Tincin de Gram

La tincin de Gram o coloracin de Gram es un tipo de tincin diferencial

empleado en microbiologa para la visualizacin de bacterias, sobre todo en
muestras clnicas. Debe su nombre al bacterilogo dans Christian Gram, que
desarroll la tcnica en 1884. Se utiliza tanto para poder referirse a la
morfologa celular bacteriana como para poder realizar una primera
aproximacin a la diferenciacin bacteriana, considerndose Bacteria Gram
positiva a las bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram
negativa a las que se visualizan de color rosa o rojo o grosella.
Metodologia
Recoger muestras.
Hacer el extendido en espiral.
Dejar secar a temperatura ambiente.
Fijar la muestra con metanol durante un minuto o al calor (flameado 3
veces aprox.)
Agregar azul violeta (cristal violeta o violeta de genciana) y esperar 1
min. Todas las clulas gram positivas y gram negativas se tien de color
azul-purpura.
Enjuagar con agua.
Agregar lugol y esperar entre 1 minuto.
Enjuagar con agua.
Agregar acetona y/o alcohol y esperar 4 segundos (parte critica de la
coloracion)
Enjuagar con agua.
Tincin de contraste agregando safranina o fucsina bsica y esperar 1-2
min Este tinte dejar de color rosado-rojizo las bacterias Gram
negativas.

Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite

de inmersin.
[Explicacin
El cristal violeta (colorante catinico) penetra en todas las clulas bacterianas
(tanto Gram positivas como Gram negativas) a travs de la pared bacteriana.
El lugol es un compuesto formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de
potasio), el cual est presente para solubilizar el yodo, y acta de mordiente,
haciendo que el cristal violeta se fije con mayor intensidad a la pared de la
clula bacteriana. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en
solucin acuosa con el cristal violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la
decoloracin, ya que en la misma es soluble el complejo I 2/cristal violeta. Los
organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los Gram negativos
s lo hacen.

Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin
de contraste. Habitualmente es un colorante de color rojo, como la safranina o
la fucsina. Despus de la coloracin de contraste las clulas Gram negativas
son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina puede o no utilizarse, no es crucial para la tcnica. Sirve para
hacer una tincin de contraste que pone de manifiesto las bacterias Gram
negativas. Al trmino del protocolo, las Gram positivas se vern azul-violceas
y las Gram negativas, se vern rosas (si no se hizo la tincin de contraste) o
rojas (si se us, por ejemplo, safranina).
Esta importante coloracin diferencial fue descubierta por Hans Christian Gram
en 1884. En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con
solucin de uno de los colorantes de violeta de metilo, que se deja actuar
durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo
y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo
que la anterior; despus se lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no
arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una coloracin de contraste,
como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta
inclusive verde de malaquita.
Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de
tratarlos con un decolorante, y el color no se modifica al aadir ste; otros
pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo. Los que fijan el
violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y
retienen la segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin
Gram, podemos clasificar a los microorganismos en uno de los dos grupos. Los
colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin
Gram. Los representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y
violeta cristal o de genciana. En realidad, violeta de metilo es el nombre
atribuido al compuesto tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de
grupos metilo en la molcula; por consiguiente, de los tres grupos, el tono ms
oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte ms ligero, la
tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R,
2R, R, B, 2B, 3B, etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La
letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos azules. El violeta de cristal
contiene seis grupos metilo, y se considera como el mejor colorante primario
para teir por el mtodo de Gram.
La facultad de las clulas para tomar la coloracin Gram no es propia de toda
sustancia viviente, sino que se limita casi en absoluto a hongos y bacterias. As
vemos que las clulas de plantas y animales superiores no conservan la

primera coloracin; los mohos se tien con cierta irregularidad; los grnulos de
micelios propenden retener el colorante. La reaccin de Gram no es infalible ni
constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el pH del medio, y quiz por
otras causas.
Tcnica de la coloracin gram
Fijar un frotis
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar
que enfre un poco.
Tomar el asa (previamente flameada) y con sta tomar un poco de
muestra.
Una vez obtenida una pequea cantidad de la muestra (con el asa),
hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual
servir para depositar la muestra contenida en el asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos,
proceder a realizar la extensin de la muestra en el portaobjetos
mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la
lmina, de tal forma que al terminar la extensin, tengamos como
producto una espiral en la parte media de la lmina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero
para fijar la muestra, teniendo en cuenta que el calor no debe ser directo
(slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede cambiar
la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es
aqul en el que el portaobjetos sea apenas demasiado caliente para ser
colocado sobre el dorso de la mano.
Tincin
Con violeta cristal, violeta de genciana, azul de metileno o en todo caso tinta
china utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra,
como para lograr cubrirla por completo. Se deja actuar al colorante por 1
minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a una temperatura
ambiente de 25 C.
Enjuague
Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra
con agua corriente. Para realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el
chorro de agua NO debe caer directamente sobre la muestra, sta debe caer
sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe
ser un chorro delgado, aproximadamente de medio a un milmetro de espesor.
Tambin el enjuague se debe realizar poniendo la lmina portaobjetos en
posicin inclinada hacia abajo... La solucin de cristal violeta, se recomienda
sea al 1% .

[Mordiente
Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol
durante 3 minuto ms. El mordiente es cualquier sustancia que forme
compuestos insolubles con colorantes y determine su fijacin a las bacterias..
Decoloracin
Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con
etanol al 75 %, etanol al 95 %, acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no
escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del frasco del
decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta
lograr que ste salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no
escurra ms lquido azul.
Lavado y secado
Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la
lmina al aire libre o con la ayuda de la llama de un mechero de la forma
anteriormente descrita.
Tincin de contraste
Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez
se va a utilizar un colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar
actuar durante 1 minuto.
Nuevo enjuague
Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua,
se escurre el agua sobrante y se seca en la forma anteriormente descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin
microscpica.
Fundamentos de diferenciacin de Gram positivo y Gram negativo
Los fundamentos de la tcnica se basan en las diferencias entre las paredes
celulares de las bacterias Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de
peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara
interna de la pared celular y unido a la membrana plasmtica, se encuentra el

cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido teicoico que est anclado

solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena)
Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y
se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (de
composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa
delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas. La
membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas
direrencias constitutivas de su pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es
el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las Gram
positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.
La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, se debe a que
la membrana externa de las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos,
como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La capa de peptidoglucano
que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se
escapa, perdindose la coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram
positivas, al poseer una pared celular ms resistente y con mayor proporcin
de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico, sino
que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda
escaparse el complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azulviolcea.
Causas que alteran la tincin de Gram
I: Edad de la bacteria.
II: Errores del operador.
III: Uso de antibiticos
A pesar de la gran utilidad del la tincin de Gram, este mtodo debe ser
valorado con precaucin, ya que la reaccin puede variar segn la edad de las
clulas y la tcnica empleada, por ella junto a la muestra deben teirse
controles con grampositivas y gramnegativas.

Tincin de Ziehl Neelsen

La tincin de Ziehl-Neelsen (BAAR) es una tcnica de tincin diferencial
rpida y econmica, para la identificacin de microorganismos patgenos, por
ejemplo M. tuberculosis.
Fue descrita por primera vez por dos mdicos alemanes, Franz Ziehl, un
bacterilogo y Friedrich Neelsen, un patlogo.

Fundamento
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de
la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los
parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades
de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras. Al suspender el calentamiento y enfriar con agua, provoca una nueva
solidificacin de lo cidos grasos de modo que el colorante ya no puede salir de
las bacterias. Por otro lado, el calentamiento aumenta la energa cintica de las
molculas del colorante lo cual tambin facilita su entrada a las bacterias. Las
bacterias que resisten la decoloracin son de color rojo y la que no se ven de
color azul, ya que se utiliza azul de metileno como tincin de contraste.
Tcnica
Variante clsica o "en caliente"
sta y la siguiente variantes son para preparaciones citolgicas.
1. Hacer un frotis de la muestra.
1. La fijacin al calor asegurar de que el frotis quede adherido al
portaobjetos. Un frotis muy delgado puede darle resultados
falsamente negativos y un frotis muy grueso puede desprenderse
del portaobjetos durante la tincin.
2. Utilizando pinzas, coloque los portaobjetos en una gradilla de
tincin con los extendidos hacia arriba. Nunca tia ms de 12
portaobjetos a la vez.
2. Dejar el frotis sobre el puente de tincin.
3. Aplicar fucsina-fenicada.
1. Deje que el colorante permanezca sobre los portaobjetos durante
5 minutos. Mantenga el calor durante este perodo.
4. Calentar con un mechero hasta la emisin de vapores (3-5 minutos).
1. Se requiere el tiempo adecuado para que la fucsina fenicada
penetre y tia la pared celular de la bacteria. No deje que hierva o
se seque el colorante.
2. Lave suavemente el colorante de cada portaobjetos con agua
corriente fra hasta que toda la tincin libre quede lavada. Lave
suavemente de manera que el extendido no se barra del
portaobjetos. Retire el exceso de agua.
5. Decolorar con alcohol-cido.
1. Cubra cada portaobjetos con la solucin decolorante, tal como
alcohol cido y mantngalo sobre el portaobjetos durante 7
minutos. Si no se decolora suficientemente, el contenido del
esputo que no son bacilos TBC puede permanecer teido.

Enjuague con agua una vez ms los portaobjetos y quite el exceso

de agua. Si los portaobjetos an estn rosa, aplique una cantidad
adicional de la solucin decolorante de 1 a 3 minutos.
6. Aplicar azul de metileno (1 minuto).
1. Aplique la solucin de contraste, azul de metileno, durante 1
minuto.
7. Enjuagar con agua
1. Vuelva a enjuagar con un leve chorro de agua e incline cada
portaobjetos hasta drenar el exceso de agua. Finalmente, coloque
cada portaobjetos en una gradilla a que sequen al aire.
8. Ahora coloquele una pequeita gota de aceite de inmersin y haga la
observacin al microscopio con 100 x 100
o en "fro"
1. Hacer un frotis.
2. Dejarlo en el puente de tincin.
3. Aplicar fucsina-fenicada (solucin con fenol y mayor concentracin de
fucsina).
4. Dejar en vasos coplin durante 20 minutos.
5. Decolorar con alcohol acido.
6. Lavar con agua del grifo.
7. Contrastar con azul de metileno
Algunos microorganismos cido-alcohol resistentes
Mycobacterium: fuertemente cido-alcohol resistentes.[1]
Nocardia y Actinomices: dbilmente cido-alcohol resistentes. [2]
Parsitos coccdeos (Cryptosporidium) de muestras [fecales]. [3]
ZIEHL-NEELSEN (BAAR)
Las paredes celulares de ciertos parsitos y bacterias contienen cidos grasos
(cidos miclicos) de cadena larga (50 a 90 tomos de carbono) que les
confieren la propiedad de resistir la decoloracn con alcohol-cido, despus de
la tincin con colorantes bsicos. Por esto se denominan cido-alcohol
resistentes. Las micobacterias como M. tuberculosis y M. marinum y los
parsitos coccdeos como Cryptosporidium se caracterizan por sus propiedades
de cido-alcohol resistencia. La coloracin clsica de Ziehl-Neelsen requiere
calentamiento para que el colorante atraviese la pared bacteriana que contiene
ceras.
Se ha desarrollado una coloracin de cido-alcohol resistencia modificada que
diferencia las especies de Nocardia (bacterias ramificadas filamentosas cuyas
paredes celulares contienen cidos-grasos de unos 50 tomos de carbono), de
los actinomiceos (muy semejantes pero no cido-alcohol resistentes). Nocardia
spp son decoloradas por la mezcla cido-alcohol estndar pero no por un
tratamiento ms suave con cido sulfrico 0,5 a 1%. Estos microorganismos se
denominan cido-alcohol resistentes parciales o dbiles.
El frotis se tie durante unos 5 min con Carbolfucsina aplicando calor suave.
Lavar con agua. Decolorar con alcohol etlico 95% con un 3% de ClH
concentrado. Lavar y teir durante 30-60 seg con Azul de Metileno (color de
contraste). Lavar y secar

Tincin de esporas (Wirtz-Conklin)

Algunos gneros bacterianos, entre los que destacan Clostridium y

Bacillus,

producen

endosporas.

Se

desfavorables

en

su

interior

producen

(agotamiento

formas

de

cuando

las

de

nutrientes,

los

resistencia

condiciones

denominadas

ambientales

temperaturas

son

extremas,

radiaciones, compuestos txicos, etc.) formndose una espora por cada forma
vegetativa. Al finalizar el proceso de esporognesis, la clula vegetativa se lisa
y libera la espora al exterior. Cuando el ambiente es favorable, la espora
germina generando una nueva forma vegetativa. La capacidad de germinar
perdura durante aos. Algunas de las bacterias productoras de endosporas son
patgenas para el hombre, por lo que su estudio y observacin son de enorme
inters.

OBJETIVOS
1
2

1. Observar las endosporas y su disposicin en las formas vegetativas.

2. Comparar las distintas morfologas y disposiciones que adoptan las endosporas en
las especies empleadas.

MATERIAL NECESARIO
- Portaobjetos con frotis bacterianos previamente preparados.
- Colorantes:
a) Solucin de verde malaquita (5%)
b) Solucin de safranina (0,5%)
- Pinzas de madera
- Mechero Bunsen o de alcohol
- Microscopio y aceite de inmersin

FUNDAMENTO
Las endosporas poseen unas cubiertas exclusivas que las hacen
resistentes a los factores ambientales adversos. Adems, estas cubiertas hacen
que las esporas aparezcan en el microscopio ptico como estructuras
refringentes y de difcil tincin.
La tincin especfica de esporas requiere dos colorantes:
1.- Verde malaquita: capaz de teir las esporas en caliente.

2.- Safranina: colorante de contraste que tie las formas vegetativas.

Las endosporas, tras la primera tincin, no perdern el colorante en
el lavado con agua, y s lo harn las formas vegetativas, que quedarn teidas
con el segundo colorante.

REALIZACIN
Se emplearn cultivos en fase estacionaria para dar lugar a que las
bacterias produzcan las esporas. Esta tincin es delicada en su realizacin y
para

poder

obtener

unos

resultados

satisfactorios

hay

que

seguir

cuidadosamente las instrucciones.

1 1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2 2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar
la muestra encima de la llama del mechero de forma que el colorante humee
durante 5 min.
Nota: evitar que la muestra hierva. Aadir ms colorante si ste se
evapora; es importante que la muestra no se seque.
3 3. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
4 4. Teir con safranina 1 min.
5 5. Lavar con abundante agua el exceso de colorante.
6 6. Secar la preparacin.
7 7. Observar la preparacin al microscopio. Anotar la disposicin y
la morfologa de las tres especies del gnero Bacillus.

Tincin de esporas

Microscopio
Portaobjetos
Cubreobjetos
Asa de siembra
Cubeta de tincin
Cultivo bacteriano

Pinzas
Frasco lavador
Mechero de alcohol
Papel de filtro
Verde Malaquita
Safranina

REALIZACIN
1. Preparar los frotis bacterianos indicados.
2. Teir con verde malaquita. Con unas pinzas de madera colocar la
muestra encima de la llama del mechero para que el colorante humee,
pero sin que hierva, durante 5 min. Aadir ms colorante si la muestra
se seca.
3. Lavar con agua el resto de colorante.
4. Teir con safranina 1 min.
5. Lavar con agua el resto de colorante.
6. Secar la preparacin.
7. Observar la preparacin al microscopio
Fundamentos
La envuelta de la endospora es mas compleja e impermeable que la envuelta
de las clulas vegetativas en las que se forma. Slo se puede teir el contenido

de la espora alterando su envuelta. La impermeabilidad de las cubiertas

dificulta que las endosporas se decoloren una vez teidas.
El verde de malaquita es un colorante dbilmente bsico (tiene una carga
positiva dbil) y por tanto, se une dbilmente a la bacteria. Penetra en las clulas
vegetativa . Cuando se calienta la preparacin tambin penetra las endosporas.
Durante el lavado con agua, el verde de malaquita se elimina de las clulas
vegetativas, pero no de la endospora.
El colorante de contraste (la safranina) solo puede teir a las clulas vegetativas
(decoloradas por el agua).
Material Necesario
Para el correcto desarrollo de esta prctica sern necesarios los siguiente
materiales: cultivos de Bacillus subtilis y de Bacillus megaterium. Verde malaquita
al 5 % en agua y Safranina al 1% en agua. Platina de Koch.
Mtodo
1. Cubrir la extensin con papel de filtro (dificulta la precipitacin del colorante
sobre las bacterias).
2. Depositar la preparacin sobre una platina de Koch. Aadir verde de
malaquita. Esperar un minuto.
3. Seguir la tincin con calor : en emisin de vapores durante 5-10 minutos.
Dejar enfriar.
4. Lavar con agua abundante. Secar
.5. Teir con safranina (dos minutos). Lavar con agua. Secar. Observar con
objetivo de inmersin.
Resultado
Esporas teidas de verde y clulas vegetativas teidas de rosa. Observar la
forma, tamao relativo y posicin de la espora en la clula vegetativa.

TINCIN DE NEGATIVA DE
CAPSULA
La cpsula es una capa mucosa, ms o menos gruesa, que envuelve
la pared celular de algunas bacterias.
Esta compuesta de polisacaridos, mucopolisacaridos o polipptidos
Por su alto contenido de agua se tien dbilmente por loscolorantes
Prepara un frotis a partir de una suspensin densa de bacteriasen
solucin salina al 0.85%
Agregar una gotita de cristal violeta o de tinta china.
Dejar secar al aire y observar