PRCTICA 5

AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
ms mtodos.
- Estudiar la morfologa de cada colonia.

Introduccin
En la naturaleza, la mayora de los microorganismos no se encuentran aislados, sino integrados
en poblaciones mixtas. Para llevar a cabo el estudio de estos microorganismos y de sus propiedades, es necesario separar unos de otros y trabajar
con especies aisladas, obteniendo cultivos axnicos o puros.
Un cultivo axnico o puro es aquel que contiene
un slo tipo de microorganismo y que procede
generalmente de una sola clula; el crecimiento
de sta origina, en medio slido, una masa de
clulas fcilmente visible que recibe el nombre de
colonia.
Para obtener cultivos axnicos o puros a partir de
una poblacin microbiana mixta, se utilizan las
denominadas tcnicas de aislamiento, que fueron
desarrolladas durante el siglo XIX. En un principio,
Lister utiliz diluciones seriadas en medio lquido
con esta finalidad, pero la presencia de contaminacin, es decir, de microorganismos no deseados, dificult el aislamiento. La escuela de Robert
Koch introdujo los medios slidos, complementados con agar, y las placas de Petri en
Bacteriologa, permitiendo as la separacin fsica
de las colonias sobre la superficie del medio de
cultivo o en el interior del mismo.
El aspecto de las colonias sirve para diferenciar
distintas especies microbianas.

Objetivos
- Familiarizarse con el manejo de microorganismos y con las tcnicas de aislamiento en placa de Petri.
- Obtener colonias separadas, utilizando uno o

Carga (1 estra)

Material
Asa de siembra, cayado, pipeta graduada, placas
de Petri con medio de cultivo slido y cultivo de
microorganismos.

Tcnicas
Existen distintas tcnicas que pueden utilizarse:
a) Extensin en superficie con cayado

Serie de
diluciones
conocidas de
la muestra

Cayado

Figura 5.1. Siembra por extensin en

superficie para recuento.
Depositar sobre la superficie de una placa con
agar nutritivo una gota 0,1 ml de una determinada dilucin del cultivo de microorganismos problema y extenderlo con ayuda del cayado, previamente esterilizado, en todas las direcciones hasta

Primera diseminacin

Segunda diseminacin

(2 estra)

(3 estra)

ltima diseminacin

(4 estra)

Figura 5.2. Tcnica de aislamiento por estra en superficie.

23

que est completamente seco. Incubar la placa,

en posicin invertida, a la temperatura deseada
(durante 24, 48 72 horas) segn el tipo de microorganismo. La posicin invertida evitar que el
agua de condensacin se deposite sobre la superficie del medio, dificultando la obtencin de colonias aisladas.
Es una tcnica usada para el aislamiento de colonias, que permite igualmente el recuento de bacterias viables en la muestra, si conocemos exactamente el volumen de muestra sembrado.
b) Estra mltiple en superficie
Con un asa de siembra, previamente esterilizada,
se toma una muestra del cultivo de microorganismos y se extiende sobre un rea pequea de la
superficie de la placa con agar nutritivo, en forma
de estras muy juntas, pero sin hacer presin para
no daar el agar.
Se flamea el asa, se enfra y despus de rozar la
siembra realizada previamente, se extiende de
nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas
estras. Este proceso se repite sucesivamente, flameando y enfriando el asa al comienzo de las
sucesivas siembras en estra. Se lleva la placa a
incubar, a la temperatura adecuada, siempre en
posicin invertida.
Mediante esta tcnica se obtienen colonias aisladas a partir de una muestra que contenga un elevado nmero de bacterias.
c) Dilucin en masa
En una placa de Petri vaca se deposita un
pequeo volumen conocido de muestra y a continuacin se aade el medio de cultivo (agar nutritivo) fundido y atemperado aproximadamente a
45C. Se mezclan ambos por rotacin suave de la
placa. De esta forma los microorganismos se distribuirn de forma homognea en el medio de cultivo, permitiendo el desarrollo de colonias separadas por todo el agar.
Otra variacin de esta tcnica consiste en inocular
Medio fundido
Medio
atemperado
fundido
Inculo
Inculo
atempera
calibrado
calibrado

Homogeneizar
Homogeneiz

Figura 5.3. Siembra por dilucin en masa

o inclusin en agar.

24

el medio de cultivo, fundido y atemperado, contenido en un tubo, con un determinado volumen de

la muestra. La homogeneizacin de la muestra y
el medio de cultivo se realiza por rotacin del tubo
entre las manos, antes de verterlo sobre la placa.
En ambos casos, trs homogeneizacin, se dejan
enfriar las placas hasta que se solidifique el medio
y posteriormente se incuban a la temperatura adecuada (siempre en posicin invertida).
Aunque con esta tcnica se obtienen colonias aisladas, generalmente slo se utiliza para determinar el nmero de microorganismos viables en una
muestra, cuando stos son anaerobios facultativos o microaerfilos.

Resultados
a) Extensin en superficie: Tras el perodo de
incubacin se examinarn las placas. Las colonias
aparecen sobre la superficie, distribuidas uniformemente si la siembra se ha realizado de forma
correcta. Podrn diferenciarse las colonias de
acuerdo a su tamao, forma, color, textura, etc.
Esta tcnica de siembra, adems de permitir que
se distingan las colonias por su morfologa, permite el recuento de microorganismos viables. La
expresin de este recuento se hace en "unidades
formadoras de colonias" (UFC) ya que cada una
procede de un slo microorganismo (o de un
grupo de microorganismos, pues en algunos
casos stos tienden a formar agregados). A partir
de las colonias aisladas, los microorganismos
pueden transferirse a otros medios de cultivo para
su estudio.
b) Por estra mltiple en superficie: Tras la incubacin, se observarn las colonias aisladas en alguna regin de la placa inoculada. Con esta tcnica
se logra la separacin de los microorganismos
que se encuentran
en un cultivo
mixto, o bien que
proceden
de
m u e s t r a s
homogneas,
pero en las que
existe un elevado
nmero.
En las zonas
donde
existen
colonias aisladas
se puede estudiar Figura 5.4. Aislamiento
la morfologa colo- por estra en superficie.
nial.
c) Dilucin en masa: Aparecen las colonias distribuidas por toda la masa del agar. Aquellas que
estn en la superficie tendrn distintas caracters-

ticas, dependiendo del tipo microbiano, mientras

que las colonias que se desarrollan en el interior,
bajo la superficie del agar, tienen forma lenticular,
aunque los microorganismos que formen las distintas colonias sean de distinto tipo. Por tanto, las
colonias que aparecen en la profundidad del agar
son siempre biconvexas y no se diferencian unas
de otras por su morfologa.

Figura 5.5.
Aislamiento por dilucin en masa.

Forma

Borde

Puntiforme

Entero

Puntifor
me
Circular
Circular
Rizoide

Elevacin

Superficie

Entero

Plana
Plana

o
LisaLisa
o rugosa

Ondulado

Elevada
Elevad

Mate
o
Mate o
brillante

Convexa
Convex

Seca o
cremosa
Seca
o

Ondulad
o

Rizoide
Lobulado
Irregular

Irregular
Filamentosa

Filamentos
a

Lobulad
o
Filamentoso
Filamentoso

Crateriforme
Crateriform

Invasiva oo
Invasiva
superficial

Acuminada
Acumina

Figura 5.6.
Aspectos ms comunes de las diversas colonias microbianas aisladas sobre medio
slido.

25

PRCTICA 6
SIEMBRAS
Objetivos
- Aprender a inocular distintos medios de cultivo
contenidos en tubo: Caldo, agar inclinado y medio
semislido sembrado en profundidad.
- Observar el crecimiento bacteriano en los distintos medios de cultivo.
- Comprobar la movilidad de determinados microorganismos.

c) En medio slido (agar inclinado): Con el asa

de siembra estril tomar los microorganismos de
la muestra e inocular el tubo realizando un movimiento de zig-zag en la superficie. El proceso se
inicia en el fondo y se va avanzando hacia arriba
por el rea inclinada.
Incubar en estufa durante 28-48 horas a la temperatura ms adecuada.
Siembra enen
Siembra
zig-zag
en
zig-zag
la

Material
Asa de siembra, hilo de siembra, pipetas Pasteur
o pipetas graduadas, suspensin de microorganismos y tubos con medio de cultivo lquido, slido
inclinado y semislido.

Asa de
siembra

Tcnica
a) En medio lquido con asa: Transferir aspticamente, con el asa de siembra, una pequea muestra de los microorganismos, desde el tubo que
contiene el material problema al tubo con medio
de cultivo estril. Sumergir el asa en el lquido y
agitar para desprender y diluir la muestra. Incubar
el tubo recin sembrado en estufa, durante 24-48
horas a la temperatura ptima de crecimiento.
Flameado

Flameado

Muestra
Medio(agar
(agar inclinado)
Muestra Medio

Figura 6.2.
Siembra en un tubo de agar inclinado.

d) En medio semislido: La siembra en este tipo

de medio, que contiene una proporcin menor de
agar que los medios slidos y que se envasa en
tubos, se lleva a cabo con un hilo de siembra esterilizado, con el cual se toma la muestra. El medio
queda inoculado al introducir el hilo en profundidad hasta el fondo del tubo, retirndolo posteriormente por la misma trayectoria utilizada al realizar
Puncin

Muestra

Muestra

Inoculacin

Inoculaci

Puncin
limpia
limpia

Incubacin
Incubaci

Figura 6.1.
Inoculacin de un caldo de cultivo
(ver tambin figura III, pg. 4).
Filamento
Filamento

b) En medio lquido con pipeta: Introducir aspticamente la pipeta Pasteur o la pipeta graduada
en el medio lquido que contiene los microorganismos y, aspirando de forma adecuada, sacar una
cantidad establecida de material que se transfiere
al tubo con medio de cultivo estril. Incubar en
estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms
adecuada.

Muestra

Muestra

Medio (agar semislido)

Medio (agar

Figura 6.3.
Inoculacin de un medio semislido por
picadura con hilo de siembra.
27

la picadura. Una siembra con asa o con un cierto

movimiento de vaivn podra originar un patrn de
crecimiento que se interpretara errneamente
como movilidad bacteriana.
Incubar durante 24-48 horas a la temperatura ptima de crecimiento.

Resultados
a y b) En los cultivos lquidos
no tiene lugar la formacin
de colonias, por lo tanto se
examinar la existencia de
enturbiamiento ms o menos
intenso, la formacin de una
pelcula o velo sobre la
superficie, la aparicin de
sedimento en el fondo del
tubo, etc. La utilizacin de
medios de cultivo lquidos
permite la obtencin de una
poblacin microbiana grande, con un elevado nmero
de microorganismos, para
ser utilizados posteriormente.

temperaturas de 4C.
d) En medio semislido se podr comprobar si el
microorganismo es o no mvil, ya que en el primer
caso se observar que el crecimiento difunde alrededor de la zona donde se hizo la picadura,
detectndose turbidez. Por eso es tan importante
que, cuando se inocula el medio de cultivo, no se
distorsione el agar y se vuelva a sacar el hilo por
el mismo sitio de inoculacin. Los microorganismos inmviles crecern nicamente a lo largo de
la picadura.
Este tipo de siembra en picadura sirve, tambin,
como otro de mtodo de conservacin de microorganismos anaerobios facultativos.

Figura 6.4.
Aspecto de cultivos en agar
inclinado (A) y
semislido (B)
c) En medio slido (agar tras la
inclinado) se observar el incubacin.

aspecto general del medio y

la aparicin de crecimiento
sobre su superficie. Este tipo de siembra permite
el cultivo de microorganismos aerobios o anaerobios facultativos. Adems, se utiliza para almacenar cultivos durante cortos perodos de tiempo, a

28

Figura 6.5.
Prueba de movilidad en agar semislido.
1. Microorganismo mvil.
2. Microorganismo inmvil.
3. Tubo control sin inocular.

PRCTICA 7
CULTIVO DE ANAEROBIOS
Objetivo

b) Siembra en superficie

Conseguir el crecimiento de microorganismos

anaerobios, en ausencia de oxgeno, utilizando
diversas tcnicas.

Estra mltiple: La siembra por estra en superficie

tambin puede hacerse con microorganismos
anaerobios, pero en este caso, las placas no se
llevan a incubar directamente, sino que se introducen en una jarra especial en la que exista un
ambiente libre de oxgeno, denominada jarra de
anaerobiosis.
Para crear un ambiente
de anaerobiosis en el
interior de estas jarras,
se utiliza una preparacin comercial que elimina el O2 y desprende

Material
Asa de siembra, medios de cultivo (segn la tcnica utilizada), parafina estril, jarra de anaerobiosis
y suspensin de Clostridium. Para comparar el
tipo respiratorio, se emplearn tambin otros
microorganismos que no sean anaerobios estrictos, como Escherichia coli y Micrococcus luteus.

Tcnicas
a) Siembra en profundidad
En tubo con medio slido vertical o semislido: Se
utilizan los medios V.L. (Viande et levures,
Buttiaux et al.) o medio fluido de tioglicolato, que
deben ser hervidos en un bao Mara durante 15
20 minutos, antes de ser inoculados, para eliminar el oxgeno disuelto. Sembrar los medios, una
vez atemperados a 45-50C. Con el asa de siembra o con una pipeta Pasteur estril, con el extremo cerrado, se realiza un movimiento en espiral
de arriba a abajo y de abajo a arriba, para distribuir la muestra homogneamente, sin agitar el
tubo durante la siembra para evitar la entrada de
aire. Con la misma finalidad, solidificar rpidamente el medio de cultivo sumergiendo el tubo en agua
fra.
Estos medios pueden utilizarse tambin para
determinar el tipo respiratorio, como se describe
en los resultados.
Si el medio utilizado es lquido, agregar una capa
de parafina estril para impedir la difusin del O2
al medio.
Incubar en estufa durante 24-48 horas a la temperatura ms adecuada.
En placa: Transferir 1 ml del inculo a una placa
de Petri estril vaca y aadir el medio de cultivo
fundido y atemperado a 45-50C, homogeneizando mediante giros repetidos de la placa, hasta que
el inculo se haya distribuido uniformemente. Una
vez solidificado el agar, aadir una segunda capa
de medio de cultivo.

CO2. La atmsfera va
reducindose y, para
verificar que el ambiente
es anaerbico, se coloca
dentro de la jarra una tira
de papel impregnada en
un indicador que vira de
Figura 7.1. Jarra
color en presencia de
de anaerobiosis.
CO2. El indicador suele
ser azul de metileno, que es de color azul cuando
se expone al aire y se vuelve incoloro cuando est
totalmente reducido.
Incubar las placas dentro de la jarra de anaerobiosis durante 48 horas a la temperatura ms adecuada.

Resultados
a) En medio semislido vertical (V.L.) o fluido (tioglicolato) los microorganismos pueden crecer en
la parte superior del medio si son aerobios estrictos, en la zona inferior del medio si son anaerobios
estrictos y a lo largo de todo el medio, en el caso
de anaerobios aerotolerantes. Los anaerobios
facultativos crecern tambin por todo el tubo,
aunque preferentemente en superficie. Por ltimo,
si se trata de microorganismos microaerfilos,
aparecer crecimiento en una pequea zona intermedia, prxima a la superficie (ver Fig. 7.2).
Observar tambin el aspecto de las colonias y el
desprendimiento de gas.
En la siembra en placa en profundidad, se debe
anotar si ha habido crecimiento de colonias en
toda la masa del agar.

29

b) Estra mltiple en superficie observar el crecimiento, teniendo en cuenta que la placa ha sido
incubada en ambiente de anaerobiosis. En las
zonas donde se hayan obtenido colonias aisladas
estudiar su morfologa.

Figura 7.2. Comportamiento de los microorganismos en tubos VL.

1. Aerobios estrictos
2. Anaerobios estrictos
3. Anaerobios facultativos
4. Anaerobios aerotolerantes
5. Microaerfilos

30

PRCTICA 8
CONTROL MICROBIOLGICO AMBIENTAL
El control microbiolgico es necesario para la evaluacin de la calidad microbiolgica de zonas
estriles en la industria farmacutica y en estudios
de la microbiota en ambientes naturales. El aire
contiene en suspensin diferentes tipos de microorganismos, especialmente bacterias y hongos.
La presencia de uno u otro tipo depende del origen, de la direccin e intensidad de las corrientes
de aire y de la permanencia y supervivencia de los
microorganismos. Algunos se encuentran en
forma de clulas vegetativas, pero lo mas frecuente son las formas esporuladas debido a que
sobreviven mejor en atmsferas secas. En el aire
se aislan bacterias esporuladas de los gneros
Bacillus y Clostridium, as como actinomicetos.
Adems son frecuentes los bacilos pleomrficos
Gram positivos de los gneros Corynebacterium,
Arthrobacter y otros. Los bacilos y cocos Gram
negativos se encuentran en escasa proporcin
debido a que no sobreviven a la desecacin.
Respecto a los hongos, los que ms frecuentemente se aslan son hongos filamentosos como
Cladosporium, Aspergillus, Penicillium, Alternaria
o Mucor y levaduras como Rhodotorula o Candida
La tcnica que se emplea rutinariamente en anlisis microbiolgico ambiental es la sedimentacin
por gravedad. Este mtodo permite determinar la
carga microbiana de un ambiente problema. Los
microorganismos suspendidos en el polvo o
aerosoles sedimentan sobre la superficie de un
medio rico, no selectivo o bien en medios selectivos contenidos en placas de Petri. Una vez tomada de muestra mediante la apertura de las placas
en el ambiente deseado, stas se incubarn en
las condiciones que favorezcan el crecimiento del
tipo de microorganismos que deseemos estudiar,
normalmente a temperatura ambiente y en aerobiosis.

Objetivo
Observar y caracterizar someramente, mediante
observacin macroscpica y microscpica, la
diversidad microbiana de un ambiente elegido por
el alumno.

Material
Asa de siembra, una placa de Petri con agar triptona soja, portaobjetos, colorantes para tincin

Figura. 8.1.
Control microbiolgico ambiental.
Aspecto tpico de una placa de gravedad
mostrando la diversidad microbiana de un ambiente.
simple y de Gram, solucin de azul de lactofenol,
cinta adhesiva transparente, microscopio y aceite
de inmersin.

Tcnica
Llevar la placa cerrada, con cuidado de que no se
abra durante el transporte, al ambiente cuya carga
microbiolgica se desee evaluar. Retirar la tapa y
dejar la placa abierta, durante 30 minutos, en un
lugar representativo de dicho ambiente. Pasado
este tiempo, cerrar la placa e incubarla a temperatura de 25-30C. La placa se incuba durante 2 a
5 das.

Resultados
Se observar la aparicin paulatina de diversos
tipos de colonias. Aparecern en primer lugar
colonias bacterianas y al cabo del segundo o tercer da de incubacin se observarn las colonias
de levaduras, que se asemejan a las bacterianas,
as como las caractersticas colonias algodonosas
de los hongos filamentosos. Se anotarn las
caractersticas ms importantes de las colonias,
segn la descripcin que aparece en la figura 5.6

31

y se realizar un estudio microscpico de cada

una de ellas. Tras la tincin de Gram de las distintas colonias bacterianas que aparezcan en la
placa, se observar todo tipo de microorganismos,
con predominio de cocos y bacilos esporulados
Gram positivos, frecuentemente dispuestos respectivamente en sarcinas y en cadenas. Los bacilos irregulares que se observaran, tienen pared de
Gram positivos, pero se decoloran fcilmente y en
las preparaciones aparecern como Gram negativos o teidos de forma irregular, en bandas o en
los extremos. Estos bacilos son muy pleomrficos:
A
C
B

unos tienen forma de maza, se agrupan en empalizada o recordando letras chinas; otros poseen un
ciclo de crecimiento de bacilo a coco y algunos originan filamentos. La observacin microscpica de
hongos filamentosos se realizar mediante tincin
con azul de lactofenol. Para ello, se pone una tira
de cinta adhesiva transparente sobre el micelio,
con el fin de que las hifas y esporas queden adheridas. Se aade una gota de azul de lactofenol en
el centro y se adhiere al portaobjetos. El color azul
facilita la visualizacin del micelio en fresco.
E

Figura 8.2.
Morfologa de algunas bacterias comunes en el aire al microscopio ptico.
A. Micrococcus. Tincin de Gram (obj. 100x). B. Bacilos regulares (Bacillus) en tincin Gram (obj.
100x). C y D. Bacilos irregulares: Corineformes (C) y Arthrobacter (D). Tincin de Gram (obj. 100x). E.
Actinomiceto. Tincin de azul de lactofenol (obj. 40x).

Figura 8.3.
Morfologa de hongos al microscopio ptico.
A. Levaduras en tincin con cristal violeta (obj. 100x). B. Penicillium. Tincin con azul de lactofenol
(obj. 40x). C. Cladosporium. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). D. Mucor. Tincin con azul de
lactofenol (obj. 40x). E. Aspergillus. Tincin con azul de lactofenol (obj. 40x). F. Alternaria. Tincin
con azul de lactofenol (obj. 40x).

32