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TITULO
AISLAMIENTO E IDENTIFICACIN DE MICROORGANISMOS
DE LA MATRIZ AMBIENTAL: AGUA
ASESORA
Dra. ROSA RICO MATA
DATOS DE IDENTIFICACIN DE LOS ANALISTAS
Fecha de inicio del anlisis: 30 de junio de 2015
Fecha de trmino: 09 de julio de 2015
Nombre
Ilse Vernica vila Araujo
Cargo
Responsable
Administrador
Laboratorista 1
Laboratorista 2
GENERACIN: 2014-2016
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SITIO DE
MUESTREO
Hora: 3:21 pm
Fecha: 02/07/15
Hora: 3:21 pm
2.Parmetros Fisicoqumicos
Color: Caf
Olor: Desagradable
pH:7.6
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
Es necesario identificar la morfologa de la bacteria para conocer sus caractersticas fsicas, lo cual, permite
la descripcin presuntiva de su taxonoma. Por otro lado el metabolismo de las bacterias es importante porque
a travs de ella se especifican las condiciones ptimas en las que se desarrolla, permitindonos conocer bacterias
benficas para el ambiente que ayudan a remover los contaminantes existentes en las matrices de agua, suelo
y aire. Todo esto se logra siguiendo una serie de pruebas bioqumicas en las que se detectan caractersticas del
metabolismo como la presencia de enzimas especficas para sustratos especficos, generacin de compuestos
finales a travs de reacciones qumicas que se llevan a cabo en las reacciones catablicas, tambin se observa la
produccin de diferentes tipos de gases como el cido sulfhdrico (H2S), dixido de carbono (CO2) y oxgeno (O2),
as como la generacin de cambios de color en los medios de cultivo los cuales indican acidez o alcalinidad
debidas a los compuestos que se generan de la degradacin de sustratos orgnicos por las bacterias. Es as como
se logra identificar el tipo de familia a la que pertenece.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Composicin)
1. (Medio 1) Agar Mac Conkey
Frmula (en gramos por litro)
Peptona
Pluripeptona
Lactosa
Mezcla de sales biliares
Cloruro de sodio
Agar
Rojo neutro
Cristal violeta
2.
17.0
3.0
10.0
1.5
5.0
13.5
0.03
0.001
10.0
5.0
5.0
2.0
13.5
0.4
0.065
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5.0
5.0
10.0
8.5
8.5
8.5
1.0
13.5
0.00033
0.025
7.5
7.5
6.8
5
5
3.5
3
2.5
0.8
0.08
13.5
Descripcin
Colonias de forma Puntiforme, Incoloras, algunas
Colonias color rosadas o rojas sobre un fondo rojizo,
de
centro
negro que se presentan solas o en cadena.
algunas colonias son transparentes, de forma puntiforme
y con margen entero.
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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)
Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar
Materiales
Equipo
Medios de cultivo
2 caja Petri
1 balanza analtica
1 mechero Fisher
1 incubadora
1 refrigerador
1 campana de flujo laminar
1 probeta de 100 mL
1 autoclave
1 asa de nicromo
1 piseta
1 gradilla
2 hisopos
1 esptula
Siembra
Tomar en un frasco muestreador con ayuda de una cuerda, una muestra aproximada de 5 mL de agua de la
planta de agua residual para el anlisis.
Sacar una placa con el medio de cultivo ya solidificado del refrigerador.
Dentro de la campana de flujo laminar en condiciones de esterilidad, tomar 1 mL de muestra de agua
residual con una jeringa.
Verterla cuidadosamente en el centro de la placa.
Homogenizar la muestra haciendo 5 movimientos de la placa a la izquierda y a la derecha de arriba abajo.
Finalmente meter a incubar la placa por 24 h a 35 C.
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Seleccin de la colonia
Segn la morfologa de la colonia que se espera encontrar, seleccionar de la placa sembrada una colonia
aislada que cumpla con las caractersticas de dicha morfologa.
Posteriormente con un marcador indeleble, localizar las colonias seleccionadas y marcarlas dentro de un
crculo.
Resiembra
Tomar del refrigerador una placa con el medio de cultivo Agar Mac Conkey preparado y solidificado para
resembrar la bacteria deseada.
Encender un mechero Fisher, y detrs de la flama abrir la placa 2 que contenga el medio de cultivo de
resiembra.
De la placa 1 sembrada anteriormente, tomar con un asa de nicromo pasada previamente por la flama del
mechero, la colonia antes identificada.
Resembrar en la placa 2 en forma estriada como se muestra en la imagen 1
Por ultimo cerrar la caja y meterla a la incubadora por 24 h a una temperatura aprox. de 35C
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Bacteria a
identificar
Caractersticas
Morfologa
Bacilos
Cocos
Gram
Negativa
Positiva
Cpsula
Positiva
Negativa
Movilidad
Positiva
Negativa
F. de Lactosa
Positiva
Negativa
Sacarosa
Positiva
Negativa
H2
Positiva
Negativa
Degradacin de Citrato
Positiva
Negativa
H2S
Positiva
Negativa
Indol
Positiva
Negativa
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cido mixto
Negativa
Positiva
Catalasa
Positiva
Negativa
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Descripcin
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1. Tincin de
Gram
Medio de cultivo
utilizado
Resultado obtenido
(positivo/negativo)
N/A
Negativa
Evidencia fotogrfica
Fundamento de la prueba
El fundamento de la tcnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram
positivas y Gram negativas. La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa capa de pptido
glucano, adems de dos clases de cidos lipoteicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a
la membrana plasmtica, se encuentra el cido lipoteicoico, y ms en la superficie, el cido lipoteicoico que est
anclado solamente en el pptido glucano (tambin conocido como murena). Por el contrario, la capa de pptido
glucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior
(descomposicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de pptido glicano unida
a una membrana exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido
y polisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien diferencialmente debido a estas diferencias constitutivas de
su pared. La clave es el pptido glucano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana,
y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.
2. Tincin de
capsula
N/A
Positivo
Fundamento de la prueba
Tambin conocida como: tinciones negativas/tinta china
No es una tincin como tal. Se llama as porque lo que realmente se tie es el fondo del portaobjetos en el
que estn los microorganismos, apareciendo estos despus sin teir.
Para ver la cpsula a travs del microscopio, se emplea tinta china (suspensin coloidal de carbono o nigrosina)
ya que las partculas de carbono no penetran la clula bacteriana sino que tien su entorno y la bacteria puede ser
observada como un cuerpo refractil sin teir.
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3. Prueba de
movilidad
Agar SIM
Positivo
Fundamento de la prueba
En esta prueba lo que se detecta son la presencia de cilios y flagelos y por eso se mueve, el medio semislido
lo permite. Cuando el medio se enturbie es porque se difunde la bacteria.
4. Fermentacin
de glucosa
(Prueba de
Voges
Proskauer)
Caldo MR-VP
Negativo
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la
glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn
la va utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos
finales neutros (acetil metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como
rojo de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de
potasio para evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Glucosa
Fermentacin Butilenglicolica
Acetil-Metil-Carbonil (Acetoina)
2-3 Butanodiol,
Etanol, H2 y CO2
5. Fermentacin
sacarosa
Agar Triple
Sugar Iron
Positivo
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Fundamento de la prueba
La sacarosa aadida permite la exclusin de determinados organismos coliformes y algunas especies como
Proteus, que pueden atacar la sacarosa , pero no la lactosa, en un perodo de incubacin de 24 48 h. Tambin,
esta puede suprimir los mecanismos enzimticos responsables de la produccin del sulfuro de hidrgeno.
Si la bacteria problema fermenta sacarosa, acidifica el medio en su superficie volvindolo de color amarillo,
mientras que si no lo es, la superficie del medio continuar de color rojo.
6.
Fermentacin de
Glucosa
Positivo
Fundamento de la prueba
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo cidos y virando totalmente
el medio a color amarillo. Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando
la glucosa que se halla en baja concentracin se consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a
utilizar la peptonas con produccin de amonaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente en
el pico, quedando el fondo cido de color amarillo
7.-Produccin de CO2
Positiva
Fundamento de la prueba
Es una prueba usada para la fermentacin de la glucosa, lactosa y sacarosa y la produccin de H2S por
parte de la bacteria sumndole tambin que puede producir gas (CO2).
La presencia de burbujas que rompen el medio al fermentar los hidratos de carbono presentes tienden a
expulsarlo lo cual indica presencia de gas como producto final de la fermentacin.
8. Degradacin de
Citrato por la
enzima citrato
permeasa
Agar Citrato
de Simmons
Negativa
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Fundamento de la prueba
9. Produccin de
cido sulfhdrico
Medio SIM
Negativo
Fundamento de la prueba
La actividad de las bacterias sobre aminocidos que contienen azufre, frecuentemente producen la
liberacin de sulfhdrico, lo cual se demuestra empleando sales de metales pesados como el hierro. El sulfhdrico
reacciona con tales metales dando una coloracin oscura al medio de cultivo.
Para detectar la capacidad de producir el H2S, el tiosulfato de sodio que contiene el medio, es el sustrato
necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los
cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro
El tiosulfato de sodio que se reduce a sulfuro de hidrgeno reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Dicha reaccin es llevada a cabo por enzimas, como:
cistena, desulfhidrasa y latiosulfato reductasa que son las encargadas de liberar al azufre.
10. Prueba de
produccin de
Indol
Medio SIM
Positivo
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Fundamento de la prueba
Caldo MR-VP
Positivo
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la
glucosa es el hidrato de carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn
la va utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos
finales neutros (acetil metil carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como
rojo de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y por la adicin de alfa naftol e hidrxido de potasio
para evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Prueba de Rojo de Metilo
Glucosa
Fermentacin Acida Mixta
cidos lctico, Actico y Succinico + CO2, H2 y etanol
Produccin de Rojo de Metilo
12. Prueba de la
catalasa
N/A
Positivo
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Fundamento de la prueba
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