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Isolamento e identificao da Casena

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RESUMO
A solubilidade das protenas est na dependncia de vrios factores, entre os quais destaca-se a
presena de cargas elctricas em radicais de aminocidos das cadeias peptdicas. O processo de
isolamento e identificao da casena pelo mtodo de precipitao no ponto isoelctrico onde o pH
aproximadamente 4,6 e a 20C, bastante aplicvel em amostras de leite, usando como agente
precipitante cido actico a 10% e ter dietlico-etanol 1:1 para a remoo de gorduras presente na
amostra.
A presente aula laboratorial teve como objectivo principal o isolamento e identificao da casena
no leite fresco (ULTARMEL), onde inicialmente determinou- se a percentagem da casena presente
no leite fresco e por fim fez-se a anlise qumica da casena de forma a evidenciar os testes que
so positivos e negativos na protena.
A massa da casena presente na amostra cerca de 1.61g que corresponde a 3.23%, e o restante
faz parte de outras substncias presentes no leite.
Comparu-se o valor obtido experimentalmente com valor fornecido pela literatura, e fez-se a
devida concluso.

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NDICE
RESUMO ........................................................................................................................................ 1
1.

INTRODUO ....................................................................................................................... 3

1.1.

OBJECTIVOS...................................................................................................................... 7

1.1.1.
2.
2.1.
3.

Gerais ............................................................................................................................... 7

PARTE EXPERIMENTAL ..................................................................................................... 8

Materiais e equipamentos .................................................................................................... 8
PROCEDIMENTOS ................................................................................................................ 9

3.1.

Isolamento e Identificao Da Casena ................................................................................ 9

3.2.

Anlise qumica da casena .................................................................................................. 9

4.
4.1.

RESULTADOS E INTERPRETAO ................................................................................ 10

Isolamento e Identificao Da Casena .............................................................................. 10

Anlise qumica da casena ........................................................................................................... 11

5.

CONCLUSO ....................................................................................................................... 14

REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS.......................................................................................... 15

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1. INTRODUO
O leite um alimento de elevado valor biolgico, podendo ser fonte de boa parte das necessidades
dirias de protenas, que tm papel fundamental no organismo humano. (Palma et. All.)
O leite de vacas contm aproximadamente 3,5% de protenas, das quais 2,9% representado pela
casena e 0,6% pelas protenas do soro do leite. Assim, as casenas representam cerca de 80% do
total de protenas do leite bovino, as protenas do soro representam de 15 a 20%, enquanto que as
protenas da membranas dos glbulos de gordura podem chegar prximo de 5% do total. (Filho et
all, 2009).
A casena um grupo de fosfoprotenas especficas do leite as quais se precipitam com acidificao
a pH 4,6 a 20C, enquanto o restante das protenas do leite que no sofrem precipitao so
chamadas colectivamente de protenas do soro, e so classificadas de acordo com a semelhana de
suas estruturas primrias (sequncia de aminocidos), nas seguintes famlias: -S1, -S2, e kcasenas, representando aproximadamente 80% das protenas totais do leite.
Actualmente existem vrios mtodos de determinao de protenas, dentre quais destacam se os
mtodos espectrofotomtricos, mtodo de precipitao, mtodo de Biureto, mtodo de Kjeldahl e
mtodo por Biureto (analise por grupos).
Mtodo de Kjeldahl
O procedimento do mtodo baseia-se no aquecimento da amostra com cido sulfrico para
digesto at que o carbono e hidrognio sejam oxidados. O nitrognio da protena reduzido e
transformado em sulfato de amnia. Adiciona-se NaOH concentrado e aquece-se para a liberao
da amnia dentro de um volume conhecido de urna soluo de cido brico, formando borato de
amnia. O borato de amnia formado dosado com uma soluo cida (HCI) padronizada. Depois
titular o cido que no reagiu com a amnia, com uma soluo bsica padronizada (NaOH). As
suas vantagens so: boa reprodutibilidade e preciso, mtodo universal e pelo facto de determinar
quantidades muito pequenas. As desvantagens devem se pelo facto de no determinar apenas
protenas, determinando assim toda quantidade de nitrognio presente na amostra que pode ser de
aminocidos e outros componentes que possam ter nitrognio, tambm por ser um mtodo

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demorado (leva no mnimo 2h de operao), utiliza reagentes txicos e tambm pelo facto de usar
vrios graus de converso. (Vicenzi)
Este mtodo consiste em 3 etapas:
1. Digesto da amostra

2. Neutralizao e destilao

3. Titulao

Esquema 1: Reaces envolvidas nas etapas do mtodo de Kjeldahl

Precipitao pela acidificao

Precipitao pela acidificao com cido orgnico ou mineral ocorre a pH 4,6 (ponto Isoelctrico),
a 20C, seguido de centrifugao para a obteno da casena isoelctrica e de soro cido. A casena
isoelctrica poder ser transformada em caseinato pela ressolubilizao em solues de vrios
tipos de base e desidratada em spraydryer. (Sgarbieri, 2005)

Mtodo de biureto
Baseado na observao de que substncias contendo duas ou mais ligaes peptdicas formam um
complexo de cor roxa com sais de cobre em solues alcalinas.

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Este mtodo tem as seguintes vantagens: Ser bastante especfico por no apresentar problemas de
interferentes. simples, rpido e barato. Por envolver uma reao com a ligao peptdica, o
mtodo determina protena, ao contrrio do mtodo de Kjeldahl que determina N total.
Porm ele tem duas desvantagens que so: A necessidade de uma curva de calibrao tomada com
um padro conhecido de protena, por exemplo, uma protena determinada por Kjeldahl. A cor
formada no complexo no idntica para todas as protenas, porm os desvios causados so
menores do que em outros mtodos colorimtricos.

Esquema 2: Reaco de formao de Biureto

Esquema 3: Representao da interaco ligao peptdica e Cu2+

Testes para o reconhecimento de protenas

I.

Teste da ninidrina

O teste da ninidrina um teste geralmente usado na identificao de aminocidos, podendo ser

usado de forma qualitativa, em geral para detectar a presena de aminocidos ou de uma forma
quantitativa. Esta reaco usada na deteco de aminocidos por ser caracterstica da funo
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amina primria. A ninidrina um poderoso agente oxidante que reage com - aminocidos, entre
pH 4 e 8, originando um composto prpura-violeta, que no apresenta sempre a mesma intensidade
de colorao. Os aminocidos prolina e hidroxiprolina so excepes pois apresentam colorao
amarela (Filho et all, 2009).

II.

Teste de xantoprotena

um teste geralmente usado na identificao da tirosina e triptofano, ou protenas que contenham

estes aminocidos baseados na reaco de nitrao dos anis aromticos pelo cido ntrico
concentrado. Esta reaco caracterstica de grupos R benznicos. Sendo assim, os aminocidos
que possuem uma estrutura com anis aromticos formam derivados nitrosos com colorao
amarela quando sujeitos ao aquecimento com cido ntrico concentrado (Filho et all, 2009).

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1.1.OBJECTIVOS
1.1.1. Gerais

Determinar a quantidade da casena em percentagem por massa na amostra de leite fresco

ULTRAMEL.

1.1.2. Especficos

Isolar e identificar experimentalmente a casena na amostra de leite fresco ULTRAMEL.

Identificar a casena pela anlise qumica, usando vrios testes qumicos.

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2. PARTE EXPERIMENTAL
2.1.Materiais e equipamentos
Para a determinao da casena, foram utilizado os materiais e equipamentos listados na tabela 1:

Tabela 1: Materiais, equipamento, reagentes e amostra analisada

Materiais
Vareta de vidro

Balo de erlenmeyer de 150 mL.

Esptula

Pina

Papis de filtro (Whatman, 150mm , cat

1113150)

Tubos de ensaio
Equipamentos
Balana analtica (Denver Instrument, XL-610; Max= 610g, e Termmetro
=0.01g)
Manta elctrica (electromantle, 300W, 50/60Hz, serie 10072015)
Reagentes
Albumina 2%

Gelatina 2%

Acido actico 10%

Leite fresco

NaOH 10%

ter dietilico-cetona 1:1

CuSO4

HNO3 (conc)

Etanol 95%

Ninidrina

Pb2+ como Pb(NO3)2

Leite fresco (Ultramel)

Hg2+ como HgCl2

Na+ como NaNO3

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3. PROCEDIMENTOS
3.1.Isolamento e Identificao Da Casena
1. Em um Erlenmeyer de 250 mL, introduziu-se 50g de leite fresco Ultramel 125 mL de gua
destilada, aqueceu-se o frasco em banho de gua e agitou-se a soluo com uma vareta de
vidro;
2. Quando a temperatura do banho alcanou 40c, valor lido com ajuda do termmetro,
removeu-se o frasco do banho e adicionou-se uma certa quantidade de cido actico 10%
agitando, necessrio para a formao do precipitado. Evitou-se o acrscimo de excesso de
cido actico, de modo a evitar a hidrlise da lactose que resultaria em galactose e glucose;
3. Filtrou-se o precipitado a vcuo e lavou-se com pequeno volume de gua. Em seguida
transferiu-se para um frasco vazio;
4. Adicionou-se 25mL de etanol 95% ao frasco, aps a agitao da mistura por 5 minutos,
deixou-se o precipitado em repouso e em seguida decantou-se o lquido, o qual contm as
gorduras e albuminas para um Bquer;
5. Ao resduo adicionou-se 25 mL da mistura de ter dietlico-etanol 1:1 e aps a agitao da
mistura resultante por 5 minutos, colectou-se o slido por filtrao a vcuo e transferiu-se
para um papel de filtro previamente pesado numa balana analtica, o qual deixou-se a
secar ao ar durante 2 dias. E depois pesou-se a casena seca

3.2.Anlise qumica da casena

a. Teste de Biureto
Colocou-se 15 gotas de cada uma das seguintes substncias em cinco tubos de ensaios limpos e
rotulados:

Gelatina 2%

Albumina 2%

Casena isolada (1- 100mg/mL H2O)

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Em cada um dos tubos adicionaram-se 5 gotas de NaOH 10% e 2 goras de soluo de CuSO4 com
agitao.
b. Teste de ies de metais pesados
Colocou-se 2 mL de leite em 3 tubos de ensaio rotulados. Adicionaram-se algumas gotas de cada
uma das solues dos seguintes ies, na seguinte ordem:

Pb2+ como Pb(NO3)2 no tubo 1.

Hg2+como HgCl2 no tubo 2.

Na+como NaNO3 no tubo 3.

c. Teste de xantoprotena
Colocou-se 15 gotas de cada uma das seguintes substncias em cinco tubos de ensaios limpos e
rotulados:

Gelatina 2%

Albumina 2%

Casena isolada (1- 100mg/mL H2O)

A cada um dos tubos, adicionaram-se 10 gotas de HNO3 concentrado com agitao. Aqueceu-se
os tubos em banho de gua quente.

4. RESULTADOS E INTERPRETAO
4.1.Isolamento e Identificao Da Casena
Clculo do teor da casena
Dados
Peso da amostra W1 = 50.09g

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Peso do papel de filtro vazio W2 = 3.70g

Peso do papel de filtro com a casena seca W3=5.32g
Frmula e resoluo
% =

3 2
100
1

% =

5,32 3,70
100% = 3.23%
50,09

A partir do resultado obtido pode se considerar que em 50.09g da amostra de leite analisada,
existem 3.23% da casena e 97.77% de outros coinstituentes como carbohidratos, sais minerais
lpidos fibras e outros nutrientes. Tambm pode se constatar que em 50.09 gramas, cerca 1.61
gramas corresponde a casena e 48.39 gramas de outros nutrientes. De acordo com Nicolini, 2008,
a quantidade de casena no leite fresco deve ser de 3%, porm o valor obtido da casena (3.23%),
pode ser explicado pelo facto de ocorrido erro durante a pesagem da casena.

Anlise qumica da casena

1. Teste de biureto
Soluo testada

Cor Observada

Resultado

Gelatina

Azul carregado

Negativo

Albumina

Prpura-violeta

Positivo

Casena isolada

Azul

Negativo

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2. Teste de ies de metais pesados

Soluo testada

Observao

Resultado

Pb(NO3)2

Formao do precipitado

Positivo

HgCl2

Formao do precipitado

Positivo

NaNO3

No formou precipitado

Negativo

3. Teste de xantoprotena
Soluo testada

Cor Observada

Resultado

Gelatina

Incolor

Negativo

Albumina

Amarelo claro

Positivo

Casena isolada

Precipitado amarelo

Positivo

No teste de biureto, a soluo da albumina inicialmente possua uma cor turva, e aps a adio da
soluo de sulfato de cobre a soluo apresentou uma nova colorao prpura-violeta que mostra
a presena de protenas com uma sequncia de aminocidos, e que possui grupos solveis em
solues salinas.

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No teste de ies de metais pesados, no primeiro tubo onde continha a soluo de Pb(NO3)2, ocorre
a formao de precipitado, e na soluo Hg(NO3)2 h formao de precipitado gelatino, o que
mostra a presena de metais pesados e na soluo NaNO3 no houve a formao de precipitado,
mostra-nos ausncia de metais leves como o sdio.
No teste de xantoprotena, com a adio do HNO3 no houve mudana nenhuma, posteriormente
aquecidos os tubos de ensaio ocorrera mudanas de cor em dois tubos de ensaio contendo solues
de albumina e casena que houve tambm a formao de precipitado. A colorao das solues
mostrou-nos a presena de aminocidos com anis aromticos a citar: triptofano, histidina,
perolina, fenilalanina e hidroxipirolina.

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5. CONCLUSO
Neste trabalho laboratorial, foi possvel isolar a casena do leite fresco, 3.23% foi o valor obtido e
mostra se satisfatrio, pois a quantidade da casinha no leite fresco deve ser 3% ou aproximado. O
mtodo usado no especfico para o isolamento da casena, pois neste processo pode se isolar
algumas protenas com caractersticas similares a da casena bem com algumas gorduras.
Com relao ao teste de anlise qumica da casena conclui-se que possvel determinar a presena
de metais pesados no leite fresco, de protenas e presena de aminocidos com anis aromticos
em soluo com o auxlio de alguns testes qumicos conhecidas, bem como a natureza de alguns
aminocidos presentes nestas protenas. possvel identificar as protenas como molculas
carregadas e reconhecer os factores ligados a solubilidade das protenas em gua.

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REFERNCIAS BIBLIOGRFICAS
Filho, F. R.; Freitas, W. R.; Lima, R. S.; Da Silva, M. S.; Lima, R. T.; Souza, H. B.; Lima,
V. A. (2009). Avaliao do Teor de Casena e Albumina no Leite de Vacas da Raa
Girolanda. Revista Brasileira deTecnologia Agroindustrial. ISSN: 1981-3686. Vol.. 03
(01). 42-48pp.
Palma,J.K., Andrade. A.A., Marsico. E. T., Semaan. F. S., Marques. F. F., Netto. A. D. P.,
Comparao entre mtodos clssicos para determinao de protenas em soro de leite
bovino. Sociedade Brasileira de Qumica (SBQ).

Nicolini, C.(2008). Leite em p. Tese de Bacharelado em Qumica de Alimentos da

Universidade Federal de Pelotas.
Sgarbieri, V. C. (2005). Review: Structural and Physicochemical Properties of Milk
Proteins. Brazilian Journal Food Technology. Vol.8 (01). 43-56pp
Vicenzi, R. Apostila de Bromatologia. Brasil. pp 28-31.

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