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Presenta
Edmundo Gutirrez Tpach
Director de tesis
Dr. Jos Francisco Zambrano Zaragoza
Co-director de tesis
Dr. Norberto Vibanco Prez
Tepic Nayarit, Abril 2015
AGRADECIMIENTOS
Al ser supremo:
Gracias por haberme permitido llegar hasta este momento en mi vida.
A mis padres:
Gracias por apoyarme en todo momento, por el esfuerzo que hicieron para
ayudarme a concluir mis estudios y por estar de acuerdo con las decisiones que
he tomado, por sus consejos.
A mi familia:
Gracias por los consejos que he recibido de cada uno de ustedes y por
apoyarme incondicionalmente, por inculcarme que la familia es lo primero, por
confiar en m. Su apoyo ha sido un gran estmulo para m y me ha ayudado a
llegar hasta este punto en mi vida.
A mis profesores:
Por tener confianza en m, por el apoyo que me han dado y principalmente por
todos los conocimientos que he recibido de cada uno de ustedes, por su
paciencia y dedicar su tiempo en m, y gracias por todo lo que han hecho por
m.
A mis amigos:
Gracias por haber compartido su tiempo conmigo, por escucharme, por
tenerme mucha paciencia, por haber sido como hermanos en este gran periodo
de mi vida.
NDICE
LISTA DE TABLAS Y FIGURAS.................................................................................I
ABREVIATURAS.......................................................................................................II
RESUMEN................................................................................................................IV
INTRODUCCIN.......................................................................................................1
Espondilitis anquilosante (EA)...............................................................................1
Sntomas y alteraciones de la EA..........................................................................1
Prevalencia e incidencia de la EA..........................................................................2
El diagnstico de la EA...........................................................................................2
ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI)....................................................3
Origen de la enfermedad........................................................................................3
Factores genticos..............................................................................................4
Factores ambientales..........................................................................................4
Relacin entre factores genticos y ambientales con la EA..................................5
OBJETIVOS...............................................................................................................8
Objetivo general.....................................................................................................8
Objetivos particulares.............................................................................................8
MATERIAL Y MTODOS...........................................................................................9
Poblacin estudiada...............................................................................................9
Medicin del BASDAI.............................................................................................9
Extraccin de DNA genmico.................................................................................9
Cuantificacin del DNA........................................................................................10
Figura 1.
Figura 2.
Figura 3.
Figura 4.
Figura 5.
ABREVIATURAS
C
Grados centgrados
IL
g
Interleucina
Microgramos
kDa
L
Kilodaltones
Microlitros
mL
BASDAI
Mililitros
ndice de actividad de la espondilitis anquilosante
mM
BSA
Milimolar
Albumina srica bovina
MPM
DNA
Marcador
de peso molecular
cido desoxirribonucleico
ng
dNTPs
Nanogramos
Desoxirribonucletidos trifosfatados
NK
EA
Clulas
asesinas
naturales
Espondilitis
anquilosante
nm
FcRIIIA
Nanmetros
Protena del Receptor para Fc de IgG tipo 3A
p30
FCGR3A
Protena
de 30 kDa
deFc
Salmonella
typhimurium
Gen del receptor
para
de IgG tipo
3A
pb
HLA
Pares
de de
bases
Antgeno
leucocitos humanos
PBS
IgG
Solucin
salina amortiguada
con fosfatos
Inmunoglobulina
G
PCR
rpm
RESUMEN
La espondilitis anquilosante (EA), es una enfermedad inflamatoria crnica, de
naturaleza autoinmune, que afecta fundamentalmente el esqueleto axial y las
articulaciones sacroilacas. La causa de la prdida de tolerancia es desconocida, sin
embargo, se considera que estn involucrados factores ambientales y genticos.
Previamente se ha establecido la asociacin de una banda de aproximadamente 30
kDa de Salmonella typhimurium con la EA, que es reconocida por anticuerpos IgG,
as como el polimorfismo rs396991 en FCGR3A, un cambio G559T, que provoca un
intercambio de una fenilalanina por una valina en la posicin 158 y tiene como
consecuencia un cambio en la afinidad para todas las subclases de IgG y este ha
sido asociado con la EA como factor de riesgo. Con base en lo anterior, el objetivo
del presente trabajo fue establecer la asociacin entre el polimorfismo rs396991 en
FCGR3A con los niveles de anticuerpos IgG totales anti- p30 de Salmonella
typhimurium y la correlacin con el ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI)
en pacientes con espondilitis anquilosante. Se incluyeron muestras de sangre
perifrica de 40 pacientes con EA, de las que se obtuvo DNA y suero. El
polimorfismo rs396991 en FCGR3A se genotipific utilizando PCR alelo-especfica,
los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 fueron determinados por ELISA
indirecto y el BASDAI fue calculado por la mdico tratante con base en cuestionario.
Se compararon los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 agrupados segn el
genotipo FCGR3A con la prueba U de Mann-Whitney y se determin la correlacin
entre los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA agrupados
segn el genotipo de FCGR3A y el BASDAI, con la prueba de Spearman, en ambos
casos con una confianza del 95%.
Los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 no mostraron diferencia estadsticamente
significativa entre los pacientes agrupados segn el genotipo FCGR3A. Asimismo,
los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 no correlacionan significativamente con el
BASDAI.
INTRODUCCIN
Espondilitis anquilosante (EA)
Las espondiloartropatas (SpA) constituyen un grupo de enfermedades inflamatorias
crnicas interrelacionadas entre s, cuya principal representante es la EA, trmino
que proviene del griego spondylos (vrtebra) y ankylos (rigidez) (1). Es una
enfermedad inflamatoria crnica, de naturaleza autoinmune (2), que afecta
fundamentalmente al esqueleto axial, especialmente a las articulaciones sacroilacas;
aunque tambin puede observarse compromiso de las articulaciones perifricas as
como manifestaciones extra-articulares (3).
Sntomas y alteraciones de la EA
Los sntomas de la enfermedad pueden variar de un paciente a otro, ya que algunos
pacientes pueden experimentar slo molestias leves, mientras que otros pueden
verse notablemente discapacitados por la gravedad de sus sntomas, adems stos
no se mantienen constantes, pues los periodos con gran actividad de la enfermedad,
denominados brotes, se alternan con otros en los que el paciente presenta menos
molestias (4).
El dolor y la inflamacin en la columna generalmente comienzan en la parte inferior
de la espalda, justo en la zona de unin entre la columna y la pelvis, que se
acompaa de marcada rigidez matutina; que suele mejorar con el movimiento y
reaparecer con el reposo. Con el tiempo, la inflamacin puede desencadenar un
proceso por el cual las vrtebras llegan a fusionarse o soldarse entre s, haciendo
que la columna pierda toda su flexibilidad. Cuando esto sucede, la rigidez extrema de
la columna provoca un estado de anquilosamiento que limita enormemente la
movilidad del paciente (5). En general los hombres presentan formas ms graves y
con mayor compromiso axial, mientras que las mujeres presentan ms compromiso
particular perifrico y menos sacroiletis (6). No obstante, la mayora de los pacientes
con EA mantienen una capacidad funcional aceptable, lo que les permite llevar una
vida activa (7).
Prevalencia e incidencia de la EA
La prevalencia de la EA vara segn la zona geogrfica y la etnia analizada. Es una
enfermedad que afecta a ms hombres que mujeres, en una proporcin de 2:1 (8).
La incidencia vara entre 0.5 y 14 por cada 100.000 personas por ao, dependiendo
de la poblacin estudiada (9), En Mxico la EA se presenta en aproximadamente el
0.09% de la poblacin (10).
El diagnstico de la EA
El diagnstico de la EA se establece con base en los criterios modificados de Nueva
York de 1984 (11), que toman en cuenta datos clnicos y evidencia radiolgica de
sacroiletis, y poseen una sensibilidad del 83% y una especificidad del 98%. Sin
embargo, el uso de estos criterios para el diagnstico en estadios precoces es muy
limitado, no slo porque la limitacin de la movilidad lumbar y la disminucin de la
expansin torcica suelen ser fenmenos tardos, sino fundamentalmente por la
sacroiletis radiolgica, que aunque se ha visto que est presente en muchos casos
en estadios precoces, en general puede tardar mucho tiempo en aparecer en la
radiografa simple, y ste es un criterio obligado para el diagnstico (12).
Origen de la enfermedad
La EA es una enfermedad de naturaleza autoinmune, aunque las causas que
desencadenan la autoinmunidad son desconocidas, se ha descrito que se
encuentran involucrados factores genticos y ambientales. La evidencia de factores
genticos incluye aumento en la prevalencia e incidencia de la enfermedad en ciertas
etnias, as como entre familiares (16). Se acepta que en la EA, al igual que otras
enfermedades
de
naturaleza
autoinmune,
son
desrdenes
multifactoriales
Entre los factores genticos asociados con la EA destaca la portacin del gen para el
antgeno de leucocitos humanos (HLA)-B27, ya que aproximadamente el 90% de los
pacientes son positivos para l (18), asimismo se ha publicado que los pacientes con
EA HLA-B27 positivos presentan sntomas articulares ms graves y prolongados,
mayor compromiso axial y de caderas, manifestaciones extra articulares como uvetis
y afeccin cardiaca que los pacientes HLA-B27 negativos. Es importante resaltar que
tener el HLA-B27 no es una condicionante para desarrollar EA, ya que, si bien cerca
del 5% de la poblacin general es HLA-B27 positiva, la mayora de ellos permanece
sana (19).
Por otra parte, el gen HLA-B1, los genes desiertos en los cromosomas 2p15 y 21q22
(20) y polimorfismos de un nuclotido (SNP) (2, 10, 21-24) han sido asociados con la
EA. Entre los SNP destacan el rs2287987 de ERAP1 (aminopeptidasa de retculo
endoplasmtico 1), que ha mostrado tener asociacin, la ms fuerte despus del
HLA-B27, (25), as como los polimorfismos; rs16944, rs2856836, rs17561, rs1894399
del gen de la IL-1, (26-28), el rs11209032 y rs1343151 del gen para receptor de
interleucina 23 (IL23R ) (23) y el rs1801274 y rs396991 de los receptores para el Fc
de IgG (FcR) (24).
Factores ambientales
OBJETIVOS
Objetivo general
Establecer la asociacin entre los niveles de anticuerpos IgG totales anti- p30 de
Salmonella typhimurium y el polimorfismo rs396991 en FCGR3A y la correlacin con
el ndice de actividad de la enfermedad (BASDAI) en pacientes con espondilitis
anquilosante.
Objetivos particulares
Comparar los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 de Salmonella typhimurium
en pacientes con EA agrupados segn el genotipo FCGR3A
Correlacionar los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con EA
agrupados segn el genotipo FCGR3A con el ndice de actividad de la enfermedad
(BASDAI).
MATERIAL Y MTODOS
Poblacin estudiada
Se incluyeron 40 muestras de sangre perifrica de pacientes con EA, diagnosticados
en la Clnica de Reumatologa del Departamento de Medicina Interna, del HGZ No. 1
del Instituto Mexicano del Seguro Social, Tepic, Nayarit, Mxico, de acuerdo con
criterios modificados de Nueva York para el diagnstico de EA de 1984 (11). Las
muestras se utilizaron para la obtencin de DNA y suero.
Todos los participantes firmaron una carta de consentimiento informado de acuerdo
con la declaracin de Helsinki (1975).
durante
minutos
72C.
Los
productos
de
PCR
se
corrieron
Anlisis estadstico
La comparacin de los niveles de anticuerpos IgG totales anti-p30 en pacientes con
EA agrupados segn el genotipo de FCGR3A fue realizada mediante la prueba
estadstica U de Mann-Whitney. La correlacin entre los niveles de anticuerpos IgG
totales anti-p30 en pacientes con EA agrupados segn el genotipo de FCGR3A y el
BASDAI, fue realizada mediante la prueba estadstica (rho) Spearman. Ambas
pruebas estadsticas fueron aplicadas con el programa estadstico Minitab versin
17 con una confianza del 95% (p0.05).
RESULTADOS Y DISCUSIN
Genotipos de FCGR3A en pacientes con EA
La figura 3, muestra los patrones electroforticos para los diferentes genotipos de
FCGR3A amplificados mediante la PCR de punto final. El tamao de las bandas
esperadas fue de 160 pb y fueron ubicadas utilizando el marcador de peso molecular
Escalera de 100 pb (invitrogen) como referencia (50).
poblacin estudiada. Estos resultados concuerdan con los reportados por MoralesLara, et al, en 2010, que present una distribucin de frecuencias similar a la
obtenida en este trabajo (51) con los genotipos F/F y F/V, aunque con el genotipo V/V
el presento una distribucin tres veces mayor a la obtenida
Figura
2.
Electroforesis de la p30 electroeluida. Carril 1, MPM (invitrogen). Carril 2. Protenas
totales de S. typhimurium. Carril 3. p30 electroeluida.
Figura 5. Correlacin entre los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con
EA y BASDAI agrupados segn el genotipo del receptor FCGR3A. (A), Correlacin entre
los anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con EA y BASDAI agrupado segn el genotipos
F/F de FCGR3A. (B), Correlacin entre los anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con EA y
BASDAI agrupados segn el genotipo V/V de FCGR3A. (C), Correlacin entre los
anticuerpos IgG anti-p30 en pacientes con EA y BASDAI agrupados segn el genotipo V/F
de FCGR3A.
De acuerdo con los resultados obtenidos se puede establecer que ninguno de los
genotipos del receptor FCGR3A tiene influencia significativa sobre los niveles de
anticuerpos IgG totales anti-p30 que se encuentran en los pacientes con EA y que los
anticuerpos IgG totales anti-p30 no influyen significativamente en el BASDAI. Aunque
no puede descartarse la influencia de los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 sobre
la secrecin de mediadores de inflamacin, o bien, de los niveles de subclases de
IgG anti-p30 con el BASDAI, ya que esta asociacin podra estar dada por las
funciones efectoras existentes entre en un determinado genotipo del receptor
FCGR3A y una de las subclases de IgG presente en los pacientes con EA, por lo que
sera necesario medir las variables inflamatorias que resulten de dicha interaccin
como: la protena C reactiva, interleucinas como IL-1 y IL-6, TNF-, entre otras y as
poder establecer si los niveles de anticuerpos IgG anti-p30 (totales o subclases) y el
polimorfismo rs396991 del receptor FCGR3A tienen influencia sobre la actividad de la
enfermedad.
CONCLUSIONES
BIBLIOGRAFA
spondyloarthritis
early.
Annals
of
the
Rheumatic
Diseases.
2004;63(5):535-43.
2. lvarez JCM, Reyes APN, Arrazola A, Coronel C, Robles BG, Lpez RR, et
al. Subtipos de HLA-B27 en familias de pacientes mestizos mexicanos con
espondilitis anquilosante. Rev Mex Med Tran. 2008;1(1):18-22.
3. Gladman DD. Established criteria for disease controlling drugs in ankylosing
spondylitis. Ann Rheum Dis. 2003 Sep;62(9):793-4. PubMed PMID:
12922946. Pubmed Central PMCID: PMC1754660. Epub 2003/08/19. eng.
4. MM W. M. Functional disability predicts total costs in patients with ankylosing
spondylitis. Arthritis Rheum. 2002:223-31.
5. Ward M. Outcomes in ankylosing spondylitis: what makes the assessment of
treatment effects in ankylosing spondylitis different? Annals of the rheumatic
diseases. 2006;65(suppl 3):iii25-iii8.
6. Sieper J, Braun J, Rudwaleit M, Boonen A, Zink A. Ankylosing spondylitis: an
overview. Annals of the Rheumatic Diseases. 2002;61(suppl 3):iii8-iii18.
7. Sanmart Sala R oGF, Carreira Delgado P, Martn Mola E, Mulero Mendoza J,
Navarro Sarabia F,Oliv Marqus A. Manual SER de las enfermedades
reumticas. Madrid Mdica Panamericana; 2004.
8. Feldtkeller E. [Age at disease onset and
delayed
diagnosis
of
PMID:
10198986.
Epub
1999/04/13.
Erkrankungsalter
und
Spondylitis
Disease
Activity
Index.
Rheumatol.
1994
anquilosante.
ANEXO
BASDAI (versin espaola) utilizando una escala con descriptores numricos (14).