Analise comunidade microbiana via sequenciamento do gene 16S rRNA

O DNA foi extrado a partir de cada amostra de pradaria nativa utilizando o mtodo descrito no
Fierer et al. (12). Resumidamente, extraiu-se DNA a partir de 0,25 g replicar duas sub-amostras a
partir de cada um dos 31 solos, utilizando o estojo de extraco de ADN Mobio PowerSoil
modificado com um passo de incubao adicional a 65 C durante 10 min (38). As concentraes
de ADN foram determinadas atravs de PicoGreen fluorometria.
Para avaliar a diversidade e composio da comunidade bacteriana encontrada em cada um dos 31
solos, utilizou-se o protocolo descrito no Fierer et al. (12). As amplificaes de PCR foram
realizadas em reaces em triplicado para cada uma das 31 amostras de DNA com a 515f / 806r
conjunto de iniciadores que amplificam a regio V4 / V5 do gene de rRNA 16S. O conjunto de
primers foi projetado para amplificar com alguns preconceitos contra qualquer taxa individual
[incluindo os membros do Verrucomicrobia, que muitos primers pr-existentes so tendenciosos
contra (23, 39)]. Alm disso, o conjunto de iniciadores foi desenhado como alvo uma regio do
gene de ARNr 16S que fornece informaes taxonmica exacta (40). Os iniciadores continham os
adaptadores 454 e o iniciador inverso continha um cdigo de barras de correco de erro de 12 pb
exclusivo para cada amostra. As reaces foram compostas em triplicado e os produtos de
amplificao de todas as amostras foram analisadas em conjunto em concentraes equimolares. A
sequenciao foi realizada em um sistema GS FLX + 454 (Roche) executando a qumica de titnio
em EnGenCore (Universidade da Carolina do Sul).
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Dados da seqncia do gene 16S rRNA Raw foi processada utilizando QIIME v.1.4.0 (41) para
demultiplex as sequncias, sequncias de fragmentao em filotipos que compartilham 97% de
semelhana de sequncias, e fornecer atribuies taxonmicos a estes filotipos. Os parmetros
padro foram usadas em todos os casos, excepto que para atribuir taxonomia, o classificador RDP
(42) foi utilizado com a libertao de Fevereiro de 2011 da base de dados GreenGenes (43), e uma
confiana mais baixo valor de bootstrap de 0,5 foi fornecido para o classificador. Todos os dados
foram rarefeito para 940 sequncias por amostra antes da anlise a jusante. Este nvel de
profundidade sequenciamento foi previamente mostrado ser suficiente para resolver as diferenas
na estrutura da comunidade bacteriana dentro e entre os tipos de solo (12, 38). Alpha diversidade foi
calculada como o nmero de filotipos por amostra ou ndice de diversidade de Shannon.
Diversidade Beta foi calculada usando a dissimilaridade Bray-Curtis mtrica com os padres de
diversidade beta visualizadas atravs de coordenadas principais anlises como implementado no
Primer (44). Todos os dados amplicon tenham sido depositados no Arquivo Europeia Nucleotide
(ERP003610).