Vitamina C, Cancro e Citotoxicidade - Marcação e Estabilidade in Vitro e in Vivo

Marcao e estabilidade in vitro e in vivo
Marcao e estabilidade in vitro e in vivo
II
Agradecimentos
Aps a realizao dessa dissertao e avaliando as contribuies que muitas pessoas
tiveram durante este ano, no podendo deixar de os referir, expresso aqui os meus
agradecimentos:
Professora Doutora Maria Filomena Botelho, Directora do Instituto de

Biofsica e Biomatemtica da Faculdade de Medicina da Universidade de Coimbra, pela
orientao deste projecto, pelo apoio, disponibilidade, dedicao e empenho ao longo do seu
desenvolvimento, em especial obrigada pela partilha de conhecimento, experincia cientfica e
pelas crticas e conselhos durante a durao do projecto.
Ao Doutor Paulo Crespo agradeo por ter estado na origem deste projecto to
aliciante e pelas suas palavras de apoio sempre com um toque de motivao.
Margarida Abrantes, um agradecimento especial, pela co-orientao,
dedicao, amizade, pacincia em ensinar e pela disponibilidade demonstrada em me
ajudar tanto quando precisava de uma co-orientadora ou de uma amiga.
Catarina Mamede, pela amizade, disponibilidade, pela pacincia por me
acompanhar durante o tempo da durao do projeto pela ajuda e apoio incondicional
na realizao deste.
Mafalda Laranjo e Ana Brito, pela disponibilidade em ajudar sempre que
precisava, Professora Brbara Oliveira pela disponibilidade em me ajudar na anlise
estatstica dos resultados, aos estagirios de Medicina Nuclear da ESTS do Porto pela
ajuda que me deram ao longo do ano, Cludia Claridade pela ajuda diria e aos
restantes elementos do servio da biofsica que de alguma forma tero contribudo

para este trabalho.
Agradeo s minhas colegas de casa pelo ambiente saudvel que
proporcionaram tornando possvel a concluso deste manuscrito.
Aos meus pais, e a minha irm que sempre me apoiaram mesmo estando longe
nunca deixei de sentir o carinho e a preocupao. Obrigada por acreditarem em mim.
Ao meu namorado, Bruno, por me encorajar sempre que apresentei fraquezas,
por acreditar em mim e pela pacincia que teve nesses ltimos dois anos.
Agradeo tambm a todos os meus colegas de curso por serem verdadeiros
companheiros de batalha e pelo apoio e encorajamento que demonstraram ao longo
desses sete anos de curso.
Por ltimo acredeo a Deus que me deu sade, assim como as pessoas que
estiveram ligadas a esse projecto, e a todos os meus familiares e amigos
ii
Resumo
A vitamina C uma substncia essencial apresentando inmeras propriedades
fisiolgicas. Ela apresenta-se sob duas formas, a reduzida e a oxidada. O cido
ascrbico (AA), a forma reduzida da vitamina C, um potente antioxidante
hidrossolvel, na medida em que neutraliza os radicais livres, constituindo um
potencial mecanismo anticancergeno. O AA actua tambm como pr-oxidante,
promovendo a formao de espcies reactivas de oxignio (ROS), como o perxido de
hidrognio (H2O2), que comprometem a viabilidade celular. Por outro lado, a maioria
das clulas tumorais no transporta directamente o AA para o seu interior, razo pela
qual as clulas obtm a vitamina C na sua forma oxidada, o cido dehidroascrbico
(DHA). As clulas tumorais demonstram ainda outra particularidade, a diminuio da
catalase (enzima responsvel pela destoxificao do H2O2), num factor entre 10 e 100,
relativamente s clulas normais. Assim, o aumento da produo de H2O2, acoplado
deficincia da actividade da catalase nas clulas neoplsicas e presena de metais de
transio, poder redundar na citotoxicidade selectiva da vitamina C e na consequente
revelao do seu potencial teraputico.
O objectivo deste trabalho avaliar o metabolismo da vitamina C e mostrar o
efeito citotxico da forma reduzida, em clulas de adenocarcinoma colorectal e de
melanoma melanoctico, recorrendo a mtodos bioqumicos e de imagiologia nuclear.
Primeiramente, efectuou-se a marcao da forma reduzida da vitamina C com

tecncio, de forma a obter um complexo radioactivo (99mTc-AA) passvel de ser usado
em imagiologia nuclear. Sendo que a sua pureza radioqumica determinada por HPLC.
Posteriormente, realizaram-se estudos in vitro, com a linhas celulares de
adenocarcinoma colorectal (WiDr) e melanoma melanoctico (A375), que incluram
iii
estudos de captao com
99m
Tc-AA, e estudos de avaliao da citotoxicidade da
vitamina C. Estes estudos incluram os estudos de avaliao da proliferao por

colorimetria e de sobrevivncia por ensaios clonognicos. Sendo que para estudos de
estabilidade por HPLC foram usadas as WIDr, pela avaliao do meio extracelular.
Por ltimo, foram feitos estudos in vivo, em que consistiu no desenvolvimento
de xenotransplantes de WiDr em ratinhos Balb/c nu/nu, que posteriormente foi feito
estudos de biodistribuio do
99m
Tc-AA. A avaliao do crescimento tumoral em
ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes pelo efeito do AA foi tambm

realizada.
Desta feita, a marcao do AA com
99m
Tc-AA, foi desenvolvida tendo uma
elevada eficincia de marcao, confirmada por HPLC. Os estudos in vitro realizados

deram resultados que levam a concluir que o AA tem potencial no tratamento do
cancro pois, apresenta efeitos anti-proliferativos nas clulas tumorais, esses resultados
foram comprovados nos estudos in vivo. Onde se tira tambm que o complexo 99mTcAA apresenta baixa captao tumoral como foi observada nos estudos in vitro.
iv
Lista de abreviaturas
-Selectividade
AA cido Ascrbico
ADN cido Desoxirribonucleico
ATP Trifosfato de Adenosina
Bq Becquerel (uma desintegrao por segundo - unidade do sistema internacional)
CAT Catalase
CPM Contagens por Minuto
CPS Contagens por Segundo
Da Dalton
DHA cido Dehidroascrbico
DMEM Dubelccos Modified Eagles Medium
GLUT Transportadores de Glicose
GSH glutationa reductase
HETP - Height Equivalent to the Theoretical Plate
HPLC High Performance Liquid Chromatography
H2O2 Perxido de Hidrognio
KeV kilo electres volte
Km Constante de Michaelis
LEHR Low Energy High Resolution

MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide]
NADPH - nicotinamide adenine dinucleotide phosphate-oxidase
PBS Phosphate Buffer Solution
R - Resoluo
RIA - Radioimunoensaio
Rf Retention Factor
ROI Region of interest
ROS Reactive Oxygen Species
SOD Superoxide Dismutase
SVCT Sodium Vitamin C Cotransporters
UV - Ultravioleta
V Volte
vi
ndice Geral
Agradecimentos .......................................................................................................... i
Resumo ..................................................................................................................... iii
Lista de abreviaturas .................................................................................................. v
ndice Geral .............................................................................................................. vii
ndice de Figuras ........................................................................................................ x
ndice de Tabelas ....................................................................................................... xi
ndice de Grficos ...................................................................................................... xi
ndice de Quadro ......................................................................................................xiv
ndice de Equaes ...................................................................................................xiv
Captulo I - Introduo ........................................................................................ 1
1.
Vitamina C .......................................................................................................... 3
1.1.
1.1.1.
Antioxidante............................................................................................................. 6
1.1.2.
Pr-oxidante ............................................................................................................ 7
1.2.
vii
Funes......................................................................................................................... 5
Transporte .................................................................................................................... 8
1.2.1.
Difuso Facilitada (GLUTs) ........................................................................................ 9
1.2.2.
Transporte Activo (SVCTs)....................................................................................... 10
2.
Stresse Oxidativo.............................................................................................. 13
2.1.
Vitamina C e Cancro .................................................................................................... 14
3.
Potencial Teraputico/Citotoxicidade ............................................................... 16
4.
Medicina Nuclear ............................................................................................. 17

4.1.
Radiofrmacos ............................................................................................................ 18
4.2.
Controlo de Qualidade................................................................................................. 20
4.2.1.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography) .................................................. 21
Captulo II - Materiais e Mtodos ..................................................................... 27
1.
Estudos de Qumica .......................................................................................... 29

1.1.
2.
Marcao do AA com tecncio-99m (99mTc).................................................................. 29
Estudos in Vitro ................................................................................................ 33

2.1.
Culturas celulares ........................................................................................................ 33
2.2.
Estudos de captao .................................................................................................... 34
2.3.
Determinao da viabilidade cellular ........................................................................... 35
2.4.
Estudos de citotoxicidade ............................................................................................ 36
2.4.1.
Avalio da proliferao celular por colorimetria .................................................... 36
2.4.2.
Avaliao da sobrevivncia celular atravs do ensaio clonognico .......................... 37
2.5.
Estudos de Estabilidade da vitamina C ......................................................................... 38
2.5.1.
Avaliao do meio extracelular ............................................................................... 39
viii
3.
Estudos in Vivo ................................................................................................. 40

Estudos de biodistribuio em ratinhos normais com
3.2.
Desenvolimento de Xenotransplantes.......................................................................... 42
3.3.
Estudos de biodistribuio em ratinhos com xenotransplantes com 99mTc-AA............... 42
3.4.
Imagiologia com 99mTc-AA ............................................................................................ 43
3.5.
Avaliao do crescimento tumoral in vivo aps tratamento com AA ............................. 44
Tc-AA .................................... 41
4.
Anlise estatsca ............................................................................................... 44
Captulo III- Resultados ..................................................................................... 47
1.
Estudos de qumica .......................................................................................... 49

1.1.
2.
Preparao e controlo de qualidade do 99mTc-AA ......................................................... 49
Estudos in vitro................................................................................................. 56
2.1.
Estudos de captao .................................................................................................... 56
2.2.
Estudos de citotoxicidade ............................................................................................ 58
2.2.1.
Avaliao da proliferao celular por colorimetria .................................................. 58
2.2.2.
Avaliao da sobrevivncia celular por ensaios clongnicos .................................. 61
2.3.
Estudos de estabilidade da vitamina C ......................................................................... 62
2.3.1.
3.
Avaliao do meio extracelular ............................................................................... 66
Estudos in vivo ................................................................................................. 71

3.1.
ix
99m
3.1.
Estudos de Biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA .................................... 71
3.2.
Estudos de Biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA .................................... 72
3.3.
Imagiologia com 99mTc-AA ............................................................................................ 76
3.4.
Avaliao do crescimento tumoral in vivo aps tratamento com AA............................. 77
Captulo IV Discusso ..................................................................................... 79
Concluso................................................................................................................. 88
Bibliografia ............................................................................................................... 92
ndice de Figuras
Figura 1 : Biossntese da vitamina C a partir da glicose. (Adaptado de Schorah et.al. 1973) ------------------ 4
Figura 2: Reaco de oxidao do cido ascrbico em cido dehidroascrbico.(Adaptado de(Levine, et al.,
1999) ------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 4
Figura 3: Esquema do sistema de transporte do DHA atravs dos GLUT. (Retirado de (Li and Schellhorn,
2007) ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 10
Figura 4: Esquema representativo do sistema de transporte do AA atravs dos SVCT.(Retirado de(Li and
Schellhorn, 2007)-------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 11
Figura 5: Esquema ilustrativo de um aparelho do HPLC. 1. Reservatrio de solventes 2. Vlvulas de
abertura 3. Bomba 4. Misturador 5. Vlvula interna 6. Injector 7.Pr-coluna 8.Coluna 9. Detectores 10.
Estao de aquisio de dados 11. Reservatrio de resduos. A seta azul, representa o sentido da
progresso do solvente durante uma anlise Adaptado de Meyer, 2004. --------------------------------------- 23
Figura 6: Visualizao das colnias formadas. Controlo visualizado no microscpio ptico - A375 (A) e
WiDr (C) e o nmero de colnias formadas aps a exposio das clulas a 2 mM de AA - A375 (B) e WiDr
(D). Visualizao macroscpica das colnias referentes ao controlo - A375 (E) e WiDr (G) e colnias
formadas aps exposio das clulas a 2 mM de AA A375 (F) e WiDr (H). ------------------------------------ 62
Figura 7: Imagens obtidas atravs da cmara de raios gama. A - Imagem esttica aos 60 minutos aps a
injeco do 99mTc-AA, de um ratinho com xenotransplante. A seta aponta para a localizao do tumor. B
Imagem esttica aos 30 munitos aps a injeco do 99mTc-AA, de um ratinho normal, onde podem ser
vistos os dois rins. Todas as imagens esto referenciadas mesma escala de cores mostrada. ------------ 77
ndice de Tabelas
Tabela 1: Resumo dos tempos de incubao e respectivos tempos de repouso ------------------------------- 37
Tabela 2: Amostras injectadas no HPLC para o estudos da estabilidade da vitamina C. ---------------------- 39
Tabela 3: Amostras injectadas no HPLC na presena de metabolismo celular para avaliar o meio
extracelular. -------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 40
Tabela 4: Caractersticas das imagens dinmicas e estticas. ------------------------------------------------------- 43
Tabela 5: Mdias das eficincias de marcao de quatro formulaes farmacuticas ao longo do tempo
------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------ 54
Tabela 6: Mdias dos tempos de reteno referentes a 3 amostras de AA, DHA e DMEM analisadas por
HPLC. ----------------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 63
ndice de Grficos
Grfico 1 : Cromatograma da amostra do AA (10mM) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica. ------------------------------------------------------------------------------------- 49
Grfico 2: Cromatograma da amostra de FeCl3 (0,1N) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
Grfico 3: Cromatograma da amostra do 99mTcO4- injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
Grfico 4: Coromatogramas do controlo de qualidade do Kit, resultante de uma formulao
farmautica. A Cromatograma resultante da decteco UV, representando os compostos no
radioactivos presentes na formulao. B Cromatograma resultante da deteco de radioactividade
correspondente ao controlo de qualidade do kit aos zero minutos aps a marcao observando uma
eficincia de marcao igual a 74,16%. C Cromatograma resultante da deteco de radioactividade
correspondente ao controlo de qualidade do kit a 4 horas aps a marcao observando uma eficincia
de marcao igual a 81,84%. D Cromatograma resultante da deteco de radioactividade
correspondente ao controlo de qualidade do kit as 24 horas aps a marcao observando uma eficincia
de marcao igual a 90,40%. ----------------------------------------------------------------------------------------------- 51
xi

correspondente ao controlo de qualidade do kit as 24 horas aps a marcao observando uma
eficincia de marcao igual a 90,91%. ---------------------------------------------------------------------------------- 52
Grfico 6: Cromatogramas de uma formulao farmacutica de elevada eficincia de marcao. A
Cromatograma resultante da decteco UV, representando os compostos no radioactivos presentes na
formulao. B Cromatograma resultante da deteco de radioactividade correspondente ao controlo
de qualidade do kit aos zero minutos aps a marcao observando uma eficincia de marcao igual a
99,45%. C Cromatograma resultante da deteco de radioactividade correspondente ao controlo de
qualidade do kit a 6 horas aps a marcao observando uma eficincia de marcao igual a 99,51%. - 53
Grfico 7: Cromotograma refente aos picos de AA (pico B) e FeCl3 (pico A) detetados por UV. ------------ 54
Grfico 8: Captao do
concentrao de
99m
99m
Tc-AA e do
Tc-AA e do
99m
99m
Tc-livre nas WiDr. As clulas foram incubadas com a mesma
Tc-livre e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os
dados expressam a mdia de oito experincias intependentes ---------------------------------------------------- 57

Grfico 9: Captao do
concentrao de
99m
99m
Tc-AA e do
Tc-AA e do
99m
99m
Tc-livre nas A375. As clulas foram incubadas com a mesma
dados expressam a mdia de oito experincias intependentes. --------------------------------------------------- 57

Grfico 10: Captao do
99m
mesma cancentrao do
99m
Tc-AA nas WiDr e A375. As duas linhas celulares foram incubadas com a
Tc-AA e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os dados
expressam a mdia de oito experincias intependentes. ------------------------------------------------------------ 58

Grfico 11: Curvas de dose-resposta do AA nas WiDr. A Grfico representando o efeito do AA com
uma e quatro horas de exposio com 24 horas de descanso. B Grfico representando o efeito do AA
com uma e quatro horas de exposio com 48 horas de descanso. Os resultados expressam a mdia de
seis experincias independentes. ----------------------------------------------------------------------------------------- 59
Grfico 12:Curvas de dose-resposta do AA nas A375. A Grfico representando o efeito do AA com uma
e quatro horas de exposio com 24 horas de descanso. B Grfico representando o efeito do AA com
uma e quatro horas de exposio com 48 horas de descanso. Os resultados expressam a mdia de seis
experincias independentes ------------------------------------------------------------------------------------------------ 60
A avaliao da sobrevivncia foi feita a fim de confirmar os efeitos pr-oxidantes da vitamia C em clulas
tumorais. Assim os efeitos que podero surgir, devido exposio ao AA, so avaliados depois de um
longo perodo de tempo. O grfico 13, mostra a relao entre a percentagem de sobrevivncia das
clulas e a concentrao do AA. Grfico 13: Relao entre a percentagem do factor de sobrevivncia e a
xii
concentrao do AA, nas WiDr e A375. As linhas celulares foram tratadas com as concentraes
referidas no grfico. Os resultados so a mdia de trs estudos independentes.------------------------------ 61
Grfico 14: Cromatogramas das amostras padro injectadas no HPLC. A Amostra do DHA (10 mM). B
Amostra DMEM. C Amostra do AA (10mM).-------------------------------------------------------------------------- 63
Grfico 15: Cromatogramas de amostras de DMEM com 10 mM de AA. A Cromatograma
correspondente injeco do DMEM com 24 horas de incubao. B Cromatograma de DMEM e AA
para 1 hora de incubao. C - Cromatograma de DMEM e AA para 24 hora de incubao. D Cromatograma de DMEM e AA para 48 hora de incubao. E - Cromatograma de DMEM e AA para 72
hora de incubao. F - Cromatograma de DMEM e AA para 96 hora de incubao.--------------------------- 64
Grfico 16: Cromatogramas de amostras de DMEM com 10 mM de DHA. A Cromatograma
correspondente injeco do DMEM com 24 horas de incubao. B Cromatograma de DMEM e DHA
para 1 hora de incubao. C Cromatograma de DMEM e DHA para 24 hora de incubao. D
Cromatograma de DMEM e AA para 48 hora de incubao. E Cromatograma de DMEM e DHA para 72
hora de incubao. F Cromatograma de DMEM e DHA para 96 hora de incubao. ------------------------ 66
Grfico 17: Cromatograma de amostras controlo. A 1 hora de incubao. B 96 horas de incubao. 67
Grfico 18: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com AA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do AA e na ausncia (C) com trs concentraes
referidas no grfico. Aps injeco no HPLC os respectivos tempos de reteno foram comparados bem
como as reas por integrao grfica.------------------------------------------------------------------------------------ 68
Grfico 19: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com DHA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do DHA e na ausncia (C) com trs concentraes
como as reas por integrao grfica.------------------------------------------------------------------------------------ 68
Grfico 20: curva de calibrao para determinar a linearidade da deteco UV. Foram injectadas cinco
amostras de AA com as concentraes apresentados no grfico. ------------------------------------------------- 69
Grfico 21: Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 3 mM.
Aps integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.----------------------------------------- 69
Grfico 22 : Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 7 mM.
Grfico 24: A - Biodistribuio do
99m
Tc-AA. Depois de passados os tempos, descritos nos grficos, da
administrao do radiofrmaco, os ratinhos foram sacrificados, os rgos colhidos e a percentagem de

dose injectada por grama de tecido quantificada. B - Fraco percentual do grfico A.---------------------- 72
xiii
99m
Tc-AA em ratinhos portadores de xenotransplantes. Depois de
passados os tempos, descritos nos grficos, da administrao do radiofrmaco, os ratinhos foram

sacrificados, os rgos colhidos e a percentagem de dose injectada por grama de tecido quantificada. B Fraco percentual do grfico A ------------------------------------------------------------------------------------------- 73
Grfico 26: Percentagem da actividade administrada por grama de tecido tumoral. ------------------------- 75
Grfico 27: Razo entre as captaes tumor/osso e tumor/sangue. ---------------------------------------------- 76
Grfico 28: Resposta in vivo das WiDr ao tratamento com o AA. O resultado uma mdia de n=6 para
cada grupo. --------------------------------------------------------------------------------------------------------------------- 78
ndice de Quadro
Quadro 1: Tempo de reteno das amostras padro injectadas no HPLC. Os valores referentes s
amostras padro representam a mdia de trs injeces ...................................................................... 50
Quadro 2: Mdia dos tempos de reteno (com n=6) referentes amostras controlo analisadas no HPLC.
............................................................................................................................................................ 67
Quadro 3: Anlise da razo entre a capatao do 99mTc-AA em ratinhos Balb/c nu/nu atmicos e normais.
............................................................................................................................................................ 74
ndice de Equaes
Equao 1: Dismutao do radical ascorbil.............................................................................................. 7
Equao 2: A e B reao de Fenton ......................................................................................................... 7
Equao 3: Reaco de reduo de compostos derivados de quinona ..................................................... 7
Equao 4: Equao de Michaelis-Menten .............................................................................................. 9
Equao 5: Resoluo ........................................................................................................................... 24
Equao 6: A - Nmeros de pratod tericos (N). B Eficincia (HETP) ................................................... 24
Equao 7: Selectividade () ................................................................................................................ 24
Equao 8: Equao para a determinao da captao do radiofrmaco ............................................... 35
Equao 9: determinao da viabilidade celular .................................................................................... 35
Equao 10: A - Eficincia da placa. B - Factor de sobrevivncia. ........................................................... 38
Equao 11: Linearidade (retirado de Snyder, 2002) ............................................................................. 40
Equao 12: Percentagem de dose do radiofrmaco injectado por grama de rgo............................... 42
Equao 13: Clculo do volume do tumor ............................................................................................. 42
xiv
Captulo I - Introduo
Vitamina C, cancro e citotoxicidade: marcao e estabilidade in vitro e in vivo
Introduo
1. Vitamina C
As vitaminas fazem parte de uma classe de nutrientes essenciais para o organismo
humano, devido s suas funes em mltiplos processos bioqumicos e fisiolgicos. O
ascorbato ou cido ascrbico (AA), mais tarde designado por vitamina C, um derivado da
glicose isolado em 1928 pelo bioqumico e Prmio Nobel Szent-GyorGyi. A biossntese do cido
ascrbico a partir da glicose decorre principalmente no fgado ou nos rins de vrios animais
devido presena do enzima gulonolactona oxidase (GULO) responsvel por catalizar o ltimo
passo da reaco (figura 1). Os humanos, os primatas e outros animais perderam a capacidade
de sintetizar endogenamente o cido ascrbico devido s inmeras mutaes que levaram a
inactivao do gene que codifica o enzima GULO; deste modo necessrio obter a vitamina C
a partir da dieta. Uma alimentao deficiente em vitamina C leva ao desenvolvimento do
escorbuto, doena caracterizada por afectar a sntese do colagnio, dificuldade em cicatrizao
das feridas, defeitos na formao dos dentes e na ruptura dos vasos sanguneos provocando
equimoses. Uma dieta rica em frutos e vegetais frescos aumenta a ingesto de vitamina C,
prevenindo assim o escorbuto. Aceita-se a designao de ascorbato ou cido ascrbico (AA)
para a vitamina C, sendo esta a forma reduzida, tendo o cido dehidroascrbico (DHA) como a
forma oxidada. Estas duas formas coexistem de igual modo nos alimentos ricos em vitamina C,
sendo que a forma reduzida a fisiologicamente activa. A sntese do DHA a partir do AA
atravs de uma reaco de oxidao, onde dois electres so removidos, dando origem
primeiramente ao radical ascorbil e de seguida ao cido dehidroascrbico, essa reaco
mediada pelos enzimas redutases (figura 2) (Fransson and Mani, 2007; Levine, et al., 1999;
Verrax and Calderon, 2008).
Figura 1 : Biossntese da vitamina C a partir da glicose. (Adaptado de Schorah et.al. 1973)
A absoro da vitamina C, tanto na forma reduzida como na forma oxidada provenientes

da dieta, ocorre na mucosa bucal e maioritariamente no estmago e nos intestinos. A primeira
absoro, feita na mucosa bucal, principalmente realizada pela difuso passiva atravs das
cavidades da membrana bucal, sendo que a maior fraco absorvida no tracto
gastrointestinal atravs da difuso facilitada e transporte activo mediada por transportadores.
Aps a absoro da vitamina c, esta entra no sangue e distribuda por outras clulas e tecidos,
sendo que na glndula supra-renal, nos glbulos brancos, no msculo esqueltico e no crebro
(hipfise ou glndula pituitria) so os tecidos onde podemos encontrar maiores
concentraes do AA (Wilson, 2005). A quantidade de vitamina C que no totalmente
absorvida pelas clulas sofre uma reabsoro nos tbulos renais proximais (Li and Schellhorn,
2007).
Figura 2: Reaco de oxidao do cido ascrbico em cido dehidroascrbico.(Adaptado de(Levine, et

al., 1999)
Introduo
1.1.
Funes
Como referido anteriormente a vitamina C desempenha um papel importante em

diversos processos fisiolgicos. Para alm de prevenir o aparecimento do escorbuto essencial
na sntese do tecido conjuntivo mais concretamente do colagnio, de aminocidos, da
carnitina e catecolaminas, tambm actua como co-enzima no metabolismo da tirosina, do
cido flico e triptofano e do colesterol, aumentando a sua eliminao do sangue, sem deixar
de referir que esta vitamina um agente redutor devido a sua grande capacidade de doar
electres. Possui a capacidade de doar dois electres formando o radical ascorbil (A-) sendo
que estes electres so usados em reaces de hidroxilao e na amidao de hormonas
peptdicas. Essas funes so conseguidas pela ingesto na dieta de pequenas concentraes
da vitamina C (Padayatty, et al., 2003). A vitamina C apresenta um vasto nmero de funes na
preveno de doenas, pois ela melhora significativamente o sistema imunitrio, prevenindo
assim o aparecimento de algumas infeces. Tambm, previne o aparecimento de doenas
cardiovasculares, cataratas e mesmo no aparecimento de certos tipos de cancro. O ascorbato
tem tambm um papel de elevada relevncia no crescimento de tecidos e nos processos de
cicatrizao de feridas, na formao de neurotransmissores e no aumento da absoro de
ferro ao nvel dos intestinos. Como antioxidante tem um papel muito importante nos tecidos,
pois protege as clulas dos efeitos dos radicais livres (Iqbal, 2004).
Hoje em dia com a crescente preocupao na preveno de doenas como a diabetes,
doenas cardiovasculares, neurodegenerativas e cancro, frequente falar-se das propriedades
antioxidantes dos alimentos e muitos estudos esto a ser feitos para relacionar o
aparecimento dessas doenas e o consumo regular de frutas e vegetais ricos em antioxidantes.
Sendo a vitamina C um potente antioxidante a sua relao com a preveno destas doenas
tem despertado interesse na comunidade cientfica, apesar do seu mecanismo de aco ser
ainda pouco conhecido.
Muitos estudos realizados recentemente indicam outras funes para a vitamina C em

clulas humanas. Essas descobertas apontam para possveis efeitos benficos de altas doses
de vitamina C aquando do crescimento celular, da transcrio gnica e na resistncia
infeco (Fransson and Mani, 2007).
1.1.1.
Antioxidante
Como antioxidante a vitamina C tem como principal funo neutralizar os radicias

livres e outros agentes que podero estar envolvidos no aparecimento de certas doenas. Esta
funo conseguida quando concentraes fisiolgicas do AA so mantidas a nvel tecidular.
Os radicais livres so compostos que apresentam electres desemparelhados podendo ser
derivados do oxignio ou do nitrognio e que so reduzidos pelo ascorbato. Existem
igualmente compostos txicos que no possuem electres desemparelhados e que so
reduzidos por esta vitamina, tais como o cido hipocloroso e outros compostos nitrosantes,
bem como produtos de reaces entre radicais livres e outros compostos. o caso da
formao do radical alfa-tocoferol pela reaco dos radicias de oxignio com o alfa-tocoferol
nas lipoprotenas de baixa densidade (LDL - do ingls low-density lipoprotein) onde a vitamina
C tem a capacidade de reduzir o radical alfa-tocoferol dando origem ao alfatocoferol(Padayatty, et al., 2003).
Por ser hidrossolvel a vitamina CC actua tanto dentro como fora das clulas doando
electes e levando reduo biolgica dos radicais livres como o anio superxido (O2-),
radical hidrixilo (HO-) e o oxignio singleto (O2-), permitindo assim que estes recuperam a sua
estabilidade. Sendo o radical ascorbil (A-) um produto intermedirio do processo de reduo
do AA relativamente estvel e pode dismutar em AA e DHA como representado na equao 1.
Este processo contribui para a reciclagem do AA, podendo ter um papel importante pois
permite a transferncia de equivalentes oxidantes da fase hidrofbica para a fase aquosa
Introduo
(membrana citosol), protegendo assim as membranas celulares de radicais livres (Verrax and
Calderon, 2008).
2A- +2H AA+DHA
Equao 1: Dismutao do radical ascorbil
1.1.2.
Pr-oxidante
O cido ascrbico conhecido principalmente por ser um antioxidante, mas ele tambm
apresenta funo de pr-oxidante em concentraes farmacolgicas. A actividade proxidante da vitamina C pode ocorrer de duas formas. A primeira logo quando o AA oxidado
para DHA dentro da clula pela enzima glutationa redutase (GSH), um antioxidante celular. No
entanto, durante este processo a glutationa redutase GSH consumida e transformada em
dissulfeto de GSH, perdendo a sua capacidade antioxidante levando ao aumento dos radicais
livres na clula. Outra forma do seu efeito pr-oxidante atravs da reao de Fenton
(equao 2 A e B). A vitamina C na presena de metais livres de transio como o ferro e o
cobre in vitro tem a capacidade de os reduzir levando assim formao dos ies Fe2+ e Cu+ e
A- que interagem com o H2O2 produzindo radicais hidroxilo (Engel and Evens, 2006; Verrax
and Calderon, 2008).
AH- + Fe3+ / Cu2+ A- +Fe2+/Cu+ + H+

H2O2 + Fe2+/Cu+ HO + Fe3+/Cu2+ + HO-
A
B
Equao 2: A e B reao de Fenton
Acredita-se que in vitro a reduo dos metais livres de transio pode ser a principal razo
do efeito pr-oxidante da vitamina C mas tambm pode reduzir compostos derivados da
quinona (Q) formando radicais que podem ser reoxidados por molculas de oxignio atravs
da reaco apresentada pela equao 3.
AH- + Q A- + Q- + H+
Q- + Q2 Q + Q2
Equao 3: Reaco de reduo de compostos derivados de quinona
As funes da vitamina C so de antioxidante e pr-oxidante e so determinadas

principalmente pela concentrao local da vitamina, a presena ou ausncia de metais de
transio e pelo potencial redox da clula.
1.2.
Transporte
O fluxo da vitamina C para dentro e fora da clula, no um processo simples, pois a

molcula tem um peso molecular relativamente grande (176,13 Da) e apresenta uma
componente polar que dificulta a sua passagem atravs da membrana celular. Existem dois
mecanismos de transportes principais responsveis em manter a concentrao da vitamina C
intracelular permitindo assim o seu desempenho como cofactor enzimtico e antioxidante. Os
mecanismos de transporte so realizados por difuso facilitada atravs dos transportadores de
glicose (GLUTs especficos para a forma oxidada da vitamina C - DHA), e por transporte activo
do ascorbato atravs dos transportadores de vitamina C dependentes de sdio (SVCT1 e SVCT2
especficos para a forma reduzida da vitamina C - AA). Estas vias de transporte so reguladas
sob condies fisiolgicas e alteradas pelo envelhecimento e em caso de doena (Wilson,
2005).
Desconhece-se o mecanismo de transporte do AA para o sangue durante a absoro
intestinal e a reabsoro tubular renal. Acredita-se na possibilidade do AA atravessar a
membrana basolateral atravs dos canais inicos sensveis a variaes de volume, entrando de
seguida no plasma sanguneo atravs de descontinuidades da parede capilar que podero
existir. Devemos porm notar que men as protenas que medeiam esse transporte nem as suas
caractersticas moleculares so conhecidas.
Para alm da dieta, o DHA tambm obtido a partir de reaces de oxidao do AA no
fluido extracelular, sendo rapidamente transportado para dentro das clulas atravs dos
GLUTs; no entanto, facilmente reduzido a AA, sendo este utilizado pela prpria clula ou
libertado para o fluido extracelular. Este processo conhecido como reciclagem do DHA. A
Introduo
converso intracelular do DHA em AA deve-se ao facto de existirem enzimas reductases,

utilizando equivalentes redutores de glutationa (GSH) ou NADPH (nicotinamide adenine
dinucleotide phosphate-oxidase). Condies patolgicas podem afectar os mecanismos da
reciclagem do DHA fazendo com que a concentrao do AA diminua e, consequentemente,
afecte as suas funes(Li and Schellhorn, 2007; Wilson, 2002).
Ambos os sistemas de transporte do AA e do DHA esto sujeitos saturao pelo
aumento da concentrao dessas molculas no fluido extracelular, reflectindo assim a
afinidade entre o substrato e o enzima, podendo ser modelados pela cintica de MichaelisMenten. A equao de Michaelis-Menten (equao 4) descreve a relao quantitativa entre a
velocidade inicial v0, a velocidade mxima vmx, a concentrao inicial de substrato [S] e a
constante de Michaelis Km.
[ ]
+[ ]
Equao 4: Equao de Michaelis-Menten
=
1.2.1.
Difuso Facilitada (GLUTs)
Protenas especficas medeiam a entrada e a sada do DHA das clulas por difuso
facilitada, sendo esta caracterizada pelo movimento do lquido apenas na direco de um
gradiente qumico ou eletroqumico do soluto transportado. Nos intestinos, onde se d a
maior absoro da vitamina C, o intake do AA inibido pela glicose proveniente da dieta o que
leva a uma diminuio da entrada dessa forma da vitamina C nos entercitos; contudo, essa
inibio no se verifica para o DHA. Assim, o transporte do AA para o interior das clulas
feito de forma indirecta, atravs da oxidao do AA em DHA, em que este transportado
atravs dos GLUTs e, de seguida, reduzido dentro da clula a AA. No entanto, o DHA que no
absorvido pelos entercitos entra no plasma sanguneo, onde poder ser absorvido por
outras clulas reduzindo-o a AA, ou ser filtrado nos capilares do glomrulo renal, e de seguida
ser reabsorvido atravs da membrana luminal das clulas epiteliais que formam os tbulos
9
renais proximais (Wilson, 2005). Os GLUTs apresentam 14 isoformas, do GLUT1 ao GLUT14, e

existem evidncias que indicam que apenas 3 dessas isoformas que apresentam afinidade
para transportar o DHA (GLUT1, GLUT3 e GLUT4) (figura 3). Devido ao facto da glicose no
inibir a captao do DHA existe uma grande competio entre essas duas molculas pelos
GLUT. Porm, verificam-se diferenas na competio entre as duas molculas de acordo com o
tipo de clula. So exemplo os astrcitos derivados do crebro onde a captao do DHA (5200M) parcialmente inibida pelo aumento da concentrao da glicose (10mM). Para alm
da competio com a glicose, a captao do DHA pode ser afectada em casos de doenas em
que afectam o sistema endcrino, pois os GLUTs so fortementes controlados por hormonas
(Rivas, et al., 2008; Wilson, 2005).
Figura 3: Esquema do sistema de transporte do DHA atravs dos GLUT. (Retirado de (Li and Schellhorn,
2007)
1.2.2.
Transporte Activo (SVCTs)
O transporte activo de um soluto caracterizado pelo transporte contra o gradiente de

concentrao com consumo de energia em forma de ATP (Adenosina trifosfato) derivados do
metabolismo celular. O AA a forma activa da vitamina C em pH fisiolgico. Existem
transportadores capazes de transportar directamente o AA para o interior das clulas
aumentando a sua biodisponibilidade. Os SVCTs so protenas membranares especficas para o
transporte da vitamina C, pois apresentam maior afinidade para o AA do que os GLUTs. O
10
Introduo
transporte para dentro das clulas feito a favor do gradiente electroqumico do sdio que
mantido pela bomba sdio-potssio, por isso um transporte secundrio (figura 4). O AA
transportado atravs de duas isoformas dos transportadores dependentes de sdio o SVCT1 e
SVCT2, em que para cada dois caties de sdio entra um anio ascorbato, sendo que o excesso
de sdio excretado para fora da clula pela troca com o potssio. Essas duas isoformas
apresentam diferenas nas suas propriedades e expresso em diferentes tipos de clulas e
tecidos (Rivas, et al., 2008). Tem sido demonstrado que o SVCT1 tem maior capacidade de
transportar o AA do que a outra isoforma, porm o SVCT2 apresenta uma maior afinidade.
No se sabe se esta diferena uma caracterstica intrnseca da protena SVCT1, ou se
por existir mais SVCT1 do que SVCT2 nas membranas plasmticas das clulas
transportadoras. Para alm desta diferena, estas duas isoformas possuem tambm
distribuies e funes distintas: o SVCT1 expressa-se predominantemente nas clulas
epiteliais, nomeadamente no intestino, rim e fgado, e pode transportar quantidades de
ascorbato superiores s suas necessidades, enquanto que o SVCT2 poder estar envolvido
na manuteo dos nveis intracelulares de vitamina C para o funcionamento neuronal e
proteco contra o stresse oxidativo, e encontra-se presente em clulas como, clulas do
crebro, olho e placenta (Wilson, 2005).
Figura 4: Esquema representativo do sistema de transporte do AA atravs dos SVCT.(Retirado de(Li and
Schellhorn, 2007)
11
Os SVCTs, tal como os GLUTs so fortemente regulados o que altera a captao do AA

e, consequentemente, a concentrao intracelular do mesmo. Como o transporte do AA
depende do fluxo de caties de sdio, as alteraes no potencial da membrana plasmtica
influenciam a captao do AA sendo que, as despolarizaes tm um efeito atenuante pois, as
sucessivas variaes do potencial membranar levam alterao no gradiente electroqumico
e, consequentemente, da energia livre do sistema de transporte. Estas protenas so
tambm reguladas pela energia cintica envolvida nas variaes de concentraes dos
substratos. Os SVCT1 e SVCT2 so sensveis ao aumento da concentrao do AA no plasma
e dentro da clula, respectivamente, logo h um controlo da concentrao plasmtica do
AA por parte do SVCT1 e um outro na regulao e manuteno da homeostase dentro da
clula feita pelo SVCT2. Verifica-se tambm uma regulao devido as alteraes do pH.
Todos os mecanismos de activao/inibio do transporte da vitamina C apresentam um
papel preponderante no estabelecimento dos nveis fisiolgicos normais do AA no
organismo, uma vez que medida que a concentrao intracelular do AA aumenta a taxa de
transporte do mesmo atenuada, constituindo assim um obstculo s estratgias de obteno
de doses elevadas de vitamina C tendo em vista a proteco antioxidante e/ou pr-oxidante
para possvel uso clnico em tratamento de doenas(Montel-Hagen, et al., 2008; Rivas, et al.,
2008).
Resumindo, os GLUTs e os SVCTs que so os principais reguladores dos nveis da vitamina C
no organismo, so considerados alvos de estudos para os mecanismos de tratamentos que
tm como objectivo atingir nveis elevados de vitamina C intracelulares. Para atingir nveis
farmacolgicos intracelulares da vitamina C, tem-se comparado as diferentes vias de
administrao desta, tais como intravenosa (iv) oral (po) e intraperitonial (ip). verificando-se
que a iv a ideal para aumentar temporariamente a concentrao efectiva de vitamina C
intracelular a nveis farmacolgicos pois ultrapassa a filtrao glomerular(Levine, et al., 2009).
12
Introduo
2. Stresse Oxidativo
O stresse oxidativo geralmente definido como um desiquilbrio entre a produo de
radicais livres e as defesas antioxidantes. Os radicais livres so compostos que apresentam um
ou mais electres desemparelhados. Destes os derivados do oxignio, so a classe mais
importante dos radicias livres gerados no organismo, sendo estes conhecidos como espcies
reactivas de oxignio (ROS). Estas espcies incluem o radical anio superxido (O2-), o oxignio
singleto (O2-), o perxido de hidrognio (H2O2) e o radical hidroxilo (OH-), um anio muito
reactivo. As ROS tm um importante papel na regulao de vrios processos metablicos na
clula pela activao de vrias cascatas enzimticas e de factores de transcrio. Desse
processo de activao, diferentes respostas podem ser desencadiadas dependendo do tipo de
clula e da concentrao celular das ROS, podendo estar envolvida no aparecimento de
diversas patologias, como a diabetes tipo II, arteriosclerose, isqumia, doenas
cardiovasculares e at mesmo o cancro.(Orrenius, et al., 2007; Schumacker, 2006; Wilson,
2002).
Outro tipo de resposta celular, que est relacionado com a produo de ROS a regulao
da morte celular, uma vez que em pequenas concentraes levam morte celular por
apoptose e em altas por necrose. As ROS so produzidas tanto por fontes exgenas como por
endgenas. A maioria das ROS produzidas endogenamente tm origem na respirao
mitocondrial (cerca de 1 a 2% do oxignio consumido pela clula convertido em radical
superxido), podendo actuar como bioprodutos prejudiciais para as clulas, bem como
molculas importantes na sinalizao intracelular (Schumacker, 2006; Valko, et al., 2006).
As cluas possuem sistemas de defesas antioxidantes para restaurar o equilbrio redox,
entre as quais se destacamo superxido dismutase (SOD), glutatona peroxidade, mas tambm
de extrema importncia a contribuio das defesas antioxidantes exgenas como as
vitaminas hidrossolveis (vitaminas C e E) (Valko, et al., 2007). A sinalizao celular o
13
mecanismo celular que traduz a resposta ao estmulo externo, induzindo actividades biolgicas
como a contraco muscular, expresso gnica, proliferao celular e at a morte celular.
Como referido anteriormente, as ROS produzidas no stresse oxidativo desempenham um
importante papel na sinalizao celular bem como na regulao da transcrio do sinal. Assim
sendo, as ROS podem influenciar posisitivamente como negativamente o funcionamento
normal das clulas, uma vez que as ROS so naturalmente oxidantes e podem causar danos
irreverssveis a nvel do ADN, protenas e alguns lpidos(Valko, et al., 2006).
2.1.
Vitamina C e Cancro
As clulas normais possuem mecanismos de resposta a sinais externos atravs de

sistemas bem regulados com o fim de manter a homeostase celular. Quando essa resposta
apresenta defeitos pode levar a alteraes genticas conduzindo progressivamente o tecido
normal a um estado alterado levando ao aparecimento de clulas com crescimento
descontrolado, surgindo assim o cancro. Acredita-se que a oncognese devido aos danos no
ADN est relacionada com os danos das espcies reactivas de oxignio como o H2O2, o O2-e o
HO-. Deste modo, os antioxidantes aparecem como um potencial nutriente de proteco
contra a incidncia do cancro, pois ajuda na proteco contra os efeitos dos radicias livres no
ADN (Lutsenko, et al., 2002).
O uso das vitaminas antioxidantes na preveno do cancro muito controversa mas
nos ltimos anos teve uma crescente e especial ateno. sabido que o consumo regular de
frutas e vegetais ricos em antioxidantes podero diminuir o risco do aparecimento do cancro.
Contudo, elevadas concentraes destes alimentos inibem o crescimento de vrias clulas
tumorais, reduzem a toxicidade nas clulas normais e melhoram o efeito dos agentes
teraputicos in vitro e in vivo. Os antioxidantes protegem o organismo da exposio a factores
ambientais e a radicais livres, produzidos na respirao mitocondrial. O efeito dos
antioxidantes no crescimento, diferenciao e morte das clulas tumorais tem sido estudado
14
Introduo
em modelos de culturas celulares e em modelos animais com tumores. Estudos usando o cido
ascrbico como suplemento para os doentes com tumores malignos comeou muito cedo, em
que observaram uma melhoria na qualidade de vida em relao ao grupo controlo (Levine, et
al., 2009; Levine, et al., 1999; Padayatty, et al., 2006). Paralelamente, estudos in vitro
demostraram que o AA em concentraes farmacolgicas actuam como pr-oxidante, pois
verificou-se a inibio de proliferao em muitas linhas celulares tumorais diferentes. Acreditase que esse efeito se deve ao facto do AA se transformar em radical ascorbil (A -) reagindo
com o H2O2 no espao extracelular levando
a um aumento dos radicais livre e
conseguentemente morte celular (Albanes, 2009; Chen, et al., 2007b). Contudo, outros
estudos in vitro com AA onde avaliaram a actividade antitumoral chegaram a concluso que
quando administrado sozinho essse efeito no se verifica (Hoffer, et al., 2008). Assim, o uso da
vitamina C no tratamento do cancro passaria pela combinao desta com outras frmacos
antitumorais, pois estudos epidemiolgicos comprovaram que essa combinao pode
potenciar o efeito citotxico de certos frmacos, estimulando a apoptose celular e interrupo
do ciclo celular. Assim, possvel concluir que a vitamina C pode actuar como um catalizador
no tratamento do cancro. Porm, outros estudos demostraram que para certos frmacos a
concentrao de vitamina C pode actuar como antioxidante inibindo assim o efeito
antitumoral dos frmacos. Com isto pode-se dizer que a vitamina C pode ter um grande
potencial no tratamento do cancro com prognstico reservado e opes teraputicas limitadas
(Chen, et al., 2007b).
No que diz respeito aos mecanismos de aco dos antioxidantes, sabido que muito ainda
h para explorar contudo, existem dados considerveis que permitem sugerir que
determinados antioxidantes, administrados sob circunstncias controladas, podero
significativamente aliviar os efeitos indesejveis da quiomioterapia e radioterapia e, longe de
prejudicar os seus benefcios, podero mesmo contribuir para a melhoria das mesmas. Cada
15
vez mais doentes tm usado suplementos nutricionais que incluem antioxidantes em

associao com terapias convencionais.
Apesar dos resultados verificados at agora serem promissores, novos conhecimentos
sobre a farmacodinmica da vitamina C precisam ser adquiridos para uma melhor
compreenso do modo de aco da vitamina C, tendo em conta a sua regulao, mecanismo
de transporte bem como da evidncia da sua eficcia teraputica.
3. Potencial Teraputico/Citotoxicidade
A selectividade do efeito citotxico apresentado pela vitamina C em relaco s clulas
tumorais uma das principais caractersticas para a sua eficcia teraputica, pois neste tipo de
clulas a concentrao da vitamina no suprime o sistema imunitrio, aumentando assim a
resistncia infeco.
A vitamina C actua de forma selectiva nas clulas tumorais, devido diminuio considervel
das enzimas antioxidantes nestas clulas em relaco as clulas normais; assim, quando
expostas vitamina C h um cresente aumento na produo do H2O2 e consequente aumento
do stresse oxidativo. Por outro lado, na presena de metais de transio e, devido ao aumento
da oxidao de AA em DHA, este efeito citotxico selectivo reforado nas clulas tumorais
(Chen, et al., 2007a; Chen, et al., 2009; Rozanova, et al., 2007).
Estudos para comprovar o potencial teraputico da vitamina C tm seguido duas
vertentes: os efeitos de elevadas concentraes de AA no desenvolvimento e progresso de
tumores e os mecanismos de aco que podero contribuir para o seu efeito anticancergeno.
trabalho abordaremos principalmente a selectividade do AA, tendo em conta que
vrios estudos in vitro demostraram que concentraes farmacolgicas do AA matam
preferencialmente as clulas tumorais e no matam as clulas normais, sendo esta resposta
16
Introduo
dependente do tempo de exposio e da concentrao do AA no meio extracelular. Como se

sabe nas clulas tumorais verifica-se uma sobrexpresso dos GLUTs, pelo que a vitamina C ser
transportada para o interior das clulas somente pelos GLUTs. Contudo, a morte celular pode
estar relacionada com a oxidao do AA em DHA, pois leva formao de ROS no meio
extracelular. Ao contrrio do que se pensava, a concentrao do AA extracelular tem maior
contribuio no efeito antiproliferativo nas clulas tumorais do que a sua concentrao
intracelular (Chen, et al., 2007b; Li and Schellhorn, 2007; Zhao, et al., 2005).
No entanto, o mecanismo da citotoxicidade selectiva no est devidamente conhecido,
mas acredita-se que pode estar relacionado com diferentes propriedades intrnsecas das
clulas tumorais, como j mencionado, nomedamente a reduo da concentrao de enzimas
antioxidantes, o aumento da disponibilidade intracelular de metais de transio e uma maior
acumulao do DHA dentro da clula devido ao aumento da expresso dos GLUTs(Li and
Schellhorn, 2007).
Mais pesquisas so necessrias para compreender melhor os mecanismos de apoptose e
vias de morte celular envolvidos na citotoxicidade relacionada com a produo de ROS, bem
como, para determinar a melhor combinao de terapias do cancro (Fruehauf and Meyskens,
2007).
4. Medicina Nuclear
A Medicina Nuclear uma tcnica multidisciplinar que utiliza radiofrmacos para estudar
os processos fisiolgicos e diagnosticar de forma no invasiva informaes funcionais de
diversas doenas. Consoante o tipo de emissores, assim os radiofrmacos podem ser usados
para fins de diagnstico, quando os emissores so gama ou de positres, ou para fins
teraputicos, quando os emissores so partculas beta, de electres auger ou de partculas
alfa. Para a obteno de informao funcional imagiolgica necessrio a administrao de
17
um radiofrmaco ao doente e, recorrendo a instrumentao especfica para a deteco de

radiao emitida, possvel visualizar a sua biodistribuio. A cmara-gama constitui um
instrumento que permite detectar e localizar a distribuio de radiofrmacos, atravs da
emisso de fotes gama, resultantes do decaimento do radionucldeo presente no
radiofrmaco, possibilitando assim obter informao funcional do tecido/rgo alvo. Os
radiofrmacos desempenham um papel muito importante no estudo e na formulao de
novos frmacos e sistemas de distribuio de frmacos, que vo desde a descorberta sua
avaliao in vitro e in vivo (Perkins, 2002).
As imagens em medicina nuclear fornecem informaes funcionais a nvel celular e
molecular que contribui para a determinao do estado de certas doenas atravs da medio
da captao de radiofrmacos no tecido alvo (Zolle, 2007). Neste trabalho a medicina nuclear
teve um importante colaborao na formulao e avaliao de um radiofrmaco.
4.1.
Radiofrmacos
Um radiofrmaco um composto radioactivo utilizado em medicina nuclear para

diagnstico e terapia em diversas patologias. Normalmente os radiofrmacos usados para
diagstico no tm efeito fisiolgico, pois so admnistrados em pequenas quantidades. Esses
compstos podem ser constitudos somente por um radionicldeo, ou frmacos ligados
quimicamente a um radionucldeo. Os radiofrmacos podem ser divididos em duas classes
principais: aqueles cuja biodistribuio determinada exclusivamente pelas suas propriedades
fsicas e qumicas e aqueles cuja distribuio final determinada pela sua ligao ao receptor
ou outras interaes biolgicas. Esta ltima classe conhecida como radiofrmacos alvoespecficos (Liu and Edwards, 1999).
A escolha de um radionucldeo para o desenvolvimento de um radiofrmaco para a
aplicao em diagnstico ou terapia em medicina nuclear depende principalmente das suas
caractersticas fsicas, nomeadamente o tipo de emisso nuclear, do seu perodo de semi-
18
Introduo
desintegrao (tempo necessrio para reduzir a metade a actividade inicial), sendo este
suficiente para preparar, administrar ao doente e adquirir a imagem, e a energia das partculas,
pois essa energia deve situar entre 80 e 300 keV ( Saha, 2003).
Actualmente, cerca de 90% dos radiofrmacos utilizados para diagstico na medicina
nuclear usa como radionucldeo o tecncio-99m (99mTc), pois este apresenta um perodo de
semi-desintegrao (6 horas) curto o suficiente para reduzir o tempo da durao do exame
bem como a irradiao ao doente, sem deixar de referir que a energia dos raios gama emitidos
pelo 99mTc adequada para a deteco pela cmara gamma (140keV). O tecncio um metal
de transio pertencente ao grupo VIIB, tendo 43 como nmero atmico, existindo em 9
estados de oxidao (1- a 7+), sendo que os estados 4+ e 7+ so os mais estveis em soluo
aquosa. Um composto radiofarmacutico marcado com
99m
Tc tem uma particularidade que
pode ser vista como uma vantegem, pois podem ser produzidos in loco, numa radiofarmcia.
Esse processo consiste na adio de
99m
Tc-pertecnetato de sdio (99mTcO4Na) eludo de um
gerador 99Mo/99mTc a um kit frio com uma mistura farmacolgica (Stapleton, et al., 1967). O
99m
Tc-pertecnetato de sdio depois de eludo encontra-se com o estado de oxidao 7+, sendo
que necessrio que haja uma reduo deste para que haja a marcao com um ligando, por
isso sempre utilizado um agente redutor na formulao radiofamacutica. Numa tpica
preparao de um radiofrmaco com 99mTc existe sempre a possibilidade de conter impurezas
qumicas recorrentes do processo de marcao, assim sendo a presena do oxignio pode
diminuir a quantidade do agente redutor, pela oxidao atravs do O2, perdendo assim a
capacidade de reduzir o 99mTcO4-. Assim o aumento do 99mTcO4- no kit, aparece como uma uma
impureza qumica. Outra impureza que normalmente est presente numa marcao com o
99m
Tc a sua forma reduzida e hidrolizada (99mTc-RH), que numa soluo aquosa, o tecncio
reduzido reage com a gua formando vrias espcies hidrolizadas (Liu and Edwards, 1999).
19
Por isso, necessrio o desenvolvimento de metodologias para determinar o controlo

da qualidade de radiofrmacos que usam o tecncio para a avaliao a sua pureza
radioqumica, ou seja, avaliar a relao entre o radionucldeo presente na preparao e a
espcie na forma qumica desejada.
4.2.
Controlo de Qualidade
O processo do controlo de qualidade para os radiofrmacos necessrio para garantir

que o produto cumpre todos os requisitos e especificaes estabelecidas para a administrao
em humanos. Os procedimentos de controlo de qualidade deve ser levado a cabo em todas as
matrias-prima utilizadas na produo bem como no produto acabado. Esses processos
envolvem vrios testes e medidas que asseguram a pureza, integridade, a segurana biolgica
e a eficincia de marcao do radiofrmaco. Contudo, um radiofrmaco em que se usa um
radionucldeo de perodo de semi-desintegrao curto, como o caso do 99mTc, necessrio
a formulao de um mtodo rpido e eficiente de controlo de qualidade que possa ser feito inhouse. Os testes de controlo de qualidade esto divididos em duas categorias: testes fisicoqumicos e testes biolgicos. O conjunto de testes que avaliam o estado fsico-qumico do
radiofrmaco pretendem avaliar a pureza radioqumica e radionucldica, determinar o pH e a
fora innica, a osmolaridade e o estado fsico da amostra.
A pureza radioqumica pode ser definida como a fraco de radioactividade presente
na forma qumica pretendida em relao radioactvidade total. Como j referido, as
impurezas qumicas presentes numa formulao radiofrmacutica onde se usa o
99m
Tc,
podem resultar de reaces qumicas entre os compostos usados, o qur permite usar vrios
mtodos para avaliar a presena dessas impurezas. Assim, tm sido desenvolvidos diferentes
mtodos tais como a cromatografia em papel, a cromatografia por gel, a electroforese em
papel ou em gel de poliacrilamida, troca inica, extrao por solvente, e destilao, assim
como, a tcnica de High Performance Liquid Chromatography (HPLC) a qual tem sido usada
20
Introduo
com muita frequncia no processo de controlo de qualidade em radiofrmacos usando 99mTc.

Esta tcnica ser explicada com mais detalhe na sesso seguinte (Liu and Edwards, 1999).
4.2.1.
HPLC (High Performance Liquid Chromatography)
O princpio geral do funcionamento do HPLC o mesmo das cromatografias de camada

fina e cromatografia de coluna convencional, sendo que a principal diferena est nas
dimenses da coluna e do material de empacotamento desta, onde as amostras so foradas a
passar pelas bombas elctricas que foram a passagem do solvente sob elevadas pressses
(cerca de 600 psi ou 400 bar). Neste trabalho escolheu-se o HPLC, pois ele apresenta
vantagens em relao as outras tcnicas de separao cromatogrfica, pois a separao feita
no HPLC apresenta uma melhor resoluo, melhor sensibilidade, reproductividade e altas
velocidades de separao.
Um mtodo cromatogrfico consiste na separao analtica de diferentes
componentes constituintes numa amostra, em que estes interagem com uma fase mvel
(solvente) e uma fase estacionria (coluna) atravs de foras intermoleculares, sendo que a
separao feita tendo em conta a afinidade que cada composto tem com a coluna ou com o
solvente. Assim, a coluna retm os componentes que interagem mais fortemente com esta,
enquanto que aqueles que possuem menor afinidade qumica so arrastados pelo solvente.
Contudo, para que o processo se desenvolva essencial que o solvente apresente
caractersticas especficas. Assim sendo, imprescindvel que a fase mvel dissolva a amostra
sem que ocorram quaisquer interaces qumicas entre elas, tambm deve ter um elevado
grau de pureza (para que se possam fazer anlises de elevada sensibilidade), e que seja
compatvel com o detector utilizado e que possua polaridade adequada para a separao dos
componentes da amostra.
Existem diferentes tipos de HPLC, atravs da combinao de diferentes solventes e de
material de empacotamento da coluna, de modo a uma melhor separao de diferentes
compostos, tendo em conta as caractersticas como a solubilidade da amostra em relao a
21
fases mveis especficas. Deste mode existem, a cromatografia de fase normal, de fase reversa
e troca inica. de referir que todos eles esto orientados na optimizao do mtodo de
separao clssica pelo aumento da resoluo e velocidade e diminuio do tempo de anlise
(Li and Franke, 2009).
Entre esses tipos de HPLC, usmos o de fase reversa, pois apresenta vantagens
inerentes sua capacidade em discriminar compostos de baixo peso molecular com
caractersticas muito semelhantes. Este mtodo consiste em usar uma fase estacionria no
polar e fases mveis hidro-orgnicas (polares). Assim, a reteno dos componentes qumicos
da amostra devido sua hidrofobia, devido s foras dispersivas interaes de Van der
Walls. As fases estacionrias que geralmente so usadas no HPLC de fase reversa so
constitudas por micropartculas porosas de slica ligadas quimicamente a cadeias alqulicas
hidrofbicas (-CH2-CH2-CH2-CH3), sendo as mais usadas as C4, C8 e C18. As fases mveis que
so combinadas com essas colunas favorece a separao e so contitudas principalmente por
gua, sendo que diferentes concentraes de solventes orgnicos so adicionados, estes
solventes tm de ser miscveis, normalmente os solventes orgnicos mais usados so o
metanol e o acetonitrilo (Kazakevich, 2007, Saha, 2003).
Aps a separao dos diferentes componentes de uma amostra necessrio fazer a
sua deteco, a qual pode ser realizada por espectrofotometria, electroqumica, fluorescncia,
espectrofotometria de massa, deteco de eventos por cintilao, entre outros. A escolha do
tipo de dectector que se usa no HPLC, no tem uma tendncia especfica, pois nenhum
detector possui propriedades que o tornem ideais, por isso, podemos dizer que no h
detectores universais. A escolha deste, depende do tipo de deteco pretendida para uma
certa separao. Na anlise de radiofrmacos, tanto o monitor ultravioleta (UV) como o
detector de radiao so frequentemente usados para medir a concentrao dos diferentes
componentes da amostra. O monitor UV mede a absorvncia de luz do eluato, a qual
proporcional concentrao do soluto presente no mesmo. O detector de radiao usado
22
Introduo
para medir a concentrao dos componentes radioactivos no eluato. A maioria dos detectores
de radioactividade possui cristais cintiladores entre dois fotomultiplicadores de elevada
eficincia de contagem. Os sinais medidos por estes so amplificados e, posteriormente,
quantificados. Esta quantificao efectuada por um processo de integrao grfica das
deteces, por cintilao, obtidas (cromatograma). O cromatograma obtido pela relao
entre o valor real da deteco da substncia e o seu tempo de reteno. Por sua vez, o tempo
de reteno o tempo que o composto leva a percorrer a distncia desde a coluna at ao
detector, o qual se inicia no momento em que a amostra injectada e termina no instante em
que a altura do pico, referente a este composto, mxima. O cromatograma obtido em
contagens por segundo (CPS) em funo do tempo (min) e em milivoltes (mV) em funo do
tempo (min) para a deteco por radioactividade e UV, respectivamente. Na figura 5 possvel
verificar esquematicamente os diferentes contituintes de um aparelho do HPLC (Clark and
Mama, 1989).
Figura 5: Esquema ilustrativo de um aparelho do HPLC. 1. Reservatrio de solventes 2. Vlvulas de

abertura 3. Bomba 4. Misturador 5. Vlvula interna 6. Injector 7.Pr-coluna 8.Coluna 9. Detectores 10.
Estao de aquisio de dados 11. Reservatrio de resduos. A seta azul, representa o sentido da
progresso do solvente durante uma anlise Adaptado de Meyer, 2004.
Antes de qualquer anlise no HPLC temos de ter a certeza que o mtodo funciona e
que o equipamento se encontra em perfeitas condies para o desenvolvimento da mesma.
Para isso temos disposio vrios parmetros para avaliar a integridade do equipamento.
Alm disso, nesse trabalho o HPLC foi usado no s para a realizao da separao analtica
23
como tambm para a quantificao analtica, logo necessrio determinar parmetros como a
resoluo da coluna, a sua eficincia e selectividade. Outras caractersticas ligadas separao
e ao equipamento tambm devem ser conhecidas, como a linearidade, a exactido e a
preciso.
Tendo essas consideraes em conta passo a defenir esses parmetros:
a) Resoluo (R) a resoluo entre dois picos adjacentes definido pela a relao entre
a distncia entre os mximos dos picos, ou seja distncia entre os tempos de reteno,
tr, e a mdia aritmtica das duas larguras do pico, w. O clculo de R obtido atravs
da equao 5 (Snyder, 2002):
=2
Equao 5: Resoluo
a) Eficincia (HETP- Height Equivalent to the Theoretical Plate) a medida que nos d o
grau de disperso do pico numa determinada coluna. Surge a partir da Teoria de
Pratos da coluna e expressa pela razo entre o comprimento da coluna (L) e o
nmero de pratos tericos (N) desta, assim como mostra a equao 6 B. Tendo tr
como o tempo de reteno do pico e w a largura do pico (Meyer, 2004).
b)
(A)
(B)
Equao 6: A - Nmeros de pratod tericos (N). B Eficincia (HETP)
b) Selectividade () a capacidade que o sistema tem em discriminar analitos

diferentes com caractersticas muito semelhantes. definido como a relao entre os
tempos de reteno dos dois picos (equao 7).
=
Equao 7: Selectividade ()
c) Linearidade a linearidade a medida que transmite o quo bem a curva de

calibrao da concentrao versus resposta se aproxima de uma linha recta, ou quo
bem os dados se ajustam a uma equao linear do tipo: y=mx+b, onde o y a resposta,
o x a concentrao, o m o declive e o b a linha de interceco com da recta de ajustes.
24
Introduo
d) Exactido refere-se a reproducitibilidade que se verifica quando uma amostra

homognea medida muitas vezes. Essas medidas podem ser feitas em dias diferentes
como no mesmo dia.
e) Preciso definida como a proximidade que os valores de uma medio possuem
relativamente a um valor verdadeiro. Esse valor pode ser determinado por vrias
tcnicas, como a calibrao, de modo a minimizar as fontes de erros (Snyder, 2002).
Sendo assim, fica claro que a ideia de usar a vitamina C como um agente antitumoral no
recente e que cada vez mais estudos nesse sentido esto a ser feitos e recorrendo a novas
tcnicas de diagnstico para perceber os mecanismos que at agora eram desconhecidos. A
avaliao da citotoxicidade da vitamina C em clulas tumorais, tem revelado resultados
promissores, mas necessrio a cunjugao de outras tcnicas para ajudar no esclarecimento
das potencialidades que a vitamina C apresenta para a oncologia.
Assim, este este trabalho tem como objectivo estabelecer a conjugao de mtodos
biolgicos e da medicina nuclear, para avaliar a citotoxicidade e a estabilidade in vitro e in vivo
desta vitamina.
25
26
Captulo II - Materiais e Mtodos
28
Materiais e Mtodos
Desde muito cedo que o interesse em estudar as propriedades da vitamina C tem

despertado interesse junto da comunidade cientfica. Como muito ainda est por descobrir
necessrio o desenvolvimento de novas tcnicas para o estudo desta molcula.
Neste trabalho, pretende-se avaliar a citotoxicidade da forma reduzida (AA) da vitamina C
em dois tipos de linhas celulares diferentes, uma de adecarcinoma colorectal (WiDr, ATCC) e
outra de melanoma melanoctico (A 375, ATCC) bem como a sua estabilidade em culturas
celulares. Foi tambm desenvolvida uma formulao farmacutica atravs da marcao
radioactiva do AA com
99m
Tc, sendo que a sua estabilidade foi avaliada atravs de estudos in
vitro e in vivo.
1. Estudos de Qumica
1.1.
Marcao do AA com tecncio-99m (99mTc)
A formulao farmacutica para a preparao do
99m
Tc-AA, consiste em adicionar ao
99mTc-pertecnetato de sdio um agente redutor, pois o estado de oxidao do 99mTcO4- tem

de ser reduzido do seu estado de oxidao (7+), para se poder complexar com o ligando.
Numa primeira fase, comeou-se por usar uma actividade de 222 MBq de pertecnetato
de sdio (99mTcO4Na), num volume de 3 mL, seguidamente acrescentou-se 0,2 mL do agente
redutor, FeCl3 0,1 N (em HCl 0,1 N). Num frasco contendo 200 mg de cido ascrbico (A5960,
SIGMA), que foi previamente argonado e encapsulado acrescentou-se a soluo inicialmente
obtida, estando o frasco a 0C e protegido da luz. Aps uma leve agitao, o pH foi levado a 6,5
- 7 pela adio de 1,2 mL de NaOH 1 M. A confirmao do pH foi verificada pelo mtodo de
comparao de cores (pH-Fix 4,5-10,0, Machenerey-Nagel). A marcao foi feita a 0C e o kit
foi mantido assim durante 3 horas.
29
1.2.
Optimizao da Marcao
Com o objectivo de alcanar sempre a melhor eficincia de marcao e estabilidade do

kit, procedeu-se ao processo de optimizao da marcao. A optimizao da marcao do AA
com o
99m
Tc, foi conseguida aps a variao do volume do
99m
TcO4Na e da temperatura de
marcao. No mtodo optimizado de marcao foi utilizada uma actividade de 222 MBq de
99m
TcO4Na em 1,5 mL, usando o mesmo agente redutor (0,2 mL de FeCl3). Todo o processo de
marcao foi feito nas mesmas condies relativamente anterior, excepto no facto do kit ser
mantido temperatura ambiente.
Este processo, permitiu que a actividade volmica do kit ficasse mais concentrada,
uma vez que diminumos o volume total final, e pelo facto de no deixarmos o kit no gelo
durante 3 horas a eficincia de marcao observada desde dos 0 minutos aps a marcao at
24 horas manteve-se sempre superior aos 90%.
1.3.
Controlo de Qualidade Determinao da pureza radioqumica
Posteriormente ao processo de marcao da forma reduzida da vitamina C (AA), foi

realizado o controlo de qualidade com o objectivo de determinar a pureza radioqumica do
complexo. A pureza radioqumica de um radiofrmaco a fraco da radioactividade na forma
qumica desejada em relao radioactividade total. Numa marcao usando o tecncio como
radioistopo as impurezas mais comuns de se encontrar so o tecncio livre (99mTcO4-) e o
tecncio reduzido hidrolizado (99mTc-RH). A presena destes compostos na soluo do
radiofrmaco resulta na diminuio da qualidade das imagens devido diferente
biodistribuio das impurezas radioqumicas em relao ao complexo marcado, donde resulta
uma elevada actividade no sangue e nos tecidos, que constitui a actividade de fundo,
revertendo assim num aumento da dosimetria para o doente. A pureza radioqumica foi
30
Materiais e Mtodos
determinada recorrendo ao mtodo cromatogrfico de alta sensibilidade e resoluo o HPLC

High Performance Liquid Chromatography .HPLC High Performance Liquid Chromatography
Desta forma, tornou-se possvel separar os vrios componentes do radiofrmaco
preparado: o AA e o FeCl3 por deteco UV e o
radioactividade, sendo que o
99m
Tc-AA, e o
99m
TcO4- por deteco de
99m
Tc-RH por ser colide no passa para a coluna j que fica
retido na pr-coluna do equipamento do HPLC e, consequentemente, no detectado. Para a

anlise no HPLC foi utilizado um equipamento Gilson composto por UV/VIS-151 Detector, 321PUMP e 506-C System Interface. A definio dos mtodos de corrida e o processamento dos
resultados foi realizado recorrendo ao software Gina-Star, cuja base de dados armazena
automaticamente todos os dados obtidos.
O mtodo de HPLC para o controlo de qualidade do 99mTc-AA foi desenvolvido usando
como fase estacionria uma coluna Nucleosil com pr-coluna (Hichrom, NC-100-5C18-250AF),
como fase mvel uma soluo de KH2PO4 (0.025 M, pH 3) e metanol na proporo de 96/4
(v/v) e o fluxo constante de 1 mL/minuto. A deteco UV foi efectuada com o comprimento de
onda de 210 nm.
Primeiramente, realizou-se uma lavagem da coluna em que se usou a fase mvel
especfica para a coluna C18 Nucleosil (Hichrom, NC-100-5C18-250AF) que consiste numa
soluo de metanol e gua, numa proporo de 90/10 (v/v), durante 30 minutos com um fluxo
constante de 1 mL/minuto e comprimento de onda de 254 nm. De seguida fez-se uma
passagem pelo sistema durante 30 minutos com a soluo a utilizar para realizar o controlo de
qualidade nas mesmas condies usadas para o controlo de qualidade, mas sem a injeco de
qualquer amostra. Esta passagem serve unicamente para estabilizao do equipamento,
nomeadamente, dos detectores UV e de radioactividade. Aps estabilizao, so injectados 25
L de uma soluo correspondente ao gradiente da fase mvel, para confirmar o desempenho
do sistema e determinar o tempo morto do equipamento (t0).
31
Aos 0, 30, 60, 90 minutos, 2, 3, 4, 5, 6 e 24 horas, aps a preparao do complexo 99mTc-AA,

foram retirados 25 L do mesmo e transferida utilizando uma seringa apropriada (Hamilton) e
injectada no loop, iniciando-se o mtodo anteriormente descrito. Cada passagem tem a
durao de 30 minutos. Obtiveram-se tambm cromatogramas de amostras padro de 99mTcO4-, AA e FeCl3, para tornar possvel a interpretao dos cromatogramas obtidos no controlo
de qualidade do 99mTc-AA e o clculo da eficincia de marcao.
Aps a obteno dos cromatogramas desejados efectuou-se uma outra passagem que
constitui um mtodo de lavagem, nas mesmas condies da primeira lavagem.
A quantificao dos componentes presentes no radiofrmaco foi feita pela integrao
grfica do cromatograma. A integrao grfica foi feita desenhando ROIs (regies de interesse)
do tipo BB, com o intuito de minimizar o erro resultante da proximidade dos diferentes
componentes do kit. As ROIs do tipo BB so desenhadas quando os extremos do pico
coincidem com a linha basal. Desta forma, obtiveram-se as reas sob a curva que
correspondentes quantidade de radioactividade total de cada composto. Foi feita a avaliao
das respectivas quantidades percentuais em funo da radioactividade total detectada. A
pureza radioqumica do radiofrmaco preparado (99mTc-AA) traduz-se na equao 8. A
percentagem definida nessa equao traduz a eficincia de marcao definindo assim a
percentagem da actividade medida do composto marcado em relaco actividade das
impurezas qumicas presentes na formulao.
( %99m Tc-AA)=100-(%99m TcO4-+ %99m Tc-RH)

Equao 8: Pureza radioqumica
Tendo em conta que a fraco da actividade do
99m
Tc-RH no determinada no HPLC, na
equao acima a % de 99mTc-RH ser considerado como valor nulo.
32
Materiais e Mtodos
Sendo o HPLC uma tcnica baseada na separao de diferentes componentes de uma amostra
essencial que a separao seja feita da melhor forma possvel para que a distino desses
componentes seja feita de uma forma mais credvel. Para isso procedeu-se ao clculo da
resoluo da coluna usada neste equipamento, bem como da sua eficincia e selectividade.
Para tal, atravs de uma anlise as amostras no radioactivas presentes no kit, o AA e o FeCl3
procedeu-se a anlise grfica de um cromatograma, obtido pela deteco UV. Outros
parmetros para avaliar o bom funcionamento do equipamento foram determinados e

vo ser apresentados mais a frente neste captulo.
2. Estudos in Vitro
2.1.
Culturas celulares
As linhas celulares, adenocarcinoma colorectal (WiDr) e melanoma (A375,) obtidas na

American Type Culture Collection (ATCC), foram descongeladas e ampliadas em cultura em
monocamada a 37 C, com 5% de CO2 (incubadora Heracell 150) utilizando, para ambas as
linhas celulares, o meio Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM, Sigma D-5648)
suplementado com 100 M de piruvato de sdio (Gibco 11360), 4,5 g/L de glicose, Lglutamina (2mM), 10% de soro bovino fetal (Gibco 2010-09) e 1% de antibitico (100 U/mL de
penicilina e 10 g/mL estreptomicina: Gibco 15140-122).
As duas linhas celulares foram usadas para compreender o comportamento in vitro das
duas formas da vitamina C (AA e DHA). Foram realizados estudos de captao com 99mTc-AA,
estudos de citotoxicidade da forma reduzida utilizado o mtodo do MTT [3-(4,5dimethylthiazol-2-yl)2,5-diphenyltetrazolium bromide] e avaliao da sobrevivncia celular
atravs dos ensaios clonognicos, para as duas linhas celulares. Estudos de estabilidade das
duas formas da vitamina C foram realizados por HPLC e estudos in vivo, usando a linha celular
WiDr.
33
de referir que todo o material de manipulao das culturas celulares foi devida e
previamente esterilizado. Da mesma forma que todos os procedimentos foram efectuados nas
condies de esterilizao e assepsia necessrias.
2.2.
Estudos de captao
Para a realizao dos estudos de captao as cluas, ambas as linhas celulares foram
incubadas com 3 mL de uma soluo de tripsina-EDTA a 0,25% (Gibco 25200) durante trs
minutos, para ocorrer a desagregao celular. Seguidamente, e para inactivar a tripsina, foram
adicionados suspenso celular cerca de 8 mL de DMEM, a qual foi posteriormente
centrifugada a 1000 rotaes por minuto (rpm) durante 5 minutos (Heraeus Multifuge 1L-R;
raio do rotor 18,7 cm). As clulas foram ento ressuspensas em meio de cultura, para
obteno de uma supenso celular com a concentrao de 2x106 clulas/mL. Com o intuito de
recuperarem do stresse causado pela aco enzimtica da tripsina, foram deixadas a repousar
durante 60 minutos, em dois frascos de 25 cm2, temperatura de 37 C e numa atmosfera
contendo 5% de CO2.
Aps a preparao da suspenso celular foi adicionado um volume de 99mTc-AA a cada
um dos frascos, de forma a obter uma concentrao de cerca de 0,925 MBq/mL do
radiofrmaco. Tubos de eppendorf contendo 500 L de uma soluo de tampo fosfato
(Phosphate Buffer Solution PBS 0,5 mg/mL ajustado a pH 7,4), foram previamente
colocados no gelo para que, ao colocar as amostras da suspenso, o metabolismo celular seja
reduzido. Passados 5, 15, 30, 45, 60, 90 e 120 minutos aps a adio do radiofrmaco,
retiraram-se trs amostras de 200 L da suspenso presente nos frascos. Para permitir a
separao do pellet e do sobrenadante centrifugaram-se as amostras a 10000 rpm durante 60
segundos. O sobrenadante foi ento transferido para um tubo RIA identificado. Adicionaramse mais 500 L de PBS gelado ao tubo de eppendorf contendo o pellet e repetiu-se o
procedimento de centrifugao para obter a completa rentabilizao do sobrenadante.
34
Materiais e Mtodos
Posteriormente, pela contagem de ambas as fraces (pellet e sobrenadantes) no

contador de poo (DPC Gamma C12) em CPM, quantificou-se a captao em percentagem do
99m
Tc-AA traduzida pela equao (9):
100
Equao 8: Equao para a determinao da captao do radiofrmaco
Para alm deste estudo de captao, foi realizado outro com o mesmo procedimento,
no entanto, com a incubao somente de
99m
TcO4Na, para efectuar a comparao com a
percentagem de captao obtida com a molcula marcada.

Na amostra incubada durante 120 minutos foi determinada a viabilidade celular da
suspenso, pelo mtodo descrito seguidamente.
2.3.
Determinao da viabilidade cellular
A viabilidade celular foi determinada recorrendo ao mtodo de excluso do azul

tripano. Este mtodo baseado no princpio de que as clulas viveis possuem membranas
celulares intactas e o corante no atravessa e portanto no ficam coradas. Nas clulas mortas,
o corante atravessa a membrana celular, devido ao facto desta se encontrar destruda. Por
conseguinte, observadas ao microscpio, as clulas mortas podem ser distinguidas pois
aparecem coradas de azul, enquanto as vivas se encontram com aspecto brilhante. Este facto
possibilita a determinao da percentagem de clulas viveis, pela equao (10):
100
Equao 9: determinao da viabilidade celular
Foram adicionados 20L azul tripano a um tubo de eppendorf, de seguida adicionou-se

20 L da suspenso celular. A mistura foi homogeneizada utilizando uma micropipeta e
colocada num hemocitmetro para observar ao microscpio ptico (Motic AE31) com
35
ampliao de 100x. Efectuou-se a contagem das clulas vivas (brilhantes) e das clulas mortas
(coradas de azul) nos quatro quadrantes do hemocitmetro. Posteriormente, calculou-se a
viabilidade das clulas de adenocarcinoma colorectal, em percentagem, utilizando a expresso
acima referida.
2.4.
Estudos de citotoxicidade
2.4.1.
Avalio da proliferao celular por colorimetriaO mtodo do MTT,
foi usado para avaliar a proliferao das clulas de adenocarcinoma colorectal (WiDr) e de
melanoma (A375), sendo este um mtodo colorimtrico baseado na capacidade da enzima
mitocondrial dehidrogenase, presente nas clulas viveis, clivar os anis tetrazlio do MTT e
formar cristais formazan de cor azul escura. Quando as membranas celulares esto ntegras,
estes cristais atravessam-nas, o que induz sua acumulao nas clulas viveis.
Consequentemente, o nmero de clulas vivas proporcional quantidade de cristais de
formazan produzidos (Mosmann, 1983).
Para estes estudos, e semelhana do descrito para os estudos de captao, foi
necessria a preparao de uma suspenso celular com 50000 clulas/mL em meio de cultura.
Esta suspenso foi distribuda por placas de 24 poos, contendo cada poo 500 L da
suspenso, e aps 24h as clulas foram incubadas com diferentes concentraes de AA. A
linha celular WiDr foi incubada com as seguintes concentraes num intervalo de 0,05 a 50
mM. De igual modo as clulas A375 foram incubadas com concentraes do AA a apartir do
0,05 at 10 mM, seguindo os mesmos valores usados na linha celular WiDr. As clulas foram
incubadas com as referidas concentraes durante os tempos apresentados na tabela 1.
Passados os tempos de incubao, os meios de cultura contendo a molcula foram retirados e
acrescentado 500 L de meio novo a cada poo. A proliferao celular foi avaliada s 24 e 48
horas de forma a obter as curvas de dose-resposta. Depois de passado o respectivo tempo de
repouso (24 e48 horas), o meio de cultura foi retirado, adicionou-se 500 L de PBS para
36
Materiais e Mtodos
lavagem e, posteriormente, 200 L de uma soluo de MTT (M2128, Sigma) dissolvida em PBS
foi adiconada a cada poo e as clulas ficaram a incubar por 3 horas. Passado esse tempo,
acrescentou-se 200 L de uma soluo de isopropanol cido, com 0,04 M de cido clordrico
(37 % fumante), e as clulas foram colocadas numa placa de agitao durante 30 minutos. O
contedo de cada poo foi transferido para uma placa de 96 poos e a absorvncia foi
quantificada a 570 nm com um filtro de referncia de 620 nm, usando o espectrofotmetro
ELISA (SLT - Spectra).
Tabela 1: Resumo dos tempos de incubao e respectivos tempos de repouso
WiDr
Tempo de incubao (horas)
Tempo de repouso (horas)
1
4
24
48
4
1
A375
24
4
1
48
2.4.2. Avaliao da sobrevivncia celular atravs do ensaio clonognico

Para determinarmos o factor de sobrevivncia das WiDr e A375 foram realizados
ensaios clonognicos de modo a avaliar a capacidade das clulas em formar colnias e em
sobreviver aps exposio ao AA. Para estes estudos, utilizaram-se as duas linhas celulares
referidas anteriomente, onde depois de serem desagregadas dos frascos de cultura pela aco
enzimtica da tripsina pelo mesmo processo usado nos estudos de captao, foram semeadas
500 clulas por poo numa placa de 6 poos. Aps 24 horas, tanto as WiDr, como as A375
foram incubadas com quatro concentraes diferentes do AA: 0,5, 2, 3 e 5 mM, durante 2
horas. Passadas as duas horas, o meio contendo o AA foi retirado e as clulas foram lavadas 2
vezes com 1ml de PBS tendo sido adicionado posteriormente 3 mL de meio novo. Estas clulas
foram mantidas na incubadora, temperatura de 37 C e numa atmosfera contendo 5% de
37
CO2, durante 10 dias com troca de meio no 5 dia. Aps os 10 dias verificam-se formao de
colnias macroscpicas. Cada colnia corresponde a uma clula semeada que aderiu placa e
se multiplicou posteriormente. Para proceder contagem das colnias formadas, melhorou-se
a visualizao destas. Com esse objectivo, os poos foram lavados duas vezes com 1 mL de PBS
e, de seguida, as clulas foram incubadas com 2 mL de metanol (Merck - K35192409) durante
5 minutos, tendo sido este procedimento repetido duas vezes. Passados os 5 minutos as placas
ficaram a secar por mais 5 minutos, logo a seguir foi adicionado 2 mL do corante violeta de
cristal (Sigma- C3886) (0,5 % diludo em metanol), o qual actuou durante 5 minutos.
Posteriormente o corante foi aspirado, as placas lavadas em gua tpida at a eliminao total
do excesso do poos, sendo que para 6 poos, 3 so controlo. Destes resultados foi possvel
calcular o factor de sobrevivncia das clulas [SF surviving factor (%)] e a eficincia da placa
[PE plate efficiency (%)], atravs das seguintes equaes:
100 (A)
100 (B)
Equao 10: A - Eficincia da placa. B - Factor de sobrevivncia.
2.5.
Estudos de Estabilidade da vitamina C
Para analisar a estabilidade das duas formas da vitamina C em culturas celulares

procedeu-se anlise por HPLC. Neste estudos a linha celular usada foi a do adenocarcinoma
colorectal (WiDr), desta feita a anlise dos diferentes compostos presentes nas culturas
celulares foi realizada no HPLC usando o mesmo mtodo desenvolvido para o controlo de
qualidade j descrito, assim, usou-se a mesma de fase estacionria, fase mvel e respectivo
gradiente, fluxo, comprimento de onda, volume injectado e durao da deteco. Esta anlise
permitiu tambm estudar a estabilidade das duas formas da vitamina C (AA e DHA) em cultura,
bem como os seus mecanismos de transporte para dentro da clula. Alm disso, foi possvel
verificar se a reaco de oxidao que forma DHA a partir do AA, se dava num meio de cultura,
bem como o efeito do pH do meio nas duas formas da vitamina C.
38
Materiais e Mtodos
Para proceder ao estudo da estabilidade da vitamina C in vitro, 1 mL de meio DMEM

foi adicionado em cada poo de uma placa de 12 poos. Aps 24 horas, as clulas foram
incubadas com 10 mM de AA e DHA (D8132, Sigma), durante os tempos de incubao referidos
na tabela 2. A diferentes tempos de incubao as amostras foram filtradas usando filtros de
0,2 M (Whatman FP30/0,2 Schleider & Schnell), e injectadas (25 L) no HPLC. Os
cromatogramas foram processados determinando o tempo de reteno de cada conponente
das amostras injectadas, e pelo desenho de ROIS do tipo DD determina-se a rea de cada pico.
De notar que, amostras padro de AA, DHA, com uma concentrao de 10 mM, e de DMEM
foram injectados no HPLC previamente, tendo os seus cromatogramas e respectivos tempos
de reteno como referncia.
Tabela 2: Amostras injectadas no HPLC para o estudos da estabilidade da vitamina C.
Amostras
Tempo de Incubao (horas)
Concentrao
DMEM+AA
24
48
72
96
10 mM
DMEM+DHA
24
48
72
96
10 mM
DMEM
24
48
72
96
---------
2.5.1.
Avaliao do meio extracelular
Neste estudos, foi verificado comportamento do AA e DHA em cultura celular, na

presena de metabolismo celular, pois pela anlise no HPLC podemos determinar a quantidade
consumida pelas clulas, bem como a influncia que os metabolitos podem ter sobre as duas
formas da vitamina C. Preparou-se uma suspeno celular com 50000 clulas/mL, e 1mL dessa
suspenso foi distribuda por placas de 12 poos e deixadas na incubadora durante 24 horas.
Nesta anlise, a nossa amostra foi o meio extracelular, pois queremos verificar a evoluo na
alterao do AA e DHA in vitro. As WiDr foram preparadas de forma semelhante aos estudos
de proliferao celular de modo a obter uma suspenso celular de 50000clulas/mL, e
distribudas por placas de 12 poos e aps 24 horas foram incubadas com as concentraes e
durante os tempos referidos na tabela 3. Passado o respectivo tempo de incubao, as
amostras foram filtradas, usando filtros de 0,2 M (Whatman FP30/0,2 Schleider & Schnell), e
39
injectadas no HPLC para obteno dos respectivos cromatogramas. Amostras de meio, sem
tratamento com o AA e DHA, com os mesmos tempos de incubao e na presena de
metabolismos celular foram injectadas para servir de controlo.
Tabela 3: Amostras injectadas no HPLC na presena de metabolismo celular para avaliar o meio
extracelular.
Amostras
Tempo de incubao (horas)
Concentrao
AA+Meio
24
48
72
96
3 mM
AA+Meio
24
48
72
96
7 mM
AA+Meio
24
48
72
96
10 mM
DHA+Meio
24
48
72
96
3 mM
DHA+Meio
24
48
72
96
7 mM
DHA+Meio
24
48
72
96
10 mM
Meio
24
48
72
96
3 mM
Meio
24
48
72
96
7 mM
Meio
24
48
72
96
10 mM
Com o objectivo de determinar a linearidade do equipamento de decteco UV foram

injectados vrias amostras de uma soluo de AA em vrias concentraes diferentes (1, 3, 5, 7
e 10 mM) a fim de construir a curva de calibrao. O detector deve apresentar uma
sensibilidade tal que, a curva de calibrao da rea de integrao versus a concentrao se
aproxima de uma linha recta ou se ajusta a uma equao linear:
=
+
Equao 11: Linearidade (retirado de Snyder, 2002)
Onde o y a resposta (rea do pico), o x a concentrao, o m o declive da recta e o b a

interceco com a linha de ajustes dos dados.
3. Estudos in Vivo
Com vista a avaliar a eficincia do mtodo usado para o controlo de qualidade bem como
o potencial imagiolgico do 99mTc-AA e de certa forma confirmar os resultados observados
40
Materiais e Mtodos
nos estudos in vitro, foram realizados estudos em ratinhos Balb/c nu/nu. A escolha destes
animais justifica-se pelo facto de serem animais atmicos e deficientes em clulas T, pelo que
permitem o desenvolvimento de tumores aps a implantao de clulas tumorais. Pelo
desconhecimento do comportamento biolgico da molcula em estudo, levou a que tivssemos de realizar estudos de biodistribuio em animais normais. Estes estudos permitiramnos inferir acerca das vias de excreo assim como dos rgos-alvo do 99mTc-AA. Os
resultados farmacocinticos obtidos serviram para anlise comparativa com os obtidos em
animais com xenotransplantes.
3.1.
Estudos de biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA
Os ratinhos Balb/c nu/nu normais foram primeiramente anestesiados com uma

soluo de ketamina (77 %) e cloropromazina (23 %) (ketamina, Ketalar, Porke-Davis e
cloropromazina, Largactil, Laboratrios Vitria), administrada por via subcutnea.
Posteriormente, para proceder aos estudos de biodistribuio, foi-lhes administrada uma
actividade de
99m
Tc-AA de cerca de 1,64 MBq por injeco intravenosa (iv) na veia dorsal da
cauda, sobre o colimador de uma cmara-gama. Aps a administrao do radiofrmaco, os

ratinhos foram sacrificados, por deslocamento cervical, de acordo com a legislao em vigor,
aos 30, 60, 90, 120, 150, 180, 210, 240, 300 e 360 min aps a administrao do radiofrmaco.
Em cada tempo, realizou-se a autpsia dos animais, com colheita de vrios rgos (corao,
pulmo, tiride, vescula biliar, fgado, bao, estmago, intestino delgado, intestino grosso,
genitais, bexiga, crebro e cerebelo), assim como de alguns tecidos (cartilagem, msculo, osso
e sangue) e fluidos de excreo (blis e urina). Cada um dos rgos, tecidos ou fluidos foi
colocado num tubo de RIA, previamente pesado. Cada tubo, agora com o respectivo contedo
da autpsia, foi pesado (em gramas) e posteriormente contado num contador de poo para
quantificao da actividade presente (em CPM).
Tornou-se ento possvel a determinao da percentagem de dose de radiofrmaco
41
99m
Tc-AA injectado/grama de rgo, tecido ou fluido. Este clculo traduzido na equao 13.
100
Equao 12: Percentagem de dose do radiofrmaco injectado por grama de rgo.
3.2.
Desenvolimento de Xenotransplantes
O modelo animal foi desenvolvido em xenotransplantes em ratinhos Balb/c nu/nu

machos, obtido atravs de injeco de cerca de 6x106 clulas da linha celular de
adenocarcinoma do clon (WiDr) no cavado axilar direito. A escolha dessa zona deve-se ao
facto deste ser contralateral ao corao, ficar longe do fgado, do rim e da bexiga, evitando
assim a sobreposio com as projeces das reas cardaca, heptica, renal ou vesical,
circunstncias muito importantes para uma boa visualizao. Tendo tambm uma boa rea
para expanso e apresenta boa vascularizao, o que permite um desenvolvimento rpido do
xenotransplante.
3.3.
Estudos de biodistribuio em ratinhos com xenotransplantes com
99mTc-AA
Um protocolo semelhante ao realizado para os estudos de biodistribuio em ratinhos

normais Balb/c nu/nu, foi realizado para os estudos de biodistribuio realizados em ratinhos
Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes. Deste modo, todos os rgos/tecidos/fluidos
referidos anteriomente foram colhidos, bem como o tumor. Aps a exciso deste, foi pesado e
contado no contador de poo e calculado o seu volume atravs a seguinte equao:
Equao 13: Clculo do volume do tumor
onde L corresponde ao dimetro maior do tumor e S ao dimetro menor.
42
Materiais e Mtodos
Com o objectivo de estabelecer uma relao entre as captaes observadas in vivo do 99mTc-AA
foram calculadas as razes tumor/osso, que consistem na razo entre a % de actividade administrada/grama do tumor e a % de actividade administrada/grama do osso e a razo
tumor/sangue, que consiste na razo entre a % de actividade administrada/grama do tumor e
a % de actividade administrada/grama do sangue.
3.4.
Imagiologia com 99mTc-AA
Os estudos de imagiologia nuclear incluram a aquisio de imagens dinmicas e

estticas. A aquisio dinmica foi concretizada para assegurar a entrada e a progresso do
radiofrmaco. As caractersticas das aquisies, dinmica e esttica, esto sumariadas na
tabela 4. Ambas foram feitas usando uma cmara-gama (GE 400 AC) controlada por um
computador de aquisio GenieAcq e incorporando um colimador paralelo de baixa energia e
alta resoluo (LEHR low energy and high resolution).
Tabela 4: Caractersticas das imagens dinmicas e estticas.
Imagens
Zoom
Matrizes (pixels)
N de Imagens
Durao
Dinmicas
128X128
10
300
Estticas
256X256
120
Os ratinhos Balb/c nu/nu foram anestesiados segundo o protocolo supramencionado

nos estudos de biodistribuio. Seguidamente, estes foram injectados com 1,64 MBq de 99mTcAA na veia dorsal da cauda sobre o colimador da cmara gama e imediatamente iniciou-se a
aquisio dinmica, com o intuito de confirmar a entrada e progresso do radiofrmaco.
Passsados os 5 minutos da aquisio dinmica forma adquiridos imagens estticas aos 30, 60,
90, 120, 150, 180, 240, 300 e 360 minutos aps a injeco do radiofrmaco.
Depois de adquiridas as imagens estticas, estas foram transferidas para uma estao de
trabalho Xeleris, para posterior processamento e anlise. Para o processamento das imagens
43
estticas desenharam-se regies de interesse (ROIs) para os vrios rgos, nomeadamente,

tiride, estmago, fgado, rim, bexiga. As ROIs foram desenhadas em rgos a partir dos quais
se poderia obter informao sobre a existncia de impurezas radioqumicas, presentes no
radiofrmaco. Sabendo-se que normalmente a acumulao de
99m
Tc-O4- se d ao nvel da
tiride e estmago, e que, por sua vez, a acumulao de 99mTc-RH se verifica ao nvel do fgado
e bao, tornou-se possvel inferir e comprovar os valores de pureza radioqumica do 99mTc-AA
obtidos por HPLC. Por outro lado, as ROIs foram tambm desenhadas em zonas de maior
actividade, para permitir a anlise das vias de metabolizao e excreo do complexo injectado.
3.5.
Avaliao do crescimento tumoral in vivo aps tratamento com
AA
Ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes, foram usados para desenvolver
esse estudo. Aps sete dias de injeco de aproximadamente 4X106 clulas por rato, sendo
que foi reallizada uma monitorizao contnua do peso e do volume dos ratinhos diariamente,
a terapia com 150mg/Kg de AA, comeou-se quando o volume do tumor atingiu os 300 a
350 mm3. O protocolo de tratamento consistiu numa injeco diria da referida soluo do AA
intraperitonealmente. Esse perodo foi de 12 dias em que as injeces tiveram dois dias de
descanso a cada 5 de injeco. Os ratinhos que serviram de controlo tambm foram pesados
diariamente e o volume dos seus tumores medidos. Aps os 12 dias de tratamento os ratinhos
foram sacrificados, e os tumores foram retirados, medidos e pesados.
4. Anlise estatsca
Atravs dos precedimentos descritos anteriormente obteve-se resultados em que para
aumentar o seu rigor interpretativo procedeu-se a anlise usando aplicaes do SPSS
(Statistical Package for Social Sciences), verso 16.
Nos estudos de captao e estudos clonognicos foram feitos testes no paramtricos visto
44
Materiais e Mtodos
que as amostras de dados so reduzidas e no seguem uma distribuio normal. Em casos em

que se pretendia fazer a comparao de valores emparelhados, isto , por exemplo duas
variveis (p.ex. WiDr e A375) ao longo do tempo, utilizmos o teste de Wilcoxon. Por outro
lado, usmos o teste de Mann-Whitney para comparar duas amostras independentes (p.ex.
WiDr e A375) dentro da mesma varivel (p.ex. concentrao do AA). Tambm, foi usado o
teste de Friedman para anlise de varincia entre dois ou mais grupos relacionados (p.ex. %
Captao e o tempo).
45
46
Captulo III- Resultados
48
Resultados
1. Estudos de qumica
1.1.
Preparao e controlo de qualidade do 99mTc-AA
O primeiro protocolo desenvolvido para a preparao do
99m
Tc-AA consistia em
adicionar, 222 MBq de pertecnetato de sdio (em 3mL de NaCl 0,9%) e 0,2 mL de FeCl3 0,1 N
(em HCl 0,1 N) a 200 mg de AA, acertando o pH a 6,5 - 7 (com uma soluo de NaOH 1M), a
temperatura de 0C durante 3 horas e mantida em atmosfera de rgon e protegido da luz.
Procedeu-se a realizao do controlo de qualidade para determinar a pureza radioqumica, por
HPLC, do composto
99m
Tc-AA. Previamente, as amostras de AA, FeCl3 e
99m
TcO4- foram
injectadas no HPLC para determianr os respectivos tempos de reteno (grfico 1, grfico 2 e

grfico 3 respectivamente).
Grfico 1 : Cromatograma da amostra do AA (10mM) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
determinado por integrao grfica.
Grfico 2: Cromatograma da amostra de FeCl3 (0,1N) injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
Grfico 3: Cromatograma da amostra do 99mTcO4- injectada no HPLC, sendo o seu tempo de reteno
49
De referir que no foi possvel visualizar o pico referente ao 99mTc-RH, uma vez que este fica
retido na pr-coluna (sendo que o poro da pr coluna s deixa passar partculas com dimetro
igal ou menor a 0,1nm e o
99m
Tc-RH um colide com 130 nm de dimetro, sendo que as
partculas que constituem os agragados coloidais apresentam um dimetro de 2 a 3 nm). Com

estes estudos obtiveram-se os respectivos tempos de reteno evidenciados nos grfico 1,
grfico 2 e grfico 3 e que esto sumariados no quadro 1.
Quadro 1: Tempo de reteno das amostras padro injectadas no HPLC. Os valores referentes s
amostras padro representam a mdia de trs injeces
Tipo de deteco
Composto
Tempo de reteno (minutos)
AA
FeCl3
99m
Tc-O4
3,85 0,03
UV
2,75 0,01
UV
4,36 0,03
Radioactividade
Baseado nos dados do grfico foi ento possvel determinar os diferentes constituintes
do composto marcado por comparao dos tempos de reteno. Tambm foi possvel calcular
a eficincia de marcao pela relao entre as reas do 99mTcO4-, cujo tempo de reteno j era
conhecido, e do 99mTc-AA. Por excluso de partes, o pico do 99mTc-AA aquele que aparece aos
3,05 minutos (3,05 0,12 minutos). O grfico 4 representa um cromatograma obtido a partir
da deteco por radioactividade de uma formulao obtida com o protocolo de marcao
supra citado. A partir deste podem observar-se claramente os tempos de reteno dos
diferentes compostos radioactivos presentes no complexo, distinguindo-se claramente o 99mTcAA do 99mTc-O4-. Os compostos no radioactivos (deteco UV) e os radioactivos (deteco por
radioactividade) esto representados no grfico 4A e grfico 4B, 4C e 4D, respectivamente. O
controlo de qualidade foi realizada logo aps a marcao bem como aos 30 min, 1 h, 1,5 h, 2 h,
2,5 h, 3 h, 4 h, 5 h, 6 h e 24 h aps a marcao.
50
Resultados

correspondente ao controlo de qualidade do kit as 24 horas aps a marcao observando uma eficincia
de marcao igual a 90,40%.
Como se pode verificar a eficincia de marcao do kit teve um melhoramento

contnuo desde do momento da marcao at as 24 horas depois, sendo que a maior eficincia
verificada a essa hora. Como prtica clnica essa formulao seria invivel uma vs que seria
necessrio uma alta actividade do
99m
Tc-pertecnetato de sdio para a realizao de uma
anlise mdica. Com vista a melhorar a eficincia de marcao, procedeu-se ao

desenvolvimento de uma nova formulao farmacutica consistindo em manter todas as
condies anteriores, excepto a temperatura do kit. Desta feita a marcao foi feita a
temperatura ambiente e o kit foi mantido assim durante todo o tempo que foi feito o controlo
de qualidade. Assim como na anterior formulao o controlo foi realizado aps os mesmos
tempos. De facto, como se verifica no grfico 5, houve uma melhoria significativa na eficincia
51
de marcao ao longo do tempo e manteve-se sempre acima dos 90% durante todo o tempo
que foi feito o controlo de qualidade.

correspondente ao controlo de qualidade do kit as 24 horas aps a marcao observando uma
eficincia de marcao igual a 90,91%.
Aps vrias tentativas no sentido de optimizar o processo de marcao, a maior

eficincia de marcao foi observada quando a formulao farmacutica teve a seguinte
composio: 222 MBq de pertecnetato (em 1,5mL de NaCl 0,9 %), 0.2 mL de FeCl3 0,1 N (em
HCl 0,1 N), 200 mg de AA, pH acertado a 6,5 - 7 (com soluo de NaOH 1M), temperatura
52
Resultados
ambiente e a formulao continuamente mantida em atmosfera de rgon e protegida da luz. O

controlo de qualidade foi realizado durante todos os tempos referidos anteriormente.
No grfico 6 podemos ver os gromatogramas de um kit com uma elevada eficincia de
marcao (> 99%), determinada a partir da formulao farmacutica supra citada.
Grfico 6: Cromatogramas de uma formulao farmacutica de elevada eficincia de marcao. A

Cromatograma resultante da decteco UV, representando os compostos no radioactivos presentes na
formulao. B Cromatograma resultante da deteco de radioactividade correspondente ao controlo
de qualidade do kit aos zero minutos aps a marcao observando uma eficincia de marcao igual a
99,45%. C Cromatograma resultante da deteco de radioactividade correspondente ao controlo de
qualidade do kit a 6 horas aps a marcao observando uma eficincia de marcao igual a 99,51%.
A tabela 5 representa o valor da mdia da eficincia de marcao de quatro

formulaes radiofarmacuticas obtidas durante os tempos em que o controlo de qualidade
foi realizado no HPLC.
Da anlise dos diversos resultados obtidos podemos verificar que a eficincia de
marcao se manteve estvel ao longo do tempo, sinal revelador da elevada estabilidade da
formulao radiofarmacutica. De notar que a maior eficincia de marcao foi alcanada aps
seis horas, sendo de ressalvar que a eficincia de marcao manteve-se sempre acima do 95%
53
durante todos os tempos em que foi realizado o controlo de qualidade. Relativamente

determinao do pH, verificou-se que ao longo do tempo este parmetro se mantm
constante entre valores de 6.5 e 7.
Tabela 5: Mdias das eficincias de marcao de quatro formulaes farmacuticas ao longo do tempo
pH
Tempo (Horas) Eficincia de Marco
0,00
97,46 1,48
6,5 - 7
0,50
95,76 2,49
6,5 7
1,00
97,26 1,39
6,5 7
3,00
96,97 2,19
6,5 7
4,00
97,72 1,30
6,5 7
6,00
98,36 1,07
6,5 - 7
Sendo assim, o HPLC aparece como o mtodo escolhido por excelncia para a
realizao do controlo de qualidade do nosso composto, contudo fica por desenvolver um
mtodo complementar para a determinao da presena do 99mTc-RH no 99mTc-AA.
Antes de considerar os resultados obtidos no HPLC, vlidos procedeu-se a anlise de
parmetros de avaliao da integridade da coluna, para que tenhamos a certeza que a
separao dos componentes da amostra feita de forma a poderem ser distinguveis.
mV
Tempo (min)
Grfico 7: Cromotograma refente aos picos de AA (pico B) e FeCl3 (pico A) detetados por UV.
A resoluo da coluna foi calculada tendo em conta os dados do grfico 7, referente a uma
deteco UV de um controlo de qualidade.
Sendo assim a resoluo da coluna :
54
Resultados
=2
=2
3,85 2,75
= 1,83333
0,6 + 0,6
Os valores dos tempos de reteno de cada pico foram referidos no quadro 1, o wA e

wB so a largura de cada pico representado no grfico 7. Desta feita, podemos dizer que a
separao entre os picos A e B boa, pois considera-se que valores de resoluo iguais ou
superiores a 1,5 so suficintes para haver uma boa distino entre dois picos adjacentes
(Snyder, 2002)
Para alm da resoluo, a selectividade da coluna tambm foi calculada em relao
aos valores do quadro 1 e do grfico 7.
3,85
= 1,4
2,75
Uma coluna apresenta uma boa selectividade quando esta superior a 1, para que a
separao seja boa, pois a selectividade depende das propriedades do analito e das interaes
deste com a coluna (Kazakevich, 2007).
Tambm os valores de eficincia foram calculados para cada um dos picos (AA e FeCl3),
baseada na teoria dos pratos, em que a coluna dividida num nmero hipottico de pratos de
altura finita (HETP- height of effective theoretical plate). E a maior eficincia observa-se
quando maior o numero de pratos ou quanto menor a altura o prato (HETP). Deste modo
uma boa eficincia caracteriza-se quando o valor do HETP for menor que um (Kazakevich,
2007).
Nmero de pratos:
= 16
= 16
3,85
0,6
= 658,78
= 16
= 16
2,75
0,6
Em relao selectividade, como a nossa coluna tem um comprimento de 20 cm:
55
= 336,11
= 0,03
= 0,059
Sendo os valores de HETPAA e HETPFeCl3 menores que a unidade podemos confiar nos
resultados obtidos no HPLC, pois os parmetros que influenciam a separao analtica esto
todos dentro do considerado ptimo
2. Estudos in vitro
Aps a realizao dos estudos de qumica pocedeu-se realizao dos estudos in vitro de
modo a estudar a estabilidade do nosso composto marcado em culturas celulares de WiDr e
A375, estudando o seu influxo nestas, pelos estudos de captao, bem como avaliar a
citotoxicidade da forma reduzida da vitamina C (AA) pela avaliao da proliferao e
sobrevivncia celular, tambm efectou estudos no HPLC para avaliar a estabilidade do AA e do
DHA in vitro.
2.1.
Estudos de captao
Os estudos de captao foram feitos nas linhas do adenocarcinoma colorectal (WiDr) e

nas do melanoma melanoctico (A375) com o intuto de comparar a captao do
nessas duas linhas. Primeiramente, foi realizado estudo captaes do
99m
Tc-AA,
99m
Tc-Livre (99mTcO4-),
para servir como referncia numa concentrao de 0,925 MBq/mL. Posteriormente a

percentagem de captao do 99mTc-AA para a mesma concentrao foi determinada nas duas
linhas celulares. No que diz respeito a captao nas clulas WiDr, podemos observar no grfico
8, que a percentagem de captao do 99mTc-AA inferior do
99m
Tc livre ao longo do tempo,
excepto aos 5 e aos 120 minutos sendo, no entanto, esta diferena pouco significativa (p >
0,05). Ao longo do tempo o 99mTc-AA comporta-se de forma semelhante ao 99mTc-livre, sendo
que o seu pico de captao ocorre aos 120 minutos com um valor de 0,45%, enquanto o do
99m
Tc-livre ocorre aos 60 minutos com um valor 0,64%. Como evidenciado no grfico, os
valores de captao encontrados para o
99m
Tc-AA no diferem significativamente dos valores
56
Resultados
obtidos para o
99m
Tc-livre, sendo por este motivo considerados baixos, apresentando valores
Captao (%)
que variam entre 0,36 e 0,45%.
99mTc-AA
0,80
99mTc-livre
0,60
0,40
0,20
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
Tempo (min)
90
100
110
120
130
Grfico 8: Captao do 99mTc-AA e do 99mTc-livre nas WiDr. As clulas foram incubadas com a mesma
99m
99m
concentrao de
Tc-AA e do
dados expressam a mdia de oito experincias intependentes
Por outro lado as A375, ao contrrio das WiDr, apresentam um aumento na captao
do 99mTc-AA em realco captao do 99mTc-livre excepto durante os primeiros vinte e cinco
minutos do estudo, como evidenciado no grfico 9. De notar que aos 90 minutos a captao
99m
do
Tc-AA semelhante do
99m
Tc-livre (0,26 e 0,25%, respectivamente). Do grfico
podemos observar que o pico de captao do 99mTc-AA ocorre aos 120 minutos com um valor
de 0,36%, bem como o do 99mTc-livre com um valor de 0,26%. A captao das A375 varia entre
0,22 e 0,36%. Verifica-se que aos 45, 60 e 120 minutos existem diferenas entre a captao do
99m
Tc-AA e do 99mTc-livre, contudo essa diferena no estatisticamente significativa (p>0,05).

99mTc-AA
Captao (%)
0,60
99mTc-livre
0,40
0,20
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
Tempo (min)
80
90
100
110
120
130
Grfico 9: Captao do 99mTc-AA e do 99mTc-livre nas A375. As clulas foram incubadas com a mesma
concentrao de 99mTc-AA e do 99mTc-livre e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os
dados expressam a mdia de oito experincias intependentes.
57
Ao comparar a captao do 99mTc-AA nas duas linhas celulares verificamos que as WiDr
tm uma maior captao do que as A375, como se pode observar no grfico 10, excepto aos
45 minutos em que a captao semelhante. Essa diferna estatisticamente significativa
(p<0,05) para 15, 30, 60 e 90 minutos, com valor p igual a 0,028, 0,015, 0,010 e 0,021
respectivamente. Por outro lado, de notar que ambas as linhas celulares tm o mesmo
comportamento ao longo do tempo, excepto no intervalo entre os trinta e os quarenta e cinco
minutos. O pico de captao das WiDr e A375 ocorre aos 120 minutos e tm o valor de 0,45% e
0,36%, respectivamente. De notar ainda que, ao compararmos a captao das duas linhas
celulares com a captao do Tc livre, conclui-se que estas possuem uma baixa captao.
Captao (%)
WiDr
A375
0,80
0,60
0,40
0,20
0,00
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90 100 110 120 130
Tempo (min)
Grfico 10: Captao do 99mTc-AA nas WiDr e A375. As duas linhas celulares foram incubadas com a
mesma cancentrao do 99mTc-AA e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os dados
expressam a mdia de oito experincias intependentes.
Ao fim dos 120 minutos de captao, em todos os estudos foi determinada a

viabilidade celular recorrendo ao mtodo de excluso do azul tripano em que se verificou uma
viabilidade celular sempre acima do 95%. Os resultados so a mdia de oito estudos
independentes para o 99mTc-Livre, e
2.2.
99m
Tc-AA em cada linha.
Estudos de citotoxicidade
2.2.1.
Avaliao da proliferao celular por colorimetria
O efeito da forma reduzida de vitamina C na proliferao celular das WiDr e A375 foi
feita atravs do mtodo colorimtrico do MTT. Foram analizadas diferentes concentraes do
58
Resultados
AA nas duas linhas celulares bem como o tempo de exposio e o tempo de repouso das
clulas aps a exposio, podendo esse tempo ser crucial para a recuperao ou no das
clulas.
Aps efectuados os estudos, as curvas de dose-resposta foram feitas de modo a determinar o
IC50 para cada linha celular, sendo esta a concentrao que inibe a proliferao celular em 50%
das clulas da amostra. De notar que a proliferao calculada em relao ao controlo em que
no foi-lhe adicionado nenhuma concentrao do AA.
No grfico 11A e 10 B esto representadas as curvas dode-resposta referente a linha celular
WiDr, para 24 e 48 horas, respectivamente, sendo este tempo o de repouso. Os resultados
foram tratados utilizando a ferramenta OriginPro verso 8, em que se avaliou-se a tendncia
dos dados tendo feito uma aproximao sigmoidal, em que posterirmente se calculou o IC50 de
para cada linha, tendo em conta o tempo de exposio e o tempo de repouso.
Grfico 11: Curvas de dose-resposta do AA nas WiDr. A Grfico representando o efeito do AA com
uma e quatro horas de exposio com 24 horas de descanso. B Grfico representando o efeito do AA
com uma e quatro horas de exposio com 48 horas de descanso. Os resultados expressam a mdia de
seis experincias independentes.
Pela anlise dos grficos e recorrendo aos dados da aproximao sigmoidal, foi
possvel verificar que para 24 horas o IC50 para 1 e 4 horas de 22,734 mM e 23,98 mM
respectivamente. Enquanto que para 48 horas e 1 hora de exposio o IC50 observa-se aos
25,09 mM, e para quatro horas houve uma diminuio do IC50 apresentando o valor de
12,2 mM. Podendo estar implicito o papel do tempo de repouso aps a exposio com o AA,
59
nesses resultados, contudo o IC50 observada aos 48 horas com 1 hora de exposio inferior
ao observado aos 24 horas com uma hora de exposio.
Em relaco avaliao da proliferao das A375, os grficos tambm foram feitos
comparando os dois tempos de exposio (1 e 4 horas) para 24 e 48 horas de descanso,
representados no grfico 12.
Grfico 12:Curvas de dose-resposta do AA nas A375. A Grfico representando o efeito do AA com uma
e quatro horas de exposio com 24 horas de descanso. B Grfico representando o efeito do AA com
uma e quatro horas de exposio com 48 horas de descanso. Os resultados expressam a mdia de seis
experincias independentes
O que pode tirar da anlise do grfico 12, que o comportamento dessas clulas
semelhante independente do tempo de repouso, mas no que diz respeito ao tempo de
exposio essa semelhana no se verifica. Essa concluso pode ser comprovada pela anlise
dos IC50, que mostra que para 1 hora igual a 2,42 mM para 24 e 48 horas. O mesmo se
verifica para a exposio de 4 horas em que o IC50 ao 1,06 mM tanto para 24 e 48 horas.
Comparando a percentagem de proliferao entre as WiDr e as A375, observa-se que o IC50
maior para as WiDr, assim sendo de salientar que o AA evidenciou um efeito antiproliferativo
mais cedo nas A375 visto que o IC50 aparece antes dos 5 mM. Para ambas as linhas celulares
baixas doses do AA leva a um aumento significativo na proliferao celular, sendo que essas
doses diferem entre essas duas linhas.
60
Resultados
2.2.2.
Avaliao da sobrevivncia celular por ensaios clongnicos
A avaliao da sobrevivncia foi feita a fim de confirmar os efeitos pr-oxidantes da

vitamia C em clulas tumorais. Assim os efeitos que podero surgir, devido exposio ao AA,
so avaliados depois de um longo perodo de tempo. O grfico 13, mostra a relao entre a
percentagem de sobrevivncia das clulas e a concentrao do AA.
A375
Factor de sobrevivncia
(%)
100,00
WiDr
80,00
60,00
40,00
20,00
0,00
0
0,5
2
Concentrao do AA (mM)
Grfico 13: Relao entre a percentagem do factor de sobrevivncia e a concentrao do AA, nas WiDr e
A375. As linhas celulares foram tratadas com as concentraes referidas no grfico. Os resultados so a
mdia de trs estudos independentes.
Obeserva-se que medida que a concentrao do AA aumenta, o factor de

sobrevivncia diminui consideravelmente em relao ao controlo. Essa diminuio verifica-se
para as duas linhas celulares usadas.
Deste modo, quando as clulas so tratadas com 0,5 mM do AA a diminuio de
cerca de 40%, tendo as WiDr um valor de 55% e as A375 de 62%. No entanto, esta diferena
no estatisticamente significativa (p>0,05). Nas concentraes de 2, 3 e 5mM, a reduo do
factor de sobrevivncia evidente, sendo sempre superior a 80%. AS A375 apresentam uma
maior sensibilidade ao AA quando so incubadas com concentraes de 2 e 3mM em relao
s WiDr. Quando as clulas so incubadas com 5 mM, o factor de sobrevivncia das A375
0,420,18% e das WiDr 1,261%. As diferenas observadas entre as duas linhas celulares
apresentam resultados estatisticamente significativos para concentraes de 2, 3 e 5 mM,
sendo que as A375 aparecem como as clulas mais sensveis ao aumento de concentrao do
AA em relao as WiDr. A reduo do factor de sobrevivncia observada para as A375 varia
61
entre 37,4% a 99,58% e nas WiDr entre 44,88% a 98,74% quando a concentrao vai de 0,5 a 5
mM. Na figura 6 podemos observar a diferena entre o nmero de colnias observadas nas
placas de WiDr e A375 tratadas com AA e nos poos controlos. visvel a reduo do nmero
de colnias formado entre o controlo e o poo com 2mM.
Figura 6: Visualizao das colnias formadas. Controlo visualizado no microscpio ptico - A375 (A) e
WiDr (C) e o nmero de colnias formadas aps a exposio das clulas a 2 mM de AA - A375 (B) e WiDr
(D). Visualizao macroscpica das colnias referentes ao controlo - A375 (E) e WiDr (G) e colnias
formadas aps exposio das clulas a 2 mM de AA A375 (F) e WiDr (H).
2.3.
Estudos de estabilidade da vitamina C
Os resultados obtidos no HPLC pela deteco UV de diferentes amostras de modo a

avaliar a estabilidade das duas formas de vitamina C foram feitos em culturas celulares de
adenocarcinoma colorectal (WiDr). Esses estudos permitiu-nos de certa forma avaliar o influxo
das duas formas da vitamina C (AA e DHA) e o seu comportamento in vitro. Amostras padro
de DMEM, AA e DHA foram injectadas no HPLC, onde pela integraco grfica foi possvel
determinar os tempos de reteno correspondentes. No grfico 14 esto representados os
cromatogramas correspondentes a essas injeces e os seus tempos de reteno esto
descritos na tabela 6, onde est representada a mdia de 3 injeces independentes.
62
Resultados
Grfico 14: Cromatogramas das amostras padro injectadas no HPLC. A Amostra do DHA (10 mM). B
Amostra DMEM. C Amostra do AA (10mM).
Na tabela 6, os diferentes picos do DMEM e DHA foram identificados por DMEM1, at

DMEM4, e DHA1 at DHA3 por desconhecimento dos compostos individuais destes. Desta
feita, verifica-se que o DMEM apresenta vrios picos de deteno devendo-se ao facto de ser
constitudo por uma mistura de vrios compostos diferentes. Pela injeco das amostras
padro, foi possvel ver que tal como o DMEM, o DHA apresenta mais do que pico de reteno
demonstrando que composto por vrias substncias, podendo tambm ser devido a sua alta
instabilidade em soluo, mas tambm como a suas propriedades ainda so poucas
conhecidas o cromatograma pode sofrer alteraes ao longo do tempo.
Tabela 6: Mdias dos tempos de reteno referentes a 3 amostras de AA, DHA e DMEM analisadas por
HPLC.
63
Amostras
Tempos de reteno
Deteco
AA
3,990,05
UV
DHA 1
2,330,02
UV
DHA 2
2,920,01
UV
DHA 3
11,640,06
UV
DMEM 1
2,520,13
UV
DMEM 2
4,340,68
UV
DMEM 3
8,110,82
UV
DMEM 4
14,691,71
UV
A determinao dos referidos tempos de reteno foi de extrema importncia para a distino
entre cada composto presente na amostra injectada. A anlise da estabildade das duas formas
da vitamina C foi feita incubando clulas de WiDr com 10 mM de AA e DHA, em que os seus
resultados foram obtidos aps 1, 24, 48, 72 e 96 horas de incubao. O pH das amostras foi
determinado para todos os tempos, assim podemos verificar se o pH do meio leva a oxidao
do AA em DHA ou a reduo deste em AA. No grfico 15 esto representados os
cromatogramas das amostras de todos os tempos de incubao com o AA. De igual modo o
DMEM foi incubado para todas as horas que foram feitas o estudo, contudo os cromatogramas
foram todos semlhantes com o passar do tempo pelo que se apresentou um deles, somente
para comparao.
Grfico 15: Cromatogramas de amostras de DMEM com 10 mM de AA. A Cromatograma

correspondente injeco do DMEM com 24 horas de incubao. B Cromatograma de DMEM e AA
para 1 hora de incubao. C - Cromatograma de DMEM e AA para 24 hora de incubao. D Cromatograma de DMEM e AA para 48 hora de incubao. E - Cromatograma de DMEM e AA para 72
hora de incubao. F - Cromatograma de DMEM e AA para 96 hora de incubao.
64
Resultados
O AA, apresenta um tempo de reteno de 3,850,03 minutos, valor determinado

anteriormente no controlo de qualidade do 99mTc-AA (grfico 1).
Como referido anteriormente o DHA apresenta 3 picos de deteno podendo estas
variar ao longo do tempo, dificultando assim a anlise grfica. Alm disso, pela anlise dos
tempos de reteno representados na tabela 6, podemos ver que o 1 pico do DHA e o 1 pico
do DMEM apresentam tempos de reteno muito prximos, como 2,330,05 e 2,520,13
minutos respectivamente, o que poder levar a sobreposio destes quando fizerem parte da
mesma amostra. No grfico 16, podemos verificar que de facto os primeiros picos de DMEM e
do DHA aparecem sobrepostos.
Pela anlise dos grficos 15 e 16, verifica-se que no h nenhum indcio da formao
do DHA a partir do AA, e nem do DHA para o AA, pois nos cromatogramas em que apresentam
a incubao com AA no h picos com tempos de reteno semelhante ao do DHA e nos em
que foram incubadas com DHA tambm no existem picos com tempo de reteno
semelhante ao AA. No que diz respeito a variao do pH do meio verificou-se que na
incubao do DMEM sem tratamento com a vitamina C, o pH diminuiu da 1 hora para 96 horas
de 7,07 para 6,63. Quando o DMEM foi incubado com o AA verificou-se tambm uma
diminuio do pH de 6,93 para 5,92, do mesmo modo quando o DMEM foi incubado com DHA,
o pH diminui de 6,85 para 6,34, ao longo do tempo. Contudo, para ambos os casos a variao
do pH no teve consequncias no processo de oxidao/reduo das duas formas da vitamina
C.
65
Grfico 16: Cromatogramas de amostras de DMEM com 10 mM de DHA. A Cromatograma

correspondente injeco do DMEM com 24 horas de incubao. B Cromatograma de DMEM e DHA
para 1 hora de incubao. C Cromatograma de DMEM e DHA para 24 hora de incubao. D
Cromatograma de DMEM e AA para 48 hora de incubao. E Cromatograma de DMEM e DHA para 72
hora de incubao. F Cromatograma de DMEM e DHA para 96 hora de incubao.
2.3.1.
Avaliao do meio extracelular
Aps a avaliao da estabilidade das duas formas da vitamaina C em culturas celulares

e por no haver transformao de uma forma noutra, os estudos de avaliao do meio
permitem determinar indirectamente os mecanismos de transporte destas. Nestes estudos,
avalia-se o meio extracelular, aps incubao com trs concentraes diferentes de AA e DHA,
para 1, 24, 48, 72 e 96 horas.
Os resultados correspondentes incubao com o AA esto representados no grfico
18 e para o DHA no grfico 19. Para termo de comparao as clulas foram incubadas com
DMEM para todos os tempos, tendo assim identificados os diferentes tempos de reteno
66
Resultados
representados no quadro 2. Para deferenciar os picos desses estudos foram identificados com
C (de controlo) e enumerados conforme o nmero de picos observados.
Quadro 2: Mdia dos tempos de reteno (com n=6) referentes amostras controlo analisadas no HPLC.
Amostras Controlo
Tempo de reteno (min)
C1
2,610,11
C2
4,040,25
C3
5,770,67
C4
12,441,49
Os controlos foram incubados durante 1 h, 24 h, 48 h, 72 h e 96 h, para servir de

referncia para a comparao com os tempos de reteno das amostras que foram tratadas
com AA e DHA. O grfico 17 A e 17 B representa dois cromatogramas de duas amostras
controlo relativa a 1 h e 96 horas, respectivamente. Como se verifica a incubao do DMEM
sem tratamento com a vitamina no apresenta variaes a nvel cromatogrfico.
Grfico 17: Cromatograma de amostras controlo. A 1 hora de incubao. B 96 horas de incubao.
67
Grfico 18: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com AA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do AA e na ausncia (C) com trs concentraes
como as reas por integrao grfica.
Grfico 19: Estudo comparativo para a valiao do meio extracelular aps incubao com DHA. A WiDr
foram tratadas durante 1, 24, 48, 72 e 96 na presena do DHA e na ausncia (C) com trs concentraes
como as reas por integrao grfica.
Atravs da integrao grfica foi possvel determinar os tempos de reteno de cada

pico bem como a rea destes. Pelo estudo da linearidade do HPLC, em que se injectaram 5
amostras de AA em concentraes diferentes verificou-se que a rea do pico proporcional
concentrao das amostras injectadas. Como pode-se ver no grfico 20, os dados da
68
Resultados
concentrao versus rea aproxima-se de uma equao linear igual a y=85,17x+ 4,7927, sendo
o valor de R2 = 0,998.
rea (mV*s)
1000,0000
800,0000
600,0000
400,0000
200,0000
0,0000
0
4
5
6
7
Concentrao (mM)
9
10
11
y = 85,17x + 4,7927
R = 0,9988
Grfico 20: curva de calibrao para determinar a linearidade da deteco UV. Foram injectadas cinco
amostras de AA com as concentraes apresentados no grfico.
Tendo em conta que a rea do pico proporcional concentrao do analit o presente

na amostra e como nos estudos de avalio do meio queremos avaliar a entrada ou no das
duas formas de vitamina C nas clulas WiDr, torna prescendvel a avaliao das reas dos picos
correspondentes ao AA e DHA ao longo do tempo. Assim os grficos 21, 22, e 23 representam
a evoluo das reas dos picos de AA e DHA para 3, 7 e 10 mM respectivamente.
comparativa entre as reas dos picos do AA e DHA ao longo do tempo.
69
Grfico
22 : Anlise do comportamento do AA e DHA no meio extracelular para concentrao de 7 mM. Aps
integrao grfica dos cromatogramas evidenciados nos grficos 17, 18 e 19, foi feita a anlise
Pelo que foi observado nos cromatogramas do grfico 19, o pico DHA1 aparece
sobreposto ao do controlo (C1). Pelo que se confirma, a partir da anlise dos grficos 21, 22 e
23, visto que para todas as concentraes a rea do pico identificado como DHA1+C1
apresenta sempre um valor mximo superior a deteco correspondentes ao controlo, o que
nos leva a crer que realmente os DHA1 e C1 aparecem sobrepostos. Alm disso verifica-se
uma ligeira diminuio nas reas doDHA2 e DHA3, para todas as concentraes ao longo do
tempo, e essa mesma diminuio verifica tambm para o pico DHA1+C1, podendo ser a
diminuio do DHA1 o responsvel. Assim podemos dizer que houve consumo celular do DHA
70
Resultados
ao longo do tempo. De notar que nesses grficos o controlo s relevante para a comparao
com a rea do A1+C1.
Por outro lado ao comparar a rea dos picos do AA, verifica-se que para todas as
concentraes a rea do pico permanece semelhante ao longo do tempo, podendo estar a
incapacidade que as clulas tumorais apresentam em transportar essa forma da vitamina C
envolvida
3. Estudos in vivo
A realizao dos estudos in vivo foi com o intuito de comprovar/esclarecer os resultados
obtidos tanto no controlo de qualidade do composto marcado como os obtidos nas estudos de
captao realizados in vitro. Nesta via procedeu-se ao desenvolvimento do modelo de
xenotransplante de clulas de adenocarcinoma de clon (WiDr) em ratinhos atmicos Balb/c
nu/nu, fez-se tambm estudos de biodistribuio e farmacocintica do 99mTc-AA, em ratinhos
normais e portadores de xenotransplantes. Alm disso, a avaliao da inibio do crescimeto
tumoral pela aco da forma reduzida da vitamina C (AA), foi realizada.
3.1.
Estudos de Biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA
Para uma melhor anlise e compreenso dos resultados obtidos a partir da biodistribuio do
radiofrmaco em ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes fundamental
conhecer a sua biodistribuio em ratinhos Balb/c nu/nu normais para poderem apreciar
eventuais diferenas nos modelos. Alm disso, estes estudos fornecem-nos a informao
acerca das vias de excreo do radiofrmaco.
De acordo com o grfico 24(A e B), obtido aps os estudos de biodistribuio com 99mTc-AA e
respectiva quantificao de dose injectada por grama de rgo, mostra, essencialmente,
excreo por via urinria (rim, urina e bexiga) e, tambm, via ciclo entero-heptico (fgado,
vescula biliar e blis).
71
Grfico 24: A - Biodistribuio do 99mTc-AA. Depois de passados os tempos, descritos nos grficos, da
administrao do radiofrmaco, os ratinhos foram sacrificados, os rgos colhidos e a percentagem de
dose injectada por grama de tecido quantificada. B - Fraco percentual do grfico A.
Para alm dos rgos onde se do a excreco no se verifica nenhuma captao

prefencial do 99mTc-AA por nenhum rgo em particular. Contudo verifica-se a % de captao
no intestino delgado vai aumentando ao longo do tempo at aos 150 minutos onde se d a
maior captao (1,37%).
3.2.
Estudos de Biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA
De notar que os resultados referentes aos estudos de biodistribuio em ratinhos

portadores de xenotransplantes foram surpreendentemente diferentes aos obtidos na
biodistribuio em ratinhos normais. Como se pode ver no grfico 25 A e B, existem rgos
que captam preferencialmente o 99mTc-AA, como o caso da tiride do estmago do msculo
e da cartilagem, em que nos normais no se verificam.
72
% Dose injectada/g
Resultados
600,0
500,0
400,0
300,0
200,0
100,0
0,0
30 minutos
60 minutos
90 minutos
120 minutos
180 minutos
240 minutos
300 minutos
360 minutos
150 minutos
Tecido
% Dose injectada/g
5,0
4,0
3,0
2,0
1,0
0,0
Tecido
99m

Tc-AA em ratinhos portadores de xenotransplantes. Depois de
passados os tempos, descritos nos grficos, da administrao do radiofrmaco, os ratinhos foram
sacrificados, os rgos colhidos e a percentagem de dose injectada por grama de tecido quantificada. B Fraco percentual do grfico A
Contudo os rgos com maior captao continuam a ser os responsveis pela excreo.
Estes resultados puseram em causa a veracidade do valor da eficincia de marcao obtida no
controlo de qualidade, pois um radiofrmaco tendo o tecncio como radionucldeo, ao ter uma
baixa eficincia de marcao, ou seja presena de
99m
TcO4- (99mTc-livre), este, numa
bioditribuio, vai preferencialmente para a tiride, plexus e estmago. Contudo essa hiptese
foi posta de lado porque com a mesma formulao farmacutica, apresentando uma elevada
eficincia de marcao obtido no HPLC, foi realizada um estudo de biodistriibuio em ratinhos
Balb/c nu/nu normais e com xenotransplantes e os resultados permaneceram iguais.
Deste modo e como os ratinhos Balb/c nu/nu normais e os atmicos podero ter
diferenas que influenciam a biodistribuio da vitamina C, procedeu-se a realizao de
73
estudos de biodistribuio do
99m
Tc-AA em ratinhos Balb/c nu/nu atmicos sem
xenotransplantes para servir de comparao.

De facto observou-se muita diferena na captao do 99mTc-AA entre esses dois grupos.
Como se pode verificar no quadro 3 nos tecidos (no sendo de excreco) como pulmo,
corao tiride, crebro , estmago, cartilagem cerebelo e intestino grosso a captao dos
ratinhos Balb/c nu/nu atmicos sempre o dobro da captao dos ratinhos Balb/c nu/nu
normais, apresentando como 4 vezes mais para a tiride. Essa razo aumenta para sete vezes
at 11 vezes mais para tecidos como os genitais, osso e msculo respectivamente.
Quadro 3: Anlise da razo entre a capatao do 99mTc-AA em ratinhos Balb/c nu/nu atmicos e normais.
Tecido
Balb/c nu/nu normais
Balb/c nu/nu
Razo
Urina
96,3281
472,0481
4,900418
Sangue
3,3046
5,4023
1,634809
Fgado
1,8336
1,4215
0,775278
Bao
0,4859
0,8312
1,71077
Pulmo
1,0057
2,6575
2,642326
Corao
0,6140
1,7214
2,803415
Int. delgado
0,7688
1,4915
1,940118
Int. grosso
0,8462
1,8590
2,196964
Tiride
0,5844
2,5816
4,417282
Crebro
0,0559
0,1396
2,496118
Cerebelo
0,0675
0,2123
3,146048
Bexiga
10,4954
33,6897
3,20995
Genitais
0,8081
5,9786
7,398365
Osso
0,6846
5,2630
7,688063
Cartilagem
0,8797
3,3600
3,819301
Estmago
1,1783
2,7918
2,369302
Msculo
0,3043
3,4582
11,36341
Rim
4,1172
12,4359
3,020515
Vescula biliar
1,6798
1,7258
1,02735
Blis
0,4019
0,4455
1,108548
74
Resultados
Desta feita procedeu-se anlise dos resultados obtidos na biodistribuio de
99m
Tc-AA em
ratinhos Balb/c nu/nu, uma vez que os dados no foram influenciados pela qualidade do nosso
composto, mas sim pelo prprio metabolismo do animal.
Para a avaliao da captao do
99m
Tc-AA pelo tecido tumoral foi calculada a %
percentagem de captao por grama de tecido tumoral, sendo que o seu valor foi sempre
inferior 1,5 % excepto aos 150 minutos tendo como a captao 5,3% por grama do tecido
tumoral, de acordo com o grfico 26.
Grfico 26: Percentagem da actividade administrada por grama de tecido tumoral.
Para alm da percentagem de actividade administrada por grama de tecido tumoral,

tambm foi determinado para cada tumor as razes entre as captaes do tumor e do osso e
entre o tumor e o sangue. Para cada tumor, aps o sacrficio dos animais, foi calculado o
volume atravs da medio dos seus eixos maior e menor.
De acordo com os resultados obtidos, para as razes entre as percentagens de
captao da actividade administrada por grama de tecido tumoral, e representados grfico 27.
Verifica-se que a razo tumor/osso sempre maior do que a razo tumor/sangue, sendo que
este ltimo apresenta valores sempre a baixo de um, o que significa que ao longo do tempo a
captao tumoral foi sempre menor que a do sangue. No que diz respeito a razo tumor/osso,
75
a captao tumoral consideravelmente superior do osso aos 90, 150 e 300 minutos, sendo
que aos 150 minutos ela de cerca de 5 vezes superior.
% da dose injectada/g
Tumor/Osso
Tumor/Sangue
6,0000
5,0000
4,0000
3,0000
2,0000
1,0000
0,0000
30
60
90
120
150
180
240
300
Tempo (min)
Grfico 27: Razo entre as captaes tumor/osso e tumor/sangue.
360
Tendo em conta os resultados das razes calculadas verifica-se que a captao do

99m
Tc-AA pelos tumores mnima, apresentando valores inferiores aos sanguneos.
3.3.
Imagiologia com 99mTc-AA
As imagens adquiridas atravs da cmara de raios gama, imediatamente aps a

injeco do
99m
Tc-AA, e visualizadas na estao de trabalho Xeleris, aps normalizao para
uma escala de cores apropriada, permitiram identificar o tumor xenotransplantado, bem como
as vias de excreo atravs de uma imagem de um ratinho Balb/c nu/nu normal, como pode
ser observado na figura 7 A e 7 B respectivamente.
76
Resultados
Figura 7: Imagens obtidas atravs da cmara de raios gama. A - Imagem esttica aos 60 minutos aps a
99m
injeco do Tc-AA, de um ratinho com xenotransplante. A seta aponta para a localizao do tumor. B
Imagem esttica aos 30 munitos aps a injeco do 99mTc-AA, de um ratinho normal, onde podem ser
vistos os dois rins. Todas as imagens esto referenciadas mesma escala de cores mostrada.
Estes estudos ao fim ao cabo veio confirmar os estudos de captao realizados in vitro
relativo s clulas WiDr, visto que a captao tumoral in vivo do tecido tumoral considerada
baixa e pela visualizao da figura 7A, o radiofrmaco no captado o suficiente para a
evidente visualizao deste.
3.4.
Avaliao do crescimento tumoral in vivo aps tratamento com
AA
Aps a avaliao da citotoxicidade da vitamina C in vitro que apresentou alguma
funo antineoplsica, diminuindo a proliferao celular, logo despertou a curiosidade para
avaliar essa citotoxicidade in vivo. Para isso, fez-se um estudo durante um perodo de vinte
dias em que se procedeu ao tratamento com AA de ratinhos Balb/c nu/nu portadores de
xenotransplantes.
Ao fim desse tempo foi possvel traar-se uma curva da taxa de crescimento tumoral
comparando o grupo controlo, em que no recebeu tratamento e o grupo que recebeu
tratamento. Os resultados esto apresentados no grfico 28.
77
Taxa de crescimento tumoral
Animais controlo
Animais terapia
20
15
10
5
0
0
5
6
7
8
Dias aps incio da terapia
10
11
12
13
Grfico 28: Resposta in vivo das WiDr ao tratamento com o AA. O resultado uma mdia de n=6 para
cada grupo.
Como se observa no grfico 28, a partir do 3 dia aps o tratamento comeou uma
atenuao no crescimento tumoral do grupo com tratamento, mas essa atenuao no
crescimento tumoral s significativa a partir do 8 dia aps o incio de tratamento.
78
Captulo IV Discusso
79
80
Discusso
No presente trabalho foi avaliado o papel da vitamina C no tratamento e preveno do

cancro atravs de estudos recorrendo a tcnicas como a medicina nuclear e biologia molecular.
Os resultados obtidos podero ter um contributo de grande importncia no desenvolvimento
de novas metodologias relacionando a vitamina C e o cancro, que ainda continua a ser algo
controverso.
O desenvolvimento do radiofrmaco, tendo a forma reduzida da vitamina C (AA) como
ligando e o tecncio-99m (99mTc) como radionucldeo, foi possvel devido a outros autores que
desenvolveram protocolos de marcao semelhantes (Stapleton et. al., 1967, Yigit, 2006).
Para a marcao radioactiva da forma reduzida da vitamina C (AA), foi necessrio ter
em conta alguns aspectos qumicos dos diferentes compostos em questo. O pertecnetato de
sdio (99mTcO4Na), eludo a partir de um gerador 99Mo/99mTc, o composto a partir do qual se
obtm tecncio no estado de oxidao +7 e, por isso, fortemente deficiente em electres. Para
o desenvolvimento de uma formulao radiofarmacutica, sendo que o
99m
Tc tem que ser
reduzido a estados de oxidao inferiores (III ou IV), da a necessidade de um agente redutor.

Deste modo, o agente redutor usado foi o cloreto de ferro (III) (FeCl3) com a funo de ceder
electres ao 99mTc e assim diminuir o seu estado de oxidao.
Assim, depois de ter em conta os aspectos qumicos, as condies fsicas do processo
de marcao foram testadas de modo a obter uma boa eficincia de marcao. Assim, como
primeiro passo procedeu-se a adio do FeCl3 ao 99mTc, nessa juno no se espera que haja
reaco entre eles pois o FeCl3 (III) no possu electres para ceder ao
99m
Tc. S
posteriormente, quando adicionado o AA, que ir ocorrer a oxidao do cloreto de ferro (III)
com a formao de cloreto de ferro (II). Por sua vez, o cloreto de ferro (II) cede electres ao
99m
Tc(VII) reduzindo-o a
99m
Tc(III) ou
99m
Tc(IV). Nestes estados de oxidao torna-se ento
possvel a formao do complexo de 99mTc-AA, que poder, ou no, incluir o cloreto de ferro na
sua constituio. Assim, necessrio ter as quantidades ptimas de todos os constituintes do
81
kit, principalmente entre o agente redutor e o ligando, tendo sido estas optimizadas e
chegando s quantidades de 0,2 ml de FeCl3 e 200 mg do AA. Para alm disso, a temperatura
em que se realiza a marcao e o tempo de incubao do kit importante ter em conta. Nesse
sentido, a primeira tentativa foi de marcao a 0C o que revelou uma baixa estabilidade da
soluo em que a maior eficincia se observou 24 horas aps a marcao, o que invivel
quando se trata de um composto de tecncio, por ter 6 horas de perodo de semidesintegrao. Por cauda desta particularidade do tecncio, espera-se que uma marcao
radiactiva com ele tenha um tempo de incubao entre 10 a 30 minutos e que a sua
estabilidade seja de pelo menos 6 horas (Liu and Edwards, 1999). Contudo, quando a marcao
passou a ser feita a temperatura ambiente o tempo de incubao diminuiu para 30 minutos, e
o kit manteve-se estvel at 24 horas aps a marcao. A relativa complexidade da reaco de
formao do complexo
99m
Tc-AA pode ser a razo pela qual se verificam diferenas na
eficincias de marcao quando h alteraes na temperatura.

Aps a marcao, a determinao da pureza radioqumica foi necessria para
confirmar se as condies so ptimas para a obteno de elevado grau de pureza do 99mTc-AA.
A tcnica cromatogrfica HPLC permitiu identificar os diferentes componentes do composto,
bem como determinar a eficincia de marcao alcanada. O protocolo desenvolvido no HPLC,
mostrou ser eficiente para a realizao da separao analtica uma vez que das anlises feitas,
a resoluo da coluna, a sua selectividade e a eficincia com que dois compostos so
separados mostraram estar dentro dos valores padro. Apesar do HPLC permitir a
determinao da eficincia de marcao pelo clculo da percentagem de radioactividade
pertencente ao 99mTc-AA em relao a actividade total detectada, no foi totalmente suficiente
para a determinao exacta dessa pureza, por no quantificar a presena do
99m
Tc-RH. Isso
deve-se ao facto do equipamento ter uma pr-coluna que tem poros com 0,1 nm de dimetro
no deixando passar partculas de tamanho superior como o caso dos constituintes de
agregados coloidais, como por exemplo o 99mTc-RH.
82
Discusso
Para alm do controlo de qualidade tambm foram realizados estudos in vitro e in vivo a fim
de estudar a estabilidade do
99m
Tc-AA nessas condies. Nos estudos in vitro, a captao
observada em clulas de adenocarcinoma colorectal (WiDr) e melanoma melanoctico (A375)

no significativa para nenhuma das linhas celulares, pois apresentam captaes de 0,45% e
0,36%, respectivamente, tendo estes a mesma ordem da captao do 99mTcO4-. Por outro lado,
quando comparamos a captao do 99mTc-AA nas WiDr verificamos que esta sempre inferior
captao do
99m
TcO4-, s no o , aos 5 e aos 120 minutos onde ligeiramente superior
(grfico 8). Em relao s clulas de melanoma melanoctico utilizadas (A375), a captao do

99m
Tc-AA apresenta valores superiores captao do 99mTcO4- em alguns tempos (45, 60 e 120
minutos) mas, no entanto, a diferena no significativa por apresentar um desvio-padro

grande, tornando assim estatisticamente no significativo (grfico 9). No entanto, ao comparar
a captao do 99mTc-AA nas WiDr esta superior das A375.
Com isso pode-se concluir que o radiofrmaco por ns desenvolvido, tem uma baixa
captao nestas linhas celulares o que poder ser justificado pela baixa afinidade que as
clulas tumorais apresentam em transportar o AA atravs da membrana para dentro da clula,
pois a expresso dos SVCT nas clulas tumorais baixa. A captao observada, uma vez que a
formulao usada para este estudo tinha elevada eficincia de marcao, poder ser devido a
dissociao do composto e s entrar dentro da clula o
semelhana entre as captaes de
99m
Tc-AA e
99m
TcO4-, justificando assim a
99m
TcO4- observadas nas duas linhas celulares.
Essa concluso foi fundamentada pelos estudos de biodistribuio realizados posteriormente.

Ainda relativamente aos estudos in vitro os estudos de avaliao da proliferao
celular revelaram que a forma reduzida da vitamina C possui um grande potencial na terapia
do cancro.
Sabe-se que a vitamina C um potente antioxidante protegendo as clulas dos efeitos dos
radicais livres, mas tambm tem um efeito pr-oxidante em concentraes farmacolgicas,
83
sendo essa a funo fundamental para o seu potencial teraputico (Verrax and Calderon,
2008).
Assim sendo, verificamos que ao expor clulas tumorais ao AA em diferentes concentraes,
variando o tempo de exposio e o tempo de repouso destas, a molcula apresenta uma
citotoxicidade j que inibe a proliferao nas duas linhas celulares a altas concentraes,
sendo estas concentraes diferentes para cada linha celular.
Em relao s clulas do clon (WiDr), existem diferenas visveis quando o tempo de
exposio e o tempo de repouso variam. Quando as clulas foram expostas durante 1 e 4
horas e estiveram a repousar durante 24 horas a diferena entre os IC50 no significativa,
sendo portanto possvel de aferir que o tempo de exposio no seria relevante. No entanto,
para os mesmos tempos de exposio, mas com 48 horas de repouso as clulas mostraram um
comportamento diferente (grfico 11). Na exposio de uma hora houve um ligeiro aumento
do IC50, podendo estar relacionada com o tempo de repouso onde as clulas podero ter
desenvolvido um mecanismo de defesa, no entanto, quando expostas as 4 horas e tendo 48 de
repouso o IC50 diminuiu de cerca de 50% do observado com 24 horas de repouso para o
mesmo tempo de exposio o que leva a crer que, tanto o tempo de exposio como o tempo
de repouso preponderante para desencadear reaces pr-oxidantes nestas linhas celulares.
Em relao s A375, estas apresentam um comportamento igual quando varia o tempo de
repouso, mas nas 4 horas de exposio verifica-se maior citotoxicidade (grfico 12).
Para alm dos estudos de proliferao celular, uma avaliao mais exaustiva foi feita para
avaliar a sobrevivncia das clulas aps 12 dias de repouso com duas horas de exposio ao AA.
Nesse estudo o objectivo no s de avaliar o poder anti-proliferativo da vitamina C, mas
tambm verificar se as clulas que foram expostas ao AA, mesmo no apresentando sinais de
leso ao fim de poucas horas, so capazes de sobreviver. O que se verificou que para
concentraes inferiores ao IC50, obtido nos estudos de proliferao, para as WiDr houve
84
Discusso
diminuio na sobrevivncia de cerca de 80% (grfico 13), enquanto que para as A375 essa
diminuio ocorre para valores prximos do IC50 observado. Neste caso, podemos reforar a
concluso anterior na citotoxicidade do AA nas A375 no depende do tempo de repouso das
clulas, mas nas WiDr o efeito pr-oxidante maior quanto maior for o tempo que clulas tm
para repousar. Contudo, o efeito pr-oxidante ocorre por dois processos, dentro da clula pela
oxidao do AA em DHA, e fora das clulas na presena de metais de transio, e pelo pH, em
que forma o radical ascorbil que ao reagir com o H2O2 e leva formao de espcies reactivas
de oxignio (ROS)(Li and Schellhorn, 2007; Zhao, et al., 2005). Para verificar qual dos mtodos
prevalece foram realizados estudos no HPLC a fim de avaliar indirectamente o mecanismo de
entrada das duas formas da vitamina C nas clulas tumorais, bem como o processo
oxidao/reduo das mesmas em cultura. Verificmos que, em meio de cultura sem
actividade metablica das clulas, o AA no oxida para o DHA e nem este reduz para o AA,
nem mesmo pela aco do pH. Assim, nas clulas tratadas com AA, detectmos a existncia de
um pico referente ao AA, mas nenhum relativo ao DHA (grfico 18). Estes resultados esto de
acordo com os estudos realizados que sugerem que o AA no capaz de atravessar a
membrana das clulas tumorais, o que justifica a sua permanncia no meio extracelular
(Verrax and Calderon, 2008). Por outro lado, nas clulas tratadas com DHA no detectmos a
presena de AA (grfico 19), o que nos leva a concluir, como seria de esperar, que no ocorre
formao de AA por reduo do DHA no meio extracelular. No entanto, apesar dos
cromatogramas apresentarem os picos de reteno do DHA, as reas destes diminuram ao
longo do tempo, sendo este o facto resultado das clulas tumorais possurem uma elevada
expresso dos GLUTs e, consequentemente, so capazes de transportar o DHA atravs da
membrana pelos GlUT1 e 3. Contudo, a presena do DHA nos cromatogramas um indicador
da saturao ao nvel dos transportadores de membrana que, na presena de elevadas
concentraes do composto, deixam de o poder transportar (Corpe, et al., 2005; Fransson and
Mani, 2007; Verrax and Calderon, 2008). Deste modo, poder hipoteticamente ser explicado o
85
efeito citotxico observado nas clulas devido a presena extracelular do AA sendo esta
responsvel pelo maior efeito pr-oxidante.
O efeito pr-oxidante do AA foi tambm verificado in vivo avaliando a taxa do
crescimento tumoral em ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes confirmando o
efeito pr-oxidante do AA em concentraes farmacolgicas. Ao fim do 3 dia do incio de
tratamento observou-se uma diminuio no crescimento tumoral sendo esse crescimento
considervel quando comparado com o crescimento tumoral do grupo controlo, o que nos leva
a inferir que a vitamina C poder ter um papel importante no tratamento do determinados
tipos de cancro (grfico28).
Observamos a partir dos estudos de biodistribuio que o tecido tumoral no
apresentou uma captao de forma a ser evidenciado numa imagem de diagnstico. Essa
captao observada in vivo considerada de m qualidade pois apresenta valores muito
inferiores aos apresentadas pelo sangue (grfico 27). Contudo, os estudos de biodistribuio
permitiram identificar as vias de excreo e metabolizao do radiofrmaco, sendo a excreo
feita essencialmente pela via renal e hepatobiliar (grfico 24 A e figura 7B). Aps anlise dos
resultados obtidos e verificando-se diferenas na biodistribuio em ratinhos Balb/c nu/nu
normais e atmicos possvel concluir que a presena ou no do timo no nosso modelo animal
influencia na captao do AA marcado com 99mTc.
Sendo assim, certo dizer que a marcao do AA com o 99mTc, pode no ser til como
traador para imagem uma vez que no captada pelas clulas tumorais in vitro nem in vivo,
sendo por isso considerado um fraco agente imagiolgico para diagnstico. Essa considerao
pode ser resultado do desconhecimento da esterioqumica molecular do 99mTc-AA, pois no se
sabe a que carbono do AA que o 99mTc se liga, sendo essa caracterstica muito importante, na
medida em que os carbonos 2 e 3 so os responsveis em doar os electres que esto
envolvidos na funo redutora do AA, bem como na oxidao do AA em DHA (Deutsch, 1998).
86
Discusso
Se por acaso o
99m
Tc estiver ligado a um destes carbonos, o
99m
Tc-AA no apresentar as
mesmas funes do AA. O ideal seria uma ligao ao carbono 6 da molcula do AA.
87
Concluso
A partir da anlise dos resultados obtidos neste trabalho possvel retirar as seguintes
concluses:
No que diz respeito marcao radioactiva do cido ascrbico (AA) com o tecncio99m, podemos dizer que o protocolo desenvolvido, se mostrou eficiente tendo em conta os
elevados valores de eficincia de marcao obtidos assim como a alta estabilidade da
formulao farmacutica. Tambm o protocolo de controlo de qualidade no HPLC foi eficiente
na medida em que a separao dos compostos constituintes do radiofrmaco foi feita em
condies de alta resoluo e sensibilidade do equipamento. Contudo, uma outra tcnica
complementar ao HPLC deve ser desenvolvido para a deteco do 99mTc-RH.
Aps a marcao, os estudos in vitro revelaram que o composto desenvolvido (99mTcAA) apresenta fraca captao em clulas tumorais, comprovando assim, o pressuposto de que
as clulas tumorais, por terem uma baixa expresso dos SVCT, no transportam o AA atravs
da membrana e consequentemente no transportam o 99mTc-AA.
Foi comprovado que a reaco de oxidao/reduo do AA em DHA e do DHA em AA,
no se verifica in vitro, nem mesmo pela aco das alteraes do pH.
Comprovou-se tambm que o AA no atravessa a membrana das clulas tumorais ao
contrrio do DHA, isto deve-se ao facto da sobrexpresso dos GLUTs nestas clulas e ao
transporte ser feito por difuso facilitada estando sujeito saturao dos transportadores com
o aumento da concentrao do DHA extracelular.
Concentraes fisiolgicas (0,5 mM) do AA tem efeito proliferativo nas clulas
tumorais e concentraes farmacolgicas apresentam uma aco anti-proliferativa pelo
aumento da produo de ROS extracelular, visto que o AA no entra na clula.
88
Discusso
A avaliao do efeito pr-oxidante do AA nas clulas de adenocarcinoma colorectal

(WiDr) e melanoma (A375) revelou que nas A375 o efeito citotxico proporcional ao tempo
de exposio enquanto que nas WiDr, o efeito citotxico proporcional ao tempo de repouso
aps a exposio, facto que pode ser importante no tratamento de cancro. No entanto, so
necessrios estudos em clulas normais a fim de avaliar se a citotoxicidade ou no selectiva,
pois os estudos apontam para que que altas concentraes do AA no so citotxicas para
clulas normais ao contrrio do que acontece para as clulas tumorais (Chen, et al., 2007b).
Nos estudos de biodistribuio do complexo 99mTc-AA, este apresentou excreo pelas
vias renal e hepatobiliar.
O potencial imagiolgico apresentado pelo composto considerado fraco, pois a
captao do tecido tumoral baixa. Contudo, sendo os ratinhos Bab/c nu/nu uma espcie
capaz de produzir a vitamina C endogenamente talvez no seja o modelo animal adequado
para o estudo da farmacocintica desta molcula.
Desta forma o complexo
99m
Tc-AA aparece como um radiofrmaco de elevada
eficincia de marcao mas, no entanto, no apresenta aplicaes clnicas favorveis, j que a

ligao entre o
99m
Tc e a molcula de AA ser desconhecida quimicamente. Desta forma,
necessria a realizao de estudos complementares para perceber o funcionamento in vitro e

in vivo do 99mTc-AA.
Alm das concluses in vitro sobre o efeito pr-oxidante do AA, com a realizao dos
estudos da avaliao do crescimento tumoral podemos concluir que o AA reduz o crescimento
tumoral levando a uma diminuio do volume tumoral, podendo ser este resultado de elevada
importncia.
89
Prespectivas futuras
Os resultados obtidos neste trabalho despertou a curiosidade em descobrir mais
potencialidades da vitamina C no tratamento de cancro, que de certa forma as tcnicas
existentes actualmente so deficientes. Assim, j que a marcao radioactiva do AA com 99mTc
apresenta deficincias em termos de aplicao, poder ser desenvolvido um protocolo de
marcao com istopos naturais pertencentes aos tomos que fazem parte da molcula do AA,
(por exempolo carbono-11) de modo a no haver modificao nos grupos funcionais da
molcula que podero interferir na farmacocintica desta.
No seguimento deste trabalho podero ser realizados estudos de captao do 99mTc-AA
em clulas normais a fim de verificar se a captao neste caso seria superior nestas estas
clulas pelo facto de possurem SCVTs o que no se verifica nas tumorais. Assim, poder ser
feita a anlise por HPLC dos mecanismos de entrada das duas formas da vitamina C, em clulas
normais. Para alm de todos este experimentos, estudos de proliferao em clulas normais
seria importante tambm a fim de comprovar a citotoxicidade selectiva do AA nas clulas
tumorais.
Por fim, a procura de novas metodologias teraputicas para o tratamento do cancro
tem levado muitos autores a publicarem estudos em que combinam frmacos antineoplsicos
com doses farmacolgicas do AA. Assim e com o objectivo de aprofundar ainda mais as
potencialidades podem ser realizados estudos nesse sentido do efeito do AA (Heaney, et al.,
2008; Kuroiwa, et al., 2008).
90
Discusso
91
Bibliografia
Albanes, D., (2009). 'Vitamin Supplements and Cancer Prevention: Where Do Randomized
Controlled Trials Stand?'. Journal of the National Cancer Institute, 101 (1):2-3.
Chen, Q., Espey, M.G., Sun, A.Y., Lee, J.H., Krishna, M.C., Shacter, E., Choyke, P.L., Pooput, C.,
Kirk, K.L., Buettner, G.R. and Levine, M., (2007a). 'Ascorbate in pharmacologic concentrations
selectively generates ascorbate radical and hydrogen peroxide in extracellular fluid in vivo'.
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 104
(21):8749-8754.
Chen, Q., Espey, M.G., Sun, A.Y., Pooput, C., Kirk, K.L., Krishna, M.C., Khosh, D.B., Drisko, J. and
Levine, M., (2009). 'Pharmacologic Doses of Ascorbate Act as a Prooxidant and Decrease
Growth of Aggressive Tumor Xenografts in Mice Editorial Comment'. Journal of Urology, 181
(5):2384-2385.
Chen, Q., Lee, J.H., Zhang, L.Q., Sun, A., Krishna, M.C., Espey, M.G., Pooput, C., Kirk, K., Choyke,
P., Buettner, G.R., Shacter, E. and Levine, M., (2007b). 'Pharmacologic ascorbate
concentrations selectively kill cancer cells: Ascorbic acid as a prodrug for ascorbate radical or
H2O2 delivery to tissues'. Journal of Nutrition, 137 (1):293s-293s.
Clark, B.J. and Mama, J.E., (1989). 'Resolution of chiral compounds by HPLC using mobile phase
additives and a porous graphitic carbon stationary phase'. J Pharm Biomed Anal, 7 (12):18831888.
Corpe, C.P., Lee, J.H., Kwon, O., Eck, P., Narayanan, J., Kirk, K.L. and Levine, M., (2005). '6Bromo-6-deoxy-L-ascorbic acid: an ascorbate analog specific for Na+-dependent vitamin C
transporter but not glucose transporter pathways'. J Biol Chem, 280 (7):5211-5220.
Deutsch, J.C., (1998). 'Ascorbic acid oxidation by hydrogen peroxide'. Anal Biochem, 255 (1):17.
92
Engel, R.H. and Evens, A.M., (2006). 'Oxidative stress and apoptosis: a new treatment
paradigm in cancer'. Front Biosci, 11:300-312.
Fransson, L.A. and Mani, K., (2007). 'Novel aspects of vitamin C: how important is glypican-1
recycling?'. Trends Mol Med, 13 (4):143-149.
Fruehauf, J.P. and Meyskens, F.L., (2007). 'Reactive oxygen species: A breath of life or death?'.
Clinical Cancer Research, 13 (3):789-794.
Heaney, M.L., Gardner, J.R., Karasavvas, N., Golde, D.W., Scheinberg, D.A., Smith, E.A. and
O'Connor, O.A., (2008). 'Vitamin C antagonizes the cytotoxic effects of antineoplastic drugs'.
Cancer Research, 68 (19):8031-8038.
Hoffer, L.J., Levine, M., Assouline, S., Melnychuk, D., Padayatty, S.J., Rosadiuk, K., Rousseau, C.,
Robitaille, L. and Miller, W.H., (2008). 'Phase I clinical trial of i.v. ascorbic acid in advanced
malignancy'. Annals of Oncology, 19 (11):1969-1974.
Kazakevich, Yuri, and Rosrio Lobruto, HPLC for pharmaceutical Scientists [livro], USA, Wiley,
2007.
Kuroiwa, Y., Yamada, M., Matsui, K., Okamura, T., Ishii, Y., Masumura, K., Tasaki, M., Umemura,
T., Mitsumori, K., Nohmi, T., Hirose, M. and Nishikawa, A., (2008). 'Combined ascorbic acid and
sodium nitrite treatment induces oxidative DNA damage-associated mutagenicity In vitro, but
lacks initiation activity in rat forestomach epithelium'. Toxicological Sciences, 104 (2):274-282.
Levine, M., Espey, M.G. and Chen, Q., (2009). 'Losing and finding a way at C: New promise for
pharmacologic ascorbate in cancer treatment'. Free Radical Biology and Medicine, 47 (1):27-29.
Levine, M., Rumsey, S.C., Daruwala, R., Park, J.B. and Wang, Y., (1999). 'Criteria and
recommendations for vitamin C intake'. JAMA, 281 (15):1415-1423.
Li, X. and Franke, A.A., (2009). 'Fast HPLC-ECD analysis of ascorbic acid, dehydroascorbic acid
and uric acid'. J Chromatogr B Analyt Technol Biomed Life Sci, 877 (10):853-856.
Li, Y. and Schellhorn, H.E., (2007). 'New developments and novel therapeutic perspectives for
vitamin C'. J Nutr, 137 (10):2171-2184.
93
Liu, S. and Edwards, D.S., (1999). '99mTc-Labeled Small Peptides as Diagnostic

Radiopharmaceuticals'. Chem Rev, 99 (9):2235-2268.
Lutsenko, E.A., Carcamo, J.M. and Golde, D.W., (2002). 'Vitamin C prevents DNA mutation
induced by oxidative stress'. J Biol Chem, 277 (19):16895-16899.
Meyer, R. Veronika, Pratical High-Performance Liquid Chromatography [livro], Switzerland,
Wiley, 4 Edition,2004.
Montel-Hagen, A., Kinet, S., Manel, N., Mongellaz, C., Prohaska, R., Battini, J.L., Delaunay, J.,
Sitbon, M. and Taylor, N., (2008). 'Erythrocyte Glut1 triggers dehydroascorbic acid uptake in
mammals unable to synthesize vitamin C'. Cell, 132 (6):1039-1048.
Orrenius, S., Gogvadze, V. and Zhivotovsky, B., (2007). 'Mitochondrial oxidative stress:
implications for cell death'. Annu Rev Pharmacol Toxicol, 47:143-183.
Padayatty, S.J., Katz, A., Wang, Y., Eck, P., Kwon, O., Lee, J.H., Chen, S., Corpe, C., Dutta, A.,
Dutta, S.K. and Levine, M., (2003). 'Vitamin C as an antioxidant: evaluation of its role in disease
prevention'. J Am Coll Nutr, 22 (1):18-35.
Padayatty, S.J., Riordan, H.D., Hewitt, S.M., Katz, A., Hoffer, L.J. and Levine, M., (2006).
'Intravenously administered vitamin C as cancer therapy: three cases'. Canadian Medical
Association Journal, 174 (7):937-942.
Perkins, A. and Frier, M., Nuclear Medicine in pharmaceutical research [Livro], UK, Taylor &
Francis, 2002.
Rivas, C.I., Zuniga, F.A., Salas-Burgos, A., Mardones, L., Ormazabal, V. and Vera, J.C., (2008).
'Vitamin C transporters'. Journal of Physiology and Biochemistry, 64 (4):357-375.
Rozanova, N., Zhang, J.Z. and Heck, D.E., (2007). 'Catalytic therapy of cancer with porphyrins
and ascorbate'. Cancer Letters, 252 (2):216-224.
Schumacker, P.T., (2006). 'Reactive oxygen species in cancer cells: live by the sword, die by the
sword'. Cancer Cell, 10 (3):175-176.
Snyder, R. Lioyd, Practical HPLC Method development, USA, Wiley, 2002.
94
Stapleton, J.E., Odell, R.W. and McKamey, M.R., (1967). 'Technetium-iron-ascorbic acid
complex. A good brain scanning agent'. Am J Roentgenol Radium Ther Nucl Med, 101 (1):152156.
Valko, M., Leibfritz, D., Moncol, J., Cronin, M.T., Mazur, M. and Telser, J., (2007). 'Free radicals
and antioxidants in normal physiological functions and human disease'. Int J Biochem Cell Biol,
39 (1):44-84.
Valko, M., Rhodes, C.J., Moncol, J., Izakovic, M. and Mazur, M., (2006). 'Free radicals, metals
and antioxidants in oxidative stress-induced cancer'. Chem Biol Interact, 160 (1):1-40.
Verrax, J. and Calderon, P.B., (2008). 'The controversial place of vitamin C in cancer treatment'.
Biochemical Pharmacology, 76 (12):1644-1652.
Wilson, J.X., (2002). 'The physiological role of dehydroascorbic acid'. FEBS Lett, 527 (1-3):5-9.
Wilson, J.X., (2005). 'Regulation of vitamin C transport'. Annu Rev Nutr, 25:105-125.
Zhao, H., Joseph, J., Fales, H.M., Sokoloski, E.A., Levine, R.L., Vasquez-Vivar, J. and
Kalyanaraman, B., (2005). 'Detection and characterization of the product of hydroethidine and
intracellular superoxide by HPLC and limitations of fluorescence'. Proc Natl Acad Sci U S A, 102
(16):5727-5732.
Zolle, Ilse, Technetium-99mPharmaceuticals preparation and quality control in nuclear
medicine, Austria, Springer, 2007.
95

Vitamina C, Cancro e Citotoxicidade - Marcação e Estabilidade in Vitro e in Vivo

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Vitamina C, Cancro e Citotoxicidade - Marcação e Estabilidade in Vitro e in Vivo

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Marcao e estabilidade in vitro e in vivo

Marcao e estabilidade in vitro e in vivo

Professora Doutora Maria Filomena Botelho, Directora do Instituto de

restantes elementos do servio da biofsica que de alguma forma tero contribudo

Primeiramente, efectuou-se a marcao da forma reduzida da vitamina C com

estudos de captao com

Tc-AA, e estudos de avaliao da citotoxicidade da

vitamina C. Estes estudos incluram os estudos de avaliao da proliferao por

Tc-AA. A avaliao do crescimento tumoral em

ratinhos Balb/c nu/nu portadores de xenotransplantes pelo efeito do AA foi tambm

Tc-AA, foi desenvolvida tendo uma

elevada eficincia de marcao, confirmada por HPLC. Os estudos in vitro realizados

LEHR Low Energy High Resolution

Resumo ..................................................................................................................... iii

Lista de abreviaturas .................................................................................................. v

ndice Geral .............................................................................................................. vii

ndice de Figuras ........................................................................................................ x

ndice de Tabelas ....................................................................................................... xi

ndice de Grficos ...................................................................................................... xi

ndice de Quadro ......................................................................................................xiv

ndice de Equaes ...................................................................................................xiv

Captulo I - Introduo ........................................................................................ 1

Difuso Facilitada (GLUTs) ........................................................................................ 9

Transporte Activo (SVCTs)....................................................................................... 10

Vitamina C e Cancro .................................................................................................... 14

Potencial Teraputico/Citotoxicidade ............................................................... 16

Medicina Nuclear ............................................................................................. 17

HPLC (High Performance Liquid Chromatography) .................................................. 21

Captulo II - Materiais e Mtodos ..................................................................... 27

Estudos de Qumica .......................................................................................... 29

Marcao do AA com tecncio-99m (99mTc).................................................................. 29

Estudos in Vitro ................................................................................................ 33

Culturas celulares ........................................................................................................ 33

Estudos de captao .................................................................................................... 34

Determinao da viabilidade cellular ........................................................................... 35

Estudos de citotoxicidade ............................................................................................ 36

Avalio da proliferao celular por colorimetria .................................................... 36

Avaliao da sobrevivncia celular atravs do ensaio clonognico .......................... 37

Estudos de Estabilidade da vitamina C ......................................................................... 38

Avaliao do meio extracelular ............................................................................... 39

Estudos in Vivo ................................................................................................. 40

Estudos de biodistribuio em ratinhos com xenotransplantes com 99mTc-AA............... 42

Imagiologia com 99mTc-AA ............................................................................................ 43

Avaliao do crescimento tumoral in vivo aps tratamento com AA ............................. 44

Anlise estatsca ............................................................................................... 44

Captulo III- Resultados ..................................................................................... 47

Estudos de qumica .......................................................................................... 49

Preparao e controlo de qualidade do 99mTc-AA ......................................................... 49

Estudos de captao .................................................................................................... 56

Estudos de citotoxicidade ............................................................................................ 58

Avaliao da proliferao celular por colorimetria .................................................. 58

Avaliao da sobrevivncia celular por ensaios clongnicos .................................. 61

Estudos de estabilidade da vitamina C ......................................................................... 62

Avaliao do meio extracelular ............................................................................... 66

Estudos in vivo ................................................................................................. 71

Estudos de Biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA .................................... 71

Estudos de Biodistribuio em ratinhos normais com 99mTc-AA .................................... 72

Imagiologia com 99mTc-AA ............................................................................................ 76

Avaliao do crescimento tumoral in vivo aps tratamento com AA............................. 77

Captulo IV Discusso ..................................................................................... 79

Grfico 5: Coromatogramas do controlo de qualidade do Kit, resultante de uma formulao

Tc-livre nas WiDr. As clulas foram incubadas com a mesma

Tc-livre e a captao foi determinada pelos estudos de influxo. Os