Gua de laboratorio N0 3.

DIVERSIDAD CELULAR I
LA CLULA BACTERIANA Y LA CLULA FNGICA

PRELABORATORIO
Antes de poder abordar el tema de diversidad debes tener algunos conceptos
previos. Resuelve el siguiente cuestionario antes de realizar la prctica de
laboratorio.
1. Cuales son las principales formas y agrupaciones bacterianas que se
pueden encontrar? Diligencia el siguiente cuadro.

2. Existen muchos mtodos de tincin de microorganismos, principalmente

de clulas bacterianas. El mas usado es la Tincin de gram. Busca la
funcin y el tiempo de aplicacin de cada uno de los siguientes
reactivos.

3. Dentro de las tinciones para microorganismos podemos encontrar las tinciones

simples, diferenciales o compuestas y coloraciones especiales, consulta un
ejemplo de cada una de ellas y completa el siguiente cuadro.

4. Completa el siguiente cuadro comparando algunas diferencias entre la

clula bacteriana y fngica:

1. OBJETIVOS
Reconocer la estructura de la clula bacteriana y fngica con el uso de
diferentes coloraciones.
Conocer e implementar protocolos de tincin de diferentes montajes.

2. INTRODUCCION
Dentro de los microorganismos se pueden encontrar las bacterias, los hongos y
los virus. Para realizar el estudio microbiolgico de cualquier muestra, es
necesario la puesta en marcha de una serie de procesos estandarizados de
laboratorio, que permitan en primer lugar reconocer a los microorganismos
presentes. Inicialmente se debe desarrollar una descripcin de sus
caractersticas macroscpicas seguido de una caracterizacin microscpica de
los mismos.
Para realizar una descripcin macroscpica de bacterias debemos tener en
cuenta los siguientes parmetros: Elevacin, Borde o margen, aspecto,
consistencia, pigmento o color y olor de la colonia (Tabla 1).

Tabla No.1. Parmetros gua para la descripcin macroscpica de

Bacterias

Por otra parte para realizar una descripcin macroscpicas de las colonias
fngicas, se deben tener presentes caractersticas la apariencia, consistencia,
color, anverso reverso de las colonias. Es esencial que la descripcin se base
en cultivos maduros de 1 a 3 semanas de edad. Se debe tener en cuenta el
color de la colonia tanto al anverso como al reverso, as como la produccin o
no de pigmentos liberados al medio. Es importante anotar en que medio de
cultivo estaba creciendo el hongo es decir sobre cual medio se realiz la
descripcin, ya que en ocasiones la morfologa macroscpica de un hongo
cambia segn el medio de cultivo. Tabla 2.
Tabla No.2. Parmetros gua para la descripcin macroscpica de
colonias fngicas

Para poder realizar una descripcin microscpica de los microorganismos se

hacen necesarias las coloraciones, debido a que por lo general las bacterias,
hongos son transparentes y esto dificulta el estudio de los detalles
morfolgicos cuando se examinan en su estado natural.
Las coloraciones permiten diferenciar formas, agrupaciones, caractersticas
tintoriales y estructuras de los diferentes microorganismos. A menos que se
quiera demostrar alguna caracterstica morfolgica especfica que dependa del
tiempo del cultivo, en general se aconseja que se utilicen medios jvenes para
los mtodos de coloracin de rutina.
COLORACIONES.
Los colorantes biolgicas tienen varias aplicaciones en microbiologa, se usan
para clasificar las bacterias en Gram positivas y Gram negativas, tambin para
observar las diferentes estructuras microbianas como pared, capsula, espora,
flagelo, ncleo y grnulos, tienen utilidad para la observacin de levaduras y
estructuras, en medios de cultivo se emplean como indicadores o inhibidores
selectivos.
Al aplicar un colorante a la preparacin microbiana, las bacterias se tien
hacindolas resaltar con claridad, debido a la composicin qumica tan
diferente con respecto al medio que las rodea, adems permite estudiar las
caractersticas morfolgicas y emplear mayores amplificaciones microscpicas.
Al poner en contacto una clula bacteriana con un colorante, ocurre un
intercambio de iones entre el colorante y los sitios activos de la superficie o
del interior de la clula. Los iones tenidos del colorante reemplazan a los iones
de los componentes celulares, por ejemplo, el catin azul de metileno,
reemplaza el catin de sodio, dndoles el color.

Segn la estructura que el colorante tie en la bacteria, las coloraciones se han

clasificado en:

-Coloraciones simples: En las que se emplea un solo colorante para el

proceso
-Coloraciones compuestas y diferenciales: En estas se usa ms de un
colorante, y con la misma coloracin las clulas se tien de manera diferente.
-Coloraciones especiales: permiten la observacin de estructuras especiales
de la bacteria como esporas, glicocalix, cpsulas, flagelos.

COLORACIONES PARA BACTERIAS

COLORACIN DE GRAM
La coloracin de Gram fue descrita en 1884, por el citlogo Christian Gram,
para teir bacterias presentes en los tejidos. Actualmente contina siendo la
ms empleada en microbiologa, esta clasificada como una coloracin
compuesta y diferencial, debido a que en el proceso se utilizan dos colorantes:
el cristal violeta y la fuscina bsica, y dependiendo de la coloracin que toma la
pared bacteriana se pueden encontrar dos grandes categoras denominadas:
Gram positivas (se tien de cristal violeta) y las Gram negativas (toman el color
de la fuscina bsica).

Tabla No 3. Reaccin de las clulas frente a los componentes de la coloracin

de Gram.

Coloraciones para hongos

Los mtodos de identificacin de rutina en el laboratorio son las coloraciones
simples como azul de lactofenol, KOH directo de lesiones y cultivos en medios
especficos para hongos como Agar PDA, Extracto de levadura, Extracto de
malta, Medio Sabouraud, Mycosel, y OGY entre otros.
Colorante azul de lactofenol: colorante que esta compuesto de cido
Lctico 20g, Cristales de fenol 20g, Glicerina 40g, Agua 20 mL los cuales se
mezclan y una vez disueltos se les adiciona 0,05g de azul de algodn. La
coloracin se fundamenta en que las paredes de los hongos por sus radicales
glcidos (Quitina y/o Glucano ) reaccionan con el Azul de lactofenol tomando
una coloracin azulosa, coloracin que es mantenida gracias al pH cido que
ejerce el cido lctico y a la Glicerina que acta preservando la integridad de la
pared celular.
Por medio de la observacin microscpica se logran observar estructuras como
hifas septadas o cenocticas, esporas, y estructuras reproductivas que sirven
como criterio de clasificacin.

Hifa septada

Hifa cenoctica

2
1

3
5
4

1.Esporangio.
2.Esporangiosporas
3.Esporangioforo
4.Rizoides
5.Estolones

Figura 1. Algunas estructuras microscpicas fngicas.

3. MATERIALES Y METODOS
Asas
microbiolgicas:
asas bacteriolgicas y
micolgicas
Aceite de inmersin
Azul de lactofenol
Colorantes
de
Cristal
violeta,
alcohol, fushina
Cubreobjetos

Gram:
lugol,

Cultivo de bacterias en
agar nutritivo
Cultivo de hongos
agar PDA
Portaobjetos
Mecheros
Microscopio
Solucin salina estril

en

Para la observacin microscpica de bacterias:

1. Haz el frotis de una colonia bacteriana. Toma una gota de la solucin
salina esterl y dispnla sobre el portaobjetos, a continuacin esteriliza el
asa, enfrala y toma una porcin de la colonia bacteriana que quieres
observar y homogenzala con la gota de agua.
2. Deja secar al aire por unos minutos y luego flamea el portaobjtetos con
el mechero para favorecer la fijacin de la muestra al mismo.
3. Realiza la coloracin de gram as:

Cristal violeta (1 minuto). Lavar

Lugol (1 minuto). Lavar
Alcohol acetona (10 a 20 sg). Lavar
Fucsina (1 minuto). Lavar y dejar secar

4. Observa en 10x, agrega una gota de inmersin a la preparacin y

observa en el objetivo de 100x. Diligencia el cuadro correspondiente que
encontraras ms adelante en la seccin de registro de resultados.

Para la observacin microscpica de hongos filamentosos

1. Toma una lmina y agrgale una gota de azul de lactofenol. Esteriliza

el asa micolgica.
2. Destapa el cultivo cerca al mechero y enfra el asa.
3. Toma un inculo pequeo. Lleva el inculo a la gota de azul de
lactofenol
4. Separa el inoculo con ayuda del asa o un cubreobjetos
5. Coloca la laminilla sobre el montaje evitando que se formen burbujas,
observa con el objetivo de 10X y 40X.

Al finalizar la practica lava el material

que utilizaste. Limpia y guarda el
microscopio
en
la
gaveta
correspondiente y deja ordenado el
sitio de trabajo.

5. REGISTRO DE RESULTADOS

A. Diligencia el siguiente cuadro para registrar los resultados de la

observacin microscpica de bacterias.

B. Describe las colonias fngicas que observaste y realiza esquemas de las

estructuras fngicas que lograste observar en el montaje con azul de
lactofenol.

(A/R): Anverso/ Reverso

REFERENCIAS
Berdugo y Useche.2010. Manual de prcticas para cursos de Biologa celular y
molecular.
Lizarazo, L. (2007). Tcnicas en microbiologa general. UPTC