PRACTICA N 3

SEPARACIN DE PROTENAS DE LA LECHE DE VACA

Objetivo.
El objetivo de esta prctica es la separacin de las principales protenas de la
leche de vaca, empleando para ello tcnicas basadas en el punto isoelctrico,
precipitacin por salado y desnaturalizacin por calor.
Introduccin.
El conocimiento actual del comportamiento de las protenas como solutos en los
sistemas acuosos, se basa en estudios fsico-qumicos. Las protenas son
macromolculas de peso molecular bien definido que forman verdaderas
disoluciones moleculares y son electrlitos cuyo comportamiento se rige por los
mismos principios fsicos que los electrlitos pequeos.
Tras el parto, todas las hembras de cualquier especie de mamferos segregan
leche destinada a nutrir a su prole. El 5% del nitrgeno total de la leche est
representado por substancias nitrogenadas no protecas y el 95% por protenas.
El contenido proteco de la leche est constituido por un 78% de casena; 22% de
albminas y 3.3% de globulinas, 4.0% de proteasas y peptonas del total de
protenas. Las protenas de la leche se encuentran distribuidas en micelas de
unas 10mu de dimetro. Forman un sistema coloidal de gran estabilidad, sensible
solo a la disminucin notable del pH y a determinadas enzimas que las precipitan
y coagulan.
El pH del sistema tiene gran influencia sobre la solubilidad de las protenas
globulares, debido a que la superficie de las protenas posee una carga elctrica
que depende del pH. Aquel pH al cual, una protena muestra un mnimo de
solubilidad, es su pH isoelctrico, definido como aquel valor de pH al cual la
molcula no posee carga elctrica neta y es incapaz de desplazarse en un campo
elctrico. En estas condiciones no existe repulsin electrosttica entre molculas
vecinas y tienden a coalecer y precipitar, sin embargo, cuando los valores de pH
estn por encima o por debajo del punto isoelctrico, todas las molculas de
protena poseen una carga elctrica neta del mismo signo, de esa manera se
repelen mutuamente y no precipitan.
Puesto que una protena determinada posee un valor de pH isoelctrico
caracterstico y propio de ella, y debido a que las protenas difieren en el
contenido de amino cidos con grupos R ionizables, con frecuencia, pueden
separarse unas de otras mediante la precipitacin isoelctrica: al ajustar el pH de
una mezcla de protenas al pH isoelctrico del componente que nos interesa,
ste, precipitar quedando en la disolucin las protenas cuyos valores de pH
isoelctrico se hallen por encima o por debajo de aquel. La protena isoelctrica
precipitada permanece en su conformacin nativa y puede redisolverse en un
medio de pH apropiado y concentracin salina adecuada aunque hay tambin

protenas que son virtualmente insolubles en sus pH isoelctricos.

La solubilidad de los solutos ionizables como las protenas, se modifica
intensamente por la presencia de otros iones. Cada protena (o electrlito) en
solucin se encuentra rodeado de una "atmsfera inica" de iones de carga
opuesta y esta atmsfera inica puede modificar grandemente la solubilidad de
otra sustancia inica dada. Los efectos de las sales neutras sobre la solubilidad
de las protenas depende de la fuerza inica de la solucin.
En general, la solubilidad de un electrlito o una protena aumenta por la
presencia de fuerzas inicas relativamente bajas de sales neutras, en tanto que,
las sales neutras con fuerzas inicas muy altas, disminuyen la solubilidad de una
sal o de una protena. El efecto facilitador de las sales neutras sobre la solubilidad
se llama: "solubilizacin salina" o "salting in", en tanto que la disminucin de la
solubilidad en caso de fuerzas inicas elevadas constituye la "precipitacin salina"
o "salting out". Al aumentar la concentracin de la sal, sta desplaza al agua, que
se transforma en agua de hidratacin alrededor de los iones cargados de la sal.
Esto provoca la formacin de agregados protenicos que precipitan.
Las protenas globulares nativas experimentan desnaturalizacin y producen
conformaciones desplegadas y al azar de sus cadenas polipeptdicas, cuando se
someten a calefaccin. Dentro de una fluctuacin limitada entre los 0 y los 40C
aproximadamente, la solubilidad de las protenas globulares aumenta al aumentar
la temperatura. Por encima de los 40 y 50C, la mayor parte de las protenas
aumentan en inestabilidad y comienzan a desnaturalizarse, generalmente con
prdida de solubilidad en la zona neutra del pH.
Material
- 500 ml de leche de
descremada (PIL)
- Papel celofan

Reactivos
- Acido clorhdrico al 2%
- Eter sulfrico
- Alcohol etlico al 95%
- Nitrato de plata al 1%
- Sulfato de amonio cristalizado
- Buffer PBS pH 7.4
- Cloruro de bario al 10%
- Acetona p.a.

Procedimiento.
1 Sesin: Obtencin de la casena
- Diluir 50 ml de leche de vaca descremada con 150 ml de agua de la pila.
-Aadir lentamente, gota a gota y agitando constantemente entre 2 y 4 ml de
cido clorhdrico al 2%, hasta que el pH est en 4.8 (midiendo con pH metro). Si
se observa con cuidado se nota el punto en el cual empieza a precipitar la
casena. Obtener el mximo precipitado posible.
- Agitar vigorosamente durante 10 minutos. Centrifugar durante 7 a 10 minutos a
3500 rpm.
- Decantar y guardar el sobrenadante bien identificado y tapado en fro para la
"Segunda Sesin" de la prctica.
- Resuspender los precipitados de todos los tubos de la centrfuga utilizando agua
destilada y filtrar a travs de 2 capas de papel filtro.
-Despus de 2 lavados con agua destilada, obtener 1 ml del lquido filtrado y

colocar en un tubo de ensayo para la prueba de cloruros:

Prueba de Cloruros:
- Colocar 1 ml del filtrado mas 1 ml de nitrato de plata al 1%. Agitar, si se observa
un precipitado o una turbidez blanca, la prueba es (+). Si no se observa ningn
cambio, la prueba es (-).
- Se sigue con los lavados con agua destilada, hasta reaccin negativa a los
cloruros. No debe cambiarse el papel filtro, slo remover cuidadosamente el
precipitado con una varilla, teniendo la precaucin de no romper el papel.
- Una vez eliminados los cloruros del residuo, en el mismo papel: Lavar una vez
con 20 ml de etanol 95%
- Lavar una vez con 20 ml de acetona p.a.
- Lavar una vez con 20 ml de ter etlico, teniendo cuidado.
- Pasar el residuo del papel filtro a un vaso de precipitados de peso conocido
utilizando una varilla y
una mnima cantidad de alcohol, y secar a 40 C en
una estufa.
- El producto (polvo blanco) pesar en una balanza y anotar el dato para sacar el
rendimiento.
- Enseguida preparar una solucin al 1% en acetato de sodio 0,1 M, guardar en
un frasquito rotulado y en fro para la prctica N 5.
2 Sesin: Obtencin de la b-lactoglobulina y alfa-lactoalbmina, proteasas y
peptonas.
NOTA. Todos los subgrupos deben reunir los sobrenadantes obtenidos.
a) Beta Lacto Globulina.
El sobrenadante obtenido en la precipitacin isoelctrica de la casena sirve de
base para esta prctica. Calcular la cantidad de sulfato de amonio necesario para
precipitar las globulinas. Teniendo en cuenta que la B-lactoglobulina precipita a
45% de saturacin. Realizar el siguiente clculo:
533 (S2-S1)
G = ------------ ,
100 - 0,3 S2

donde:

S2 = Saturacin final
S1 = Saturacin inicial
G = g de sulfato de amonio para 1 litro de

solucin.
- Medir 10 ml del sobrenadante obtenido del precipitado de las casenas y
agitando constantemente aadir la cantidad necesaria de sulfato de amonio.
Dejar reposar unos 30 minutos, centrifugar (15 minutos a 3500 rpm), el
sobrenadante guardar utilizar para la obtencin de alfa lactoglobulinas.
- Resuspender el precipitado en buffer PBS pH 7,4 con no ms de 2 ml, dializar
contra el mismo buffer cambiando el lquido de dilisis 2 veces al da, hasta
reaccin negativa para sulfatos:
Prueba de sulfatos:
1 ml del lquido de dilisis mas 1 gota de cido clorhdrico 2% mas 1 gota de

cloruro de bario al 10%. Si se observa turbidez blanca, la prueba es (+); si no se

observa ningn cambio, la prueba es (-).
- Una vez eliminados los sulfatos, vaciar de la bolsita de dilisis la protena
precipitada a un tubo etiquetado con los datos necesarios y guardar en fro para
la prctica N4
b) Alfa Lacto Albminas.
El sobrenadante obtenido en la precipitacin salina de la beta lacto globulina,
sirve de base para esta prctica. Calcular la cantidad de sulfato de amonio
necesario para precipitar las albminas, teniendo en cuenta que la alfalactoalbmina precipita a 60% de saturacin. Realizar el siguiente clculo:
533 (S2-S1)
G = ------------ ,
100 - 0,3 S2

donde:

S2 = Saturacin final
S1 = Saturacin inicial
G = g de sulfato de amonio para 1 litro de

solucin.
- Medir el sobrenadante obtenido del precipitado de la beta lacto globulina, y
agitando constantemente aadir la cantidad necesaria de sulfato de amonio.
Dejar reposar unos 30 minutos, centrifugar (15 minutos a 3500 rpm), el
sobrenadante guardar para su utilizacin en la obtencin de proteasas y
peptonas.
- Resuspender el precipitado en buffer PBS pH 7,4 con no ms de 2 ml, dializar
contra el mismo buffer cambiando el
lquido de dilisis 2 veces al da, hasta
reaccin negativa para sulfatos.
c) Proteasas y Peptonas.
El sobrenadante del paso b), colocar en tubos de ensayo y calentarlos en bao
Mara a ebullicin. Observar lo que ocurre. El precipitado contiene proteasa y
peptonas.
Resultados.
Hallar el rendimiento de la purificacin de la casena en base a la siguiente
frmula:
gramos de casena obtenida x 100
%R = -----------------------------------------ml de leche
- Anotar las caractersticas organolpticas de la b-lactoalbmina y blactoglobulinas, as como la cantidad aproximada que se ha obtenido.
- Comparar con la bibliografa.
Temas de estudio