ENUMERACIN DE BACTERIAS COLIFORMES Y ESCHERICHIA COLI EN

PRODUCTOS CRNICOS
William Andrs Olalla Chicaiza
Laboratorio de Microbiologa de los Alimentos II, Facultad de Ciencia e Ingeniera en
Alimentos, Universidad Tcnica de Ambato

I.

Resumen

Mediante el uso de productos crnicos: carne de res y pollo, se observ la presencia de

coliformes totales y fecales (E. coli). El medio de cultivo a emplearse fue caldo bilis-verde
brillante (Difco, Francia), la utilizacin de ste medio para el aislamiento de coliformes en las
muestras dio como resultado utilizando el mtodo de NMP por triplicado la presencia de >2400
bacterias por gramo para la carne de res y 20 bacterias por gramo de pollo. En conclusin el
caldo de cultivo bilis-verde brillante (Difco, Francia), puede ser utilizado para el aislamiento
selectivo de coliformes totales y fecales, los cuales son indicadores de contaminacin e
inocuidad alimentaria.

II.

Introduccin

Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales, capaces de fermentar la
lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen los totales. Aproximadamente el 95% del grupo
de los Coliformes presentes en heces estn formados por Escherichia coli. Ya que los
Coliformes Fecales se encuentran casi exclusivamente en las heces de los animales de sangre
caliente, se considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal, (Galvn, 2003).
Segn Ribes (2002), la presencia de E. coli (o bien de coliformes termotolerantes) es un indicio
de contaminacin fecal reciente, por lo que tras su deteccin debera considerarse la toma de
medidas adicionales, como la realizacin de muestreos adicionales y la investigacin de las
posibles fuentes de contaminacin, como un tratamiento inadecuado o alteraciones de la
integridad del sistema de distribucin. La capacidad de los Coliformes fecales de reproducirse
fuera del intestino de los animales homeotrmicos es favorecida por la existencia de condiciones
adecuadas de materia orgnica, pH, humedad, (Alarcn, 2001).
El caldo bilis-verde brillante es el medio est recomendado para el recuento de coliformes
totales y fecales, utilizando la tcnica del nmero ms probable. En el medio de cultivo, la
peptona aporta los nutrientes necesarios para el adecuado desarrollo bacteriano, la bilis y el
verde brillante son los agentes selectivos que inhiben el desarrollo de bacterias Gram positivas y
Gram negativas a excepcin de coliformes, y la lactosa es el hidrato de carbono fermentable. Es
una propiedad del grupo coliforme, la fermentacin de la lactosa con produccin de cido y gas.

El objetivo de la prctica fue aislar utilizando caldo bilis-verde brillante (Difco, Francia), a
colonias pertenecientes al grupo coliforme Totales y E. Coli aplicando el mtodo del nmero
ms probable (NMP) a partir de la tcnica de tubos mltiples. Mientras mayor sea el nmero

de coliformes en la muestra de carne, mayor ser la probabilidad de estar frente a una

contaminacin fecal reciente.
III.

Material y Mtodos

Para la experimentacin se prepar caldo bilis-verde brillante (DifcoTM, Francia). La

esterilizacin de los materiales se lo realiz en el autoclave (All American, USA), luego de este
proceso en la cmara de flujo laminar (Streamline, USA) se realizaron diluciones seriadas de
las muestras utilizando 25 g. de muestra y agua peptonada, obteniendo concentraciones de 10 1
,10-2 ,10-3, se inocul 0.1 ml de cada dilucin por triplicado en el caldo lactosado verde bilis
brillante. Se debe tener en cuenta un tobo testigo. La muestra fue llevada a proceso de
incubacin en estufa (Memmert, Alemania) a 30C por 24 horas. Finalizado este proceso se
procedi a la interpretacin de resultados, el crecimiento se evidencia por la presencia de
turbidez en el caldo de cultivo, puede existir viraje del color del medio de cultivo al color
amarronado o amarillo, mientras que los resultados negativos se presentan por ausencia de
turbidez y/o gas. Los resultados positivos son comparados con la Tabla 2. Nmero ms
probable (NMP) de bacterias coliforme y Escherichia coli, cuando la muestra ha sido realizada
por triplicado, por g o por cm3, para realizar los clculos posteriores.
Tabla 1. Receta para el Caldo lactosado verde brillante bilis 2%

Tabla 2. Nmero ms probable (NMP) de bacterias coliformes y Escherichia coli, cuando la

muestra ha sido realizada por triplicado, por g por cm3

IV.
Resultados
Clculo de NMP por g, en medio de cultivo BGLB 2%
Ec. 1

NMP=

NMP del ensayo

Factor de dilusin intemedio
100

NMP: Nmero Ms Probable por gramo de muestra de carne de res

NMP=

2400
2
10
100

NMP=2400 Coliformes/ g
Tabla 1: Nmero de Tubos positivos en muestras de pollo y carne de res

10-1
Pruebas
positivas

10-1
Pruebas
positivas

Muestras de carne de res

Diluciones
10-2
3
Muestras de carne de pollo
Diluciones
10-2

10-3
3

10-3
1

NMP
>2400

NMP
20

Elaborado por: Olalla, A., FCIAL.UTA.2014.

Fuente: Laboratorio de Microbiologa I.

De las muestras obtenidas de los productos crnicos pollo y carne de res, se realiz el clculo
del NMP, en cada uno de ellos, en la Tabla 1 se muestran los resultados de tubos positivos y
negativos, segn el mtodo empleado de NMP se pudo determinar el grado de contaminacin de
los productos, los valores de la cantidad de bacterias fueron elevados, esto no significa que sean
alarmantes ya que al ser productos crudos su consumo no se realiza en ese estado, por lo que
son sometidos a coccin, con esto se eliminan los coliformes, el problema radicara si estos
valores se presentan en productos que ya fueron sometidos a algn tratamiento trmico. De
igual forma en la Figura 1 se muestra la contaminacin en los tubos con respecto al tubo de
control, el cual no presento turbidez ni cambios de color, tampoco el desprendimiento de gases
en la Campana Durham.

Figura 1.- Muestras, la del centro no presento variacin de color.

Fuente: Laboratorio de Microbiologa II.
V.

Discusin

De acuerdo al anlisis microbiolgico de los productos crnicos pollo y carne de res, present
contaminacin microbiana superior a los lmites que establece la NTE INEN 1 338:2010 Carne
y productos crnicos crudos (< 1000 bacterias por gramo); los microorganismos indicadores
predominantes fueron Coliformes Totales y Coliformes fecales con valores >2400 bacterias por
gramo de carne de res utilizando la tcnica NPM. Segn Alarcn (2001), la enumeracin de
coliformes contina siendo la tcnica de referencia para indicar si un alimento o el proceso de
su elaboracin parcial o total poseen caractersticas sanitarias satisfactorias.
En esta prctica se demostr que los productos crnicos examinados presentaron un nmero de
coliformes que sobrepasaron los lmites establecidos, lo cual permite inferir que estn siendo
excesivamente manipulados desde el momento en que salen del matadero hasta su
comercializacin.
Galvn, (2003) indica que los organismos coliformes se analizan solo como sealizadores de la
eficacia del tratamiento y la integridad del sistema de distribucin no como indicadores de la
presencia de patgenos, mientras que los organismos coliformes termotolerantes, en este caso
los E. coli se analizan como indicadores de contaminacin fecal.
El valor del recuento de Escherichia coli indicara prcticas de higiene deficientes en la
elaboracin o conservacin inadecuada del producto, se sugirela revisin de las Buenas
Prcticas de Manufactura, (Lpez, 1984).
En muchos productos crudos de origen animal, altos recuentos de E. coli pueden ser esperados
dada la asociacin cercana de estos alimentos con el ambiente animal y por la probabilidad de
contaminacin de pieles, reses, etc. con materia fecal animal durante la faena.
E. coli se puede eliminar fcilmente mediante procesos trmicos, por consiguiente, la presencia
de la misma en un alimento sometido a temperaturas elevadas significa un proceso deficiente o,
lo que es ms comn, una contaminacin posterior al proceso atribuible al equipo,
manipuladores o contaminacin cruzada. Sin embargo, si el objetivo del anlisis es controlar la
contaminacin post tratamiento trmico, los organismos seleccionados deberan ser las bacterias
coliformes en lugar de E. coli, (Ribes, 2002).
Pascual (1999), dice que las bacterias de este gnero se encuentran principalmente en el
intestino de los humanos y de los animales de sangre caliente, es decir, homeotermos, pero
tambin ampliamente distribuidas en la naturaleza, especialmente en suelos, semillas y
vegetales, Los coliformes se introducen en gran nmero al medio ambiente por las heces de
humanos y animales. Por tal motivo suele deducirse la mayora de los coliformes que se
encuentran en el ambiente son de origen fecal. Sin embargo, an existen muchos coliformes de
vida libre.
VI.

Cuestionario
a)
Describa 3 pruebas bioqumicas para confirmar la presencia de coliformes.
1. Produccin de indol (I)
Inocular un tubo en caldo triptona e incubarlo a 35C por 24 2 h.
Adicionar entre 0.2 y 0.3 mL de reactivo de Kovacs.

 La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera una prueba
positiva.
2. Produccin de cidos mixtos (Rojo de metilo, RM)
Inocular un tubo adicional con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.
Adicionar 5 gotas de solucin de rojo de metilo.
Se considera una prueba positiva cuando se desarrolla un color rojo. Un color amarillo
es una prueba negativa.
3. Produccin de metabolitos neutros (Voges-Proskauer VP)
Inocular un tubo con caldo RM-VP e incubar a 35C por 48 2 h.
Adicionar 0.6 mL de solucin VP1 y 0.2 mL de solucin VP2 y agitar.
Dejar reposar durante 10 minutos sin agitar el tubo; se considera una prueba positiva
cuando se desarrolla un color rosa en la superficie, Lpez, J. C. (1984).
b)
Enumere las caractersticas del grupo coliforme
El grupo contempla a todas las bacterias entricas que se caracterizan por tener las
siguientes propiedades bioqumicas:
ser aerobias o anaerobias facultativas;
ser bacilos Gram negativos;
no ser esporgenas; (Si es Gram negativo NO esporula), Ribes, M. E. (2002).
c)
Escriba 3 gneros y especies del grupo coliforme y coliforme fecal.
Coliforme
Gnero
Especies
Escherichia
E. albertii
E. blattae
Klebsiella
K. ozaenae
K. pneumoniae
Enterobacter
E. cloacae
E. sakazakii
Coliforme fecal
Gnero
Enterococcus
Streptococcus.
Escherichia

Especies
E. faecium
E. columbae
S. bovis
S. equinu
E. coli, Case, C. L. (2007).

d)
La determinacin del NMP consta de tres etapas: presuntiva, confirmatica,
complementaria. Describir cada una de forma resumida.
En la fase presuntiva el medio de cultivo que se utiliza es el caldo lauril sulfato de sodio
el cual permite la recuperacin de los microorganismos daados que se encuentren
presentes en la muestra y que sean capaces de utilizar a la lactosa como fuente de
carbono. Durante la fase confirmativa se emplea como medio de cultivo caldo lactosado
bilis verde brillante el cual es selectivo y solo permite el desarrollo de aquellos
microorganismos capaces de tolerar tanto las sales biliares como el verde brillante. La
determinacin del nmero ms probable de microorganismos coliformes fecales se
realiza a partir de los tubos positivos de la prueba presuntiva y se fundamenta en la
capacidad de las bacterias para fermentar la lactosa y producir gas cuando son
incubados a una temperatura de 44.5 0.1C por un periodo de 24 a 48 h. La bsqueda
de Escherichia coli se realiza a partir de los tubos positivos de caldo EC, los cuales se
siembran por agotamiento en medios selectivos y diferenciales (Agar Mac Conkey,

Agar eosina azul de metileno) y posteriormente realizando las pruebas bioqumicas

bsicas (IMViC) a las colonias tpicas.

VII.

Conclusiones
Se determin que Escherichia coli indica el ndice de contaminacin fecal ms
adecuado, en la mayora de las circunstancias, las poblaciones de coliformes
termotolerantes se componen predominantemente de E. coli por lo que es el
microorganismo de eleccin para los programas de monitoreo para la verificacin,
incluidos los de vigilancia sanitaria en el consumo de alimentos.
Se obtuvo que la determinacin de microorganismos coliformes totales por el mtodo
del Nmero ms Probable (NMP), se fundamenta en la capacidad de este grupo
microbiano de fermentar la lactosa con produccin de cido y gas al incubarlos a 35C
durante 24 h., utilizando un medio de cultivo que contenga sales biliares.
Se analiz que el aislamiento de la bacteria E. coli en alimentos da alto grado de certeza
de contaminacin de origen fecal, alrededor del 99 %. Sin embargo, el aislamiento de
este microorganismo no permite distinguir si la contaminacin proviene de excretas
humanas o animales, lo cual puede ser importante, puesto que la contaminacin que se
desea habitualmente controlar es la de origen humano, Su presencia se interpreta como
una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar presentes y su ausencia
indica que el agua o el alimento estudiado se hallan exentos de organismos productores
de enfermedades.
Estos microorganismos tambin se utilizan como indicadores de desinfeccin, pero los
anlisis son mucho ms lentos y menos fiables que la medicin directa de la
concentracin residual de desinfectante. Adems, E. coli es mucho ms sensible a la
desinfeccin que los protozoos y virus entricos, Pascual, V. C. y. (1999).

VIII.

Bibliografa

Alarcn, L. R. (2001). Manual de practicas de Microbiologa bsica y Microbiologa de

alimentos.
Programa
de
Nutricin.
UACJ.
Retrieved
from
https://books.google.com/books?id=Oy-kG04ClBUC&pgis=1
Anderson, M. del R. P., & Pascual, V. C. y. (1999). Microbiologa Alimentaria: Metodologa
Analtica para Alimentos y Bebidas. Ediciones Daz de Santos. Retrieved from
https://books.google.com/books?id=9EIfkks8uxMC&pgis=1
Galvn, R. M. (2003). Fisicoqumica y microbiologa de los medios acuticos. Tratamiento y
control de calidad de aguas. Ediciones Daz de Santos. Retrieved from
https://books.google.com/books?id=k8bIixwJzYUC&pgis=1
Lpez, J. C. (1984). Curso de ingeniera qumica: introduccin a los procesos, las operaciones
unitarias y los fenmenos de transporte (Primera Ed). Reverte. Retrieved from
https://books.google.com/books?id=XZNYpvnO_V8C&pgis=1
Organization, W. H. O. P. A. H. (1987). Guas para la calidad del agua potable, Issue 481,
Volume 3. Pan American Health Org. Retrieved from https://books.google.com/books?
id=X9QgncMbnsYC&pgis=1
Prez, R. G., & Peris, M. del C. V. (1997). Microbiologa. Editorial Paraninfo. Retrieved from
https://books.google.com/books?id=sUrIecdf_O8C&pgis=1
Tortora, G. J., Funke, B. R., & Case, C. L. (2007). Introduccin a la microbiologa. Ed. Mdica
Panamericana.
Retrieved
from
https://books.google.com/books?
id=Nxb3iETuwpIC&pgis=1
Vandevenne, C. A., & Ribes, M. E. (2002). Mtodos de anlisis microbiolgicos de alimentos.
Ediciones Daz de Santos. Retrieved from https://books.google.com/books?
id=_H9PkmwKdZ0C&pgis=1
NTE INEN 1 108: Agua potable
NTE INEN 1 338:2010 Carne y productos crnicos crudos