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El control de calidad de los alimentos es un tema de mucho interés en nuestro medio, ya que la salud pública está implicada, hay diferentes fuentes bibliográficas que indican que el riesgo de sufrir alguna enfermedad producida por la ingesta de alimentos contaminados es real en nuestra sociedad. Algunas de esta bacterias que podrían encontrase en los alimentos son: Salmonella spp, Salmonella entérica, Listeria spp, Listeria Monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni, Cronobacter sakazakii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc.
El control de calidad de los alimentos es un tema de mucho interés en nuestro medio, ya que la salud pública está implicada, hay diferentes fuentes bibliográficas que indican que el riesgo de sufrir alguna enfermedad producida por la ingesta de alimentos contaminados es real en nuestra sociedad. Algunas de esta bacterias que podrían encontrase en los alimentos son: Salmonella spp, Salmonella entérica, Listeria spp, Listeria Monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni, Cronobacter sakazakii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc.
El control de calidad de los alimentos es un tema de mucho interés en nuestro medio, ya que la salud pública está implicada, hay diferentes fuentes bibliográficas que indican que el riesgo de sufrir alguna enfermedad producida por la ingesta de alimentos contaminados es real en nuestra sociedad. Algunas de esta bacterias que podrían encontrase en los alimentos son: Salmonella spp, Salmonella entérica, Listeria spp, Listeria Monocytogenes, E. coli O157:H7, Campylobacter jejuni, Cronobacter sakazakii, Pseudomonas aeruginosa, Staphylococcus aureus, etc.
realiza mediante la deteccin directa e indirecta de los agentes infecciosos. Mediante los mtodos directos se detectan las partculas de los agentes infecciosos y/o sus componentes, tales como los cidos nucleicos, las protenas estructurales y no estructurales, los enzimas, etc. Los mtodos indirectos ponen de manifiesto los anticuerpos inducidos por las infecciones. Los mtodos ms comunes de deteccin directa son: el aislamiento o el cultivo in vitro, la microscopa electrnica, la inmunofluorescencia, la inmunohistoqumica, el enzimoinmunoensayo (ELISA para antgenos), la hibridacin de cidos nucleicos (NAH), las micromatrices y macromatrices y las diversas tcnicas de amplificacin de cidos nucleicos, tales como la reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) o los mtodos de amplificacin isotrmica, como por ejemplo la amplificacin basada en la secuencia del cido nucleico (NSABA), la amplificacin isotrmica mediada por bucles (LAMP). Tambin se denominan mtodos de diagnstico molecular, puesto que los ensayos de NAH, de macro y micromatrices y los
diversos ensayos de amplificacin tienen como objetivo
las molculas de cidos nucleicos. Los mtodos indirectos ms comunes de deteccin del agente infeccioso son las pruebas serolgicas tales como: la neutralizacin vrica, la deteccin de anticuerpos mediante el ELISA y las pruebas de inhibicin de la hemoaglutinacin,a las que se han incorporado otras ms novedosas, tales como el mtodo de los biosensores, la bioluminometra, el mtodo de la fluorescencia polarizada, los ensayos de quimioluminiscencia, etc. En general, los laboratorios de diagnstico aplican simultneamente los dos mtodos para garantizar un diagnstico seguro. Las experiencias de las dos ltimas dcadas indican que las tcnicas de la PCR finalmente sustituirn a muchos de los mtodos directos clsicos de deteccin de agentes infecciosos. Est claro que la PCR est reemplazando el aislamiento de virus o el cultivo de bacterias para la deteccin de agentes que son difciles o imposibles de cultivar. Hay varias razones para esta tendencia, teniendo en cuenta que el aislamiento de los virus requiere: i) la presencia de los microorganismos que se replican (virus o bacterias); ii) cultivos celulares caros y el mantenimiento de las
instalaciones; iii) hasta varias semanas para completar
el diagnstico en algunas ocasiones; y iv) una pericia especial, que se est perdiendo o disminuyendo hoy en muchos laboratorios. Aunque los ensayos de la PCR inicialmente eran caros y engorrosos, hoy en da son herramientas relativamente baratas, seguras y fciles de utilizar en los laboratorios de diagnstico (2, 4, 6, 7, 11, 13). Generalmente, la sensibilidad y la especificidad de la PCR son mayores que los procedimientos ELISA de captura del antgeno. La introduccin de varios mtodos de la PCR en tiempo real, de robots para la extraccin del cido nucleico y de estaciones de trabajo automatizadas ha dado como resultado hoy en da a un gran volumen de trabajo y a ensayos muy fiables, rpidos y slidos para el diagnstico molecular .
1.
Principios de la tcnica de PCR
La reaccin en cadena de la polimerasa (PCR) implica
que en el ensayo hay una reaccin de amplificacin basada en enzimas. El trmino "reaccin en cadena" se refiere a varios ciclos de copiado de un tramo
especfico de ADN, en este caso a partir del genoma
del agente infeccioso. La regin que hay que amplificar est definida por dos (o ms) secuencias de nucletidos cortos denominados sitios de los cebadores, que flanquean a la secuencia diana. Los cebadores, oligonucletidos cortos que son complementarios a los sitios de los cebadores, se unen a las hebras de ADN para ser copiadas. Utilizando una polimerasa que no se desnaturalice durante el ciclo de calentamiento, es posible copiar la secuencia diana uniendo los nucletidos libres a los cebadores. Repitiendo el rgimen de ciclos de calentamiento de 20 a 40 veces, la cantidad de ADN diana copiado que se obtiene aumenta de forma exponencial, produciendo suficiente para operaciones posteriores, tales como la deteccin, la clonacin y la secuenciacin. La sensibilidad de diagnstico de la PCR es muy alta, porque se producen varios millones de copias de la diana seleccionada. La especificidad de la reaccin puede ser tambin muy alta, ya que est determinada por las secuencias especficas de nucletidos de la diana seleccionada, as como por el diseo del cebador. Los cebadores pueden disearse para detectar secuencias especficas de nucletidos en los genomas de los agentes infecciosos diana
seleccionados o pueden disearse para ser
complementarios de regiones ms conservadas, permitiendo de este modo la deteccin de miembros dentro de una familia o gnero del agente infeccioso. Se ha publicado una sinopsis ms detallada de las tcnicas moleculares (17). a)
Amplificacin del ADN
Si el genoma del agente infeccioso es de ADN, la amplificacin se realiza directamente, con o sin purificacin previa del ADN diana. En muchos casos el empleo de ADN extrado y purificado del material que se va a utilizar en la prueba, dar como resultado un aumento en la sensibilidad analtica y diagnstica.
Amplificacin del ARN (PCR de trascripcin
inversa) b)
Los genomas de muchos agentes infecciosos
contienen cido ribonucleico (ARN) que no se puede amplificar directamente mediante la PCR. Para la amplificacin por PCR se necesita un ADN diana monocatenario, y ste no est disponible en los virus de ARN. El problema puede resolverse por la
adicin de una etapa antes de comenzar la PCR.
Utilizando la transcriptasa inversa, el ARN se puede transcribir a ADN complementario (ADNc), que es ADN de doble cadena y, por tanto, se puede usar en el ensayo de la PCR (el procedimiento se denomina PCR de trascripcin inversa: RT-PCR). Tradicionalmente, la reaccin de trascripcin inversa se realiza en un tubo aparte y el ADNc producido se transfiere despus a un tubo nuevo para la reaccin de la PCR. Sin embargo, ya se dispone de polimerasas de ADN termoestables con actividad transcriptasa inversa y tampones especficos en los cuales las polimerasas RT y ADN estn activas. Ambas permiten una reaccin RT-PCR que tiene lugar en el mismo tubo en secuencia directa sin manipulacin adicional y con menos probabilidad de seguir contaminando. En la mayora de los casos ser necesario extraer y purificar el ARN antes de la trascripcin inversa. c)
Deteccin del amplmero por la PCR
El producto PCR o amplmero puede detectarse utilizando varios procedimientos. El ms comn incluye la deteccin no especfica del producto de la PCR, basada en una medida amplmera utilizando
electroforesis en gel de agarosa y tiendo el ADN
con un tinte intercalado no especfico, como el bromuro de etidio (ahora es posible reemplazar este ltimo con tintes no cancergenos, por ejemplo GelRed, o el reconocimiento especfico de la secuencia diana amplificada utilizando una transferencia de ADN por Southern blot seguido de hibridacin con sondas de oligonucletidos complementarias de la secuencia diana. Las sondas de hibridacin pueden ser, enzima, marcado como quimioluminiscente o radionucletido para permitir la deteccin de la secuencia diana especfica. Ms adelante se dan algunos ejemplos de mtodos de la PCR utilizados actualmente. 2.
PCR convencional
En la "PCR convencional" (o simplemente PCR) se
utiliza un par de cebadores oligonucletidos para amplificar una parte pequea del genoma del agente infeccioso. La sensibilidad analtica es relativamente alta con un nmero mnimo de 100 a 1000 copias de ADN diana detectable. La especificidad analtica puede ser alta, dependiendo de la seleccin de la diana, del cebador designado, y de la optimizacin de la prueba.
La sensibilidad y especificidad analticas se pueden
mejorar mediante la aplicacin de la PCR anidada (vase ms adelante el punto 3). La especificidad y la sensibilidad se pueden mejorar posteriormente utilizando el mtodo Southern blot seguido de las sondas de hibridacin, pero esto lleva mucho tiempo y requiere el manejo en el laboratorio de ADN amplificado, y la interpretacin de los resultados puede ser tcnicamente subjetiva. Esta deteccin de los mtodos, basada en la complejidad y los gastos, no es una prctica comn hoy en da en los laboratorios de diagnstico. 3.
PCR anidada
En los ensayos de la PCR anidada se utilizan dos
ciclos de amplificacin con cuatro cebadores, denominados cebadores externos e internos. En general, los ensayos de la PCR anidada proporcionan una sensibilidad y especificidad analticas superiores si se comparan con las pruebas de la PCR convencionales. Sin embargo existe un alto riesgo de contaminacin cruzada dado que los productos de la primera tanda de amplificacin se utilizan a menudo como molde inicial para la segunda tanda, dando como
resultado la transferencia de material entre los
diferentes tubos de PCR. La PCR anidada ha sido ampliamente reemplazada por los protocolos de la PCR en tiempo real, los cuales son igualmente sensibles, pero tienen un riesgo de contaminacin mucho menor. La sensibilidad analtica es tpicamente <10 copias de genoma del agente infeccioso, y la especificidad analtica tambin aumenta porque, en la PCR anidada, cuatro oligonucletidos tienen que unirse especficamente a las dianas seleccionadas para producir una reaccin positiva (4). 4.
PCR en tiempo real
La PCR en tiempo real difiere de la PCR estndar. Aqu
los productos de la PCR amplificados son detectados directamente durante los ciclos de amplificacin utilizando sondas de hibridacin que incrementan la especificidad del ensayo. Diversos mtodos en tiempo real, tales como los ensayos que se realizan con las sondas fluorescentes TaqMan, los cebadores Scorpion, la transferencia de energa fluorescente mediante resonancia (FRET), la transferencia de energa con cebadores-sondas (PriProET), la tcnica del fluorforo SybrGreen, la tcnica Light- Upon-extension (LUX) y los ensayos con baliza molecular (Molecular Beacon)
se han convertido en herramientas con mucha
aceptacin para la deteccin de agentes infecciosos. La PCR en tiempo real se ha utilizado para la deteccin de bacterias, virus o parsitos de una amplia variedad de especies animales (2, 4, 14, 17). Estos ensayos tienen varias ventajas comparados con los mtodos "clsicos" de la PCR convencional o anidada. En general, slo se utiliza un par de cebadores, presentando, a menudo, una sensibilidad prxima o igual a la PCR anidada tradicional, pero con un riesgo mucho ms bajo de contaminacin. La fluorescencia, que indica la presencia del producto amplificado, se mide a travs de la tapa o del lado del tubo de reaccin, de forma que no es necesario el manejo posterior de los productos de la PCR. Estos procedimientos llevan considerablemente menos tiempo si se compara con la deteccin tradicional de los productos de la PCR en geles de agarosa, seguidos de la tincin con bromuro de etidio o el equivalente a la tincin de deteccin del ADN con lo que, de nuevo, se reduce el riesgo de contaminacin. El empleo de la modalidad de placa de microtitulacin de 96 pocillos, sin la necesidad de la PCR anidada, permite que el procedimiento sea automtico y apropiado para pruebas a gran escala (10, 17). El diagnstico se
puede automatizar posteriormente utilizando robots
para las extracciones de ADN/ARN y el pipeteo. En comparacin con los mtodos clsicos, una ventaja adicional de la tcnica de la PCR en tiempo real, es que es posible realizar ensayos cuantitativos (6, 7). Utilizando la PCR en tiempo real, el tiempo de diagnstico puede acortarse de horas a minutos. La PCR en tiempo real tambin puede utilizarse para la PCR de trascripcin inversa, usando protocolos de una etapa, que permiten que la etapa de la RT y la PCR tengan lugar en el mismo tubo durante el mismo protocolo de la PCR (17). 5.
PCR mltiple
Se denominan pruebas de PCR mltiple a las PCR que
utilizan cebadores mltiples dirigidos a diferentes dianas en un nico ensayo. En la PCR mltiple se pueden detectar y diferenciar de forma simultnea varios agentes infecciosos en un nico tubo de reaccin individual. Los diferentes PCR diana amplificados en una prueba estndar de PCR se identifican basndose en el tamao del producto de la PCR. El empleo de los mtodos de la PCR anidada "clsica" para la construccin de un ensayo mltiple resulta complicado debido a la necesidad de dianas de
diferentes tamaos, as como de cebadores que
puedan "competir" entre s en la misma mezcla reactiva, todo lo cual puede repercutir negativamente en la eficacia de la PCR. Por el contrario, el concepto de la PCR en tiempo real (pares de cebadores nicos) proporciona excelentes posibilidades para la construccin de sistemas mltiples muy sensibles (2, 4, 9) basados en un tamao ms uniforme de la diana, en unas condiciones de amplificacin uniformes y en la deteccin por separado de las dianas utilizando sondas de hibridacin especficas marcadas con fluorforos diferentes. Tambin debera advertirse que los cebadores comunes pueden utilizarse para amplificar regiones especficas del genoma de un grupo de patgenos y despus pueden emplearse las sondas fluorognicas (TaqMan) para discriminar entre los miembros del grupo. Esta no es estrictamente una PCR mltiple, aunque podra describirse errneamente como tal. 6.
Mtodos adicionales de diagnstico molecular
Aunque este captulo se centra en el diagnstico
molecular basado en la PCR, debera mencionarse brevemente que, adems de la PCR, se estn introduciendo muchos otros mtodos nuevos para la
deteccin molecular de los patgenos, por ejemplo,
varios mtodos de amplificacin isotrmica (tales como la amplificacin basada en la secuencia del cido nucleico [NASBA], tecnologas para la amplificacin isotrmica mediada por bucles, varias macromatrices y micromatrices utilizando sondas-candado, amplificacin de ciclos rodantes y otros enfoques moleculares. Se estn evaluando otros enfoques para detectar y analizar los productos de la PCR, tales como MALDI y LUMINEX. La ventaja de estos enfoques, en combinacin con la PCR mltiple, es que se hace posible la tipificacin de diferentes cepas o tipos a partir de un microorganismo. Es evidente que el arsenal de diagnsticos moleculares se est reforzando con estos mtodos.
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