayos en
tubos o pequeos frascos son menos confiables.
A veces es posible el diseo de un procedimiento simple de "screening" selectivo para un tipo
particular de mutantes. Por ejemplo, clulas no mutadas que mueren en un plaqueo por
seleccin de mutantes resistentes a drogas, metales, etc. En estas condiciones se aslan
mutantes con un esfuerzo mnimo an de poblaciones donde la tasa de mutacin es menor a 1
x 106.
Cuando se comparan los incrementos en los rendimientos de cepas obtenidas por mutaciones
naturales como las que resultan del empleo de un agente tal como la luz ultravioleta se
observa, en general, que con agentes como el mencionado los incrementos en productividad
son superiores y con una mayor tasa de mutacin.
2. Mutacin inducida.
El procedimiento de mutacin mediante el empleo de un agente determinado implica dos
etapas, el tratamiento de la poblacin con el mutgeno elegido y luego el aislamiento de los
mutantes para su posterior ensayo y seleccin.
Mtodos clsicos.
Elegida la fuente de aislamiento, las posibilidades de xito dependen de la tcnica elegida para
el mismo; en este caso las alternativas son:
a. aislamiento directo, o
b. enriquecimiento del cultivo con o sin pretratamiento de la muestra.
Una vez efectuado el muestreo y seleccin (screening) para el aislamiento de una cepa de
inters, la misma deber ser caracterizada. En este procedimiento se debe tener en cuenta que
la composicin qumica del material a partir del cual se va a realizar el aislamiento comienza a
variar a partir del momento en que es tomada la muestra, por lo tanto sta se debe procesar
rpidamente, tratando de evitar alteraciones que afecten a la poblacin de inters.
a) Aislamiento directo: en este caso es deseable que el medio que se utiliza para el aislamiento
permita la mxima expresin del material gentico del organismo.
Si se busca por ejemplo un organismo con accin antimicrobiana, se puede crecer al potencial
productor, en una caja de Petri en presencia del o los organismos contra los cuales se requiere
la accin antimicrobiana, observndose la produccin del inhibidor por las zonas de inhibicin
de crecimiento.
Para la deteccin de productores de factores de crecimiento tales como aminocidos y
nucletidos se utiliza la estimulacin del desarrollo de bacterias auxtrofas por un lisado del
organismo. Esto se puede llevar a cabo en medios slidos.
En este caso se debe tener una "rplica" de la caja a ensayar. Una vez obtenido el crecimiento
en la primera caja, se replica a una segunda, antes de "matar" las colonias con luz. U.V., por
ejemplo. Esta caja es luego cargada con agar conteniendo una suspensin del organismo
auxtrofo al producto buscado. Despus de un perodo de incubacin se observa crecimiento
en forma de halo alrededor de las colonias productoras, lo que permite el aislamiento de este
organismo de la placa rplica.
b) Enriquecimiento del cultivo: esta tcnica consiste en incrementar en una poblacin mixta el
nmero de organismos de inters en relacin al resto. De esta forma se busca favorecer el
crecimiento de un tipo dado de microorganismos mediante condiciones de cultivo adecuadas al
mismo, o de condiciones inapropiadas para el desarrollo de los otros. Esto se logra mediante el
empleo de sustratos especficos o ciertos inhibidores. Para mantener la fuerza selectiva del
medio, el cual se modifica por el crecimiento del organismo buscado, se realizan subcultivos
peridicos en medio fresco. Esto lleva a que el organismo de inters sea el dominante de la
poblacin, lo cual facilita su posterior aislamiento en medio slido.
Se debe considerar en este caso el efecto del medio sobre la velocidad especfica de
crecimiento (m). La seleccin de un organismo por este procedimiento depende de su valor de
m comparado con los de los otros organismos. Evidentemente el dominante de la poblacin
ser el que posea el mayor valor de m para las condiciones de cultivo empleadas.
Sin embargo no necesariamente ser ms til un organismo de mm ms alto; puede ser
deseable uno con mayor afinidad por el sustrato. El problema de seleccin puede ser superado
empleando el sistema de cultivo continuo, tema que se trata en el captulo 7, donde la fuerza de
seleccin se mantiene a un nivel constante y el organismo dominante ser seleccionado por su
afinidad por el sustrato, ms que por su u mxima.
En la Fig. 3 se muestra un modelo de competicin entre dos organismos capaces de crecer en
un cultivo continuo enriquecido. | |
Ingeniera Gentica.
Todo organismo, an el ms simple, contiene una enorme cantidad de informacin. Esta
informacin se encuentra almacenada en una macromolcula que se halla en todas las clulas:
el ADN. Este ADN est dividido en gran cantidad de sub-unidades (la cantidad vara de acuerdo
con la especie) llamadas genes. Cada gen contiene la informacin necesaria para que la clula
sintetice una protena. As, el genoma (y por consecuencia el proteoma), va a ser la
responsable de las caractersticas del individuo. Los genes controlan todos los aspectos de la
vida de cada organismo, incluyendo metabolismo, forma, desarrollo y reproduccin. Por
ejemplo, la sntesis una protena X har que en el individuo se manifieste el rasgo "pelo
oscuro", mientras que la protena Y determinar el rasgo "pelo claro".
Vemos entonces que la carga gentica de un determinado organismo no puede ser idntica a la
de otro, aunque se trate de la misma especie. Sin embargo, debe ser en rasgos generales
similar para que la reproduccin se pueda concretar. Y es que una de las propiedades ms
importantes del ADN, y gracias a la cual fue posible la evolucin, es la de dividirse y fusionarse
con el ADN de otro individuo de la misma especie para lograr descendencia diversificada.
Otra particularidad de esta molcula es su universalidad. No importa cun diferente sean dos
especies: el ADN que contengan ser de la misma naturaleza: cido nucleico. Siguiendo este
razonamiento, y teniendo en cuenta el concepto de gen, surgen algunas incgnitas: Son
compatibles las cargas genticas de especies distintas? Puede el gen de una especie
funcionar y manifestarse en otra completamente distinta? Se puede aislar y manipular el
ADN?
La mezcla de reaccin se somete a ciclos sucesivos, cada uno correspondiente a una fase de
desnaturalizacin, una de hibridacin o alineacin y una de elongacin.
a) Durante la desnaturalizacin, que se realiza por calentamiento de la mezcla a 95C, se
separan las dos cadenas del ADN molde.b) Durante la hibridacin, la temperatura de
incubacin se reduce para permitir el apareamiento de las bases de ambos cebadores en el
sitio donde encuentran una secuencia complementaria.
c) Durante la fase de elongacin, la mezcla se calienta a 72C y la enzima Taq ADN polimerasa
se usa para replicar las hebras de DNA. La Taq polimerasa comienza el proceso de extensin
de la cadena complementaria a partir del extremo 3 de los cebadores. Al finalizar cada ciclo, la
cantidad de ADN molde disponible para el ciclo siguiente aumenta al doble.
Entre muchas de las aplicaciones que la PCR pone a disposicin se encuentran la deteccin
precoz o prenatal de enfermedades genticas, la deteccin de infecciones virales latentes o la
produccin de grandes cantidades de fragmentos de ADN humano a una velocidad muy
superior a la posible mediante otros mtodos. Esta tcnica tambin se aplica para estudios de
identidad y filiacin.
correctamente el organismo modificado tendr entonces un nuevo gene y har algo diferente,
crear una nueva protena. Se convertir en otro organismo vivo y transmitir a su progenie sus
nuevas caractersticas.
El desarrollo de estas tcnicas a principios de los aos setenta impuls a nivel internacional un
debate sobre la seguridad en biotecnologa moderna y en el verano de 1975 en Asilomar,
California, se dio lugar a una reunin para tratar estas cuestiones. La Conferencia de Asilomar
aport una cierta cautela en forma de llevar a cabo las investigaciones de ingeniera gentica y
con el pasar de los aos se ha obtenido una mayor onfianza. Sin embargo, es necesario
recordar que el nuevo organismo modificado es capaz de producir protenas distintas del
organismo natural y por lo tanto su posible impacto en el medio ambiente y en la salud humana
puede tener giros inesperados que no necesariamente se pueden observar en el laboratorio o
en experimentos en los que se mantienen confinados.
La utilizacin de estos organismos en gran escala y completamente libre en el medio ambiente
es relativamente nueva. No se cuenta con la experiencia suficiente en el uso de dichos
organismos, sobre todo en zonas en las que hay parientes silvestres u organismos nativos que
puedan recibir la informacin gentica novedosa y por lo tanto es de vital importancia estudiar
los posibles impactos que ese nuevo gene introducido en algn organismo pudiera tener en las
poblaciones no modificadas por tcnicas de ingeniera gentica.
Este es precisamente el caso de Mxico, en cuyo territorio se originaron el maz y algunos otros
cultivos de importancia comercial a nivel global como el frijol, el tomate, el cacao, el chile, las
calabazas, entre otros. Es gracias a la domesticacin y cultivo milenario que en Mxico se ha
realizado de estas especies, que nuestro pas es considerado tambin centro de diversidad ya
que muchas variedades ms, se encuentran en nuestro territorio en forma nica y existen
muchas otras especies que son propias de una regin geogrfica dentro del territorio nacional
consideradas especies endmicas.
Cabe recordar que Mxico particip activamente durante la Conferencia de las Naciones
Unidas sobre Medio Ambiente y Desarrollo (CNUMAD) celebrada en Ro de Janeiro n junio de
1992, durante la cual se aprob el Programa 21 el cual en su captulo 16 establece una
"gestin racional de la biotecnologa". En dicho documento se reconoce que, aun cuando la
biotecnologa no puede resolver todos los problemas fundamentales del medio ambiente y el
desarrollo, cabe esperar, no obstante que aporte una importante contribucin al desarrollo
sustentable.
El captulo 16 del programa 21 reconoce asimismo que la comunidad en general se podr
beneficiar al mximo de la biotecnologa si se desarrolla y aplica de forma racional y
juiciosamente.
Asimismo, en la misma Conferencia se firm por parte de nuestro pas el Convenio sobre
Diversidad Biolgica el 13 de junio de 1992, el cual fue ratificado por el Senado de la Repblica
el 3 de noviembre de 1993 y publicado en el Diario Oficial de la Federacin el 7 de mayo de
1993.
El Convenio dispone en su artculo 8g, que cada pas signatario establecer la legislacin y
dems reglamentacin para administrar o controlar los posibles riesgos derivados de la
utilizacin y la liberacin de organismos modificados genticamente resultantes de la
biotecnologa moderna y que sea probable que tuvieran repercusiones ambientales adversas
que pudieran afectar a la conservacin y a la utilizacin sustentable de la diversidad biolgica,
tomando tambin en cuenta los riesgos a la salud humana.
Por su parte, en el artculo 19 prrafo 3, se estipula que las Partes del Convenio estudiarn la
necesidad y las modalidades de un protocolo para la transferencia, manipulacin y utilizacin
seguras de cualesquiera organismos vivos modificados resultantes de la biotecnologa que
puedan tener efectos para el medio ambiente o la salud humana.
En el prrafo 4 de ese mismo artculo se estipula que cada Parte Contratante proporcionar,
directamente o exigindoselo a toda persona fsica o moral bajo su jurisdiccin, que suministre
toda la informacin disponible acerca de las reglamentaciones relativas al uso y la seguridad
para la manipulacin de dichos organismos, as como toda la informacin disponible sobre los
posibles efectos adversos de los organismos vivos modificados de que se trate.
La implementacin de dichos artculos llev a la comunidad internacional a partir del mes de
noviembre de 1995 a establecer un Grupo de Trabajo Especial de Composicin Abierta
encargado de elaborar un protocolo sobre bioseguridad de la biotecnologa centrado en el
movimiento transfronterizo de cualesquiera organismos vivos modificados o resultantes de la
biotecnologa moderna, que estableciera en particular procedimientos adecuados para la
aplicacin del acuerdo fundamentado previo.
A partir de este momento se llev a cabo una serie de reuniones internacionales de este grupo
de trabajo especial en las cuales se discuti a partir de las propuestas de texto legal
presentadas por cada pas, incluyendo el nuestro, un texto consolidado que a travs de las
negociaciones lleg a convertirse en el articulado que hoy conforma la redaccin del Protocolo
de Cartagena y que fue adoptada por 129 pases el 28 de enero del presente ao.
El Protocolo de Cartagena establece el mandato para que cada pas adopte las medidas
legales y administrativas para implementar las obligaciones derivadas del mismo con base en
el principio precautorio y establece la posibilidad de prohibir la internacin al pas de dichos
organismos ante la falta de certeza cientfica que asegure un nivel adecuado de proteccin a la
biodiversidad y la salud humana.
Dado que en Mxico se ha venido dando una expansin en la utilizacin de la biotecnologa
moderna y una experiencia adquirida con ciertos tipos de utilizacin a nivel experimental y
recientemente comercial, consideramos que es el momento oportuno de adoptar una
legislacin sobre seguridad en biotecnologa.
Tomando en consideracin que Mxico cuenta ya con ciertas disposiciones legales y
reglamentarias relacionadas con la investigacin y uso de productos biotecnolgicos en las
reas de salud y sanidad vegetal, y que se encuentra dispersa en una serie de leyes,
reglamentos y normas oficiales mexicanas, se requiere de la participacin coordinada de
diversas dependencias del Ejecutivo Federal en la aplicacin y vigilancia de la normatividad
existente, para remediar las lagunas legales que an existen en materia de bioseguridad.
Aunado a lo anterior, existe un vaco legislativo en materia de evaluacin de los posibles
impactos que pudieran afectar el medio ambiente y a la salud humana, toda vez que la
legislacin vigente slo establece las normas para la liberacin a escala experimental de
plantas modificadas genticamente, careciendo de un marco regulatorio integral que coordine
las facultades de las dependencias relacionadas en materia de bioseguridad desde un punto
de vista transectorial.
Por ello se consolida la creacin de una autoridad intersecretarial y los rganos necesarios
para facilitar sus funciones, con el objeto de coordinar las polticas de la administracin Pblica
Federal relativas a la bioseguridad y a la produccin, comercializacin, importacin,
exportacin, movilizacin, propagacin, liberacin, consumo y en general, uso y
aprovecahamiento de organismos genticamente modificados, sus productos y subproductos.
La existencia de una ley federal establece las condiciones para disminuir los mrgenes de
discrecionalidad en la toma de decisiones en materia de evaluacin y manejo del riesgo
derivados de la utilizacin de organismos modificados genticamente y por lo tanto establecer
las medidas de prevencin y control de los posibles impactos negativos en el medio ambiente y
la salud humana, bajo criterios cientficos, para las solicitudes de liberacin de estos
organismos en el medio ambiente.
Una ley como la que se propone derivada de disposiciones constitucionales aplicables en las
materias de medio ambiente, salud, ciencia y tecnologa establecen las bases de los
instrumentos de poltica en bioseguridad, disposiciones y mecanismos legales para dar
cumplimiento efectivo a estas as como a compromisos internacionales, adoptando principios
previstos en el Protocolo de Cartagena, y los que se disponen en la presente iniciativa
considerando, nuestra especial y reconocida condicin de pas megadiverso y centro de origen
de una gran variedad de especies, cultivos de importancia estratgica.
Es importante mencionar tambin la insuficiencia de instrumentos y e in situ ya que es de vital
importancia conservar y proteger los sitios que actualmente ocupan los hbitats naturales de
las especies de las que Mxico es centro de origen y mecanismos nacionales para la creacin
y fortalecimiento de capacidades con relacin a recursos humanos y financieros, as como
capacidades de infraestructura. Entre ellos, es de vital importancia atender las necesidades
nacionales y sumarse a las polticas actuales de conservacin de la biodiversidad a travs de
medidas que impulsen la creacin de colecciones ex situ, como sera la creacin de bancos de
germoplasma, diversidad, a manera de conservar todas sus caractersticas genticas fuera del
alcance del flujo gentico proveniente de Organismos modificados genticamente. Esta ley
propone la creacin y fortalecimiento de bancos de germoplasma regionales o nacionales.
Se considera la creacin de un fondo para la reparacin de los posibles efectos adversos al
medio ambiente o a la salud humana, que pudieran derivarse del uso y aprovechamiento de
organismos modificados genticamente sus productos y subproductos. As como tambin para
impulsar la investigacin de la biotecnologa moderna con el fin de satisfacer las demandas y
necesidades de la sociedad en materia de salud y alimentacin.