UNIVERSIDAD PEDRO RUIZ GALLO

MICROBIOLOGA DE LOS ALIMENTOS I

INTRODUCCIN
Existen diversos mtodos para cuantificar el nmero de
microorganismos presentes en muestras lquidas y slidas. Dentro de
las tcnicas ms comunes se encuentra el recuento directo por
microscopia, as como los procedimientos basados en diluciones en
serie, haciendo crecer microorganismos en medios de cultivo sintticos
slidos o lquidos, como el recuento en placa de Unidades Formadoras
de Colonias(UFC) o la estimacin por el mtodo del Nmero Ms
Probable (NMP).
El Mtodo del Nmero Ms Probable fue descrito por McCrady en 1915
y actualmente sigue siendo ampliamente utilizado. En un principio este
mtodo fue empleado para estimar el nmero de microorganismos en
muestras de alimentos y aguas. Sin embargo, se ha demostrado que
tambin puede ser aplicado para la determinacin de microorganismos
aerobios y anaerobios en lodos, sedimentos marinos y suelos
contaminados, por tanto este mtodo es aplicable para estimar el
nmero de microorganismos en muestras de suelo y agua, tanto para
bacterias aerobias como anaerobias.
Los Coliformes Fecales son un subgrupo de los Coliformes totales,
capaces de fermentar la lactosa a 44 C en vez de 37 C como lo hacen
los totales.
Aproximadamente el 95% del grupo de los Coliformes presentes en
heces estn formados por Escherichiacoli y ciertas especies de
Klebsiella. Ya que los Coliformes Fecales se encuentran casi
exclusivamente en las heces de los animales de sangre caliente, se
considera que reflejan mejor la presencia de contaminacin fecal. stos
ltimos se denominan termotolerantes por su capacidad de soportar
temperaturas ms elevadas. Esta es la caracterstica que diferencia a
Coliformes Totales y Fecales. La capacidad de los Coliformes fecales de
reproducirse fuera del intestino de los animales homeotrmicos es
favorecida por la existencia de condiciones adecuadas de materia
orgnica, pH, humedad. Desde hace mucho tiempo se han utilizado
como indicador ideal de contaminacin fecal. Su presencia se interpreta
como una indicacin de que los organismos patgenos pueden estar
presentes y su ausencia indica que el agua o el alimento estudiado se
hallan exentos de organismos productores de enfermedades.

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OBJETIVOS
Detectar si la muestra trada es apta para el consumo humano.
Diferenciar los organismos coliformes totales de los microorganismos
coliformes fecales.
Evaluar la calidad sanitaria de muestras de agua o alimentos
mediante la bsqueda de microorganismos coliformes totales,
coliformes fecales.

MARCO TERICO

Nmero ms Probable (NMP)

El mtodo se basa en determinar la presencia o ausencia (positivo o
negativo) de atributos especficos de microorganismos en copias
obtenidas por diluciones consecutivas a partir de muestras de suelo u
otros ambientes. Se basa en el principio de que una nica clula viva
puede desarrollarse y producir un cultivo turbio. El mtodo requiere la
realizacin de una serie de diluciones en serie de la muestra de cultivo,
en un medio lquido adecuado para el crecimiento de dicho organismo
de un volumen diez veces mayor. Luego, se incuban las muestras de
esos tubos y, pasado un tiempo, se examinan los tubos. Aquellos tubos
que recibieron una o ms clulas microbianas procedentes de la
muestra, se pondrn turbios, mientras que los tubos que no recibieron
ninguna clula permanecern transparentes.
Al aumentar el factor de dilucin, se alcanza un punto en el que algunos
tubos contendrn tan slo un microorganismo y otros tubos no
contendrn ninguno. Al calcular la probabilidad de que los tubos no
hayan recibido ninguna clula, se puede estimar el nmero ms
probable de microorganismos presentes en la muestra original, a partir
de una tabla estadstica.
La precisin del mtodo del nmero ms probable aumenta con el
nmero de tubos que se usan; cinco tubos por dilucin se considera
como una relacin adecuada entre precisin y economa.
Una condicin del mtodo es la necesidad de poder reconocer un
atributo especfico de la poblacin en el medio de crecimiento que se

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emplee. La estimacin de la densidad poblacional se obtiene del patrn

de ocurrencia de ese atributo en sucesivas diluciones en serie y el
empleo del clculo probabilstico.
Hay muchas entidades discretas que son fciles de detectar pero
difciles de contar. Una aplicacin es el de cualquier clase de reaccin
de amplificacin o reaccin de catlisis que impide una cuantificacin
fcil, pero permite que su presencia sea detectada de modo muy
sensible. Algunos ejemplos comunes son: crecimiento de
microoganismos, accin enzimtica, o catlisis qumica. El mtodo del
NMP supone tomar la disolucin original o muestra y subdividirla en un
factor (frecuentemente 10 veces, o 2 veces) y evaluar la
presencia/ausencia en mltiples subdivisiones.
El grado de dilucin para el cual comienza a aparecer la ausencia indica
que los elementos se han diluido tanto que hay muchas submuestras en
las que no aparece. Un juego de repeticiones para cualquier
concentracin dada permite una resolucin ms fina, para usar el
nmero de muestras positivas y negativas que estiman la concentracin
original dentro del apropiado orden de magnitud.

Coliformes totales
Son las Enterobacterias lactosa-positivas y constituyen un grupo de
bacterias que se definen ms por las pruebas usadas para su
aislamiento que por criterios taxonmicos. Pertenecen a la familia
Enterobacteriaceae y se caracterizan por su capacidad para fermentar
la lactosa con produccin de cido y gas, ms o menos rpidamente, en
un periodo de 48 horas y con una temperatura de incubacin
comprendida entre 30-37C.
Son bacilos gramnegativos, aerobios y anaerobios facultativos, no
esporulados. Del grupo <<coliforme>> forman parte varios gneros:
Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Citrobacter, etc. Se encuentran en
el intestino del hombre y de los animales, pero tambin en otros
ambientes: agua, suelo, plantas, cscara de huevo, etc.
Una elevada proporcin de los coliformes que existen en los sistemas
de distribucin no se debe a un fallo en el tratamiento en la planta, sino
a un recrecimiento de las bacterias en las conducciones. Dado que es
difcil distinguir entre recrecimiento de coliformes y nuevas
contaminaciones, se admite que todas las apariciones de coliformes
son nuevas contaminaciones, mientras no se demuestre lo contrario.

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Coliformes fecales
Son coliformes totales que adems fermentan la lactosa con produccin
de cido y gas en 24-48 horas a temperaturas comprendidas entre 44 y
45C en presencia de sales biliares. Los coliformes fecales comprenden
principalmente Escherichiacoli y algunas cepas de Enterobacter y
Klebsiella.
Su origen es principalmente fecal y por esos se consideran ndices de
contaminacin fecal. Pero el verdadero ndice de contaminacin fecal
es Escherichiacoli tipo I ya que su origen fecal es seguro. Desde el
punto de vista metodolgico Escherichiacoli es el Coliforme ms es
positivo a la prueba del Indol.

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Materiales
Muestra: Jugo de manzana
Medios de cultivo: Caldo Brilla (presuntivo), agar MacConkey,
agar Endo, EMB, CB.
Caldo EC
Tubos de dilucin
Pipetas

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Bombilla de aspiracin
Placas de Petri
Mechero Bunsen
Bao Mara
Estufa
Gradillas
Ansas microbiolgicas

Procedimiento

Coliformes Totales:
Tomar 3 mL de muestra y realizar 3 diluciones sucesivas.

Sembrar 3 tubos por cada dilucin.

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Incubar a 37C1C y observar a las 24 y 48 horas.

Determinar turbidez y produccin de gas.

De los tubos positivos, sembrar en placas con agar ENDO

o ABRV.

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Coliformes fecales
De los tubos positivos para Coliformes Totales, tomar una
asada y sembrar en Caldo E.C.
Incubar a 45.5 C 0,2 C por 24-48 horas.
El resultado positivo es determinado por la produccin de
gas.

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RESULTADOS
Coliformes totales:
Pruebavsnti:

Resultados a las 48
-1

-1

-2

-2

-3

-3

horas de incubacin a
35C en Caldo Lauril
Sulfato.
Turbidez: Positivo (+)
Gas: Positivo (+)
Combinacin
de
tubos positivos: 2-22

Prueba Confirmativa:

Lectura: Los coliformes presentan una caracterstica

cuando

se

siembran

en

Agar

Bilis

Rojo

Violeta,

diferencindolos en lactosa positiva (color rojo) y negativa

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Lectura: usando el mtodo de NMP.

Lectura: NMP DE COLIFORMES TOTALES = 14/mL

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Coliformes Fecales
Caldo EC

Lectura:

Turbidez

gas

positivos en los 4 tubos a las

24 horas. Indica la presencia
de coliformes termotolerantes
o fecales.

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CONCLUSIONES
El ceviche analizado no es apto para el consumo, debido a su
contenido de coliformes fecales.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

Forbes, B. (2009)Bailey y Scott: Diagnstico microbiolgico. 12va

Edicin. Ed. Panamericana. Argentina.

REFERENCIAS LINCOGRFICAS

http://fos.panalimentos.org/LinkClick.aspx?fileticket=NmZogH4P
%2Bmk%3D&tabid=120&mid=460&language=es-ES

http://bscw.rediris.es/pub/bscw.cgi/d311306-3/*/*/*/normictb.htm

http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedr
aMicro/10_AgarEndo.pdf

http://www.bvsde.paho.org/bvsacd/scan/013761/013761-02.pdf