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Cargo
Responsable
Administrador
Laboratorista 1
Laboratorista 2
GENERACIN: 2014-2016
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Ubicacin
/coordenadas GPS
CUPA - Universidad
Tecnolgica de Len
21 3'52.25"N
10134'56.71"O
2.Parmetros Fisicoqumicos
Color: Caf tabaco
20C
pH: 6.8
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AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS
1. Justificacin del proceso para la identificacin bacteriana
Es necesario identificar la morfologa de la bacteria para conocer sus caractersticas fsicas, lo cual, permite
la descripcin presuntiva de su taxonoma. Por otro lado el metabolismo de las bacterias es importante porque
a travs de ella se especifican las condiciones ptimas en las que se desarrolla, permitindonos conocer
bacterias benficas para el ambiente que ayudan a remover los contaminantes existentes en las matrices de
agua, suelo y aire. Todo esto se logra siguiendo una serie de pruebas bioqumicas en las que se detectan
caractersticas del metabolismo como la presencia de enzimas especficas para sustratos especficos,
generacin de compuestos finales a travs de reacciones qumicas que se llevan a cabo en las reacciones
catablicas, tambin se observa la produccin de diferentes tipos de gases como el cido sulfhdrico (H2S),
dixido de carbono (CO2) y oxgeno , as como la generacin de cambios de color en los medios de cultivo los
cuales indican acidez o alcalinidad debidas a los compuestos que se generan de la degradacin de sustratos
orgnicos por las bacteria. Es as como se logra identificar el tipo de familia a la que pertenece.
2. Dos medios de siembra (Nombre y Composicin)
1. Medio 1: Agar Mac Conkey
Frmula (en gramos por litro)
Peptona
17.0
Pluripeptona
3.0
Lactosa
10.0
Mezcla de sales biliares
1.5
Cloruro de sodio
5.0
Agar
13.5
Rojo neutro
0.03
Cristal violeta
0.001
pH final: 7.1 0.2
Puntiformes, convexas
Incoloras, verdes, negras.
Se pueden presentar solas o en cadenas.
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2.
7.5
7.5
6.8
5
5
3.5
3
2.5
0.8
0.08
13.5
Puntiformes, convexas.
Incoloras, negras.
Se presentan aisladas o en cadena de forma
circular.
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4. Procedimiento de Aislamiento
(describir detalladamente la cantidad de materiales y los pasos a seguir)
Materiales/Reactivos/Medios de cultivo/ Equipo a utilizar
Lista de materiales, reactivos y equipo
Materiales
1 Chalora de aluminio
1 Esptula pequea
1 Matraz Erlenmeyer de 250 mL
1 Probeta de 100 mL
1 Gradilla
2 Cajas Petri
1 Mechero Fisher
1 Aza de nicromo
2 Hisopos
Reactivos
Agar Mac Conkey
Agua destilada
Equipo
Balanza analtica
Autoclave
Incubadora
Refrigerador
Campana de flujo laminar
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Resiembra
1. Tomar del refrigerador una placa con medio de cultivo (Agar Mac Conkey) solidificado para hacer la
resiembra.
2. Acercar tambin la caja Petri con la siembra.
3. Encender el mechero Fisher.
4. Flamear el aza de nicromo hasta que est de color naranja.
5. Abrir la caja Petri con la siembra por atrs del mechero Fisher.
6. Tomar con el aza de nicromo la colonia deseada.
7. Abrir la caja Petri con el cultivo nuevo por atrs del mechero Fisher.
8. Hacer el estriado correspondiente de forma horizontal y posteriormente vertical.
9. Flamear el aza de nicromo.
10. Cerrar la caja Petri con la resiembra.
11. Incubar 24h a 35-37C.
12. Apagar el mechero Fisher.
La resiembra se har como se muestra en la imagen 1.
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Cocos
Gram
Negativa
Positiva
Cpsula
Positiva
Negativa
Motilidad
Positiva
Negativa
F. de Lactosa
Positiva
Negativa
Sacarosa
Positiva
Negativa
CO2
Positiva
Negativa
Degradacin de Citrato
Positiva
Negativa
H2S
Positiva
Negativa
Indol
Positiva
Negativa
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cido mixto
Negativa
Positiva
Glucosa
Positiva
Negativa
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Medio de cultivo
utilizado
Resultado obtenido
(positivo/negativo)
1. Tincin de
Gram deteccin
de pared celular
N/A
Negativa
Evidencia fotogrfica
Fundamento de la prueba
El fundamento de la tcnica se basa en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias Gram positivas
(color morado) y Gram negativas (color rosado). La pared celular de las bacterias Gram positivas posee una gruesa
capa de peptidoglucano, adems de dos clases de cidos teicoicos: Anclado en la cara interna de la pared celular y
unido a la membrana plasmtica se encuentra el cido lipoteicoico, y en la superficie, el cido teicoico est anclado
solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena). Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las
Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una segunda membrana plasmtica exterior (descomposicin
distinta a la interna) por medio de lipoprotenas. Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana
exterior por lipoprotenas. La membrana exterior est hecha de protena, fosfolpido y lipopolisacrido.
Por lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien de distintos colores debido a estas diferencias constitutivas de su
pared. La clave es el peptidoglicano, ya que es el material que confiere su rigidez a la pared celular bacteriana, y las
Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas.
2.-Tincin de
cpsula
N/A
Positiva
Fundamento de la prueba
Tambin conocida como: tinciones negativas/tinta china
No es una tincin como tal. Se llama as porque lo que realmente se tie es el fondo del portaobjetos en el que
estn los microorganismos apareciendo estos despus sin teir.
Para ver la cpsula a travs del microscopio, se emplea tinta china (suspensin coloidal de carbono o nigrosina)
ya que las partculas de carbono no penetran la clula bacteriana sino que tien su entorno y la bacteria puede ser
observada como un cuerpo refrctil sin teir.
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3.-Prueba de
Motilidad
Agar SIM
Negativo
Fundamento de la prueba
Lo que se detecta son la presencia de cilios y flagelos y por eso se mueve el medio SIM slido lo permite. El que el
medio se enturbie es solo porque se difunde la bacteria
4.- Desarrollo
lactosa
de
Agar inclinado
Triple Azcar y
Hierro T.S.I
Positivo
Fundamento de la prueba
La fermentacin de la lactosa requiere dos enzimas, permeasa y -galactosidasa, mientras la permeasa facilita la
penetracin de la molcula de lactosa dentro de la clula bacteriana, la -galactosidasa hidroliza la lactosa para
formar galactosa y glucosa. Las bacterias no fermentadoras de lactosa carecen de ambas enzimas, sin embargo hay
bacterias que tienen -galactosidasa pero no permeasa.
Si el organismo fermenta lactosa, la estra permanecer cida (amarilla). Si no fermenta lactosa, la estra se vuelve
alcalina (roja).
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5.- Fermentacin
de Sacarosa
Agar inclinado
Triple Azcar y
Hierro T.S.I
Positivo
Fundamento de la prueba
La sacarosa aadida permite la exclusin de determinados organismos coliformes y algunas especies como
Proteus, que pueden atacar la sacarosa , pero no la lactosa, en un periodo de incubacin de 24 48 h.
Tambin, esta puede suprimir los mecanismos enzimticos responsables de la produccin del sulfuro de
hidrgeno.
Si la bacteria problema fermenta sacarosa, acidifica el medio en su superficie volvindolo de color amarillo,
mientras que si no lo es, la superficie del medio continuar de color rojo
6. Fermentacin
de Glucosa
Agar inclinado
Triple Azcar y
Hierro T.S.I
Positivo
Fundamento de la prueba
Primero los microorganismos empiezan a fermentar la glucosa, produciendo cidos y virando totalmente el
medio a color amarillo. Como solamente utilizan la glucosa, no pueden usar la sacarosa ni la lactosa, cuando la
glucosa que se halla en baja concentracin se consume (antes de las 24hs) los microorganismos comienzan a
utilizar la peptonas con produccin de amonaco que alcaliniza el medio dando un color rojo, pero solamente
en el pico, quedando el fondo cido
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7.-Produccin de
CO2
Agar inclinado
Triple Azcar y
Hierro T.S.I
Positiva
Fundamento de la prueba
Es una prueba usada para la fermentacin de la glucosa, lactosa y sacarosa y la produccin de H2S por parte
de la bacteria sumndole tambin que puede producir gas (CO2).
La presencia de burbujas que rompen el medio al fermentar los hidratos de carbono presentes tienden a
expulsarlo lo cual indica presencia de gas como producto final de la fermentacin.
8. Degradacin
de Citrato por la
enzima citrato
permeasa
Agar inclinado
Citrato de
Simmons
Positiva
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, el fosfato mono-amnico es la nica fuente de nitrgeno y el citrato de sodio es la
nica fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo bacteriano. Las sales de
fosfato forman un sistema buffer, el magnesio es cofactor enzimtico. El cloruro de sodio mantiene el balance
osmtico, el azul de bromotimol es el indicador de pH, que vira al color azul en medio alcalino y el agar es el
agente solidificante.
El medio de cultivo es diferencial en base a que los microorganismos capaces de utilizar citrato como
nica fuente de carbono usan sales de amonio como nica fuente de nitrgeno, con la consiguiente
produccin de alcalinidad.
El metabolismo del citrato se realiza, en aquellas bacterias poseedoras de citrato permeasa, a travs
del ciclo del cido tricarboxlico. El desdoblamiento del citrato genera progresivamente, oxalacetato y
piruvato. Este ltimo, en presencia de un medio alcalino, da origen a cidos orgnicos que al ser utilizados
como fuente de carbono, producen carbonatos y bicarbonatos alcalinos. El medio entonces vira al azul y esto
es indicativo de la produccin de citrato permeasa.
Citrato
Piruvato
CO2 + Na + H2O
Na2CO3
Azul de Bromotinol
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9. Produccin
de H2S
Agar SIM
Negativa
Fundamento de la prueba
.
La actividad de las bacterias sobre aminocidos que contienen azufre, frecuentemente producen la liberacin
de sulfhdrico, lo cual se demuestra empleando sales de metales pesados como el hierro. El sulfhdrico
reacciona con tales metales dando una coloracin oscura al medio de cultivo.
Para detectar la capacidad de producir el H2S, el tiosulfato de sodio que contiene el medio, es el sustrato
necesario para la produccin de cido sulfhdrico, el sulfato de hierro y amonio, es la fuente de iones Fe3+, los
cuales se combinan con el cido sulfhdrico y producen sulfuro de hierro
El tiosulfato de sodio que se reduce a sulfuro de hidrgeno reacciona luego con una sal de hierro
proporcionando el tpico sulfuro de hierro de color negro. Dicha reaccin es llevada a cabo por enzimas, como:
cistena, desulfhidrasa y latiosulfato reductasa que son las encargadas de liberar al azufre.
10. Produccin
de Indol
Agar SIM
Negativo
Fundamento de la prueba
El Indol, es uno de los productos de la degradacin metablica del aminocido triptfano. Las bacterias que
producen la enzima triptofanasa son capaces de hidrolizar y desaminar el triptfano con produccin de Indol,
cido pirvico y amoniaco. La prueba del indol est basada en la formacin de un complejo rojo cuando el Indol
reacciona con el grupo aldehdo p-dimetilaminobenzaldehdo. Este es el principio activo del reactivo de
Kovacs.
En la prueba, segundos despus de aadir el reactivo de Kovacs, el desarrollo de un color rojo-fucsia en la
interface del reactivo y de los medios, indican la presencia de indol y por lo tanto se considera una prueba
positiva.
MICROBIOLOGA AMBIENTAL UTL
ASESORA:
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11. Fermentacin
de cido mixto
(Rojo de
Metilo)
Caldo MR-VP
Negativo
Fundamento de la prueba
En el medio de cultivo, la pluripeptona aporta los nutrientes necesarios para el desarrollo bacteriano y la
glucosa, lo que es el hidrato de carbono fermentable.
La glucosa puede ser metabolizada por los microorganismos, a travs de distintas vas metablicas. Segn la va
utilizada, se originarn productos finales cidos (cido lctico, cido actico, cido frmico), o productos finales
neutros (acetil-metil-carbinol).
Esta diferencia en el metabolismo bacteriano, podra ser reconocida por la adicin de un indicador como rojo
de metilo, para revelar la presencia de productos cidos, y la produccin de alfa naftol e hidrxido de potasio
para evidenciar la presencia de productos finales neutros.
Glucosa
12. Fermentacin
de Glucosa
Caldo MR-VP
Positivo
Fundamento de la prueba
Voges y Proskauer describieron una coloracin rojiza que apareca despus de adicionar hidrxido de
potasio a los cultivos de ciertos microorganismos en medio con glucosa. Esta coloracin se debe a la oxidacin
del acetil-metil-carbinol a diacetilo, el cual reacciona con la peptona del medio para dar un color rojo.
Para determinar la capacidad de algunas bacterias para generar un producto final neutro (acetoina y
2,3 Butanodiol) a partir de la fermentacin de la glucosa, los productos neutros formados en la presencia de
oxigeno atmosfrico, alcalisis (Hidrxido de Potasio al 40%) y peptonas, se oxidan en diacetilo, reactante para el
color producido en la reaccin. El Alfa naftol acta como catalizador para revelar un complejo color rojo.
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3. Caractersticas generales
Son bacterias Gram negativas, la asimilacin y la fermentacin de la lactosa se pueden observar en el agar Mac
Conkey donde las colonias son de color rosado y en el medio Kliger o TSI donde son cido/cido, es decir
fermentador de la lactosa ms la produccin de gas; y en la fermentacin acetnica o prueba de Voges
Proskauer son positivos. Por ltimo, sus condiciones ptimas de cultivo son en agar nutritivo a 37 C, pH de 7.0,
presin osmtica de 1 atm
4. Ciclo(s) biogeoqumicos en el (los) que intervienen
Nitrgeno
5. La funcin que juegan en la transformacin de la materia orgnica a travs
de los ciclos biogeoqumicos
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