REA DE SUSTENTABILIDAD PARA EL DESARROLLO

PROGRAMA ACADMICO DE QUMICA

ESPECIALIDAD TECNOLOGA AMBIENTAL
GRUPO
QU-301
MATERIA
MICROBIOLOGA AMBIENTAL
REPORTE DE DIAGNOSTICO MICROBIOLGICO EN SITIO ALTERADO
PRESA BLANCA PUENTE 1 DE ACUERDO A LA NMX-AA-042-SCFI1987 Y
PROY-NMX-AA-042-/1-SCFI-2008
PRESENTAN
BECERRA CALVILLO RUBN ISAAS
GONZLEZ DAZ JOS LUIS
MARTNEZ SARABIA DIANA AURORA DEL ROCO

GENERACIN: 2014-2016
LEN, GUANAJUATO. JUNIO-2015

ANTECEDENTES
La Presa Blanca es una poblacin perteneciente al municipio de Len, en el
Estado de Guanajuato, se encuentra a 1784 metros sobre el nivel del mar. El
punto asignado para realizar el muestreo para diagnostico microbiolgico est
ubicado a las orillas de la presa blanca en el rio el Mastranzo, que esta
especficamente en las coordenadas 101 42' 25.45" W, 21 5' 36.13" N.

Bordo el Mastranzo

Presa blanca

Se eligi este sitio como rea

muestreo,
Presa de
blanca
(INEGI) debido a que se cree que hay
un alto contenido de microorganismos como Coliformes totales y Escherichia coli
como indicadores de contaminacin fecal tanto en suelo como en agua. El 27 de
Marzo del 2013 fue publicado un apartado en el que se da a conocer que:
La zona sur del municipio de Len es la ms contaminada debido a la
quema de pastizales y a los tiraderos clandestinos de desechos industriales. La
quema de 80 hectreas en el vaso de la presa de El Mastranzo, o presa Blanca,
ha puesto al descubierto que ah se arrojan de forma clandestina toneladas de
desechos industriales desde, lodos de teneras, llantas y madera, por lo cual
sumado a las toneladas de lirio seco, ha dificultado combatir el fuego. El
coordinador de Proteccin Civil, Sal Lozano Ontiveros, coment, que mientras
combatan el fuego, se percataron de que llegaron tres camionetas a la presa
Blanca a tirar desechos. (Mndez J. Peridico A.M.); es por ello que se ha optado
por evaluar la calidad microbiolgica en suelo y agua de dicho lugar.
NARRACIN DEL MUESTREO PARA ANLISIS MICROBIOLGICO
La hora de partida de la Universidad Tecnolgica de Len hacia la zona de
muestreo La Presa Blanca fue realizada a las 9:30 de la maana, con un
recorrido de 45 min. La llegada al sitio fue a las 10:15 am. En un lapso de tiempo
2

que fue de las 10:30 hasta la 1:50 de la tarde se llev a cabo la recoleccin y
preservacin de muestras que no son de inters microbiolgico.
A la 1:50 de la tarde se llev una siembra microbiolgica in situ tanto de
agua como de suelo. Las cuales consisten colocar una pequea muestra de
ambos sitios en una placa con medio de cultivo. La siembra in situ se realiz de
la siguiente manera.
Suelo: Con un hisopo estril, se tom una pequea cantidad de la superficie
del suelo, posteriormente se coloc el suelo recolectado y se realiz un estriado
por toda la caja de Petri, la cual contena Agar Rojo Bilis Violeta, que es un medio
de cultivo selectivo y se utiliza para la investigacin presuntiva y el recuento de
bacterias Coliformes, despus se serr la caja de Petri ya identificada y se
envolvi en papel aluminio para evitar que sta se contaminara y ah concluy la
siembra in situ de suelo para el anlisis microbiolgico.

Figura 1

Figura 2

Figuras 1 y 2. Siembra in situ de la matriz suelo.

Agua: La siembra in situ se realiz sumergiendo una jeringa estril a

aproximadamente 2 cm de profundidad en el agua del rio, posteriormente se tom
1 mL de muestra de agua y se coloc en otra caja Petri que tambin contena Agar
Rojo Bilis Violeta, se distribuy el agua en toda la caja ya identificada, se cerr y
tapo con papel aluminio y con esto se concluy la siembra in situ de las dos
matrices ambientales deseadas.

Figura 3

Figura 4

Figuras 3 y 4. Siembra in situ de la matriz agua.

Una vez concluida la siembra se almacenaron en una hielera a 4 o C hasta la

llegada al laboratorio para su posterior incubacin.

Figura 5. Preservacin a 4 C de las siembras in situ.

A las 2:04 de la tarde se realiz la recoleccin de muestra para su anlisis

microbiolgico en el laboratorio, la cual consisti en llenar 2/3 partes de un
recipiente de vidrio estril, con muestra de suelo y la recoleccin de la muestra de
agua consisti en tomar otro recipiente de vidrio esterilizado y sumergirlo a 15 cm
de profundidad del ro donde se tom la muestra, una vez que el frasco estuvo
dentro del agua, este se abri en sentido opuesto de la corriente y se dej llenar
hasta 2/3 partes, dejando la otra parte libre, para permitir la presencia de oxgeno
y poder mezclar la muestra al momento de hacer el anlisis. Y con estas dos
recolecciones de muestra, concluy el muestreo microbiolgico en La Presa
Blanca.

Figura 6. Muestras de las matrices ambientales agua y suelo.

El clima fue caluroso y estuvo soleado. El rea especfica del muestreo de

suelo fue cerca de unos rboles frutales y el de agua fue a las orillas del ro El
Mastranzo, el cual es una de las principales fuentes de alimentacin de agua de
La Presa Blanca.

Figura 7
Figura 8
Figuras 7 y 8. Vegetacin presente en el rea de muestreo y rio de la zona.

La llegada de regreso a la Universidad Tecnolgica de Len fue a las 3:00

de la tarde aproximadamente y en cuanto se lleg al laboratorio se prosigui con
la entrega de las muestras de agua y suelo y la incubacin de las cajas de Petri ya
sembradas.

MUESTREO Y SIEMBRA IN SITU

FUNDAMENTO
5

El Agar Rojo Bilis Violeta es utilizado como uno de los procedimientos para
llevar a cabo la deteccin, enumeracin e identificacin presuntiva de
microorganismos Coliformes. En este medio las colonias de Coliformes presentan
una morfologa tpica que permite su identificacin presuntiva y que debe ser
confirmada mediante reacciones bioqumicas.
En este medio la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes y la
fuente de nitrgeno y carbono necesarios para el crecimiento bacteriano, las sales
biliares y el cristal violeta inhiben el desarrollo de la flora Gram positiva, la lactosa
es la fuente de hidratos de carbono, y el rojo neutro acta como indicador para
evidenciar el cambio de pH como consecuencia de la fermentacin de la lactosa
ya que el medio es acidificado y se produce un viraje al color rojo intenso. El agar
es el agente solidificante.

MATERIALES, EQUIPO Y REACTIVOS

-

2 Frascos de vidrio estriles

3 Cajas Petri con Agar Rojo
Bilis Violeta
1 Hisopos estriles
1 Jeringa estril sin aguja

1 Hielera
2 bolas de hielo
1 Termmetro
1 Papel aluminio

PREPARACIN DEL
ROJO BILIS VIOLETA

AGAR

Suspender 41.5 g del polvo en 1

litro de agua purificada. Reposar
5 minutos. Calentar con agitacin
frecuente y llevar a ebullicin por
1 minuto hasta disolucin total
(no esterilizar en autoclave).
Enfriar un poco, distribuir en
placas de Petri estriles, y dejar
solidificar por completo.

PROCEDIMIENTO
MUESTREO

PARA

1.- Siempre que sea posible,

llenar el frasco a 2/3 partes de su
capacidad (el espacio de aire
disponible provocando la perdida
de microorganismos aerobios),
con muestra de suelo o agua.

2.- El frasco donde se colecta la

muestra no se debe destapar
sino hasta el momento del
muestreo. Al muestrear, se debe
evitar que el cuello del frasco se
ponga en contacto con los dedos
o
cualquier
otro
material
contaminante.

3.- El procedimiento de muestreo

en agua es el siguiente:

3.1.- Sin quitar el papel aluminio

del cuello del frasco estril introducirlo aproximadamente de 15-30 cm 3 bajo la
superficie del agua.

3.2.- Destapar el frasco dentro

del agua poniendo la boca del envase en sentido contrario al flujo de la
corriente. Si no existe corriente, crearla empujando el frasco de forma en
direccin opuesta al movimiento de la mano.
3.3.- Una vez que la muestra
ocupe el volumen correspondiente del frasco ( 2/3 partes); tapar sin sacarlo del
agua teniendo cuidado de que el papel aluminio vuelva a cubrir el cuello de la
botella.
-

4.- El volumen de muestra

suficiente para efectuar el
anlisis
bacteriolgico,
de
preferencia
debe
ser
de
3
aproximadamente 100cm .

5.- El mecanismo de muestreo

superficial en suelo es el
siguiente:

5.1.- Retirar todas las posibles

hojas o desechos de plantas que se encuentren en la zona que se muestrear.
5.2.- Abrir el frasco estril y
2
llenarlo con suelo hasta /3 partes de su capacidad.
5.3.Cerrar
el
frasco
rpidamente, cuidando que el aluminio cubra nuevamente el cuello de ste.
-

** Las muestras tanto de agua

como de suelo deben ser
etiquetadas,
selladas
y
guardadas
inmediatamente
despus de su recoleccin, en
una hielera a 4 C.

** El examen de la muestra debe

realizarse lo ms pronto posible,
para evitar proliferacin o muerte
de las bacterias. Cuando el
examen se practica dos horas
despus de tomar la muestra, los
resultados empiezan a ser
inciertos.

SIEMBRA
SUELO

IN

SITU

PARA

1. Con un hisopo esterilizado tomar un poco de suelo de la zona a muestrear.

2. Abrir la caja Petri y colocar la muestra estriando con el hisopo en toda la
superficie del agar rojo bilis violeta.
3. Cerrar la caja Petri y preservar.
-

SIEMBRA IN SITU PARA AGUA

1. Tomar con una jeringa estril un mililitro del agua residual.

2. Colocar la muestra en una caja Petri con Agar Rojo Bilis Violeta.
3. Tapar la caja Petri, homogeneizar la muestra uniformemente sobre el agar y
preservar.
-

PRESERVACIN
ALMACENAMIENTO

El anlisis bacteriolgico de la
muestra
debe
realizarse
inmediatamente despus de su
recoleccin. Durante el perodo
que transcurra del muestreo al
anlisis, se debe conservar la
muestra a 4 C, con objeto de
inhibir la actividad bacteriana
para no obtener resultados falsos
o dudosos.

DETERMINACIN DE
COLIFORMES TOTALES PRUEBA PRESUNTIVA

FUNDAMENTO

La prueba presuntiva consiste en

inocular
volmenes
determinados de la muestra (10;
1; 0.1 mL) en series de tres
tubos de caldo Lactosado, que
son incubados a 35 | C durante
24-48 horas. El medio de cultivo
que se utiliza permite la
recuperacin
de
los
microorganismos daados que
se encuentren presentes en la
muestra y que sean capaces de
utilizar a la lactosa como fuente
de carbono.
Resultando una
produccin de cidos y gas el
cual se manifiesta en las
campanas de fermentacin e
indica una prueba presuntiva
positiva para Coliformes.

MATERIALES Y EQUIPO

1 Incubadora
1 Autoclave
1 Balanza analtica
4 Pipetas graduadas, con tapn de algodn
18 Tubos de cultivo con tapn de baquelita, aluminio o algodn
18 Campanas de fermentacin (Durham)
2 Asas de inoculacin
2 Matraces de vidrio de 250 ml con tapn de algodn
1 Gradilla.
1 Mechero bunsen
Agua destilada
- MEDIOS DE CULTIVO
Caldo Lactosado.
- Ingredientes:
- Extracto de carne 3.0 g
- Peptona de gelatina 5.0 g
- Lactosa 5.0 g
- Preparacin:
- Suspender 3.38 g del polvo en
130 mL de agua destilada.
Calentar con agitacin frecuente
para disolucin total. Distribuir en
6 tubos de cultivo un volumen de
10 ml de medio (concentracin
doble), en otros 6 tubos 5 mL del
medio y 4 mL de agua destilada
(concentracin sencilla) y en 6
tubos ms agregar 5 mL del
medio y 5 mL de agua destilada
(concentracin sencilla), colocar

una campana de Durham a cada

tubo con medio de cultivo.
Esterilizar en autoclave a 121
1.0 C durante 15 minutos. El
aspecto del caldo es claro y de
color beige. Las campanas de
fermentacin no deben contener
burbujas de aire despus de la
esterilizacin.
-

PROCEDIMIENTO
INOCULACIN

DE

1. Diluir 5 mL de muestra de agua en 45 mL de agua estril.

2. Agitar la muestra diluida y transferir volmenes de:
- 10 mL de muestra a cada uno de los 3 tubos de concentracin doble.
- 1 mL de muestra a cada uno de los 3 tubos de concentracin sencilla
que contienen 5 mL de medio y 4 mL de agua.
- 0.1 mL de muestra a cada uno de los 3 tubos de concentracin sencilla
que contienen 5 mL de medio y 5 mL de agua.
3. Pesar 1 g de muestra de suelo en 50 mL de agua estril y disolver
perfectamente.
4. Agitar la muestra de suelo y transferir volmenes los volmenes como en el
punto 2.
5. Incubar los tubos a 35 C por 24 2 h y observar si hay formacin de gas
(si la formacin de gas no se observa, incubar por 48 2 h).
6. La formacin de gas en las campanas de Durham indica una prueba
positiva para Coliformes.
-

- DETERMIACIN DE
COLIFORMES TOTALES PRUEBA CONFIRMATIVA
-

FUNDAMENTO

Durante la fase confirmativa se

emplea como medio de cultivo
caldo Lactosado bilis verde
brillante el cual es selectivo y
solo permite el desarrollo de
aquellos
microorganismos
capaces de tolerar tanto las
sales biliares como el verde
brillante. En el medio de cultivo,
la peptona aporta los nutrientes
necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la bilis y el
verde brillante son los agentes
selectivos
que
inhiben
el
desarrollo de bacterias Gram
positivas y Gram negativas a
excepcin de Coliformes, y la
lactosa es el hidrato de carbono
fermentable.
Es una propiedad del grupo
Coliforme, la fermentacin de la
lactosa con produccin de cido
y gas.

MATERIALES Y EQUIPO

1 Incubadora
1 Autoclave u olla de presin o con manmetro
1 Balanza analtica con sensibilidad de 0.0001 g
4 Pipetas bacteriolgicas graduadas, con tapn de algodn
18 Tubos de cultivo con tapn de baquelita, aluminio o algodn
18 Tubos de fermentacin (Durham)
2 Asas de inoculacin

2 Matraces de vidrio de 250 ml con tapn de algodn

Utensilios esterilizados para la obtencin de muestras: cuchillos, pinzas,
tijeras, cucharas, esptulas, etc.
1 Gradilla.
3 Soluciones buffer de 4, 7 y 10.
1 Mechero bunsen.
-

PREPARACIN DEL CALDO

LACTOSADO BILIS VERDE
BRILLANTE
Ingredientes:

Peptona 10.0 g
Lactosa 10.0 g
Sales biliares 20.0 g
Verde brillante 0.0133 g
-

Preparacin:
Suspender 7.6 g del polvo en
190 mL de agua destilada.
Disolver y distribuir volmenes
de 10 ml en 18 tubos con
campana de Durham. Esterilizar
en autoclave a 121C durante 15
minutos. Las campanas de
fermentacin no deben contener
burbujas de aire despus de la
esterilizacin.

PRUEBA CONFIRMATIVA

1. Transferir una asada de cada tubo positivo obtenido durante la prueba

presuntiva, a otro tuvo con caldo bilis verde brillante, con campana de
Durham.
2. Agitar ligeramente los tubos para su homogeneizacin.
3. Incubar a 35 0,5 C por 24 2 horas (si la formacin de gas no se
observa en este tiempo, incubar por 48 2 horas).

4. Registrar como positivos aquellos tubos en donde se observe turbidez

(crecimiento) y produccin de gas.
5. Consultar las tablas de NMP de la Norma Oficial Mexicana NOM-112-SSA11994 para conocer el nmero ms probable de organismos Coliformes
totales/100 mL.
-

DETERMINACIN DE
Escherichia coli PRUEBA
CONFIRMATIVA PARA LA
PRODUCCIN DE INDOL
-

FUNDAMENTO

El triptfano es un aminocido
constituyente de muchas peptonas, y particularmente de la triptena, que puede
ser oxidado por algunas bacterias para formar indol. En el proceso interviene un
conjunto de enzimas llamadas triptofanasa. El indol producido se combina con el
aldehdo del reactivo de Kovacs, para originar un compuesto de color rojo. Este
mtodo determina si la bacteria posee una enzima triptofanasa y la habilidad de
romper el indol del aminocido triptfano.
-

REACTIVO
PARA
PRODUCCIN DE INDOL

Reactivos

LA

Reactivo de Kovacs para indol

Para-dimetil-amino-benzaldehdo ((CH3 )2NC6H4CHO) 5,0 g

Alcohol amlico (CH3 (CH2 ) 4 OH) (libre de bases orgnicas) 75 mL
cido clorhdrico (HCl) (d = 1,18 g/mL) 25 mL
cido clorhdrico (HCl) (d = 1,18 g/mL) 25 mL
-

Preparacin

Disolver el para-dimetil-aminobenzaldehdo en alcohol amlico.

Aadir con cuidado el cido
concentrado. Conservar en un
frasco mbar con tapn de vidrio,
en sitio oscuro y refrigerar. El
reactivo
debe
tener
una
coloracin amarillo claro o caf
claro.

MEDIO PARA PRODUCCIN

DE INDOL

Reactivos

Preparacin

Suspender 1.05 g de polvo en 70

mL de agua destilada. Mezclar
bien y en 6 tubos de cultivo
colocar 10 mL del agua.
Esterilizar en autoclave a 121C
durante 15 minutos.

Agua de peptonada

peptona 1.0 g
Cloruro de sodio (NaCl) 8.5 g

EQUIPO,
MATERIALES
Y
REACTIVOS PARA LA PRUEBA
DE PRODUCCIN DE INDOL

6 tubos de cultivo con tapn de algodn gasa.

1 Asa de platino
1 Mechero bunsen
1 Gradilla
1 Gotero
1 Matraz Erlenmeyer con tapn
Reactivo de Kovacs
Autoclave
Pipeta graduada
Agua destilada
Balanza analtica
Incubadora
-

PROCEDIMIENTO

1. Tomar una asada de la suspensin bacteriana que se encuentra en el tubo

con agar verde bilis brillante que dio positivo a la prueba confirmativa de
Coliformes.
2. Inocular con la asada otro tubo contiene 10mL de caldo peptona.
3. Incubar a 44 1 C por 24 2 h.
4. Finalizada la incubacin, adicionar de 0.2 a 0.3 mL de reactivo de Kovacs.
5. La presencia de una coloracin roja en la superficie del tubo se considera
como prueba positiva para la presencia de indol.
-

PRUEBA CONFIRMANTIVA DE
Escherichia coli PRUEBA DE
OXIDASA

FUNDAMENTO

Esta
prueba
sirve
para
determinar la presencia de enzimas oxidasas. La reaccin de la oxidasa se debe a
la presencia de un sistema citocromooxidasa que activa la oxidacin del citocromo
que es reducido por el oxgeno molecular que produce agua o perxido de
hidrgeno segn la especie bacteriana. El oxgeno acta por tanto como aceptor
final de electrones en la cadena transportadora de electrones. Por lo general, el
sistema citocromooxidasa slo se encuentra en los organismos aerobios, algunos
anaerobios facultativos y, excepcionalmente, en algn microaerfilo, pero los
anaerobios estrictos carecen de actividad oxidasa. La prueba de Oxidasa es
importante y muy til para diferenciar las Enterobacterias (Todas Oxidasa
negativas) de otras especies como Pseudomonas o Neisserias oxidasa positiva.
-

MATERIALES Y REACTIVOS

3 Caja Petri
1 Varilla de Vidrio
3 Papel Filtro
Reactivo oxidasa
-

PREPARACIN
REACTIVO DE OXIDASA

DEL

Reactivo

Solucin al 1% de NNN'N',
tetrametil, 1-4 fenilendiamina en
agua destilada.

Preparacin

El reactivo de oxidasa es
bastante txico, manejar con
precaucin. Se altera por la luz y
el oxgeno, por lo que debe ser
de preparacin extempornea y
protegerse envolvindolo con
papel negro

PROCEDIMIENTO

1. Colocar de 2 a 3 gotas de reactivo de oxidasa preparado recientemente en

un papel filtro colocado sobre una caja de Petri.

2. Con una varilla de vidrio o un palillo de madera, colocar una colonia aislada
del cultivo puro en el papel filtro preparado.
3. Considerar la aparicin de un color azul-purpreo en un lapso de 10
segundos como una reaccin positiva.