Laboratorio 1.

Espectrofometra: Espectros de
absorcin y cuantificacin espectrofotomtrica de
biomolculas
OBJETIVOS
Establecer el espectro de absorcin UV-Vis para clorofila para determinar su max
Aplicar la ley de Lambert-Beer y realizar una recta de calibrado para clorofila
Calcular grficamente el valor del coeficiente de extincin molar.
Determinacin cuantitativa de clorofila en una muestra problema

INTRODUCCIN

energtico basal o fundamental, E 1, a un estado de

mayor energa (estado excitado), E 2. Y slo se
absorber la energa que permita el salto al estado
excitado. Cada molcula tiene una serie de estados
excitados (o bandas) que la distingue del resto de
molculas. Como consecuencia, la absorcin que a
distintas longitudes de onda presenta una molcula
-esto es, su espectro de absorcin- constituye una
sea de identidad de la misma. Por ltimo, la
molcula en forma excitada libera la energa
absorbida hasta el estado energtico fundamental.

El estudio a nivel bioqumico de cualquier

biomolcula requiere la utilizacin de tcnicas
analticas que permitan su determinacin cualitativa
y cuantitativa, as como su caracterizacin fsicoqumica y biolgica. Uno de los mtodos ms
sencillos, accesibles, tiles y utilizados es la
espectroscopa, en general, y la espectroscopa
ultravioleta-visible, en particular. Se pueden
identificar y cuantificar biomolculas en solucin y
en muestras biolgicas, con el empleo de reactivos
especficos que reaccionan con el compuesto a
analizar y forman un producto coloreado que permite
detectarlo en muestras complejas.
El fundamento de la espectroscopa se debe a la
capacidad de las molculas para absorber
radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del
espectro UV-visible. Las longitudes de onda de las
radiaciones que una molcula puede absorber y la
eficiencia con la que se absorben dependen de la
estructura atmica y de las condiciones del medio
(pH, temperatura, fuerza inica, constante
dielctrica), por lo que dicha tcnica constituye un
valioso instrumento para la determinacin y
caracterizacin de biomolculas.

Figura 1. Diagrama de niveles de energa en una molcula. La

absorcin de energa luminosa hace que la molcula pase desde un
estado fundamental (E1) a otro excitado (E2). Posteriormente la
molcula relaja su energa mediante distintos mecanismos (vibracin,
rotacin, etc.)

En espectroscopia el trmino luz no slo se aplica a

la forma visible de radiacin electromagntica, sino
tambin a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectrofotometra de absorbancia se utilizan las
regiones del ultravioleta (UV cercano, de 195-400
nm) y el visible (400-780 nm).

Las molculas pueden absorber energa luminosa y

almacenarla en forma de energa interna. Esto
permite poner en funcionamiento ciclos vitales como
la fotosntesis en plantas y bacterias. Cuando la luz
(considerada como energa) es absorbida por una
molcula se origina un salto desde un estado
1

La regin UV se define como el rango de longitudes

de onda de 195 a 400 nm. Es una regin de energa
muy alta. Provoca dao al ojo humano as como
quemadura comn. Los compuestos con dobles
enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptdicos,
sistemas aromticos, grupos carbonilos y otros
heterotomos tienen su mxima absorbancia en la
regin UV, por lo que sta es muy importante para la
determinacin cualitativa y cuantitativa de
compuestos orgnicos. Diversos factores -como pH,
concentracin de sal y el disolvente- que alteran la
carga de las molculas, provocan desplazamientos
de los espectros UV.

La transmitancia (T) de una sustancia en solucin

es la relacin entre la cantidad de luz transmitida
que llega al detector una vez que ha atravesado la
muestra, It y la cantidad de luz que incidi sobre ella,
Io, y se representa normalmente en tanto por ciento:
% T = It/Io x 100
La transmitancia nos da una medida fsica de la
relacin de intensidad incidente y transmitida al
pasar por la muestra. La relacin entre %T y la
concentracin no es lineal, pero asume una relacin
logartmica inversa.
La absorbancia (A) es un concepto ms
relacionado con la muestra puesto que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma, y se define
como el logaritmo de 1/T, en consecuencia: A = log
1/T = -log T = -log It/Io

La fuente de radiacin ultravioleta es una lmpara

de deuterio.
En la regin visible apreciamos el color visible de
una solucin y que corresponde a las longitudes de
onda de luz que transmite, no que absorbe. El color
que absorbe es el complementario del color que
transmite.

Cuando la intensidad incidente y transmitida son

iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica
que la muestra no absorbe a una determinada
longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.

Por tanto, para realizar mediciones de absorcin es

necesario utilizar la longitud de onda en la que
absorbe luz la solucin coloreada.

La cantidad de luz absorbida depender de la

distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin
del cromforo y de la concentracin de ste.

La fuente de radiacin visible suele ser una lmpara

de tungsteno y no proporciona suficiente energa por
debajo de 320 nm.

1.2 Ley de Lambert-Beer

longitud de onda color de luz que se color de luz que

se aproximada absorbe refleja o ve

Esta ley expresa la relacin entre absorbancia de luz

monocromtica (de longitud de onda fija) y
concentracin de un cromforo en solucin:

390 - 435 Violeta Amarillo verdoso

435 - 490 Azul Amarillo
490 - 580 Verde Rojo
580 - 595 Amarillo Azul
595 - 650 Naranja Azul verdoso
650 - 780 Rojo Verde azulado

A = log I/Io = cl
La absorbancia de una solucin es directamente
proporcional a su concentracin a mayor nmero
de molculas mayor interaccin de la luz con ellas-;
tambin depende de la distancia que recorre la luz
por la solucin a igual concentracin, cuanto mayor
distancia recorre la luz por la muestra ms
molculas se encontrar-; y por ltimo, depende de
, una constante de proporcionalidad -denominada
coeficiente de extincin (en algunas referencias se
maneja con el nombre de absortividad)- que es
especfica de cada cromforo. Como A es
adimensional, las dimensiones de dependen de las
de c (concentracin) y l (ancho de la celda que

1.1. Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud
de onda de intensidad I o incide perpendicularmente
sobre una disolucin de un compuesto qumico que
absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber
una parte de la radiacin incidente (I a) y dejar pasar
el resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

contiene la muestra). La segunda magnitud (l) se

expresa siempre en cm mientras que la primera (c)
se hace, siempre que sea posible, en M, con lo que
las dimensiones de resultan ser M -1cm-1. Este
coeficiente as expresado, en trminos de unidades
de concentracin molar (o un submltiplo
apropiado), se denomina coeficiente de extincin
molar (M). Cuando, por desconocerse el peso
molecular del soluto, la concentracin de la
disolucin se expresa en otras unidades distintas de
M, por ejemplo g/L, las dimensiones de resultan
ser distintas, por ejemplo g-1Lcm-1, y al coeficiente
as expresado se denomina coeficiente de extincin
especfico (s).

que se va a realizar la medida. Hay

espectrofotmetros de un solo haz (con una sola
celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de
doble haz (con dos celdillas para dos cubetas); en
nuestro caso se trabajar con los de un solo haz.
Se mide primero la absorbancia del disolvente
(conocido como blanco) y al que se le asigna el
valor de cero mediante el ajuste del mando, de
forma que la intensidad incidente y transmitida sean
iguales (Io = It), y por tanto la absorbancia es cero. A
continuacin se pone en la celdilla la cubeta con la
muestra y se lee la absorbancia de sta.
1.4 Obtencin de un espectro de absorcin

La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones

diluidas; para valores de c altos, vara con la
concentracin, debido a fenmenos de dispersin de
la luz, agregacin de molculas, cambios del medio,
etc.

El espectro de absorcin es una representacin

grfica que indica cantidad de luz absorbida () a
diferentes valores de .
A partir de diversas soluciones diluidas de un
compuesto (la concentracin mxima de trabajo
depende de cada sustancia), cuya absorbancia
mxima entra dentro del rango de medida del
espectrofotmetro (se recomienda una absorbancia
no mayor a 0.8, pero en algunos casos se encuentra
comportamientos lineales hasta 1.2), se ver el valor
de absorbancia a diferentes longitudes de onda
frente a un blanco que contenga el disolvente de la
solucin de la muestra a caracterizar. A partir del
espectro de absorcin de las soluciones diluidas se
obtendr el valor de de trabajo en donde se
presenta linealidad entre las diferentes absorbancias
de las soluciones diluidas, sin que se sobrepasa el
rango de medida del espectrofotmetro (En algunos
casos el max a determinada concentracin
sobrepasa los lmites recomendados del
espectrofotmetro y no se toma en cuenta al menos
se observe una correlacin lineal). Dicho se
utilizar a la hora de hacer determinaciones
cualitativas y cuantitativas del compuesto.

1.3. Instrumentacin para la medicin de

absorbancias de la luz visible y ultravioleta:
espectrofotmetro UV-visible
La medicin de absorbancia de la luz por las
molculas se realiza en unos aparatos llamados
espectrofotmetros. Aunque pueden variar en
diseo, en especial con la incorporacin de
ordenadores para el anlisis de datos, todos los
espectrofotmetros constan, segn se indica en la
figura, de:
1. Una fuente de energa radiante: lmpara de
deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la seleccin de
radiaciones de una determinada longitud de onda:
filtros, prismas, redes de difraccin.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente
transparente (cubetas o tubos) que contenga la
muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plstico
transparente. Para medir en UV se deben usar las
de cuarzo o slice fundido o plstico transparente,
porque el vidrio no transmite la radiacin UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor
de las seales luminosas en seales elctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

El espectro de absorcin de un cromforo depende,

fundamentalmente, de la estructura qumica de la
molcula.
No obstante, hay una gran cantidad de factores que
originan variaciones en los valores de max y M, entre
los que se incluye el pH, la polaridad del solvente o

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es

seleccionar la fuente de luz y longitud de onda a la
3

molculas vecinas y la orientacin de los cromforos

vecinos; y cada uno afecta de forma particular. Por
ejemplo, variaciones originadas por cambios de pH
son debidas al efecto de ste sobre la ionizacin del
compuesto.

1. Tomar el patrn de clorofila (pastilla) y macerarlo

finamente con la ayuda del mortero.
2. Preparar una solucin patrn de clorofila de 5
mg/mL en una mezcla de etanol 90% y ter de
etlico 10%.
3. Si no se disuelve completamente el slido llevar
a cabo una centrifugacin y tomar el
sobrenadante.
4. Con el patrn montar una alcuota en una celda
de cuarzo
5. Llevar a cabo un barrido del espectro UV-Vis
con la ayuda del espectrofotmetro
6. En caso de no obtener pico(s) definido(s) diluir
la muestra con la mezcla de etanol-ter hasta
determinar la max
7. Una vez determinada la max realizar la curva de
calibracin.

1.5 Curvas de calibracin

Para obtener una curva de calibracin de un
compuesto se preparan soluciones de diferentes
concentraciones del mismo, determinndose para
cada una de ellas el valor de absorbancia a max.
Estos valores de absorbancia para determinadas
se representan en el eje de las ordenadas (eje de y)
y los de concentracin en el eje de abcisas (eje de
x). Se observar que, a bajas concentraciones, el
aumento de concentracin se corresponde con un
incremento lineal en la absorbancia (zona de
cumplimiento de la ley de Lambert-Beer). A
concentraciones altas la linealidad se pierde y se
observa que la lnea se aplana, por lo que las
medidas son poco fiables.

Curva de calibracin para clorofila

1. Con el patrn preparado en la primera parte
preparar 6 diluciones de 10 o 25 mL de 2, 4, 8,
12, 16 y 20 veces.
2. Determinar
la
absorbancia
en
el
espectrofotmetro para cada dilucin.
3. Realizar la curva de calibracin y determinar su
coeficiente de correlacin.

La representacin de Lambert-Beer, A = cl, nos

permitir calcular el valor del coeficiente de extincin
molar, que corresponde a la pendiente de la recta.
MATERIAL Y REACTIVOS

Determinacin de Clorofila en la muestra

problema

Espectrofotmetro.
Agitador de tubos de ensayo.
Balanza.
Gradillas con 12 tubos de ensayo.
Juego de pipetas graduadas (0.5, 1.0, 2.0, 5.0, 10.0
y 25.0 ml).
Juego de micropipetas
Probetas 100 ml
Vaso de precipitado 100 mL
7 Balones aforados de 25 mL
Agitador de vidrio
Mortero
Celdas de cuarzo para medir en el
espectrofotmetro.

1.
2.
3.
4.
5.

Pesar 200 g de acelga fresca

Cortarla en trozos muy pequeos
Dejar en estufa 3 h a 40C
Pesar la acelga y determinar el % de humedad
Colocar el material seco dentro de los dedales
de soxhlet y llevar a cabo la extraccin con una
mezcla de etanol-ter etlico (9:1) durante 3 h.
(tener en cuenta el volumen de solvente
empleado por peso de muestra seca).
6. Retirar el extracto y descartar el material slido.
7. Secar completamente el extracto, conociendo el
peso de la capsula empleada y el peso de la
muestra despus de secada.
8. Preparar una solucin de 1 mg/mL en la mezcla
etanol-ter etlico para hacer la determinacin
de clorofila en las condiciones que se realiz la
curva de calibracin.

PROCEDIMIENTO
Espectros de absorcin UV-Vis para clorofila
para determinar su max
4

CUESTIONARIO
(para incluir en el informe del lab. a mano).

Calcular el coeficiente de extincin molar, .

1. El coeficiente de extincin molar de cierto soluto

es de 2.3x104. Calcular la transmitancia para una
solucin 3.00x10-6 M. utilizando una cubeta de 4.00
cm.

7. Se sabe que las sales de VO +2 tienen un

coeficiente de extincin molar de 14000 a su
longitud de onda de mxima absorcin. Si se utiliza
celda de 9.00 cm, calcular cuntos mg/ml de VO +2
debern estar presentes para producir una
absorbancia de 0.673. (Pm VO+2 = 91.942).

2. Se sabe que una sustancia tiene un coeficiente de

extincin molar de 12000 a su longitud de onda de
mxima absorcin. Calcular que molaridad de esta
sustancia. Podr medirse en un espectrofotmetro,
si se desea que la lectura de absorbancia sea de
0.870, en una cubeta de 1.00 cm?.

8. El coeficiente de extincin molar () del cido

benzoico en metanol es aproximadamente 1850 a
285nm. cul ser la mxima concentracin de
cido benzoico, en g/ml que puede usarse en una
celda de 1.00 cm para que la absorbancia no
exceda de 0.103?

3. El porcentaje de transmitancia de una solucin

acuosa de fumarato de sodio a 260 nm y 25C, es
de 17.2% para una solucin 6x10 -4 M. en una celda
de 1.00 cm. Calcular la absorbancia y el coeficiente
de extincin molar correspondiente.

9. Una solucin de permanganato de potasio de

concentracin C tiene una transmitancia de 70.0 %
en una celda de 1.00 cm., a una determinada
longitud de onda. Si se dobla la concentracin,
calcular. a. El % de T b. La absorbancia y la
concentracin de KMnO4 para dar 70.0 % de T en
una celda de 10.00 cm de paso de luz.

4. Una solucin de concentracin C de una

sustancia coloreada tiene un %T de 84.0 si la
concentracin se cuadriplica en %T es de 46.2.
Demostrar que la solucin obedece la ley de
Lambert-Beer y calcular el %T para una
concentracin 2C.

10. Una muestra de 3.000 g que contiene manganeso se

determin por espectrofotometra, se prepar un extracto
de 750 ml de la solucin de concentracin desconocida,
se tom una alcuota de 2 ml y se diluy en un baln
aforado de 20 ml. Luego, para poder interpolar la curva
estndar de manganeso a 545 nm de la ltima solucin,
se tom una alcuota y se diluy en una solucin 1:3. La
transmitancia de la solucin medida en un espesor de 1
cm es de 30 %. Si el coeficiente de extincin molar es
2200 L/mol.cm, determine: a) % de Mn en la muestra b)
mg/Kg de Mn en la muestra.

5. Cuando se analiza una muestra que contiene

hierro (II) por el mtodo del - bipiridilo se obtiene
una transmitancia de 53.5% contra un blanco de
reactivos, en una cubeta de 1.00cm. Si el coeficiente
de extincin molar del - bipiridilo ferroso es de
8.950. cul ser la concentracin del hierro en la
muestra, en moles/litro?
6. Utilizando una cubeta de absorcin de 1.00 cm,
se determin la transmitancia de la luz de 463 nm
(463 A) para una solucin de bromo en tetracloruro
de carbono, encontrndose los siguientes
resultados:

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