PRACTICA N 2

MATERIALES Y EQUIPOS DE LABORATORIO DE MICROBIOLOGIA

I.

INTRODUCCIN:
Se utiliza una serie de equipos y materiales de los cuales es necesario
conocer como se lo utiliza y de qu manera funciona. Se usa ms el
material de vidrio porque no participa en la reaccin y tiene
especificaciones para usarlo adecuadamente.

II.

OBJETIVOS:
Reconocer los equipos y cada uno de los materiales.
Conocer su definicin para el uso adecuado de cada uno.

III.

MATERIALES Y EQUIPOS:
MICROSCOPIO:
El microscopio se emplea para aumentar o ampliar las imgenes
de objetos y organismos no visibles a simple vista. Se trata de un
instrumento ptico que contiene una o varias lentes que permiten
obtener una imagen aumentada del objeto y que funciona por
refraccin. El microscopio ptico puede ser monocular, binocular.
La observacin en estos casos se hace con un solo ojo. Es binocular
cuando posee dos tubos. La observacin se hace con los dos ojos.
Esto presenta ventajas tales como mejor percepcin de la imagen,
ms cmoda la observacin y se perciben con mayor nitidez los
detalles.

 Autoclave:
Es el equipo ms utilizado para la esterilizacin mediante calor
hmedo. Se realiza en al autoclave durante 15 20 min, segn el
volumen, a 115C 121C, segn la naturaleza del material que se
desee esterilizar.
Auto-clavado: es un procedimiento en el que se emplea vapor a
presin (a 1 atmsfera). Como tiene gran poder de penetracin la
temperatura y el tiempo utilizado son menores que los que se
emplean con el horno Pasteur (121 C, 15-20 minutos).

 Horno de Pasteur:
Emplea altas temperaturas (160-180 C) durante un tiempo
prolongado (1.5 a 3 horas). Debido a su poca capacidad de
penetracin se usa para esterilizar vidrio y metales. Acta
principalmente
desnaturalizando
las
protenas
y
secundariamente oxidando los compuestos celulares.

Estufa o incubadora:
Es una cmara de temperatura controlada para cultivo de
microorganismos.
Se utiliza para facilitar el desarrollo de los microorganismos a su
temperatura ptima de crecimiento (generalmente 35-37).

 Frigorfico o cmaras refrigeradas:

Se utilizan para conservar tanto materiales (medios de cultivo,
reactivos) como microorganismos generalmente estn a una
temperatura fija de 4C.

La balanza:
Se usa para pesar colorante, componentes de medio de cultivo,
animales, etc.

 Bao mara:
Tienen salida de aire presentan un termostato que regula la
temperatura del agua presenta un piso para colocar los
materiales que se desea.

Bomba de vaco:
Extrae molculas de gas de un volumen sellado, para crear un
vaco parcial.

Contador de colonias:
Es un aparato que mediante la iluminacin de la placa y una lupa,
nos permite observar con mayor nitidez las colonias y por tanto
facilita su recuento.

 Asas de siembra:
Se utilizan para sembrar. Pueden ser metlicas o de plstico,
curvas o rectas (para la siembra por picadura).

Portas y cubres:
Para realizar las observaciones al microscopio.

 Matraces:
Se utiliza para calentar lquidos, con poca perdida de evaporacin,
hacer titulaciones y recristalizar un slido.

Potencimetro:
Miden el pH de los medios de cultivo y de las solucione buffer.
Constituido de un par de electrodos sensible a concentraciones de
hidrogeniones, conectados a un potencimetro que indique las
mediciones, Los potencimetros emplean un electrodo de vidrio,
unido a un electrodo de calomel como estndar.

 Probetas:
Recipientes graduados de forma cilndrica y capacidad variable,
con base para la esterilidad. Pueden estar graduadas.

Pipetas:
Tubos cilndricos delgados terminados en punta, graduados al
dcimo o al centsimo de mI. Se emplean en la medicin de
pequeas cantidades de lquidos
Volumtricas, se reconocen por presentar una dilatacin bulbosa
central con unas marcas de aforamiento conocida, en el extremo
proximal angosto de la pipeta, se les llama tambin pipetas de
bola, las medidas ms conocidas son de 10, 25, 50 y 100 ml.

Pipetas Pasteur:
Confeccionados de varillas de vidrio de dimetro de 4 x 20mm de
30 40cm de longitud. La calidad de vidrio debe facilitar
reblandamientos a la accin directa de la llama del mechero,
para conseguir por estiramiento la capilaridad deseada. Se
emplea para la toma de pequeos inculos de siembra.

 Placas Petri:
Cajas cilndricas, se emplean como recipientes de medios de
cultivo para el cultivo y aislamiento de microorganismos. Las ms
usadas son las de 10, 15 20 mm x 100 mm.

Tubos:

IV.

CONCLUSIONES:
La mayora de los instrumentos usados deben pasar por el
autoclave donde son esterilizados para recin poder lavarlos y
acondicionarlos en otras palabras no es limpieza si no pasa por el
autoclave.
Todo material para darle un buen acondicionamiento debe estar
protegido del polvo el cual tambin contiene microorganismos
esto se hace al envolverle ya sea el papel Kraft, algodn al
colocarle como tapones o papel.
Adems se debe asegurar que antes de empezar a acondicionar el
material, este debe estar limpio y seco.

V.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS:

Olivares A., Escalona L. (2.005). Asesoramiento para la

Elaboracin del Trabajo Especial de Grado e Informe de Pasantias
de los Tcnicos superiores Universitarios.
Qumica 9 , Ediciones Eneva Caracas, autor: REGULO
RODRIGUEZ GIMON

PRACTICA N 3
PRCOCESO DE ESTERILIZACIN Y MEDIOS DE CULTIVO
I.

INTRODUCCIN:
La esterilizacin es un proceso a travs del que se logra la destruccin
total de los microorganismos viables presentes en un determinado
material. Este procedimiento es de gran utilidad dentro del campo
farmacutico, ya que existen muchos procesos que requieren la
utilizacin de materiales estriles. Entre stos podemos destacar: La
esterilizacin de equipos quirrgicos y otros materiales de uso mdico
con el propsito de reducir el riesgo de infecciones en pacientes. El
acondicionamiento del material (pipetas, tubos, placas de Petri, pinzas,
etc.) que va a ser utilizado en los laboratorios de microbiologa.
Tipos bsicos de medios de cultivo
Atendiendo a su estado fsico:
lquidos
semislidos
slidos
Atendiendo a su utilidad prctica:
Medios para aislamientos primarios:
Para usos generales: no selectivos, para cultivo de una amplia variedad
de organismos difciles de hacer crecer. A menudo estn enriquecidos
con materiales como: sangre, suero, Hemoglobina, FX, FV, glutamina, u
otros factores accesorios para el crecimiento de las bacterias (Agar
Sangre, Schaeadler, etc. Selectivos: (pueden ser de moderada o de alta
selectividad) se aaden sustancias que inhiban el crecimiento de ciertos
grupos de bacterias, permitiendo a la vez el crecimiento de otras.

Variando la sustancia aadidas, se vara el tipo y grado de selectividad

(Mac
Conkey,
Kanamicina-Vancomicina)
enriquecidos:
ralentizan/suprimen el crecimiento de la flora competitiva normal
potenciando el cultivo y crecimiento deseado (Selenito, medio con
Vitamina K).
Para aislamientos especializados: formulaciones nutritivas especiales
que satisfacen requerimientos de grupos especficos de bacterias,
ayudando a su identificacin (Lowenstein).
Medios para identificacin: Diferenciales: formulaciones especiales en
las que se estudian las peculiaridades fisiolgicas (nutricin y respiracin
sobre todo) especficas de las bacterias. Seleccionando los medios
adecuados se puede llegar a la identificacin de casi cualquier bacteria
(Oxidacin-Fermentacin)
II.

OBJETIVOS:
La preparacin de medios de cultivo que sern empleados con
diferentes propsitos (cultivo de microorganismos, control de
ambiente, equipos o personal, anlisis microbiolgico de
medicamentos, alimentos, etc.)
La descontaminacin de material utilizado.

III. DISCUSIN:
Condiciones generales para el cultivo de microorganismos
El desarrollo adecuado de los microorganismos en un medio de cultivo se
ve afectado por una serie de factores de gran importancia y que, en
algunos casos, son ajenos por completo al propio medio.

1- Disponibilidad de nutrientes adecuados

Un medio de cultivo adecuado para la investigacin microbiolgica
ha de contener, como mnimo, carbono, nitrgeno, azufre, fsforo y
sales inorgnicas. En muchos casos sern necesarias ciertas
vitaminas y otras sustancias inductoras del crecimiento. Siempre han
de estar presentes las sustancias adecuadas para ejercer de
donantes o captadores de electrones para las reacciones qumicas
que tengan lugar.
Todas estas sustancias se suministraban originalmente en forma de
infusiones de carne, extractos de carne o extractos de levadura. Sin
embargo, la preparacin de estas sustancias para su aplicacin a los
medios de cultivo provocaba la prdida de los factores nutritivos
lbiles.
Actualmente, la forma ms extendida de aportar estas sustancias a
los medios es utilizar peptona que, adems, representa una fuente
fcilmente asequible de nitrgeno y carbn ya que la mayora de los
microorganismos, que no suelen utilizar directamente las protenas
naturales, tienen capacidad de atacar los aminocidos y otros
compuestos ms simples de nitrgeno presentes en la peptona.
Ciertas bacterias tienen necesidades nutritivas especficas por lo que
se aade a muchos medios sustancias como suero, sangre, lquido
asctico, etc. Igualmente pueden ser necesarios ciertos carbohidratos
y sales minerales como las de calcio, magnesio, manganeso, sodio o
potasio y sustancias promotoras del crecimiento, generalmente de
naturaleza vitamnica.
Muy a menudo se aaden al medio de cultivo ciertos colorantes, bien
como indicadores de ciertas actividades metablicas o bien por sus
capacidades de ejercer de inhibidores selectivos de ciertos
microorganismos.

2- Consistencia adecuada del medio

Partiendo de un medio lquido podemos modificar su consistencia
aadiendo productos como albmina, gelatina o agar, con lo que
obtendramos medios en estado semislido o slido.
Los medios solidificados con gelatina tienen el gran inconveniente de
que muchos microorganismos no se desarrollan adecuadamente a
temperaturas inferiores al punto de fusin de este solidificante y de
que otros tienen la capacidad de licuarla.
Actualmente los medios slidos son de uso universal, por su
versatilidad y comodidad, pero hay tambin gran cantidad de medios
lquidos cuyo uso est ampliamente extendido en el laboratorio.
3- Presencia (o ausencia) de oxgeno y otros gases
Gran cantidad de bacterias pueden crecer en una atmsfera con
tensin de oxgeno normal. Algunas pueden obtener el oxgeno
directamente de variados sustratos. Pero los microorganismos
anaerobios estrictos slo se desarrollarn adecuadamente en una
atmsfera sin oxgeno ambiental. En un punto intermedio, los
microorganismos microaerfilos crecen mejor en condiciones
atmosfricas parcialmente anaerobias (tensin de oxgeno muy
reducida), mientras los anaerobios facultativos tienen un
metabolismo capaz de adaptarse a cualquiera de las citadas
condiciones.
4- Condiciones adecuadas de humedad
Un nivel mnimo de humedad, tanto en el medio como en la
atmsfera, es imprescindible para un buen desarrollo de las clulas
vegetativas microbianas en los cultivos. Hay que prever el
mantenimiento de estas condiciones mnimas en las estufas de
cultivo a 35-37C proporcionando una fuente adecuada de agua que
mantenga la humedad necesaria para el crecimiento de los cultivos
y evitar as que se deseque el medio.

5- Luz ambiental
La mayora de los microorganismos crecen mucho mejor en la
oscuridad que en presencia de luz solar. Hay excepciones evidentes
como sera el caso de los microorganismos fotosintticos.
6- pH
La concentracin de iones hidrgeno es muy importante para el
crecimiento de los microorganismos. La mayora de ellos se
desarrollan mejor en medios con un pH neutro, aunque los hay que
requieren medios ms o menos cidos. No se debe olvidar que la
presencia de cidos o bases en cantidades que no impiden el
crecimiento bacteriano pueden sin embargo inhibirlo o incluso
alterar sus procesos metablicos normales.
7- Temperatura
Los microorganismos mesfilos crecen de forma ptima a
temperaturas entre 15 y 43C. Otros como los psicrfilos crecen a
0C y los temfilos a 80C o incluso a temperaturas superiores
(hipertemfilos). En lneas generales, los patgenos humanos crecen
en rangos de temperatura mucho ms cortos, alrededor de 37C, y
los saproftos tienen rangos ms amplios.
8- Esterilidad del medio
Todos los medios de cultivo han de estar perfectamente estriles
para evitar la aparicin de formas de vida que puedan alterar,
enmascarar o incluso impedir el crecimiento microbiano normal del
o de los especimenes inoculados en dichos medios. El sistema clsico
para esterilizar los medios de cultivo es el autoclave (que utiliza
vapor de agua a presin como agente esterilizante)
La evolucin de los medios de cultivo
Podemos decir que la microbiologa empieza su verdadero desarrollo
como ciencia en el momento en que se descubre el microscopio y
comienza la observacin de los primeros microorganismos, pero es
indudable que la puesta a punto de los medios de cultivo y la
utilizacin del agar como solidificante, marcan dos importantes
puntos de inflexin en su evolucin.

Al almacenar los materiales estriles se deben tomar una serie de

precauciones, tales como:
IV. CONCLUSIONES:
Controlar el acceso a las reas de almacenamiento de materiales
estriles.
Mantener el rea de almacenamiento limpia, libre de polvo, sucio
e insectos.
Controlar la temperatura y la humedad de las reas de
almacenamiento.
La temperatura ideal debe estar por debajo de los 26C y la
humedad relativa entre 30 y 60%.
Los periodos prolongados de almacenamiento en lugares tibios y
hmedos, pueden producir condensacin de humedad sobre el
material de empaque.
Utilizar, preferiblemente, estantes cerrados para colocar el
material.
Dejar que los materiales que salen del horno o el autoclave
alcancen la temperatura ambiente antes de ser almacenados; de
esta forma se evita la condensacin dentro del empaque.

V.

REFERENCIAS:
Murray, P. 1999. Manual of Clinical Microbiology. 7th edition.
American Society for Microbiology. Washington, DC.

PRACTICA N 4
METODODOS DE SIEMBRA Y AISLAMIENTO

I.

INTRODUCCIN:
En el manejo de muestras contaminadas o cultivos mixtos en los que se
encuentran diversos microorganismos, el primer paso para proceder a
su estudio es el aislamiento, es decir la separacin de cada uno de los
posibles integrantes microbianos de la muestra.
Existen diversos mtodos para conseguir esta separacin, la mayora de
ellos basados en la inmovilizacin de las clulas microbianas en la
superficie de los medios de cultivo slidos. Al depositar una clula
bacteriana o una levadura en un punto del medio de cultivo, sta
quedar inmovilizada en ese punto y en l se reproducir por absorcin
de los nutrientes del medio. Las nuevas clulas generadas
permanecern igualmente inmviles y tras sucesivas generaciones
conformarn lo que denominamos una "colonia" que no es ms que un
montn de clulas derivadas de una sola clula madre inicial, es decir,
un clon de la bacteria o levadura depositada al sembrar. Esta colonia es
visible al ojo humano y presenta diferentes caractersticas segn el
microorganismo que la genera. Esto nos permite distinguir las
diferentes poblaciones microbianas que se encuentran en la muestra
sembrada y separarlas transfiriendo una colonia de cada tipo a un
nuevo medio de cultivo estril, a estos cultivos los consideraremos
"puros" por poseer un slo tipo de microorganismo. (El fundamento es
vlido teniendo en cuenta slo microorganismos cultivables).

II.

OBJETIVOS:
Aislar bacterias por siembra en estras.
Aprender a caracterizar bacterias por sus colonias.
Conocer las tcnicas de siembra y cultivo de bacterias.
Ser consciente de la importancia de la higiene y el cuidado en la
manipulacin de materiales biolgicos.
Conocer el instrumental de laboratorio necesario en microbiologa
y los procedimientos para su utilizacin en la siembra y
esterilizacin de cultivos

III. MATERIALES

Mechero
Asa de siembra
Placas de agar
Dilucin de rhyzobion
Incubadora

A. Aislamiento
Es la separacin de un determinado microorganismo del resto de
microorganismos que le acompaan. El mtodo ms usual es la siembra por
estra sobre un medio de cultivo solido adecuado dispuesto en una placa de
Petri.
Para ello se toma una pequea cantidad de muestra con un asa de platino y se
reparte sobre la superficie del medio de cultivo. Sobre el medio quedan
separadas e inmovilizadas las clulas bacterianas. Tras la incubacin en
condiciones adecuadas, cada clula viable origina una colonia visible resultado
de sucesivas divisiones celulares. Cada colonia bacteriana tiene unas
caractersticas determinadas en cuanto a su forma, borde, elevacin, tamao,
consistencia, etc. Los tipos de bacterias presentes en la muestra original son
visible como tipos diferentes de colonias. A partir de colonias separadas
suficientemente es posible obtener un cultivo puro de cada uno de los tipos de
bacterias presentes en la muestra original.
El xito del aislamiento, de la separacin sobre el medio de cultivo, depende de
la superficie sobre la que se ha distribuido la muestra. Es muy importante
realizar el mayor nmero de estras posible. En las primeras estras aparecern
colonias confluentes o una masa contina de microorganismos. En las estras
finales debern aparecer colonias separadas unas de otras. El aislamiento
requiere un reducido inoculo de partida. La sucesiva disminucin del tamao
de la poblacin sobre el asa (por descarga sobre el medio de cultivo) al recorrer
el medio de cultivo, debe asegurar que finalmente algunas clulas queden
suficientemente separadas (aisladas unas de otras) sobre la superficie.

Incubacin y observacin
Se llevan las placas a incubar a 37C (temperatura corporal), durante 24 horas.
Tras este perodo se recogen las placas y SIN ABRIR se observa el crecimiento
bacteriano.
B. SIEMBRA
Es el acto de colocar el material bacteriolgico en el medio de cultivo para
promover su crecimiento y desarrollo, y subsiguiente multiplicacin.
El resultado de una siembra se llama: Cultivo
Las siembras pueden ser:
- Primarias: cuando el material es inoculado en los medios por primera vez
- Secundarias: cuando el material a inocular procede de una siembra primaria

B.1. Mtodo de siembra por estra en placa

Es el mtodo ms fcil y el ms usado para obtener cultivos axnicos. Para

ello, con un asa de siembra se toma una muestra de la poblacin mixta y a
continuacin se hacen estras sobre la superficie de un medio slido
preparado en una placa Petri. Conforme se van haciendo estras en zigzag
con el asa, cada vez se van depositando en la superficie del medio de
microorganismos. A continuacin, se flamea el asa, se toca en la regin
donde se han realizado las ltimas estras y se contina la siembra con la
misma tcnica, en la superficie de medio sin sembrar an. Repitiendo este
proceso varias veces se logra separar clulas individuales. A continuacin,
las placas se incuban en un lugar adecuado, permitiendo que las clulas
aisladas experimenten un nmero suficiente de divisiones para formar
colonias visibles. Aunque cada colonia posiblemente representa un clon
derivado de una sola clula, no podemos asegurarlo. Quizs, dos clulas
quedaron depositadas tan juntas que han originado una nica colonia
mixta. Por tanto, para asegurarnos de que hemos obtenido un cultivo
axnico, conviene repetir el procedimiento a partir de una colonia bien
aislada en la primera placa. Las colonias que se desarrollen la segunda vez,
sern, casi con toda seguridad, cultivos axnicos.

Medio de cultivo: agar base inclinado

Instrumento: asa o aguja bacteriolgica

B.2. Mtodos de vertido en placa y extensin en placa

En estos mtodos, las suspensiones de clulas microbianas se diluyen antes

de su siembra en placa.
Se siguen estas tcnicas cuando la muestra contiene tantos
microorganismos, que la dilucin no se puede realizar en una sola etapa.
Por ejemplo, una suspensin con mil millones de clulas por mililitro debe
ser diluida 10 veces para obtener una suspensin con un centenar de
clulas por mililitro, Por tanto, se realizan diluciones seriadas (en varias
etapas), normalmente de diez en diez, pero a veces de cien en cien.
Para realizar diluciones de diez en diez, se aade 1 ml de la suspensin
bacteriana a 9 ml (de medio estril o solucin salina, igualmente estril. Se
agita vigorosamente para diluir las clulas y el proceso se repite cuantas
veces sea necesario. A continuacin, se puede proceder de dos maneras
diferentes.
En el mtodo de vertido en placa, las muestras diluidas se mezclan con

agar fundido y se vierten en placa. Algunas colonias quedarn embebidas

en el agar y otras crecern en la superficie. Las colonias superficiales se
extendern y sern ms grandes.
En el segundo mtodo (extensin en placa), las muestras diluidas se
siembran directamente en la superficie de la placa de agar, extendindolas
con ayuda de un asa de Diralsky de cristal estril. La suspensin se absorbe
en el agar, dejando las clulas microbianas sobre la superficie. En ambas
tcnicas las placas se incuban hasta la aparicin de las colonias. Como en el
mtodo de siembra por estra, no existe la seguridad de que las colonias
que aparecen en las placas sembradas por extensin o en el agar
solidificado sembrado por el mtodo del vertido en placas sean cultivos

axnicos hasta que se repita el proceso. Las dos tcnicas de siembra por
dilucin presentan la ventaja de que permiten obtener un mayor nmero
de colonias aisladas que el mtodo de siembra por estra, por tanto se
eligen cuando se ha de seleccionar una cepa a partir de una mezcla con
varios tipos de microorganismos. Para obtener un cultivo axnico mediante
este mtodo:
Hacer diluciones seriadas de la suspensin bacteriana hasta obtener
una muestra con slo unos pocos cientos de bacterias.
verter la muestra en un tubo con agar a sobrefusin, mezclar y verter
el contenido en una placa Petri.
Despus de la incubacin, se desarrollan colonias en el agar (ms
pequeas) y en su superficie (ms grandes).
Mtodo de aislamiento por siembra por estra en placa, Para obtener un
cultivo axnico:
Esterilizar un asa de siembra por flameado en la llama de un
mechero.
Introducirla en la suspensin bacteriana para recoger una muestra.
sembrar haciendo estras sobre la superficie de un medio slido en
una placa Petri.
volver a esterilizar el asa, tocar en la zona de la placa ya sembrada y
hacer un segundo grupo de estras en una regin nueva de la placa.
Repetir el proceso una tercera y una cuarta vez, hasta conseguir que
los grupos de clulas se diluyan y se separen clulas aisladas.
Despus de la incubacin, se desarrollan colonias aisladas. Para estar
seguro de que el cultivo es puro, repetir el proceso entero; para ello
tomar una colonia aislada y sembrar por estras una segunda placa.
Siembra por dilucin: Se toma el tubo de ensayo con medio lquido, como el

caldo simple. Se toma el material a diluir y se siembra en el tubo con el uso del
asa cargada con el material bacteriolgico, se agita, con movimientos
moderados.

Medio de cultivo: Liquido

Instrumento: Asa
Finalidad: poner la bacteria en suspensin
Siembra por estra por agotamiento: Con ste procedimiento se puede

conseguir una buena separacin de las colonias y aislarlas fcilmente. Para ello
se funde el medio de cultivo, se vuelca en caja de Petri y se deja solidificar. Con
el asa previamente esterilizada se toma material de un cultivo heterogneo y
se descarga sobre la superficie del medio formando estras. Esto puede
realizarse de varias formas:
a- Al comienzo se coloca el inoculo, luego se contina con las estras. Cuando
se quiere obtener colonias muy separadas se puede utilizar dos o tres placas de
Petri, para lo cual se repite la operacin sin tomar con el asa nuevo material.
b- Se puede dividir la placa de Petri en cuatro cuadrantes; una vez depositado
el material en el primero, siguiendo el sentido de las agujas del reloj, se hace
una estra luego en el segundo, tercero y cuarto cuadrante sin cargar
nuevamente el asa; en el ltimo cuadrante aparecern las colonias aisladas.
c- El inculo se extiende sobre una pequea zona de la placa, prxima al borde,
se esteriliza el asa y se traza otra estra a partir del depsito y as
sucesivamente.
Medio de cultivo: solido en placa de Petri
Instrumento. Asa
Finalidad. Obtener colonias aisladas

Siembra por estras en superficie: Se siembra el material en la superficie del

agar inclinado en un tubo de ensayo, all se extiende por toda la superficie con
el asa bacteriolgica, previamente esterilizada y cargada con el material a
sembrar, haciendo estras no muy amplias, pero tampoco muy estrechas. Se
inicia por la parte ms profunda de la superficie inclinada y se termina la estra
en la parte ms cerca de la boca del tubo.
Medio de cultivo: Agar base inclinado
Instrumento: Asa o aguja bacteriolgica.
Por picadura o puncin: Con una aguja se toma el material que se quiere
sembrar y se lo introduce en el tubo, con medio semislido. Introducir la aguja
hasta el fondo, formando un canal de puncin, trayecto por el cual la

retiraremos luego. Este mtodo se utiliza para estudiar la movilidad de las

bacterias.
Medio de cultivo. Semislido
Instrumento: aguja bacteriolgica
Finalidad: Estudiar la movilidad de las bacterias
Siembra en TSI: (Por picadura y estras en superficie): El TSI (Triple Sugar

Iron) es un medio que contiene glucosa, sacarosa y lactosa, hierro y un

indicador que es el rojo fenol.
En este medio sembraremos por picadura y estras en superficie, como ya
conocemos, para estudiar los cambios que ocurrirn en superficie y
profundidad. A lo largo del canal se desarrollan los microorganismos, y segn
lo hagan en la parte superior o inferior del tubo, estarn indicando su
comportamiento frente a los azucares, los cambios indican lo siguiente:

Siembra en agar inclinado. Esta se realiza por puncin y por estra. Por

puncin: Introduzca el inoculo con el asa recta hasta el fondo del medio con un
solo movimiento y teniendo cuidado de hacer el mismo trayecto de entrada
que de salida. Por estra: Extienda el inoculo sobre el agar inclinado deslizando
suavemente el asa por la superficie en forma de zigzag.
No olvide flamear la boca del tubo antes y despus de la siembra. Evalu la
presencia de crecimiento en el agar por la formacin de una pelcula o por el
crecimiento de colonias en la superficie.
Siembra en profundidad. Marque la caja de Petri estril con el nmero de

grupo, la fecha y siembra en profundidad. Abra ligeramente la caja de Petri

cerca del mechero.
Abra un tubo con cultivo de bacterias y con ayuda de una pipeta de Pasteur
plstica, transfiera 1 ml de ste cultivo a la base de la caja de Petri estril.
Descarte la pipeta en el frasco de boca ancha con clorox. Embebido de un
cultivo lquido, procediendo a su deslizamiento sobre toda la superficie de una
placa de agar.

Desarrollo de la prctica
Mtodo de siembra por estras
Procedimiento
Prender el mechero

Esteriliza el Asa de platino hasta el rojo vivo.

Realiza el sembrado de los microorganismos (rysobium) por el mtodo

de estra utilizando el asa y como se muestra en la figura. Evita destapar
completamente la tapa de los medios de cultivo.

 Incubar a 37C y dentro de unos das observar los resultados.

Resultados de la prctica
Formacin de colonias de estreptomicetos

IV. CONCLUCIN

Aprender a realizar la prctica de forma ordenada para obtener buenos

resultados
E aprendido a sembrar bacterias en un medio solido nuestro caso la
bacteria rhizobium

V.

BIBLIOGRAFA
Clavell, L.; Pedrique de Aulacio, M. 1992. Microbiologa. Mtodos de
siembra Generales (2da edicin). Facultad de Farmacia. Universidad
Central de Venezuela.
Difco y BBL. 2003. Manual de Mtodos de Siembra Microbiolgicos.
Merck. 2002. Microbiologa Manual de Siembra y Aislamiento
Ortega, Y; Quevedo F. 1991. Mtodos y tcnicas de siembra en
laboratorios de Microbiologa

PRACTICA N 5
COLORANTES Y TCNICAS DE COLORACIN
I.- INTRODUCCIN
Una de las caractersticas ms importante de las bacterias es su morfologa,
definida por el tamao, la forma, el arreglo y la estructura. Existen bacterias
en forma redondeada denominadas cocos, en forma cilndrica, denominadas
bacilos y una tercera morfologa como son las que tienen forma de espirales,
denominadas espirilos. A su vez cada categora puede sub clasificarse con base
a diferentes arreglos.
Estas caractersticas pueden determinarse examinando muestras al
microscopio. Las clulas no teidas son prcticamente transparentes, pero
pueden observarse al microscopio de luz haciendo preparaciones entre lmina
y laminilla o con microscopios especiales como por ejemplo: de contraste de
fases o de campo oscuro.
Cuando se dispone de un microscopio de luz, se pueden teir las bacterias para
facilitar su visualizacin.
Si se tie una muestra del cultivo extendida y fijada en una lmina portaobjeto
con un colorante dado, las clulas adquirirn el color del colorante aadido y
podr observarse la forma, tamao y el arreglo de las mismas. Este tipo de
coloracin se conoce con el nombre de coloracin simple.
Para obtener mayor informacin sobre la morfologa y composicin qumica
de las bacterias, debe recurrirse a tinciones diferenciales que involucran el uso
de varios reactivos y stas pueden diferenciarse con base al color que retienen.
Ej. Tincin de Gram y Tincin de Ziehl Neelsen.
II.- OBJETIVOS
Al finalizar el ejercicio prctico el estudiante estar en capacidad de:
Preparar una lmina con la muestra, realizar una tincin de Gram, observar al
microscopio con el objetivo de 100X y reportar el resultado.

III.- MATERIALES

Mechero
Fosforo
Alcohol
Porta objetos
Asa de siembra
Cristal de violeta
Lugol
Alcohol acetona
Safranina
Aceite de cedro
Microscopio
Colonia de bacterias

IV. MARCO TERICO

Cristal violeta
El violeta de metilo, comnmente denominado cristal violeta o violeta de
genciana, es el nombre dado a un grupo de compuestos qumicos empleados
como indicadores de pH y colorantes.
En la forma pura, el violeta de cristal se presenta como lustrosos cristales azul
verdosos que funden a 137 Celsius (279Fahrenheit). Los violeta de metilo son
solubles en agua, etanol, di etilenglicol, y dipropilenglicol. En particular, el
violeta de metilo 6B es soluble en agua al 2.93% y soluble en etanol al 15.21%.
El violeta de metilo se obtiene por reaccin de condensacin de la cetona de
Michler (4,4'-Bis-dimetilamino-benzofenona) con N, N-dimetilanilina en
presencia de clorato de fosforilo
Frmula: C24H28N3Cl
Punto de fusin: 137 C

 Lugol
El lugol o disolucin de Lugol es una disolucin de yodo molecular I2 y yoduro
potsico KI en agua destilada. Se prepar por primera vez en 1829 y recibe su
nombre en honor al mdico francs J.G.A. Lugol
Este producto se emplea frecuentemente como desinfectante y antisptico,
para la desinfeccin de agua en emergencias y como un reactivo para la prueba
del yodo en anlisis mdicos y de laboratorio.

 Alcohol acetona
Usos: para usos de laboratorio, anlisis, investigacin y qumica fina.

Safranina
La safranina (tambin llamada Safranina O o rojo bsico 2), es un colorante
biolgico, de contraste que se utiliza en la Tincin de Gram para proporcionar
un color violeta ms intenso a las bacterias Gram+ y tie de rosa a las bacterias
G- ; en histologa y en citologa. La safranina se usa como lquido de contraste
en algunos protocolos de tincin, coloreando el ncleo celular de rojo.
Tambin para detectar cartlago, mucina y grnulos de mastocitos.
Frmula qumica C20H19ClN4

Asa de siembra
El asa bacteriolgica o asa de platino es un instrumento de laboratorio tipo
pinza que consta de una base que puede estar hecha de platino, acero,
aluminio y un filamento que puede ser de nicromo, tungsteno o platino que
termina o en un arito de 5 mm o en punta.

Se emplea para transportar o arrastrar o trasvasar inculos (pequeo volumen

que contiene microorganismos en suspensin) desde la solucin de trabajo
tambin llamada solucin madre al medio de cultivo (slido o lquido) o de
un medio a otro (resiembra). Tambin sirve para la realizacin de frotis.

Microscopio compuesto
Un microscopio compuesto tiene ms de una lente objetiva. Los microscopios
compuestos se utilizan especialmente para examinar objetos transparentes, o
cortados en lminas tan finas que se transparentan. Se emplea para aumentar
o ampliar las imgenes de objetos y organismos no visibles a simple vista. El
microscopio ptico comn est conformado por tres sistemas:

El sistema mecnico est constituido por una palanca que sirve para
sostener, elevar y detener los instrumentos a observar.
El sistema de iluminacin comprende un conjunto de instrumentos,
dispuestos de tal manera que producen las ranuras de luz.
El sistema ptico comprende las partes del microscopio que permiten
un aumento de los objetos que se pretenden observar mediante filtros
llamados "de antigel subsecuente".

 Colonias de bacterias
Una colonia es un trmino utilizado ampliamente como un grupo de seres
vivos organizados bajo bases cooperativas

Aceite de cedro
El Aceite de cedro se utiliz como base para las pinturas de los antiguos
sumerios. Se molan los compuestos de cobalto en un mortero para producir
un pigmento azul. Podran obtener el color verde del cobre, el amarillo de
antimoniato de plomo, el negro del carbn de lea, y el blanco de yeso.
Nosotros lo utilizamos en las muestras que se va a observar con el objetivo de
inmersin del microscopio

Tcnica para realizar una preparacin coloreada

Una preparacin coloreada exige la sucesin de tres pasos: preparacin del
extendido, fijacin y coloracin.

1.- Preparacin del extendido

Debe utilizarse un portaobjetos limpio y desengrasado. Si el cultivo proviene

de un medio lquido, se transfiere con ansa una gota del mismo y se extiende
hasta formar una fina pelcula que cubra el centro del porta objetos. Si el
cultivo proviene de un medio slido, se procede as de la siguiente manera:
Con pipeta o ansa se coloca una gota de agua en el centro del portaobjetos

Se quema el exceso de cultivo que queda en el ansa, se deja enfriar y luego

se extiende la suspensin bacteriana hasta formar una fina pelcula sobre el
portaobjetos sin tocar los bordes.
Se deja secar al aire, o se seca al aire caliente de la llama, si los
microorganismos lo admiten.
2.- Fijacin

Este segundo paso se efecta para que los microorganismos queden adheridos
al vidrio y no sedes prendan del portaobjetos con los lavados a los que hay que
someterlos posteriormente. La fijacin coagula las sustancias proteicas de las
clulas, lo cual hace que los microorganismos queden pegados al portaobjetos.
Con este procedimiento no mueren todas las bacterias. Existen dos tipos de
fijacin: con calor o mtodo de Koch y fijacin qumica. Mtodo Koch El
procedimiento ideado por Koch consiste en pasar lentamente el preparado por
la llama del mechero 3 veces seguidas, con la precaucin de llevar el extendido
hacia arriba. El inconveniente de este mtodo es que los microorganismos
pueden deformarse demasiado si el calentamiento resulta excesivo.

Despus del procedimiento, el portaobjetos debe notarse caliente pero no

debe quemar cuando se coloca en la parte posterior de la mano. Fijacin
qumica La coagulacin del protoplasma microbiano con sustancias qumicas
es lo ideal pues las clulas no resultan deformadas. Existen varios mtodos:Se inunda el preparado con alcohol metlico, se deja actuar 3 minutos y se lava
con agua. Es el ms usado.- Idem con formalina al 5 % (v/v).- se inunda el
extendido con licor de Hoffman (partes iguales de etanol absoluto y ter
sulfrico) y se deja actuar hasta su evaporacin completa.

3.- Coloracin

En este paso se hacen actuar sobre el preparado ya fijado las soluciones de

colorantes de acuerdo al mtodo de tincin que se realice. Para la observacin
microscpica existen diferentes tipos de coloraciones segn las caractersticas
morfolgicas que quieran ponerse de manifiesto. Se clasifican en simples y
compuestas.
A) Coloracin simple
Se entiende por coloracin simple al teido de los microorganismos aplicando
slo una solucin colorante. Pueden ser
Positivas o negativas.
A.1. La coloracin positiva.- Es la tincin de los microorganismos, efectuada

con colorantes bsicos que, como ya dijimos, poseen afinidad por los
constituyentes celulares y se combinan qumicamente con el citoplasma
microbiano. Tcnica: Se cubre el frotis, despus de fijado, con la solucin
colorante y se deja actuar el tiempo preciso. Luego se lava con agua y se deja
secar.
Con fucsina bsica: se diluye 1/10 la solucin de uso (fucsina fenicada de
Ziehl) y se deja actuar 30 a 60 segundos.
Con violeta de genciana: se diluye al 1/10 la solucin de uso y se deja actuar
30 a 60segundos.

 Con azul de metileno: se cubre el preparado con la solucin de uso (azul de

metileno alcalino de Loeffler) sin diluir y se deja actuar 3 a 5 minutos. El azul
de metileno es el colorante ms dbil de los tres, razn por la cual se usa ms
concentrado y se deja actuar durante ms tiempo. Tambin a la solucin de
azul de metileno de uso se le agrega un lcali (KOH) como intensificante, que
acta haciendo ms rpida e intensa la reaccin de coloracin. Generalmente
como intensificante se usa un lcali para un colorante bsico y un cido para
un colorante cido. Debido a que el protoplasma bacteriano tiene una dbil
carga negativa que aumenta al aumentar el pH, se explica que en medios
alcalinos las coloraciones de bacterias se hagan ms intensas.
El azul de metileno se utiliza para observacin de levaduras y protozoos
intestinales
A.1.La coloracin negativa es lo contrario del procedimiento de tincin usual:

los microorganismos quedan sin teir y se colorea el medio que los rodea. Por
lo tanto, lo que se ve es el perfil de las clulas. La sustancia usada para la tincin
negativa es un colorante opaco que no tiene afinidad por los constituyentes
celulares y que simplemente rodea a las clulas, tal como:
Tinta china (suspensin de partculas de Carbono coloidal demasiado
grandes como para penetrar en la bacteria)
Colorantes cidos (no poseen afinidad por los constituyentes celulares). El
ms utilizado es la nigrosina dado que es el que ms contraste ofrece por ser
negro. La coloracin negativa es un modo satisfactorio de aumentar el
contraste de los microorganismos en microscopa ptica, pero su mxima
utilidad est en revelar estructuras como cpsulas tanto bacterianas como de
levaduras, esporas que se observan como cuerpos refringentes y espiroquetas
que, por su pequeo dimetro transversal, resulta difcil ponerlas en evidencia;
por medio de la coloracin negativa se observan sin dificultad. Mtodo de
Burri (con tinta china o nigrosina): Se coloca en un extremo del portaobjetos
una gota de tinta china o nigrosina y otra de la suspensin microbiana y se
mezclan bien con el ansa. Luego, con otro porta se apoya sobre la mezcla y se
hace un extendido a lo largo del porta.

Con este procedimiento el espesor del frotis va disminuyendo a medida que

se extiende, con lo cual se conseguir una zona donde el contraste sea el
adecuado. Se deja secar bien y se observa con el objetivo de inmersin.
B) Coloraciones compuestas
Aunque existen mltiples tipos de tinciones, vamos a referirnos aqu a los dos
mtodos de coloracin especiales ms comn mente empleados en la prctica
corriente del laboratorio de microbiologa: la tincin de Gram y la de Ziehl
Neelsen.

B.1. Tincin de Ziehl-Neelsen

El fundamento de esta tcnica diferencial, se basa en la propiedad de a cidoalcohol resistencia de algunas bacterias del orden Actinomycetales, si bien no
es privativa de ellas. Estos microorganismos se consideran gram positivos,
pero se colorean difcil e irregularmente, de ah que emplee este tipo de
tincin (Ziehl- Neelsen) o su variante (Kinyoun). Cualquiera delas dos tcnicas
citadas consiguen, ya sea por el calor o aumentando el tiempo de contacto,
que la fucsina penetre profundamente y pueda resistir la accin decolorante
de una solucin de cido-alcohol, apareciendo los bacilos de color rojo sobre
un fondo azul.
Etapas en la tincin de Ziehl-Neelsen
Pasos

Mtodo

Acido-alcohol
resistente

No cido alcohol
resistente

Colorante bsico

Fucsina

Se tie de rojo

Se tie de rojo

Mordiente

Calor

Permanece rojo

Permanece rojo

Decolorante

Alcohol-clorhdrico Permanece rojo

Se decolora

Contraste

Azul de metileno

Se tie de azul

Permanece rojo

B.2. Tincin de Gram

Elaborada por Hans Christian Gram en 1884, es la ms empleada en

bacteriologa. Permite diferenciar las bacterias incluso cuando tienen igual
forma y tamao, por esta razn es una tincin diferencial. Las etapas a seguir
se detallan en la Tabla 1.Aunque no totalmente aclarada, la propiedad de la
Gram positividad depende de la naturaleza y composicin qumica de la pared
o parte de ella. Se han propuesto varias teoras para su explicacin, pero la
ms aceptada es la que sostiene que las bacterias gram negativas son ms
permeables al alcohol debido a su alto contenido en lpidos. Cuando la bacteria
se tie con el complejo colorante bsico-mordiente, ste queda atrapado en
las bacterias gram positivas y no puede ser arrastrado por el decolorante a
causa de la naturaleza fsico-qumica de su pared. Por el contrario, en las gram
negativas es arrastrado debido a su alto contenido lipdico.
A travs de la tincin de Gram pueden valorarse la afinidad tintorial, forma y
agrupaciones de las bacterias.
-Afinidad tintorial. Permite dividir a las bacterias en:

1) Gram positiva (violetas) que retienen el colorante principal tras la

decoloracin con alcohol o alcohol-acetona

2) Gram negativa (rojas) que pierden el colorante principal tras la

decoloracin por lo que es necesario aplicar un colorante de contraste para

visualizarlas.
Esta diferencia de coloracin est basada en la diferencia estructural de la
pared. En las Gram positivas el colorante se fija fuertemente al peptidoglicano
que lo "retiene" e impide que "salga" con el decolorante. En las gramnegativas
el colorante es retenido con menos fuerza al ser ms delgada la capa de
peptidoglicano. Adems la mayor cantidad de lpidos presentes hace que el
colorante se elimine al solubilizarse los lpidos en el alcohol.

Pueden tener diferentes formas:

- esfricas: cocos (Streptococcus spp., Staphylococcus spp., etc)

- cilndricas: bacilos (enterobacterias, Pseudomonasspp., etc...)
- espiroquetas: Treponema pallidum, Borrelia burgdorferi

- Pueden aparecer aisladas o asociarse en parejas [diplococcos: (Neisseria

gonorrhoeae, Streptococcus pneumoniae)], cadenas (estreptococcos),
tetradas, sarcinas, racimos (estafilococos), "letras chinas" (corinebacterias),
etc
- Tamao: las bacterias se miden en metros (1metro = 10-3 mm) y, en
general y como ejemplo, las bacterias esfricas tienen un dimetro de 1m
y las bacterias alargadas 1.5-8 m de longitud, aunque este parmetro vara
en funcin de los diferentes gneros bacterianos.

Etapas en la tincin de Gram

Pasos

Mtodo

Gram(+)

Gram (-)

Colorante bsico

Cristal de bioleta

Se tie de violeta

Se tie de violeta

Mordiente

Lugol

Permanece violeta Permanece violeta

Decoloracin

Alcohol de 95% o
Alcohol-acetona

Permanece violeta Se decolora

transparente

Contraste

Fucsina o
Safranina

Permanece violeta Se tie de rosa

EN LA PRCTICA HEMOS UTILIZADO LA TINCIN DE GRAM

Procedimiento
Prender el mechero

Esterilizar el asa de siembra

Coger una gota de agua con la asa de siembra y depositar en el

portaobjetos

 Coger una colonia de bacterias y depositar en el portaobjetos

Calentar y hacer una extensin

Fijar la muestra

 Cubrir con cristal violeta, despus de dos minutos eliminar el exceso de

colorante

Agregar lugol y despus de dos minutos lavar con agua.

Agregar alcohol acetona para eliminar el color.

 Agregar safranina y lavar

Llevar al mechero para secar

Colocar una gota de aceite de inmersin sobre las lminas teidas y

secas y examinarlas bajo un microscopio de luz, utilizando el objetivo
de inmersin.

IV. OBSERVACIONES:

Explicacin de la prctica
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas
(tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro
de potasio) y Sl (Siulterio), los cuales estn presente para solubilizar el yodo, y
actan de mordiente, haciendo que el cristal violeta se fije con mayor
intensidad a la pared de la clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma
un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin,
ya que en la misma es soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos
Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina
o la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas
son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen violetas.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para hacer
una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram negativas.
Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas y las Gram
negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se
us, por ejemplo, safranina).
V. CONCLUSIONES
Hemos aprendido a colorear las bacterias mediante el mtodo de
Gram.
E aprendido a observar en el microscopio utilizando aceite de cedro.
Hemos observado las bacterias de diferentes formas.
VI. BIBLIOGRAFA
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