INTRODUCCION

El gnero Enterococcus pertenece a un grupo de microorganismos conocido

como las bacteriascidas lcticas (BAL). Los enterococos son cocos Grampositivos, no esporulados, catalasa yoxidasa negativos, anaerobios facultativos
que se presentan individualmente, en pares, o encadenas. Desde un punto de
vista taxonmico, el gneroEnterococcus ha sido revisado varias veces. Ellos
pertenecieron, clsicamente, a los Streptococcus grupo D de Lancefield; sin
embargo, a mediados de la dcada de 1980 fueron oficialmente clasificados en su
propio gnero.
Son ubicuos yestn normalmente presentes en el tracto digestivo de humanos y
animales. Este grupo seconstituyen como el ms polmico dentro de las BAL.
Diversos estudiosmicrobiolgicos han demostrado que ellos juegan un papel
importante en la maduracin de algunasvariedades de quesos tradicionales
elaborados con leche cruda o pasteurizada y producida enzonas y pases
mediterrneos.
Los enterococos son causantes de problemas en las industrias de procesamiento
de vegetales, fbricas de alcohol y mayormente se investigan en alimentos
sometidos a procesamientos trmicos como enlatados, embutidos, alimentos
lcteos (leche en polvo) en utensilios industriales y caseros. El estudio de
enterococos tambin est orientado a su deteccin en aguas sobre todo a agua de
consumo humano o agua de mesa.
Adems de su reconocida capacidad para adquirir resistencia a antibiticos. Los
enterococos desarrollan, gracias al intercambio de informacin gentica por
conjugacin, caractersticas que aumentan su virulencia. Dentro de estas
caractersticas se puede mencionar: la adherencia a tejidos del husped, la
invasin y formacin de abscesos, la modulacin de la respuesta inflamatoria, la
secrecin de productos txicos y la sntesis de enzimas hidrolticas.

OBJETIVOS
-

Aplicar la tcnica correspondiente para el aislamiento de Enterococcus.

Identificacin del gnero Enterococcus a partir de leche deshidratada.
Realizar la numeracin de Enterococcus de la muestra puesta en prctica.

MARCO TERICO
LosEnterococcus son clulas esfricas u ovoides, de tamao 0,6-2,0 0,6-2,5 m.
Son cocos grampositivos, no formadores de endosporas. Se presentan en forma
de pares o de cadenas cortas. Son no mtiles, con excepcin de las especies E.
gallinarum y E. casseliflavus. Son anaerobios facultativos, quimiorganotrofos, con
metabolismo fermentativo. Fermentan un amplio rango de carbohidratos con
produccin principalmente de L (+)- cido lctico, pero no de gas, y producen un
pH final de 4,2-4,6. Presentan requerimientos nutricionales complejos. Son
catalasa negativos o, ms comnmente, dbilmente positivos. Crecen usualmente
en un caldo de cultivo a 10 C y 45 C, aunque el crecimiento ptimo es a 37 C.
Pueden crecer a pH 9,6, con 6,5 % de NaCl y con 40 % de bilis. Usualmente
fermentan la lactosa. Portan el antgeno D del grupo Lancefield y poseen el
carbohidrato C. Sobreviven despus del calentamiento a 60 C durante 30 min.
Todas las especies de Enterococcus son capaces de crecer en presencia de 40 %
de bilis y de hidrolizar la esculina, al igual que Streptococcus del grupo D, pero se
diferencian de estos ltimos porque muestran una respuesta positiva a la prueba
de PYR (L-pirrolindonil -naltil-amida). Todas las cepas producen leucinoaminopeptidasa (LAP), por lo que son positivas a esta prueba.
Las colonias en los medios agarizados, generalmente, se presentan incoloras a
grises, que tienen de 2-3 mm de dimetro a los 2 das de
incubacin. Enterococcus pueden presentar hemlisis de tipo a, o pueden ser no
hemolticos.
Una misma cepa puede variar en sus propiedades hemolticas en dependencia del
animal del cual provenga la sangre empleada en el medio de cultivo.
La capacidad de Enterococcus para crecer en un caldo que contenga 6,5 % de
cloruro de sodio, su poder de sobrevivencia despus del calentamiento a 60 C
durante 30 min y su habilidad para crecer en un caldo de cultivo a 10 C y a 45 C,
son pruebas de caracterizacin muy tiles para la diferenciacin
de Enterococcus de Streptococcus.
Enterococcus pueden diseminarse por transmisin fecal-oral, por contacto con
fluidos de personas infectadas o por contacto con superficies contaminadas.

Enfermedades provocadas por Enterococcus

Las especies del gnero Enterococcus constituyen un serio peligro para la

salud, pues se han convertido en un patgeno nosocomial de primer orden y
de importancia creciente. Pueden provocar enfermedades muy graves como la
bacteriemia y la endocarditis. Tambin son causantes de infecciones de
heridas quirrgicas, septicemia, abscesos intraabdominales y plvicos,
infecciones de piel, tejidos blandos, neonatales y peditricas. La mayora de
las infecciones son originadas de la microbiota endgena, aunque pueden ser
transmitida de persona a persona o por consumo de agua o alimentos
contaminados.
Las infecciones urinarias son la que con ms frecuencia producen estos
microorganismos. La naturaleza de su interaccin con el tejido uroepitelial es
bastante compleja, involucrando adhesinas de superficie de naturaleza
proteica y polisacrida. La tasa de incidencia de estas infecciones aumenta
drsticamente, pudiendo llegar a ser responsables del 16 % de estas, y
aunque no es habitual, son la fuente ms comn de bacteriemia.
La bacteriemia debida a Enterococcus ocurre primariamente en pacientes que
han sido hospitalizados por perodos prolongados. Las enfermedades
malignas, la cateterizacin uretral, los dispositivos intravasculares, las cirugas
recientes, las quemaduras y la terapia antimicrobiana previa, son condiciones
asociadas con las bacteriemias. Tambin influyen la hiperalimentacin, la
colonizacin previa del tracto gastrointestinal con Enterococcusvancomincina
resistentes (EVR), el uso de vancomicina y de antianaerbicos. La incidencia
anual de bacteriemias nosocomiales provocadas por Enterococcus es de 1 o 2
episodios por cada 1 000 pacientes hospitalizados.
Dentro de los pacientes con un riesgo particular de bacteriemia causada por
EVR, estn aquellos que reciben hemodilisis y los receptores de
corticoesteroides, de agentes antineoplsicos o con nutricin parenteral. Otros
factores de riesgo son la gravedad de la enfermedad, la forma de
administracin antibacteriana, la neutropenia y la mucositis.
Enterococcus en aguas y alimentos
Las aguas y los alimentos contaminados con microorganismos constituyen un
vehculo de transmisin de enfermedades infecciosas; por otra parte, el
desarrollo microbiano destruye grandes cantidades de alimentos, causando
problemas econmicos y una considerable prdida de importantes nutrientes.

El control de la calidad sanitaria de los recursos del ambiente se lleva a cabo

mediante la enumeracin de bacterias o grupos de ellas indicadoras de
contaminacin fecal. La enumeracin de estas bacterias es utilizada para
valorar la calidad sanitaria de alimentos, sedimentos y aguas destinadas al
consumo humano, la agricultura, la industria y la recreacin. No existe un
indicador universal, por lo que se debe seleccionar el ms apropiado para la
situacin especfica en estudio. Dentro del rango de los indicadores se
encuentra el grupo de bacterias coliformes, E. coli, colifagos,
Bifidobacteriumsp., Clostridiumperfringens y el grupo estreptococos fecales.
Estos microorganismos se encuentran formando parte de la microbiota del
tracto gastrointestinal del hombre y de los animales de sangre caliente; son
excretados en sus heces, de ah que su presencia en el ambiente indica
contaminacin de origen fecal y el riesgo de aparicin de grmenes
patgenos.
Enterococcus se encuentran dentro del grupo de microorganismos indicadores
de la inocuidad de los alimentos, pues por su amplia distribucin pueden
encontrarse en estos productos, especialmente en los de origen animal.
Suelen considerarse buenos indicadores porque mueren ms lentamente que
los coliformes, debido a que son muy resistentes a condiciones adversas
como congelacin, desecacin y como resultado sobreviven ms que stos.
La presencia de E. faecalis y E. faecium es usada frecuentemente para indicar
contaminacin de origen fecal. E. faecalisssp. faecalis es considerado como
un indicador de contaminacin fecal de fuentes humanas, mientras que E.
faecium y otras especies indican contaminacin de otras fuentes.
Los productos de consumo pueden contener Enterococcus procedentes de
una contaminacin fecal directa o indirecta. En los productos
semiconservados, procesados por calor pero no estriles, Enterococcus, junto
con microorganismos esporulados, son con frecuencia los nicos
microorganismos sobrevivientes. Los productos mantenidos en el rango de
temperatura entre 10-45 C pueden contener cifras muy altas de estos
microorganismos.
El anlisis de Enterococcus es interesante cuando se analizan muestras de
aguas, ya que E. bovis y E. equinus, son indicadores de contaminacin por
animales de sangre caliente no humana y, adems, son las especies que ms
rpidamente mueren en el medio exterior; por eso, cuando se detectan,
indican una contaminacin reciente por animales de granja; tambin en

alimentos tienen su importancia, especialmente en industrias que procesan

carne y productos de granja.
El anlisis de Enterococcus se realiza cuando se trata de aguas de bebida de
calidad dudosa como son las muestras de pozos, es decir, aguas subterrneas
o para aguas de recreacin.
La Organizacin Mundial de la Salud discute la ineficacia de coliformes fecales
como indicador de polucin fecal y debate los mritos de indicadores
alternativos, como Enterococcus o clostridiossulfito reductores.
Para su anlisis se emplea la tcnica de nmero ms probable (NMP), usando
el medio EVA (etil violeta azida) o mtodos de siembra en placa, empleando el
medio KF-Streptococcus. La azida sdica y el cristal violeta, se utilizan
frecuentemente para el cultivo de estos microorganismos.
Es de vital importancia que el agua para uso recreativo tambin posea una
buena calidad. Diversos estudios de aguas marinas y playas indican que las
enfermedades de las mucosas, de la piel y digestivas, asociadas con los
baistas, estn directamente relacionadas con contaminacin fecal.
Enterococcus es considerado el indicador bacteriolgico ms eficiente para
evaluar la calidad de agua de mar para uso recreativo, debido a que es
altamente resistente a las condiciones salinas de este medio y adems est
relacionado directamente con gastroenteritis, enfermedades respiratorias,
conjuntivitis y dermatitis, entre otras.
La Organizacin Mundial de la Salud defini los criterios de clasificacin de las
playas de acuerdo con los niveles de Enterococcus presentes en el agua.
Estos son los siguientes:

Tambin es necesario realizar el control sanitario de las piscinas para

garantizar la calidad adecuada del agua y prevenir o minimizar riesgos a la
salud pblica por enfermedades gastrointestinales, de la piel y otras,
ocasionadas por ingestin, contacto e inhalacin de microorganismos
patgenos a travs de estas aguas. La vigilancia sanitaria se basa en los
parmetros bacteriolgicos y fisicoqumicos que determinan la calidad del
agua, as como en sus condiciones sanitarias de operacin y mantenimiento.

Estas deben estar ausentes de organismos indicadores de contaminacin

fecal y de patgenos como Escherichiacoli o coliformes fecales,
Staphylococcusaureus, Enterococcus, Cryptosporidiumsp., Giardialamblia,
ameba de vida libre, Vibrio cholerae.
Por lo general, los procedimientos empleados en aguas consisten en el
enriquecimiento en medio lquido de acuerdo con el mtodo del nmero ms
probable y la tcnica de filtracin por membrana. En el primero se ha
determinado que los medios que contienen azida de sodio producen los
mejores resultados; en cuanto al segundo, ms de 70 medios han sido
propuestos para la determinacin de estreptococos fecales por dicha tcnica.
Los medios selectivos usualmente estn constituidos por un agente como la
azida de sodio, un antibitico, con frecuencia gentamicina o kanamicina, o
sales biliares y un indicador que puede ser esculina o tetrazolium. La
incubacin a temperaturas elevadas (42-45 C) tiene tambin un efecto
selectivo para algunos Enterococcus.
El mtodo de tubos mltiples utilizado para la determinacin de Enterococcus
en muestras de agua de mar consta de una prueba presuntiva en la cual se
utiliza el medio caldo azida dextrosa y de una etapa confirmativa con el medio
agar PSE selectivo para Enterococcus. La presencia de turbiedad en el caldo
dextrosa azida al transcurrir de 24 a 48 horas de incubacin, indica la
presencia de Enterococcus de forma presuntiva. El desarrollo de colonias caf
negruzcas con halos color caf en el agar PSE despus de 24 horas de
incubacin, confirman la presencia de estreptococos fecales. Estas colonias
pueden ser transferidas a tubos con caldo infusin cerebro corazn que
contengan 6,5 % de NaCl. La presencia de crecimiento en este medio,
despus de incubar a 45 C, confirma que son Enterococcus.
La relativa resistencia de Enterococcus a condiciones adversas como
temperaturas extremas, pH y salinidad elevados, es ventajosa cuando se
determina la historia sanitaria de alimentos moderadamente calentados,
congelados, salados u otro alimento o bebida en los cuales los coliformes
pueden no haber sobrevivido. Sin embargo, debido a la habilidad de
Enterococcus para crecer en ambientes lejanos de la fuente original de
contaminacin fecal, se recomienda precaucin y discrecin en atribuirle una
significacin al nmero y tipo de Enterococcus y estreptococos fecales
presentes en los alimentos.

La Organizacin Mundial de la Salud plantea que los estreptococos fecales

son considerados de gran valor para medir la eficiencia de los tratamientos del
agua potable, para los controles corrientes despus de la insercin de nuevos
conductos, o cuando se reparan los sistemas de distribucin.

Se han establecido diferentes parmetros en cuanto a la calidad de las aguas

destinadas al consumo humano. Estos parmetros son los siguientes:

Para las aguas comercializadas en botellas u otros recipientes se aplican los

valores siguientes:

MATERIALES
Material Biolgicos:

Leche deshidratada.
Agua de acequia

Materiales De Laboratorio

o Medios de cultivo:

Agar Azida Cristal Violeta de Packer en sangre.

Agar Enterocococon TrifenilTetrazoliumy acetato de talio 1%
Agar triptosatrifeniltetrazolium acetato de talio
Caldo EVA
Caldo triptosa sorbitol
Caldo triptosaNaCl 6.5%
Cladotriptosa pH 9.6

o Diluyente: agua destilada, agua peptonada 1% o SSFe.

o Placas Petri
o Pipetas de 1 y 10 ml
o Frascos de vidrio
o Tubos de dilucin.
o Gradillas
o Estufa
o Mecheros, algodn, alcohol.

PROCEDIMIENTO
A. Alimentos ( leche deshidratada)
1. Diluciones sucesivas:
Pesar 3 gr. de muestra y diluirlos en 27 ml. de SSF esteril (10 -1).
Realizar las diluciones 10-2 y 10-3.

2. Mtodo presuntivo:
-Realizar siembra en profundidad en Agar Azida Cristal Violeta de
Packer, dos placas por cada dilucin.

Homogenizar.

Incubar a 35.37C por 48 horas.

Observar colonias pequeas de color violeta.

3. Mtodo confirmativo
Sembrar en Agar Glucosa TripticasaAzida o Agar TTC.
4. Identificacin
Realizar Tincin de Gram y las siguientes pruebas:
Catalasa
Fermentacin de Sorbitol
Crecimiento a 45C
Tolerancia a 65C/30
B. Agua (agua de mar)-NMP
1. Mtodo presuntivo:
- Sembrar alcuotas de 10 ml, 1 ml y 0.1 ml en una serie de 3 tubos
con
Caldo Glucosa Azida y Caldo simple.
-

Incubar a 37C por 24 horas.

Observar turbidez.

2. Mtodo confirmativo:
Sembrar una azada de los tubos positivos en Agar Enterococcus.
Incubar a 37C por 24 horas.
Observar sedimento rojo ladrillo y turbidez.
3. Identificacin
Realizar Tincin de Gram y las siguientes pruebas:
Catalasa
Fermentacin de Sorbitol
Crecimiento a 45C
Tolerancia a 65C/30

RESULTADOS
Muestra: Leche deshidratada
No creci ningn microorganismo.

Muestra: Agua de la desembocadura del Dren

Serie de tubos positivos: 3-3-3

NMP:1 100 UFC/ml

Tincin Gram

Catalasa

NEGATIVO
Fermentacin de Sorbitol

POSITIVO

Crecimiento a 45C
POSITIVO
Tolerancia a 65C/30
POSITIVO

I.

CONCLUSIONES
- Se logr determinar la existencia de Enterococcus en la muestra de
leche en polvo.
- De la muestra de agua se pudo aislar Enterococcusfaecalis, y por el
mtodo del NMP se determin la presencia de 1100 UFC/ml

II.

REFERENCIAS
Pascual M. y V. Caldern. 2000. Microbiologa Alimentaria:
metodologa analtica para alimentos y bebidas. Editorial Daz de
Santos. Segunda edicin. Madrid-Espaa.
James M. Jay. 2002. Microbiologa moderna de los alimentos.
Editorial Acribia S.A. Cuarta edicin. Zaragoza-Espaa.
Direccin general de Salud Ambiental (DIGESA). Manual de
Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2001. Lima-Per.