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30.04.2010
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1. INTRODUCCIN
1.1 Curva de crecimiento
Tomando como ejemplo un cultivo que est creciendo en un matraz agitado (cultivo
batch), normalmente se observarn estas cuatro fases de crecimiento. En primera
instancia las clulas en fase de latencia (procedentes de un cultivo anterior o pre-inculo)
no crecen enseguida, ya que deben adaptarse al nuevo medio antes de comenzar a
crecer a un ritmo exponencial. Durante esta fase, aunque no ocurra divisin celular, las
clulas pueden estar creciendo en tamao y volumen, sintetizando protenas, enzimas,
ARN, entre otras molculas. En sntesis, aumentando su actividad metablica. La
duracin de esta fase de latencia depende de numerosos factores, como por ejemplo la
edad del inculo, la cantidad de pre-inculo agregado, de la temperatura del medio, de la
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concentracin de nutrientes tanto del cultivo antiguo como del nuevo, de la aireacin del
cultivo y de la concentracin de toxinas que pueden haberse formado en el cultivo
antiguo. Es as como, si los medios de cultivo antiguo y nuevo presentan grandes
diferencias en su composicin, la fase de latencia se har ms extensa.
Una vez que las clulas se encuentran adaptadas, estas comienzan a dividirse
rpidamente, lo que da inicio a la fase de crecimiento exponencial. En esta fase, las
clulas se dividen a una tasa constante y caracterstica de su especie. Es as como se
pueden utilizar algunos parmetros para caracterizar el crecimiento del microorganismo
durante esta fase. Uno de ellos es la velocidad especfica de crecimiento ( con unidades
t-1) y el otro es el tiempo de duplicacin (tD con unidades t). Estos parmetros se puede
relacionar por medio de la expresin =ln2/tD. Como se mencion anteriormente, estos
parmetros son propios de cada especie microbiana, adems dependen del medio en el
cual se est desarrollando el microorganismo.
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Recuento Celular
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Turbidimetra
Generalmente los medios de cultivo son lquidos transparentes que dejan atravesar la luz.
Sin embargo, al aumentar el nmero de clulas o biomasa, estos lquidos comienzan a
adquirir
turbidez
la
cual
puede
cuantificarse
por
turbidimetra,
colorimetra
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).
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo general
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3. ACTIVIDADES
3.1 Construir la curva de crecimiento de la levadura S. cerevisiae en un medio YPD
utilizando espectrofotometra.
3.2 Caracterizar la fase de crecimiento exponencial por medio de los parmetros y t D.
3.3 Utilizar la cmara de Neubauer para realizar el conteo de levaduras y posteriormente
calcular la viabilidad celular.
3.4 Medir el consumo de glucosa por medio del uso del kit GOD-PAP. Determinar el
rendimiento de glucosa.
4. MATERIALES
Cultivo de levadura Saccharomyces cerevisiae, medio de cultivo (YPD), cmara de
Neubauer, solucin de azul de metileno (0,02%), cubetas de espectrofotmetro, tubos
eppendorf, micropipetas, vasos prcipitados, pizetas con agua destilada, alcohol 70%,
papel absorbente, kit GOD-PAP para medicin de glucosa.
5. PROCEDIMIENTOS
Se tendrn dos puntos de la curva de crecimiento por cada grupo de trabajo. Estas
muestras correspondern a medio de cultivo con levaduras en suspensin obtenidas a
diferentes tiempos de cultivo.
5.1 Construccin de la curva de crecimiento por medio de espectrofotometra
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2. Tomar 1mL de medio de cultivo YPD sin levaduras y depositarlo en una cubeta de
espectrofotometra. Esta cubeta se utilizar como blanco.
1. Tomar una muestra de 50L de muestra del cultivo y mezclarlo con 50L de azul de
metileno. Para tiempos avanzados de incubacin, realizar diluciones con medio YPD
antes de mezclar con el colorante. No olvide corregir por el factor de dilucin cuando
realice los clculos.
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Donde:
C: Concentracin celular [cl/mL]
x: Promedio clulas contadas en la cmara
FD: Factor de dilucin utilizado.
5. Calcular la viabilidad celular por medio de la frmula
1. Tomar 50L de muestra y mezclarlo en un tubo eppendorf con 1mL de reactivo GODPAP. Se debe tener en consideracin que la linealidad del kit es hasta
concentraciones de glucosa de 700mg/dL. Si considera que su muestra superar este
valor, diluya las veces que considere pertinente. No olvide corregir su valor de
absorbancia por el factor de dilucin utilizado.
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